Đồ án Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp

Nội dung text: Đồ án Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHITOSANASE TỪ ASPERGILLUS SPP. Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. NGÔ ĐẠI NGHIỆP Sinh viên thực hiện : PHẠM MINH SANG MSSV: 0851110196 Lớp: 08DSH6 TP. Hồ Chí Minh, 2012
2. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ ix DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Error! Bookmark not defined. DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ix MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đại cương về chitin và chitosan 6 1.1.1. Lịch sử phát hiện 6 1.1.2. Phân bố và đặc điểm sinh hóa 7 1.1.2.1. Phân bố 7 1.1.2.2. Đặc điểm sinh hóa 7 1.1.3. Phương pháp thu nhận Chitosan và oligomer từ Chitin 10 1.1.4. Ứng dụng của Chitosan và các dẫn xuất thủy phân từ Chitosan 13 1.2. Đại cương về hệ enzyme Chitosanase 16 1.2.1. Định nghĩa 16 1.2.2. Nguồn gốc và phân loại 16 1.2.3. Các đặc tính cơ bản của hệ enzyme chitosanase 19 1.2.3.1. Trọng lượng phân tử 19 1.2.3.2. Tính đặc hiệu cơ chất 19 1.2.3.3. Đặc tính thủy phân 20 1.2.3.4. Đặc tính động học 21 i
3. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 1.2.3.5. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt động của chitosanase 22 1.2.3.6. Chất hoạt hóa và chất ức chế 24 1.2.4. Cảm ứng tổng hợp, tinh chế và xác định hoạt tính chitosanase 24 1.2.4.1. Cảm ứng sinh tổng hợp chitosanase 24 1.2.4.2. Tinh chế chitosanase 25 1.2.4.3. Phương pháp xác định hoạt tính chitosanase 26 1.2.5. Ứng dụng của chitosanase 26 1.2.6. Tình hình nghiên cứu chitosanase trên Thế giới và ở Việt Nam 27 1.2.6.1. Tình hình nghiên cứu chitosanase trên thế giới 27 1.2.6.2. Tình hình nghiên cứu chitosanase ở Việt Nam 28 1.3. Khái quát về lên men bán rắn 29 1.3.1. Định nghĩa lên men 29 1.3.2. Lên men bán rắn 29 1.3.3. So sánh lên men bán rắn với lên men chìm 30 1.4. Khái quát về Aspergillus spp. 32 1.4.1. Giới thiệu về Aspergillus spp. 32 1.4.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Aspergillus spp. 33 1.4.3. Một số ứng dụng của Aspergillus spp. 34 1.5. Khái quát về nguồn nguyên liệu cám gạo và vỏ trấu trong nước 35 1.5.1. Nguồn cám gạo trong nước 35 1.5.2. Nguồn vỏ trấu trong nước 36 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu 38 2.1.1. Chủng giống 38 ii
4. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 2.1.2. Cơ chất cảm ứng 38 2.1.3. Cơ chất nuôi cấy 38 2.1.4. Hóa chất và thiết bị 38 2.1.4.1. Hóa chất 38 2.1.4.2. Thiết bị 39 2.1.5. Môi trường 39 2.1.5.1. Môi trường giữ giống 39 2.1.5.2. Môi trường nhân giống 39 2.1.5.3. Môi trường kiểm tra hoạt tính enzyme 40 2.1.5.4. Môi trường lên men bán rắn 41 2.2. Phương pháp 41 2.2.1. Phương pháp xác định độ ẩm nguyên liệu 41 2.2.2. Phương pháp xác định trực tiếp số lượng bào tử 42 2.2.2.1. Cấy nhân sinh khối 42 2.2.2.2. Xác định số lượng bào tử bằng phương pháp đếm bằng buồng đếm hồng cầu 42 2.2.3. Phương pháp cấy điểm trên môi trường thạch đĩa chọn chủng nấm mốc có hoạt tính chitosanase cao 43 2.2.3.1. Nguyên tắc 43 2.2.3.2. Tiến hành 43 2.2.4. Phương pháp khuếch tán thạch đĩa 44 2.2.5. Phương pháp mô tả hình thái vi sinh vật 44 2.2.5.1. Quan sát đại thể 44 2.2.5.2. Quan sát vi thể 44 iii
5. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 2.2.6. Phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn 44 2.2.7. Phương pháp so màu với thuốc thử DNS (acid 3,5 – dinitrosalicylic) xác định hoạt tính chitosanase 45 2.2.7.1. Nguyên tắc 45 2.2.7.2. Tiến hành 45 2.2.8. Phương pháp Bradford – xác định hàm lượng protein 47 2.2.8.1. Nguyên tắc 47 2.2.8.2. Tiến hành 47 2.2.9. Phương pháp trích ly enzyme chitosanase 48 2.2.10. Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý thống kê 49 2.2.10.1. Bố trí thí nghiệm 49 2.2.10.2. Xử lý thống kê 49 2.2.11. Bố trí thí nghiệm 49 2.2.11.1. Thí nghiệm khảo sát chọn chủng nấm mốc sinh tổng hợp chitosanase cao 49 2.2.11.2. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất cảm ứng 49 2.2.11.3. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của độ thoáng khí 50 2.2.11.4. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường 50 2.2.11.5. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống 50 2.2.11.6. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 51 2.2.11.7. Nuôi cấy thu enzyme chitosanase 51 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 3.1. Khả năng sinh tổng hợp chitosanase từ năm chủng nấm mốc khảo sát 52 3.1.1. Định tính khả năng sinh tổng hợp chitosanase 52 iv
6. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 3.1.2. Định lượng khả năng sinh tổng hợp chitosanase 53 3.2. Hình thái đại thể và vi thể của chủng O2 54 3.2.1. Hình thái đại thể 54 3.2.2. Hình thái vi thể 55 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase 55 3.4. Ảnh hưởng của độ thoáng khí đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase 58 3.5. Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase 61 3.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase 64 3.7. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase 67 3.8. Kết quả lên men bán rắn thu nhận enzyme 70 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận 71 4.2. Kiến nghị 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 PHỤ LỤC 1 v
7. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CMC Carboxy Methyl Cellulose GlcN Glucosamine GlcNAc N – acetyl glucosamine kDa Kilo Dalton O1 Aspergillus oryzae – 1 O2 Aspergillus oryzae – 2 N1 Aspergillus niger – 1 N3 Aspergillus niger – 3 N7 Aspergillus niger – 7 NADH Nicotinamide adenine dinucleotide PGA Potato Glucose Agar LSF Liquid state fermentation SSF Solid state fermentation vi
8. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. DANH MỤC CÁC BẢNG TT Bảng Nội dung Trang Các phương pháp hóa học được sử dụng để tạo các 1 1.1 10 oligomer của chitosan Các chitosanase trong Họ 46 thuộc enzyme thủy phân liên 2 1.2 17 kết glycoside Trọng lượng phân tử chitosanase thu nhận từ các loài khác 3 1.3 18 nhau 4 1.4 Đặc điểm thủy phân của một số chitosanase vi sinh vật 20 Hằng số Michaelis và V của chitosanase ở một số loài 5 1.5 max 20 tiêu biểu 6 1.6 Giá trị pH tối ưu của một số chitosanase 22 7 1.7 Nhiệt độ tối ưu của một số chitosanase 23 8 1.8 So sánh giữa các quá trình lên men lỏng và rắn 30 9 1.9 Thành phần xơ và giá trị dinh dưỡng của các nguyên liệu 35 10 2.1 Các bước tiến hành dựng đường chuẩn glucosamine 36 11 2.2 bước tiến hành xác định hoạt tính đối với mẫu thí nghiệm 37 12 2.3 Các bước tiến hành dựng đường chuẩn albumine 38 Các nghiệm thức khảo sát nồng độ cơ chất cảm ứng lên khả 13 2.4 39 năng sinh tổng hợp Chitosanase) Đường kính vành khuyên phân giải chitosan theo phương 14 3.1 42 pháp cấy điểm của các chủng O1, O2, N1, N3, N7 Bán kính vòng thủy phân và hoạt tính chitosanase của các 15 3.2 43 chủng nấm mốc sau 24 giờ nuôi cấy Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến khả năng sinh 16 3.3 46 tổng hợp chitosanase Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến hàm lượng 17 3.4 47 protein Ảnh hưởng của độ thoáng khí đến khả năng sinh tổng hợp 18 3.5 49 chitosanase 19 3.6 Ảnh hưởng của độ thoáng khí đến hàm lượng protein. 50 Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến khả năng sinh tổng 20 3.7 51 hợp chitosanase 21 3.8 Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến hàm lượng protein. 53 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến khả năng sinh tổng hợp 22 3.9 54 chitosanase. 23 3.10 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến hàm lượng protein. 56 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng 24 3.11 57 hợp chitosanase. 25 3.12 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hàm lượng protein 58 Điều kiện tối ưu lên men bán rắn thu nhận chitosanase với 26 3.13 60 chủng O2. vii
9. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. DANH MỤC CÁC HÌNH TT Hình Nội dung Trang 1 1.1 Công thức cấu tạo của chitin 7 2 1.2 Công thức cấu tạo của chitosan 8 3 1.3 Công thức biểu diễn công thức chính xác của chitosan 9 Cơ chế xúc tác của chitosanase trong phản ứng phân cắt 4 1.4 9 chitosan Đặc điểm của quá trình lên men bán rắn (SSF) (Moo – Young và cộng sự, 1983) – sự sắp xếp các hạt chất rắn ẩm 5 1.5 30 và pha khí liên tục trong hệ thống SSF với hệ nấm sợi (bên trái) và sinh vật đơn bào (bên phải). Hình thái đại thể chủng O2, mặt trên khuẩn lạc (bên trái) 6 3.1 54 và mặt dưới khuẩn lạc. Khuẩn ty (trái) và cuống sinh bào tử (phải) chủng O2 khi 7 3.2 chưa nhuộm - ảnh được quan sát và ghi nhận ở vật kính 55 40. Khuẩn ty (trái) và cuống sinh bào tử (phải) chủng O2 khi 8 3.3 nhuộm Methylene Blue - ảnh được quan sát và ghi nhận ở 55 vật kính 40. 9 PL1 Khuẩn lạc và đường kính vành khuyên phân giải 1 10 PL2 Bình nhân giống chủng O2 trên môi trường lúa 2 11 PL3 Đường chuẩn D - glucosamine 3 12 PL4 Đường chuẩn Albumine 3 viii
10. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ TT Biểu đồ Nội dung Trang Bán kính vòng thủy phân và hoạt tính chitosanase của 1 3.1 53 các chủng nấm mốc sau 24 giờ nuôi cấy Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến khả năng 2 3.2 56 sinh tổng hợp chitosanase Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến hàm lượng 3 3.3 58 protein Ảnh hưởng của độ thoáng khí đến khả năng sinh tổng 4 3.4 59 hợp chitosanase 5 3.5 Ảnh hưởng của độ thoáng khí đến hàm lượng protein 60 Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến khả năng sinh 6 3.6 61 tổng hợp chitosanase 7 3.7 Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến hàm lượng protein 63 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến khả năng sinh tổng 8 3.8 65 hợp chitosanase 9 3.9 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống đến hàm lượng protein 66 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh 10 3.10 68 tổng hợp chitosanase 11 3.11 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hàm lượng protein 69 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ TT Sơ đồ Nội dung Trang Quy trình thủy phân chitosan để thu nhận oligomer 1 1.1 12 (Tokutake và cộng sự, 1986). ix
11. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Chitin, chitosan là polymer hữu cơ phổ biến trong thiên nhiên; trong động vật thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm lượng chitin chiêm tỷ lệ khá cao, từ 14-35% so với trọng lượng chất khô. Hiện nay chitin, chitosan và các dẫn xuất của chúng đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiêu lĩnh vực như trong nông nghiệp, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, y dược, Do dó, việc nghiên cứu sản xuât chitin, chitosan và các dẫn xuất của chúng đang là vấn đề được quan tâm nghiên cứu. Các sản phẩm từ các loài giáp xác trên toàn thế giới ước tính tới 1,9 triệu tấn mỗi năm, phần lớn các sản phẩm từ tôm được sản xuất từ các nước châu Á trong đó có Việt Nam. Mỗi năm ngành công nghiệp này thải ra 1,4 triệu tấn chất thải với chủ yếu là vỏ và đầu tôm. Phương thức xử lý phần thừa thông dụng hiện nay chủ yếu là đốt bỏ, thải ra biển hoặc tập kết đến nơi xử lý rác. Cách làm này làm ô nhiễm vượt mức cho phép tại các khu vực có kinh doanh khai thác chế biến các loại giáp xác. Ở nước ta, sản lượng phế phụ phẩm từ các nhà máy chế biến thủy hải sản là rất lớn. Theo ước tính mỗi năm riêng các nhà máy chế biến thủy, hải sản thải ra môi trường hơn 70 nghìn tấn phế liệu là vỏ tôm, cua các loại. Nếu các phế phẩm này được chế biến thành các sản phẩm có giá trị, ngoài việc mang lại nguồn lợi cao, nó còn góp phần giải quyết vấn đề ô nhiễm và các chi phí phát sinh trong quá trình xử lý chất thải. Chitin, chitosan có thể được thủy phân để tạo thành những chất có hoạt tính sinh học cao bằng phương pháp hóa học (acid HCl đậm đặc) hoặc bằng phương pháp sinh học (dùng các enzyme như papain, hemicellulase, ). Việc thủy phân chitin, chitosan bằng phương pháp hóa học có nhiều nhược điểm như chi phí cao, hiệu suất thấp, gây ô nhiễm môi trường, gây hao mòn máy móc thiết bị cao và quan trọng là sản phẩm thu được có hoạt tính không cao. Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất các dẫn suất thủy phân từ chitin và chitosan bằng phương pháp sinh học là một 1
12. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. hướng đi có nhiều triển vọng vì điều kiện phản ứng nhẹ, ít gây ô nhiễm môi trường và nhất là sản phẩm thu được có chất lượng tốt. Bên cạnh đó, nấm mốc là nguồn cung cấp hệ enzyme ngoại bào vô cùng phong phú, khả năng sinh trưởng mạnh trên các nguồn cơ chất khác nhau. Vì vậy, việc nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase trên nấm mốc là việc làm cần thiết nhằm giảm thiểu chi phí cho nguyên liệu, hóa chất và quan trọng là sẽ dễ dàng đưa vào ứng dụng sản xuất với điều kiện trong nước. Vì những lý do trên, tôi quyết định chọn đề tài “Bước đầu nghiên cứu thu nhận chitosanase từ Aspergillus spp.” trong khóa luận tốt nghiệp này. 2. Tình hình nghiên cứu Trong nước: + Bước đầu nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật từ Streptomyces griceus, Phạm Hồng Ngọc Thùy – Khoa chế biến trường đại học Nha Trang (03/2008). + Thu nhận và mô tả đặc tính của enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1, Nguyễn Thị Phương Nhung – Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội (2012). + Phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase từ mẫu đất ở Phước Long – Nha Trang; Nguyễn Trọng Thăng và Ngô Xuân Mạnh; Khoa Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội (2011). + Lâm Ngọc Tuyết, Đỗ Anh Tuấn, Nguyễn Đức Hoàng, Trần Linh Thước (2003), Tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa chitosanase trong E. Coli, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Hội nghị toàn quốc lần thứ 2, Nghiên cứu cơ bản trong Sinh học, Nông nghiệp và Y học, Bộ Khoa học và Công nghệ, Hội đồng Khoa học tự nhiên, Ngành Khoa học sự sống, Huế. + Cao Thị Ngọc Phượng, Ngô Phước Hậu, Đỗ Anh Tuấn, Trần Linh Thước, Jügen Pleiss (2003), Xây dựng cơ sở dữ liệu protein phục vụ nghiên cứu sinh 2
13. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. học: trường hợp chitinase và chitosanase, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc 2003, Bộ Khoa học và Công nghệ, Hội các ngành Sinh học Việt Nam, Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia, Hà Nội. Nước ngoài: + J. S. PRICE and R. STOCK; Production, Purification, and Characterization of an Extracellulase Chitosanase from Streptomyces; Journal of Bacteriology (12/ 1975). + Tamo Fukamizo, Yuji Honda, Sachio Goto, Isabelle Boucher and Ryszard Brzezinski; Reaction mechanism of chitosanase from Streptomyces sp. N174; Biochem. J. (1995). Great Britain. + Xiao-E Chen, Xu-Bo Fang và Wen-Sui Xia; Strain imvironment and optimization of the media composition of chitosanase-producing fungus Aspergillus sp. CJ 22-326; African Journal of Biotechnology Vol. 7 (14), 18 July, 2008. + Chih-Yu Cheng, Chu-Han Chang, Yue-Jin Wu, và Yaw-Kuen Li; Exploration of Glycosyl Hydrolase Family 75, a chitosanase from Aspergillus fumigatus; The Journal of Biological Chemistry Vol. 281, NO. 6, February 10, 2006. U.S.A. 3. Mục đích nghiên cứu - Nghiên cứu thu nhận chitosanase từ Aspergillus spp. - Làm phong phú thêm nguồn thu nhận chitosanase từ vi sinh vật. - Tận dụng nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu - Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chitosanase từ 5 chủng Aspergillus ban đầu, chọn ra chủng có khả năng sinh tổng hợp chitosanase cao nhất để tiến hành nghiên cứu. - Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình lên men. - Tiến hành nuôi cấy và xác định hoạt tính chitosanase của chủng được chọn trên môi trường tối ưu hóa. 3
14. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 5. Phương pháp nghiên cứu Trong nuôi cấy vi sinh vật, khả năng thuần cũng như khả năng sinh ra các hoạt chất cao của giống là yếu tố quyết định đến hiệu suất của quá trình. Vì vậy, trước khi thực hiện, cần tiến hành khảo sát từ 5 chủng mốc giống được cung cấp để chọn ra được chủng cho kết quả khảo sát tối ưu nhất trên môi trường thực hiện khảo sát. Sau khi đã chọn được chủng tiến hành nghiên cứu, thực hiện việc nghiên cứu đối với chủng được chọn trên các yếu tố môi trường ảnh hưởng lên khả năng sinh tổng hợp enzyme như: tỷ lệ cơ chất, độ ẩm, độ thoáng khí, tỷ lệ tiếp giống, thời gian nuôi cấy Trong các thí nghiệm này, thông số thay đổi là mức của các yếu tố và chỉ tiêu theo dõi chính là hoạt tính enzyme và hàm lượng protein thu được ở từng mức của yếu tố khảo sát. 6. Các kết quả đạt được của đề tài - Đã chọn ra được một chủng từ 5 chủng giống được cung cấp. - Đã tối ưu hóa được một số điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase. - Đã tiến hành nuôi cấy và xác định hoạt tính của enzyme trên môi trường đã tối ưu hóa. 7. Kết cấu của đồ án - CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU – nội dung chương đề cập đến các nội dung có liên quan đến đề tài nghiên cứu. - CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP – nội dung chương đề cập đến các dụng cụ thiết bị và đặc biệt là các phương pháp thực nghiệm dùng trong đồ án. - CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ – BIỆN LUẬN – nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề tài thực hiện được và đưa ra những biện chứng cho những kết quả thu được. 4
15. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. - CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ – nội dung chương tóm tắt lại những kết quả mà đề tài đạt được và đệ trình những phần cần thực hiện thêm của đề tài. 5
16. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 1.1. Đại cương về chitin và chitosan 1.1.1. Lịch sử phát hiện Chitin được Braconnot phát hiện lần đầu tiên vào năm 1811 trong cặn dịch chiết của một loại nấm và ông đã đặt tên là “fungine” để ghi nhớ nguồn gốc tìm ra nó. Năm 1823, Odier đã phân lập được một chất từ bọ cánh cứng và ông gọi là “chitin” hay “chitine” có nghĩa là lớp vỏ. Nhưng không phát hiện ra sự có mặt của Nitơ, cuối cùng cả Braconnot và Odier đều cho rằng cấu trúc của chitin giống cấu trúc của cellulose [3]. Năm 1929, Karrer đun sôi chitin với dung dịch KOH 5% trong 24 giờ và đun tiếp ở 160oC với kiềm bảo hòa trong 50 phút, ông thu được sản phẩm có phản ứng màu đặc trưng với thuốc thử, sản phẩm đó chính là chitosan [3]. Việc nghiên cứu về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất lý hóa và ứng dụng của chitosan đã được công bố từ những năm 30 của thế kỷ X. Nhật, Mỹ, Ấn Độ, Trung Quốc và Pháp là những nước đã thành công trong lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chitosan. Năm 1973, Nhật Bản là nước đầu tiên sản xuất chitosan thương phẩm với sản lượng 20 tấn/năm, hiện nay đã lên tới hơn 700 tấn/năm, Mỹ sản xuất trên 300 tấn/năm. Theo Know (1991), thị trường có nhiều triển vọng của chitin, chitosan là Nhật Bản, Mỹ, Anh, Đức. Nhật Bản được coi là nước dẫn đầu về công nghệ sản xuất và buôn bán chitin, chitosan. Theo như ước tính của các nhà phân tích, trong những năm tới sản lượng chitosan sẽ đạt tới 118000 tấn/năm, trong đó, Nhật và Mỹ là những nước sản xuất chính [1]. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và sản xuất chitin, chitosan và ứng dụng trong sản xuất phục vụ đời sống là một vấn đề tương đối mới mẻ. Vào những năm 1978 – 1980, trường đại học Thủy sản Nha Trang đã công bố quy trình sản xuất chitosan của tác giả Đỗ Minh Phụng. Điều này đã mở đầu bước ngoặc quan trọng trong việc nghiên cứu, tuy nhiên vẫn chưa có ứng dụng nào thực tế trong sản xuất [1]. 6
17. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 1.1.2. Phân bố và đặc điểm sinh hóa 1.1.2.1. Phân bố Chitin là một polymer hữu cơ phổ biến trong tự nhiên sau cellulose, được tổng hợp với năng suất trung bình là 20 g/năm/m2 bề mặt trái đất. Trong tự nhiên, chitin hiện diện ở động vật và thực vật. Ở động vật, chitin được tìm thấy trong lớp vỏ ngoài của tôm, cua và các loài giáp xác; là thành phần cấu trúc quan trọng của vỏ một số loài động vật không xương sống như côn trùng, nhuyễn thể và giun tròn. Ở thực vật, chitin có ở thành tế bào của nấm và một số tảo Chlorophiceae [11]. 1.1.2.2. Đặc điểm sinh hóa Chitin là chất rắn vô định hình, bền, không tan trong nước, acid, kiềm, cồn và các dung môi hữu cơ khác. Tuy nhiên, chitin cũng có thể bị thủy giải bởi acid vô cơ mạnh (HCl đậm đặc, H2SO4 đậm đặc, HF khan) hoặc bởi enzyme vi sinh vật [7]. Ngoài ra, chitin ít hiện diện ở trạng thái tự do, thường ở dạng phức hợp với các protein, CaCO3 và các hợp chất hữu cơ khác [3]. Chitin là polysaccharide mạch thẳng được cấu tạo từ các đơn phân N – acetyl glucosamine (GlcNAc), có thể xem như là dẫn xuất của cellulose, trong đó nhóm (– OH) ở C2 được thay thế bằng nhóm acetyl amino (-NHCOCH3). Như vậy, chitin là poly N – acetyl – 2 – amino – 2 – deoxy – β – D – glucopyranose liên kết với nhau bởi các liên kết 1,4 – β – glycoside. Trong đó, các mắc xích của chitin cũng được đánh số như glucose [3]. Công thức phân tử: [C8H13NO5]n Mchitin = (203,186)n Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitin 7
18. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. Phụ thuộc vào nguồn gốc đặc điểm từng vùng, chitin có hai loại cấu trúc đặc trưng, gọi là dạng α và β. Sự khác nhau giữa hai dạng này được nhận biết bằng các phương pháp phổ nghiệm như phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) chụp trạng thái rắn kết hợp với phân tích nhiễu xạ tia X (XRD). Dạng thứ ba ít phổ biến hơn là γ – chitin, nhưng xuất phát từ các số liệu phân tích, theo một số nhà phân tích thì dạng thứ ba chỉ là một dạng khác trong cấu trúc của α – chitin. α – chitin là dạng phổ biến nhất trong tự nhiên, nó có mặt trong vỏ tôm, cua, các loài nhuyễn thể là thức ăn của cá voi và trong biểu bì của các loại côn trùng hiếm hơn là dạng β – chitin, được tìm thấy trong protein của mực ống [7]. Chitin là một nguyên liệu bền, giúp các loài giáp xác chống lại các tác nhân gây hại và áp suất của môi trường. Để thủy phân hoàn toàn chitin, vi sinh vật có khả năng thủy phân chitin hầu hết đều có một hệ gồm 2 loại enzyme thủy phân là chitinase và chitobiase (β – N – acetylglucosaminidase hoặc β – N – acetylhexosaminidase) [13]. Chitosan là dẫn xuất deacetyl hóa của chitin, trong đó nhóm (–NH2) thay thế nhóm (–NHCOCH3) ở vị trí C2. Chitosan có cấu trúc mạch thẳng được hình thành từ các đơn phân D – glucosamin liên kết với nhau bằng liên kết 1,4 – β – glycoside, do vậy chitosan có thể gọi là poly 1,4 – β – 2 – amino – 2 – deoxy – D – glucose hay poly 1,4 – β – D – glucosamin. Công thức phân tử: [C6H11NO4]n Mchitosan = (161,151)n Hình 1.2. Công thức cấu tạo của chitosan. Chitosan được tạo thành từ quá trình hóa học hay enzyme đều không bị khử hoàn toàn nhóm acetyl. Tỷ lệ acetyl còn lại trong chitosan khác nhau tùy theo 8
19. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. phương pháp khử acetyl và tính nhạy cảm của enzyme. Sự phân bố N – acetyl glucosamine (GlcNAc) và glucosamine (GlcN) trên mạch chitosan cũng ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme thủy phân chúng. Chitosan có hai dạng dị liên kết là GlcNAc- GlcN, GlcN – GlcNAc và hai đồng liên kết là GlcNAc – GlcNAc, GlcN – GlcN. Do vậy, sự thủy phân các liên kết này trong chitosan bằng enzyme cũng khác nhau [13]. Trên thực tế thường có mắt xích chitin đan xen trong mạch cao phân tử chitosan (khoảng 10%). Vì vậy, công thức chính xác của chitosan được thể hiện như Hình 1.3, trong đó tỷ lệ m/n phụ thuộc vào độ deacetyl hóa chitin [8]. Hình 1.3. Công thức biểu diễn công thức chính xác của chitosan. Độ deacetyl hóa – DD (Degree of deacetylation), là tỷ lệ thay thế nhóm – NHCOCH3 bằng nhóm –NH2 trong phân tử chitin (Hình 1.4.). Nếu DD < 50% thì là chitin, DD ≥ 50% thì là chitosan [7]. Hình 1.4. Cơ chế xúc tác của chitosanase trong phản ứng phân cắt chitosan Độ deacetyl hóa có thể được xác định dựa vào: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (H – NMR). 9
20. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. Phổ hồng ngoại IR. Chưng cất chitin, chitosan với acid phosphoric Phản ứng tạo màu với ninhydrin. Xác định theo Nitơ [32]. Khi hòa tan trong dung dịch acid acetic loãng sẽ tạo thành dung dịch keo dương, nhờ đó mà không bị tủa khi có mặt một số ion kim loại nặng như: Pb2+, Hg+ chitosan là một polymer mang điện tích dương nên được xem là một heteropolymer của “polycation”, có khả năng bám dính trên bề mặt có điện tích âm như protein, amino polysaccharide (alginate), acid béo và phospholipid nhờ sự có mặt của nhóm amino (-NH2) [12]. Trong khi hầu hết các polysaccharide trong tự nhiên như cellulose, dextran, pectin, agar, agarose đều trung tính hay có tính acid thì chitosan (chitin) lại có tính base cao [32]. Nhiệt độ nóng chảy của chitosan là 309 – 311oC. Trọng lượng phân tử chitosan thay đổi từ vài kDa đến hơn hai ngàn kDa, tùy thuộc vào nguồn gốc của chúng. Trong tự nhiên, chitosan được tìm thấy trong vách tế bào một số loài nấm như Zygomycetes, trong tảo lục Chlorella sp., cũng như trong lớp vỏ của côn trùng, tôm, cua [33]. 1.1.3. Phương pháp thu nhận Chitosan và oligomer từ Chitin Nguyên liệu giàu chitin có nguồn gốc từ các loài giáp xác như: tôm, cua, mực, sam được rửa sạch, sấy khô, xay nhỏ và ngâm trong dung dịch acid loãng (HCl 6 – 12%) để loại bỏ các khoáng canxi và tạp chất. Hỗn hợp này được nấu với dung dịch NaOH loãng (8 – 15%) để loại các protein tạp; sau đó ngâm lần lượt trong các hỗn hợp dung dịch KMnO4 0,5% và H2SO4 10% (1:1), oxalic acid 3% để tẩy màu, thu nhận sản phẩm là chitin. Để thu nhận được chitosan thì phải qua quá trình khử nhóm acetyl của chitin bằng cách đun với dung dịch NaOH (40 – 50%) [9]. Việc thủy phân chitin thành oligomer có thể được thực hiện bằng phương pháp dùng acid [29], enzyme [3]. Sự thủy phân mạch polysaccharide của chitosan bằng acid sẽ cắt đứt các liên kết glycoside giữa các phân tử đường D – glucosamin 10
21. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. tạo ra một hỗn hợp các đoạn oligomer. Một số loại acid mạnh như acid hydrochloric, acid nitric, acid phosphoric và hydrogen fluoride đã được sử dụng để thủy phân chitosan tạo oligomer ở các nồng độ và thời gian thủy phân khác nhau (Bảng 1.1.). Bảng 1.1. Các phương pháp hóa học được sử dụng để tạo các oligomer của chitosan [9]. Nồng độ acid Nhiệt độ phản Thời gian Acid phản ứng ứng (oC) phản ứng Hydrochloric 35% 53 48 giờ 11% 100 34 giờ 35% 80 2 giờ 1% 100 5 giờ 35% 72 1 giờ Nitric 0,4 mM 37 15 giờ 70 mM 0 9 giờ Phosphoric 60% 70 4 giờ 85% 37 4 tuần Hydrogen fluoride 100% 20 19 giờ Các oligomer có kích thước mong muốn sẽ được phân đoạn và thu nhận bằng các phương pháp sắc ký trao đổi ion, HPLC và lọc gel. Tuy nhiên, những phương pháp này khó có thể áp dụng ở quy mô lớn, cũng như rất khó để tách được các oligomer có kích thước lớn. Ngoài sắc ký, phương pháp tủa các oligomer có trọng lượng phân tử lớn ở nhiệt độ thấp cũng đã được nghiên cứu và sử dụng [20]. Quy trình thủy phân chitosan bằng HCl 35% trong 3 giờ ở 80oC được đề nghị bởi Tokutake và cộng sự (1986) hiện được sử dụng khá phổ biến. Nguyên tắc cơ bản của quy trình này là dùng acid mạnh để thủy phân chitosan trong một thời gian nhất định để tạo ra hỗn hợp chitosan polymer và chitosan oligomer. Sau đó dùng phương pháp tủa phân đoạn để thu nhận các sản phẩm chitosan oligomer tinh sạch có các kích thước khác nhau (Sơ đồ 1.1.). 11
22. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. Sơ đồ 1.1. Quy trình thủy phân chitosan để thu nhận oligomer (Tokutake và cộng sự, 1986). Các phương pháp hóa học kể trên thường làm thay đổi trọng lượng phân tử, mức độ acetyl hóa sản phẩm và thoái biến những protein có giá trị dinh dưỡng cao 12
23. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. trong nguyên liệu, đồng thời tạo những sản phẩm phụ gây ô nhiễm môi trường. Vì vậy, những quy trình khử khoáng và khử acetyl của chitin từ nguyên liệu giàu chitin bằng enzyme cũng đã và đang được quan tâm nghiên cứu. Hiệu quả khử protein bằng enzyme tùy thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu vỏ giáp xác và điều kiện tiến trình xử lý. Xử lý nhẹ nguyên liệu vỏ giáp xác bằng enzyme có thể loại bỏ 90% protein và carotenoid, sản phẩm carotenoprotein tạo thành này thường dùng làm chất bổ sung cho thức ăn gia súc [48]. Chitin và chitosan ở trạng thái rắn đều bị thủy phân bằng acid (như: HCl, HF, H3PO4 ) ở nồng độ cao. Thủy phân bằng enzyme đòi hỏi mức độ hòa tan cao của cơ chất trong môi trường. Sự phân cắt ngẫu nhiên nội mạch sẽ tạo những sản phẩm oligomer đa dạng. Phản ứng thủy phân chitosan bằng enzyme có tính đặc hiệu cơ chất (theo nhóm acetyl) nên vị trí phân cắt do thủy phân có thể được điều khiển tạo các chitooligosaccharide được quan tâm nhiều trong các ứng dụng thực tiễn. Vì độ hòa tan trong dung dịch của chitosan thường thấp nên nồng độ chitooligosaccharide tạo ra cũng thấp. Như vậy, việc nghiên cứu enzyme có khả năng thủy phân chitosan hòa tan ở pH thấp vừa mang lại hiệu quả về kinh tế vừa an toàn với môi trường hiện đang là một thách thức lớn cho các nhà nghiên cứu [8]. 1.1.4. Ứng dụng của Chitosan và các dẫn xuất thủy phân từ Chitosan Những nghiên cứu gần đây cho thấy chitin, chitosan và những dẫn xuất của chúng được ứng dụng nhiều trong các ngành hóa học, công nghệ sinh học, y học, thú y, nha khoa, nông nghiệp, chế biến thực phẩm và bảo vệ môi trường Những ứng dụng này chủ yếu dựa trên các đặc tính đặc biệt của sản phẩm dẫn xuất như: có sự hiện diện của những nhóm chức phản ứng, có khả năng tạo thành dạng gel, khả năng bám hút cao, kháng nấm và vi khuẩn, kháng ung thư và khả năng phân hủy sinh học [41] Trong lĩnh vực y học, chitin và chitosan được xem là những vật liệu sinh học được định nghĩa là “vật liệu tương tác” có khả năng tương thích với mô tế bào xung quanh và không tạo ra đáp ứng đào thải của vật chủ [54]. Do đó, chitin và chitosan có một số các ứng dụng sau: 13
24. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. - Nguyên liệu làm chỉ phẫu thuật tự hủy: Đại học Delaware Mỹ đã chế tạo thành công chỉ phẫu thuật tự hủy từ chitosan. - Chitin làm tăng mức kéo giãn của vị trí mổ ở chuột và thỏ. Chitin nguyên chất xúc tiến khả năng lành vết thương và không gây phản ứng phụ bất lợi [54]. - Tạo da nhân tạo: da nhân tạo làm từ chitin được gọi là Beschitin W, giống như một tấm vải và được bọc ốp lên vết thương chỉ một lần cho đến khi vết thương lành. Tấm Beschitin W sẽ tự phân hủy sinh học cho đến khi lớp biểu bì mới ở vết thương hình thành. Da nhân tạo từ chitin có tác dụng giảm đau, giúp cho các vết sẹo bỏng phục hồi nhanh chóng. - Chitosan có đặc tính tăng cường tính thấm, tính bám dính sinh học và một số đặc tính lý – hóa khác nên có thể được dùng làm chất tải trong thuốc nhỏ mắt (hệ thống dạng gel chitosan hay những phần tử có kích thước nano), trong sản xuất thuốc trị viêm loét dạ dày, tá tràng [12]. - Một số thử nghiệm trên động vật nhỏ như chuột, chó cho thấy chitosan có khả năng tăng cường hiệu quả trên các vết thương ở mạch máu, da, xương điều này cho thấy, khi sử dụng làm vật liệu sinh học, chitosan đều đạt các thử nghiệm an toàn về khả năng không gây đột biến, gây độc cấp tính, mãn tính, gây sốt Tuy có nhiều tiềm năng, nhưng trong thực tế có rất ít các sản phẩm từ chitin và chitosan đạt được đầy đủ các yêu cầu của một vật liệu sinh học thương mại. Một nguyên nhân chính gây khó khăn cho việc sản xuất nguyên liệu sinh học từ chitin và chitosan là khả năng hòa tan kém của chúng trong điều kiện ôn hòa [54]. - Chitosan còn có hiệu quả ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Ouchi và cộng sự (1991) đã kết hợp chitosan hay chitosamino – oligosaccharide (COS) vào 5-fluorouracil (5FU) tạo thành hệ đại phân tử có hiệu quả kháng ung thư mạnh [50]. - Chitobiose và chitotriose có hoạt tính kháng oxy hóa in vivo ở đường tiêu hóa trên chuột. Chúng ức chế sự thủy phân benzoate thành salicylate bởi H2O2 với sự hiện diện của Cu2+, trong khi glucosamine và N – acetylchito – oligosaccharide (di – N – acetylchitobiose và tri – N – acetylchitotriose) không có biểu hiện hoạt tính ức chế này. Chitobiose và chitotriose có hiệu lực lọc sạch những gốc hydroxyl. 14
25. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. Chitobiose còn có khả năng lọc sạch các gốc superoxide sinh ra bởi hệ thống thử nghiệm (không dùng enzyme) sử dụng phenazine methosulfate và NADH [15]. Trong lĩnh vực công nghiệp, chitosan và các dẫn xuất thủy phân có một số ứng dụng như sau [30]: - Xử lý nước thải, làm sạch môi trường: loại bỏ các cặn bã và các kim loại độc hại như: Ag+, Pb2+, Cu2+, Ni2+, Cadmium, Chromium - Công nghiệp giấy: sản xuất giấy chịu nhiệt, giấy hoa dán tường. Do cấu trúc tương tự như cellulose nên việc bổ sung chitosan vào nguyên liệu làm giấy có tác dụng làm tăng độ bền dai của giấy và tăng độ nét khi in. - Công nghiệp dệt: dùng chất phối trộn để giữ màu hoa vải, sản xuất vải, vải chịu nhiệt, vải chống thấm. - Công nghiệp hóa mỹ phẩm: chitosan được dùng làm thành phần sản xuất kem chống khô da dựa vào tính chất dễ cố định trên biểu bì da nhờ các nhóm NH4+. Sản xuất kem dưỡng da chống nắng dựa vào khả năng ngăn các chất lọc tia cực tím của các nhóm NH4+. - Công nghiệp thực phẩm: chitosan được dùng để tạo màng mỏng bao gói bảo quản thực phẩm; tẩy lọc nguồn nước trong các nhà máy chế biến; khử màu các sản phẩm thẫm màu như: dầu cá, nước mắm xuất khẩu ; được dùng làm các chất giảm béo do có khả năng gắn với các chất béo trong dạ dày tạo thành phức hợp có kích thước lớn khó hấp thu được. - Công nghệ sinh học: chitosan được dùng làm giá thể để cố định enzyme và cố định tế bào dùng trong công nghiệp, y học và khoa học phân tích. Trong lĩnh vực nông nghiệp, chitosan được dùng để bao bọc hạt giống ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất, dùng để cố định phân bón, thuốc trừ sâu, tăng cường khả năng nẩy mầm của hạt. Dẫn xuất thủy phân của các chitosan ở dạng hỗn hợp các oligomer của đường D – glucosamin cũng có nhiều ứng dụng đặc biệt trong ngành y dược. Các dẫn xuất này được sử dụng riêng rẽ hoặc kết hợp với các chất có hoạt tính sinh học khác như các vitamin, acid succinic, taurine [30] Một số tác dụng của các dẫn xuất thủy phân từ chitosan [30] là: 15
26. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. - Ngăn chặn sự tích lũy các tế bào mỡ trong các cơ quan nội tạng, sự tác động tiêu cực của rượu lên gan. - Hoạt hóa chức năng gan, loại bỏ mỡ trong gan. - Giảm hàm lượng đường và cholesterol trong máu. - Thúc đẩy sự tiêu hóa các nguyên tố vi lượng như Fe2+, Ca2+ - Kích hoạt hệ thống miễn dịch, ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Các đặc tính tan tốt trong nước, có tác dụng chữa lành vết thương và giữ ẩm tốt của các dẫn xuất này là cơ sở để ứng dụng trong lĩnh vực mỹ phẩm (kem dưỡng da, keo xịt tóc, son môi, mascara, dầu gội ). 1.2. Đại cương về hệ enzyme Chitosanase 1.2.1. Định nghĩa Chitosanase là hệ enzyme thuộc nhóm thủy phân (hydrolase), xúc tác cho phản ứng phân cắt các liên kết β – 1,4 – glycoside giữa N – acetyl – D – glucosamin và D – glucosamin (hay giữa các D – glucosamin) trong phân tử chitosan. Mã số enzyme của chitosanase là EC 3.2.1.132 [47, 56]. Chitosanase thu nhận từ các nguồn khác nhau sẽ có hoạt động phân cắt cơ chất khác nhau tùy thuộc vào mức độ acetyl hóa của cơ chất. Hầu hết các chitosanase thuộc loại enzyme phân cắt nội mạch polymer, do đó các sản phẩm tạo thành chủ yếu là các dimer, trimer, tetramer hoặc các đoạn oligomer của chitosan [47]. 1.2.2. Nguồn gốc và phân loại Chitosanase hiện hiện rộng rãi ở nhiều loài sinh vật khác nhau như: xạ khuẩn (Streptomyces N174), nấm (Penicillium islandicum, Fusarium solani), thực vật (Hordeum vulgare) [26] và một số loài vi khuẩn (Myxobacter AL – 1, Amycolaptosis sp., Enterobacter sp.) [39]. Hầu hết các loài vi khuẩn và nấm đều tiết ra chitosanase ngoại bào [36]; chitosanase nội bào được tìm thấy ở thực vật và các loài nấm Zygomycete [43]. Việc phân loại chitosanase hiện nay vẫn còn là vấn đề đang bàn luận và cũng chưa biết chính xác là có bao nhiêu loại chitosanase hiện diện trong tự nhiên. Tuy 16
27. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. nhiên, các nhà enzyme học cũng đã tiến hành phân loại dựa trên cơ sở trình tự gen và các đặc tính cơ bản của chitosanase. Dựa vào tính tương đồng của các trình tự gen mã hóa cho chitosanase ở các loài khác nhau mà các nhà nghiên cứu đã xếp các enzyme này vào 5 họ của enzyme thủy phân liên kết glycoside là 5, 8, 46, 75 và 80. Trong số này, họ 46 chứa nhiều chitosanase nhất. Các chitosanase thuộc họ 46 và 80 đều là những enzyme thủy phân cơ chất đường, có hai vị trí amino acid ở trung tâm xúc tác phản ứng là glutamic acid và aspartic aicd [30]. Các enzyme trong họ này được sắp xếp như trong Bảng 1.2. [56]. Trong khi đó, Họ 5, 8 và 75 chứa một số enzyme chitosanase đặc trưng như: - Họ 5: hai enzyme ChoI và ChoII có nguồn gốc từ Streptomyces griseus HUT 6037, đều là những enzyme xúc tác phản ứng transglycosyl [49]. - Họ 8: tiêu biểu là các chitosanase từ Bacillus sp. No. 7M (chỉ phân cắt liên kết GlcN – GlcN), Bacillus circulans WL – 12 và Paenibacillus fukuinensis. Ngoài ra họ này còn gồm một số cellulase và endoxylanase. - Họ 75: gồm các chitosanase có nguồn gốc từ Aspergillus oryzae, Aspergillus fumigatus hay Metarhizium anisopliae [31]. Ngoài ra, chitosanase ở vi sinh vật còn được phân loại dựa trên vị trí cắt đặc hiệu của chitosanase đối với cơ chất chitosan [31]: - Nhóm I: gồm các chitosanase thủy phân các mối liên kết GlcN – GlcN và GlcNAc – GlcN (Streptomyces sp. N174). - Nhóm II: các chitosanase thủy phân liên kết GlcN – GlcN (Bacillus sp. No. 7 – M). - Nhóm III: các chitosanase thủy phân các mối liên kết GlcN – GlcN và GlcN – GlcNAc (Bacillus circulans MH – K1). 17
28. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. Bảng 1.2. Các chitosanase trong Họ 46 thuộc enzyme thủy phân liên kết glycoside [9]. Ký hiệu chitosanase Tên loài STR_N174 Streptomyces sp. strain N174 NOC_N106 Norcadioides sp. strain N106 AMY_CS02 Amycolatopsis sp. strain CsO-2 STR_COEL1 Streptomyces coelicolor A3(2) STR_COEL2 Streptomyces coelicolor A3(2) BAC_SUBT Bacillus subtilis BAC_AMYL Bacillus amyloliquefaciens BAC_KFB Bacillus KFB-C04, Bacillus sp. strain CK4 PBCV-1 Chlorella virus PBCV-1 CVK2 Chlorella virus CVK2 BAC_EHIM Bacillus ehimensis BAC_COA Bacillus coagulans BUR_GLAD Burkholderia gladioli BAC_CIRC Bacillus circulans MH-K1 Sự khác biệt giữa chitosanase, chitinase, lysozyme và N – acetyl – β – D – glucominidase cũng không rõ nét. Cả chitosanase và chitinase đều có khả năng thủy phân một số loại chitosan với các mức độ acetyl hóa khác nhau. Tuy nhiên, chitinase thường hoạt động trên cơ chất có tỷ lệ nhóm N – acetyl cao hoặc trên chitosan có tỷ lệ khử nhóm N – acetyl thấp (20 – 45%), trong khi chitosanase không hoạt động trên cơ chất có tỷ lệ nhóm N – acetyl cao [10]. Ngoài ra, chitosanase còn được phân biệt với chitinase ở đặc điểm có phân tử lượng thấp hơn (khi điện di trên gel SDS – PAGE trong điều kiện không có chất khử) và có tính đặc hiệu cơ chất [25]. 18
29. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 1.2.3. Các đặc tính cơ bản của hệ enzyme chitosanase 1.2.3.1. Trọng lượng phân tử Các chitosanase có nguồn gốc từ các loài khác nhau có trọng lượng phân tử khác nhau. Đa số đều có trọng lượng phân tử thấp, dao động từ 10 – 50 kDa. Tuy nhiên, chitosanase của Rhodotorula gracilis có trọng lượng phân tử đến 100 kDa và của Mucor rouxii ChoA là 76 kDa. Trọng lượng phân tử của các chitosanase của vi khuẩn thì dao động trong khoảng từ 23 – 50 kDa, chitosanase từ các loài thực vật có trọng lượng phân tử dao động trong khoảng từ 10 – 23 kDa [47]. Bảng 1.3. Trọng lượng phân tử chitosanase thu nhận từ các loài khác nhau [8]. Trọng lượng Phương pháp Loài Tài liệu tham khảo phân tử (kDa) xác định Mucor rouxii (enzyme A) 79 Lọc gel Alfonso, C. (1992) Mucor rouxii (enzyme B) 63 Lọc gel Alfonso, C. (1992) Macrotermes estherae 35 (40) - Aruchami, M. (1982) (mối thợ) Bacillus sp. R-4 31 Lọc gel Tominaga, Y. (1975) Macrotermes estherae 31 - Aruchami, M. (1982) (mối đực và mối cái có cánh) Penicillium islandicum 30 Lọc gel Fenton, D.M. (1981) Bacillus sp. No. 7-M 30 Lọc gel Uchida, Y. (1988) Từ trình tự Bacillus circulans 29,5 Ando, A. (1992) nucleotide Streptomyces sp. 29 Lọc gel Price, J.S. (1975) Bacillus circulans 27 Lọc gel Yabuki, M. (1988) Amycolatopsis sp. 27 Lọc gel Okajima, S. (1994) Bacillus sp. PI-7S 25 Lọc gel Seino, H. (1991) Streptomyces griceus 10 Lọc gel Ohtakara, A. (1988) (-): không có thông tin về phương pháp xác định trọng lượng phân tử. 1.2.3.2. Tính đặc hiệu cơ chất Cơ chất của chitosanase chủ yếu là chitosan và các dẫn xuất như glycol chitosan, carboxymethyl chitosan và chitosan dạng keo. Ngoài ra, một số loại chitosanase có khả năng thủy phân cơ chất là chitin và carboxymethyl cellulose (CMC). 19
30. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. Có rất nhiều dạng chitosanase được tìm thấy từ các loài sinh vật khác nhau như Bacillus, Streptomyces, Citrus có tính đặc hiệu cơ chất khác nhau. Ví dụ: chitosanase từ Myxobacter AL – 1 [27], S. griceus [40], Bacillus sp. No. 7 – M và Bacterium K – 1 [45] thủy phân được cả chitosan và CMC. Chitosanase từ B. megaterium, F. solani và M. rouxii có thể thủy phân chitosan, một phần CMC và chitin. Enzyme của Enterobacter sp. G – 1 có hoạt tính trên cả chitosan và chitin [46]. Giải thích về tính đặc hiệu cơ chất, Schindler (1977) đã đưa ra giả thuyết về những thay đổi trong cấu trúc cơ chất theo thời gian tiến hóa có thể ảnh hưởng đến sự hình thành những vị trí hoạt động khác nhau của enzyme (ví dụ lysozyme). Do đó, ở mỗi loài, enzyme có thể có tính đặc hiệu đối với cơ chất tự nhiên khác nhau. 1.2.3.3. Đặc tính thủy phân Chitosanase chỉ thủy phân cơ chất chitosan mà không thủy phân chitin do không có khả năng phân cắt liên kết GlcNAc – GlcNAc. Enzyme này phần lớn chỉ tác động lên những cơ chất có tỷ lệ nhóm acetyl dưới 60% [22]. Chitosanase từ các loài vi sinh vật đã thể hiện các đặc điểm thủy phân khác nhau, tùy thuộc vào độ lớn của phân tử và độ deacetyl hóa cơ chất. Chitosanase từ B. circulans MH – K1 và Streptomyces N – 174 có thể xúc tác sự thủy phân các cơ chất chitosan có mức độ acetyl hóa khác nhau [36]. Ngược lại, chitosanase từ F. solani và N. orientalis chỉ có thể hoạt động tối ưu trên chitosan có mức acetyl hóa là 30%. Đặc biệt, chitosanase của B. circulans MH – K1 thủy phân tốt chitosan có độ deacetyl hóa 80%. Chitosanase ở loài Enterobacter sp. G – 1 có khả năng thủy phân chitin và chitosan ở dạng keo có mức độ deacetyl hóa khoảng 80% nhưng không thủy phân chitosan dạng keo 100% deacetyl hóa và oligomer (dimer – hexamer) [36]. Đặc tính phân cắt của chitosanase tương tự như những enzyme thuộc nhóm thủy phân cơ chất đường với một cặp amino acid đóng vai trò xúc tác và sự tham gia của các cặp carboxylic acid mạch bên [22]. 20
31. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 1.2.3.4. Đặc tính động học Trong tất cả các phản ứng enzyme, khi các điều kiện khác được giữ cố định thì tốc độ phản ứng tùy thuộc vào nồng độ enzyme và nồng độ cơ chất. Hằng số Km (hằng số Michaelis) và Vmax của chitosanase thay đổi tùy thuộc vào nguồn gốc của enzyme và cơ chất thủy phân. Hầu hết các chitosanase tinh sạch xúc tác cho một loại phản ứng phân cắt nội mạch chuyên biệt. Vận tốc phản ứng tùy thuộc vào mức độ khử acetyl của chitosan cũng như lượng acetyl hòa tan trong môi trường phản ứng [51]. Hằng số Km và Vmax của một số chitosanase vi sinh vật tiêu biểu được trình bày trong Bảng 1.3. Bảng 1.4. Đặc điểm thủy phân của một số chitosanase vi sinh vật [9] Mức acetyl Mức acetyl Nguồn gốc hóa của cơ hóa tối ưu Vị trí cắt chitosanase chất (%) (%) Streptomyces N-174 1 – 60 1 – 21 - Cắt liên kết GlcN-GlcN Nocardia orientalis 0 – 41 30 hoặc GlcNAc Bacillus circulans 0 – 60 20 - Bacillus sp. P1-7S 0 – 70 1 - Bacillus pumilus 25 – 35 - Cắt liên kết GlcN-GlcN Cắt liên kết GlcNAc- Enterobacter sp. G-1 20 20 GlcNAc Penicillium islandicum 0 – 80 30 -60 Cắt liên kết GlcNAc-GlcN (-): không có thông tin Bảng 1.5. Hằng số Michaelis và Vmax của chitosanase ở một số loài tiêu biểu [9] Nguồn gốc K Cơ chất đặc Tài liệu tham m V chitosanase (mg/ml) max hiệu khảo Ohtakara và Streptomyces griseus 2,1 96,5 U/mg Chitosan, CMC cộng sự (1984) 0,75 Hedges, Wolfe Myxobacter AL-1 0,3 Chitosan, CMC μmol/phút (1974) Pelletier, Bacillus megaterium 0,82 286,3 U/mg Chitosan, CMC Sygusch P1a (1990) Fenton, Penicillium 2,7 1,4 Chitosan Eveleigh islandicum μmol/phút (1981) 21
32. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 1.2.3.5. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên hoạt động của chitosanase Sự thay đổi về pH trong môi trường hoạt động của chitosanase sẽ gây ra một số tác động như sau: - Có thể làm thay đổi sự ion hóa những nhóm chức có vai trò xúc tác trong phản ứng thủy phân. - Thay đổi sự ion hóa những nhóm chức có vai trò trong việc gắn cơ chất. - Làm biến tính enzyme. Mỗi loại chitosanase đều có pH và nhiệt độ tối ưu riêng cho phản ứng thủy phân cơ chất. Nói chung, pH tối ưu của các chitosanase dao động từ pH 4,0 – 8,0 và phụ thuộc vào loại cơ chất được sử dụng. Trị số pH tối ưu của chitosanase từ các loài Myxobacter AL – 1, Streptomyces griseus và Bacterium K – 1 lần lượt là 5,0; 6,5 và 5,0 khi sử dụng cơ chất là CMC. Mặt khác, tính bền pH của chitosanase cũng khác nhau tùy loài. Chitosanase từ Streptomyces spp. thường trong khoảng 4,5 – 8,0; của Bacillus spp. là 3,3 – 11; Penicillium islandicum, Nocardia orientalis, Pseudomonas sp. H-14, Enterobacter sp. G-1 và Rh. gracilis CFR-1 là 3,5 – 7,0 (Bảng 1.5). Chitosanase của Penicillium islandicum có hai khoảng pH giới hạn là pH 4,5 – 6,8 và pH 7,1 – 8 đối với cơ chất hòa tan glycol chitosan [24]. Điểm đẳng điện (pI) thay đổi từ 4 – 10,1 tùy thuộc nguồn gốc của chitosanase. Hoạt tính của đa số chitosanase sẽ nhanh chóng bị ức chế khi giá trị pH của dung dịch phản ứng dưới 4,0. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của chitosanase trong khoảng 40 – 65oC. Nhiều enzyme có nhiệt độ tối ưu lên đến trên 50oC (Bảng 1.6). Đa số chitosanase mất khoảng 40 – 50% hoạt tính ở nhiệt độ 50 – 60oC sau 30 – 60 phút. Tuy vậy, một số chitosanase chịu nhiệt từ Bacillus có khả năng hoạt động trong khoảng nhiệt độ từ 60 – 100oC [28]. 22
33. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. Bảng 1.6. Giá trị pH tối ưu của một số chitosanase [24]. pH tối ưu Tên loài Tài liệu tham khảo 8,0 Streptomyces griseus Ohtakara, A. (1988) 6,5 Streptomyces griseus Ohtakara, A. (1988) 6,5 Bacillus circulans Yabuki, M. (1988) 6,2 Macrotermes estherae Aruchami, M. (1982) 5,8 Macrotermes estherae Aruchami, M. (1982) 5,6 Bacillus sp. Tominaga, Y. (1975) 5,6 Fusarium solani Shimosaka, M. (1993) 5,5 Streptomyces sp. Boucher, I. (1992) 5,3 Macrotermes estherae Aruchami, M. (1982) 5,0 Mucor rouxii Alfonso, C. (1992) 5,0 Citrus sinensis Osswald, W. F. (1991) 5,0 Nocardia orientalis Sakai, K. (1991) 4,9 Macrotermes estherae Aruchami, M. (1982) 4,5 Penicillium islandicum Fenton, D. M. (1981) 4,5 Streptomyces sp. Price, J. S. (1975) 4,0 Pseudomonas sp. Yoshihara, K. (1992) 23
34. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. Bảng 1.7. Nhiệt độ tối ưu của một số chitosanase [24] Nhiệt độ tối ưu Loài Ghi chú Tài liệu tham khảo (oC) 65 Streptomyces sp. - Boucher, I. (1992) 60 Streptomyces sp. - Price, J. S. (1975) 55 Mucor rouxii Enzyme A Alfonso, C. (1992) 55 Amycolatopsis sp. ở pH 5,3 Okajima, S. (1994) 50 Bacillus sp. - Uchida, Y. (1988) 50 Bacillus circulans ở pH 6,5 Yabuki, M. (1988) 50 Mucor rouxii Enzyme B Alfonso, C. (1992) 50 Bacillus megaterium Enzyme A Pelletier, A. (1990) 50 Nocardia orientalis - Sakai, K. (1991) 50 Enterobacter sp. - Yamasaki, Y. (1993) Penicillium Fenton, D. M. (1981) 45 - islandicum 40 Bacillus sp. - Tominaga, Y. (1975) Fusarium solani Shimosaka, M. 40 - (1993) (-): không có thông tin 1.2.3.6. Chất hoạt hóa và chất ức chế Chất hoạt hóa là những chất có khả năng làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme hoặc làm cho enzyme không hoạt động trở thành hoạt động [8]. Các chitosanase khác nhau có thể được hoạt hóa bằng các chất khác nhau. Các ion kim loại (Mn2+, K+, Ca2+ ) và một số hợp chất (EDTA ) đều có khả năng hoạt hóa chitosanase [2]. Ngược lại, một số ion kim loại có tác dụng ức chế hoạt động của chitosanase, chủ yếu là các ion Hg2+, Cu2+, Pb2+, Zn2+, Sn2+, Ni2+, Ag+, Fe2+ Chitosanase cũng có thể bị ức chế bởi một số hợp chất như para – chloromercuribenzoate, N – bromosuccinimide [36]. 1.2.4. Cảm ứng tổng hợp, tinh chế và xác định hoạt tính chitosanase 1.2.4.1. Cảm ứng sinh tổng hợp chitosanase Hầu hết các loài vi sinh vật có khả năng tạo ra enzyme chitosanase đều có sự cảm ứng dể sinh tổng hợp nên enzyme này. Ở chủng Streptomyces N – 174, chitosanase được cảm ứng sinh tổng hợp trong môi trường có chứa chitosan, hoặc 24
35. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. D-glucosamin như là nguồn cacbon duy nhất [14]. Chitosanase từ Bacillus circulans [18] và Amycolatopsis CsO – 2 [41] được cảm ứng tổng hợp bởi chitosan. Ở Streptomyces sp. N6, D – glucosamin cũng có vai trò là chất cảm ứng tổng hợp chitosanase nếu được bổ sung vào môi trường cùng với glucose ở giai đoạn tăng trưởng tế bào. Tuy nhiên, nồng độ D – glucosamin tối ưu cho sự cảm ứng sinh tổng hợp chitosanase là 0,05 M; ở nồng độ lớn hơn 0,1 M, D – glucosamin sẽ có tác dụng ức chế. Galactosamin cũng có hoạt tính cảm ứng nhẹ, nhưng các đường mannosamin, N – acetylglucosamin và galactose không có hoạt tính cảm ứng. Ngoài ra, chitosanase cũng được cảm ứng sinh tổng hợp bởi các pathogensis related protein (PR – protein) và các nấm (vesicular arbuscular mycorrhial – VAM) ở một số loài thực vật [21]. Chitosanase cũng được cảm ứng sinh tổng hợp ở đậu phộng bởi chitosan [17]. 1.2.4.2. Tinh chế chitosanase Chitosanase có thể được tinh chế bằng kỹ thuật thông dụng như tủa phân đoạn bằng amonium sulfate, lọc gel, sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực Năm 1988, Minoru Yabuki và cộng sự đã tiến hành tinh chế chitosanase ngoại bào từ vi khuẩn Bacillus circulans MH-K1 bằng phương pháp sắc ký CMC và phương pháp HPLC. Nguyên tắc chủ yếu như sau: sau khi loại các tế bào vi khuẩn trong dung dịch nuôi cấy bằng cách ly tâm, dịch nổi có chứa enzyme chitosanase ở dạng thô sẽ được tủa lại bằng amonium sulfate với nồng độ bão hòa 70 – 90% ở pH 7,0. Ly tâm thu tủa và hòa tan trong dung dịch đệm Tris – maleate, pH 7,2; tiếp tục thẩm tích dung dịch protein chitosanase trong 8 giờ, ở 0oC để loại muối. Sau đó dung dịch enzyme thô này được cho qua cột CMC để loại bỏ tạp chất. Các phân đoạn có chứa chitosanase được gộp lại và tiến hành tinh chế tiếp bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) để thu được chitosanase có độ tinh sạch cao [36]. 25
36. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 1.2.4.3. Phương pháp xác định hoạt tính chitosanase Hoạt tính thủy phân chitosanase có thể được xác định dựa trên mức độ giảm cơ chất hoặc mức độ tăng của sản phẩm tạo thành. Tuy nhiên, do cơ chất chitosan không tan trong nước nên việc xác định hoạt tính và đo động học xúc tác cũng gặp một số khó khăn. Phương pháp đầu tiên được đề nghị để theo dõi phản ứng thủy phân của chitosanase là do sự thay đổi về độ nhớt của dung dịch chitosan trong acetic acid hoặc dịch đệm sodium acetate, cũng như đối với cơ chất là các dẫn xuất tan như glycol chitosan. Tuy nhiên, phương pháp này có độ nhạy thấp [24]. Phương pháp thứ hai là phương pháp đo độ đục được sử dụng để xác định sự giảm hàm lượng chitosan dạng keo trong phản ứng thủy phân. Phương pháp xác định hoạt tính dựa trên sản phẩm phổ biến là phương pháp đo các nhóm khử được tạo thành [39]. Một số nhà nghiên cứu đã đề xuất phương pháp đo hoạt tính dựa trên lượng glucosamin được tạo thành bằng phản ứng màu đặc hiệu của glucosamin với p – dimethyl – aminobenzaldehyde [44]. 1.2.5. Ứng dụng của chitosanase Ứng dụng trong y dược: sự thủy phân chitosan bằng chitosanase cho sản phẩm là các oligomer có trọng lượng thấp có những đặc tính sinh học đặc biệt như tác dụng ức chế sự tăng trưởng của nấm và vi khuẩn, khả năng kích thích sự tạo thành phytoalexin (chất kháng vi sinh vật được tổng hợp và tích lũy ở thực vật bậc cao). Chitosanase còn được dùng để định vị chitosan ở một số loài nấm. Ứng dụng trong nông nghiệp: nhiều dạng chitosanase được tìm thấy ở thực vật mà người ta tin rằng chúng có vai trò kháng lại các loại nấm bệnh xâm nhập bằng cách phá hủy tính nguyên vẹn của vách tế bào nấm [23]. Chitosanase còn tạo ra các oligomer có tác dụng kháng nấm cũng như gia tăng tạo thành những protein kháng nấm khác đi đến khu vực xâm nhập bằng cách hoạt hóa các gen kháng bệnh ở thực vật. Ứng dụng trong thực phẩm và mỹ phẩm: chitosan là một chất gôm cation tự nhiên có hoạt tính kháng nấm được dùng để bổ sung vào kem, nước hoa, hóa chất 26
37. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. sơn móng Hoạt tính thủy phân chitosan được tìm thấy ở nhiều vi khuẩn và nấm. Vì vậy, các quy trình sử dụng chitosanase từ vi sinh vật có thể thay thế các quy trình thủy phân hóa học sử dụng lượng lớn chlorhydric acid. 1.2.6. Tình hình nghiên cứu chitosanase trên Thế giới và ở Việt Nam 1.2.6.1. Tình hình nghiên cứu chitosanase trên thế giới Do có những ứng dụng rộng rãi nên từ lâu trên thế giới đã có rất nhiều các nghiên cứu về chitosanase như: - Price và Stock (1975) đã nghiên cứu sản xuất, tinh sạch và đặc tính của chitosanase ngoại bào từ Streptomyces. - Fenton và cộng sự (1981) thực hiện tinh sạch và nghiên cứu phương thức hoạt động của chitosanase từ Penicillium islandicum. - Daris và Eveleigh (1984) đã tiến hành các nghiên cứu trên chitosanase như: sự tìm thấy, sản xuất và cố định trên chitin, chitosan và enzyme liên quan. - Reyes và cộng sự (1985) tìm hiểu về sự tự phân hóa của Mucor rouxii dưới tác dụng của chitosanase. - Boucher và cộng sự (1993) đã tiến hành tinh sạch và nghiên cứu đặc trưng của chitosanase từ Streptomyces N-147. - Shimosaka và cộng sự (1993) đã thực hiện các nghiên cứu về quy trình tinh sạch và một số thuộc tính của chitosanase từ nấm gây bệnh cây Fusarium solani f. sp. phaceoli. - Shimosaka và cộng sự (1996) tiếp tục những nghiên cứu về sự tách dòng và đặc trưng của gen chitosanase từ nấm gây bệnh cây Fusarium solani - Jun-ichi Saito và cộng sự (1999) nghiên cứu về cấu trúc tinh thể của chitosanase từ Bacillus circulans MH-K1 ở độ phân giải 1,6 Å và cơ chế nhận dạng. - Hugo Tremblay và cộng sự (2000) đã nghiên cứu về dấu hiệu phân tử phổ biến thống nhất chitosanase thuộc họ 46 và 80 trong số enzyme thủy phân glycoside. 27
38. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. - Tanabe và cộng sự (2003) nghiên cứu một dạng Chitosanase mới từ Streptomyces griceus HUT 6037 với hoạt động chuyển giao đường khử từ một glycoside khác. - Xiao-E Chen và cộng sự (2008) nghiên cứu trên các chủng cải tiến và tiến hành tối ưu hóa các thành phần dinh dưỡng để sản xuất chitosanase từ nấm Aspergillus sp. CJ 22-326. 1.2.6.2. Tình hình nghiên cứu chitosanase ở Việt Nam Tại Việt Nam, quá trình nghiên cứu về chitosan để ứng dụng vào các lĩnh vực công nghệ nhằm phục vụ cho khoa học và đời sống đã được bắt đầu vào cuối những năm thập niên 70 của thế kỷ XX. Tuy nhiên, những nghiên cứu về chitosanase thì chỉ mới được quan tâm nghiên cứu trong những năm gần đây: - Lâm Ngọc Tuyết và cộng sự (2003), nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa chitosanase trong E. coli đề tài nghiên cứu cơ bản trong Sinh học, Nông nghiệp và Y học, báo cáo trong hội nghị khoa học toàn quốc lần thứ 2. - Cao Thị Ngọc Phượng và cộng sự (2003) đã xây dựng cơ sở dữ liệu protein phục vụ nghiên cứu sinh học: trường hợp chitinase và chitosanase, báo cáo tại hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 2003, Bộ Khoa học và Công Nghệ, Hội các ngành Sinh học Việt Nam, Trung tam Khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia Hà Nội. - Vũ Thị Ánh Tuyết (2008) nghiên cứu thu nhận, tinh sạch và xác định đặc tính enzyme chitosanase từ chủng Penicillium Oxalicum and Thom và ứng dụng để thu nhận chitosan oligosaccharide. - Trần Đình Cảnh và cộng sự (2012) đã thực hiện nghiên cứu tuyển chọn chủng giống vi sinh vật có khả năng sinh enzyme chitosanase để sản xuất glucosamin. 28
39. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 1.3. Khái quát về lên men bán rắn 1.3.1. Định nghĩa lên men Lên men là quá trình oxy hóa khử sinh học được tiến hành do hoạt động sống của vi sinh vật nhờ sự tiếp xúc của các enzyme nhằm cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cần thiết cho chúng [35]. Quá trình lên men có thể chia làm hai pha: - Pha sinh trưởng: trong pha này, chủ yếu là quá trình sinh tổng hợp protein và xây dựng tế bào. Các tế bào trong giai đoạn này rất trẻ, sinh trưởng nhanh và tăng sinh khối khối nhanh. Môi trường dinh dưỡng trong pha này giàu nguồn cacbon, nitơ, và phosphor vô cơ. Sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật trong giai đoạn này không có hoặc chỉ mới bắt đầu tích tụ với một số lượng rất nhỏ, sau tăng dần lên đồng thời với sự phát triển của vi sinh vật, cho đến khi ổn định thì chuyển sang pha thứ hai [35]. - Pha thứ hai là pha tích tụ các sản phẩm của sự trao đổi chất. Ở pha này, môi trường dinh dưỡng cạn dần, sinh khối tế bào cũng giảm dần nhưng lượng sản phẩm trao đổi chất tích lũy ngày càng tăng. Tuy nhiên, ở cuối pha này, do tế bào bắt đầu tự phân, quá trình tích tụ sản phẩm bị chậm lại và một sản phẩm sẽ trở thành nguồn dinh dưỡng của vi sinh vật. Do đó, môi trường khi nuôi cấy phải thống nhất, trong đó vi sinh vật với môi trường có quan hệ tương hỗ với nhau. Trong thực tế sản xuất, pha này bao giờ cũng phải kết thúc trước điểm cuối để tránh sự tự phân của tế bào, làm tăng độ nhớt gây khó khăn cho việc tách lọc [35]. 1.3.2. Lên men bán rắn Theo Susana Rodríguez Couto và M. Ángeles Sanromán (2005), lên men bán rắn (Solid State Fermentation – SSF) được định nghĩa là phương thức lên men bề mặt của vi sinh vật diễn ra trên cơ chất rắn không tan, trong cơ chất này vẫn còn có chất dinh dưỡng và có thể có một lượng không đáng kể nước hoặc là không có mặt nước, chúng là giá đỡ về mặt cơ học, vừa cung cấp dưỡng chất cho vi sinh trong điều kiện thiếu dòng nước chảy tự do. Hầu như toàn bộ hệ thống lên men được lấp 29
40. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. đầy bởi pha khí, còn nước chỉ tồn tại với lượng rất ít ở khoảng không gian giữa các hạt cơ chất và không liên tục. Phần lớn lượng nước bị thẩm thấu vào các hạt cơ chất rắn. Hàm ẩm nhỏ dẫn đến sự lên men chỉ có thể tiến hành với một số ít vi khuẩn, nhưng phù hợp với phần lớn các nấm men, nấm mốc và các loài nấm khác. Hình 1.5. Đặc điểm của quá trình lên men bán rắn (SSF) (Moo – Young và cộng sự, 1983) – sự sắp xếp các hạt chất rắn ẩm và pha khí liên tục trong hệ thống SSF với hệ nấm sợi (bên trái) và sinh vật đơn bào (bên phải) (David A. Mitchell, Nadia Krieger, Marin Berovic (Eds), 2006). Tinh bột, cellulose, sợi thiên nhiên, polymer hóa học là những nguyên liệu phổ biến được dùng trong nuôi cấy nấm và các loài vi sinh vật khác để lên men thể rắn [35]. Quy trình SSF thông thường dùng nguyên liệu thô tự nhiên là nguồn cacbon và cũng là nguồn năng lượng. SSF cũng có thể sử dụng nguyên liệu trơ làm hỗn hợp rắn, khi này cần phải bổ sung thêm chất dinh dưỡng cần thiết cũng như nguồn cacbon. 1.3.3. So sánh lên men bán rắn với lên men chìm Môi trường cho các vi sinh vật phát triển của SSF khác hẳn với lên men giá thể lỏng LSF Bảng 1.8: 30
41. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. Bảng 1.8. So sánh giữa các quá trình lên men lỏng và rắn (Maurice Raimbault (1998), David A. Mitchell (2006)). LSF SSF Sợi nấm nằm trong pha lỏng, không sợ Sợi nấm tiếp xúc với không khí, dễ bị khô. dàng bị khô. Dễ dàng kiểm soát nhiệt độ, nhiệt độ Nhiệt độ khác nhau tại những khác được duy trì không đổi trong suốt quá nhau trong thiết bị lên men, dễ tăng cao trình sinh trưởng của vi sinh vật. nếu không thổi khí tới. Lượng O2 cần thiết cho vi sinh vật được O2 tự do có khắp trên bề mặt hạt cơ điều chỉnh hợp lý tùy vào mức độ bão chất, tuy nhiên lại rất thấp bên trong. hòa của môi trường. Các thành phần dinh dưỡng dễ dàng Lượng chất dinh dưỡng có sẵn để vi điều chỉnh. sinh vật sử dụng rất ít do chất dinh dưỡng bên ngoài hạt thấp hơn so với bên trong rất nhiều. Dễ dàng kiểm soát được lực xé do Sự dịch chuyển các hạt có thể gây va khuấy đảo cơ học. chạm và hư hại vì các sợi nấm chịu va chạm kém. Điều chỉnh pH dễ dàng. Khó điều khiển được pH. Nguy cơ nhiễm khuẩn cao. Nguy cơ nhiễm khuẩn thấp nhờ vào khả năng sinh trưởng mạnh của nấm. Tiêu thụ năng lượng cao. Tiêu thụ năng lượng thấp. Số lượng thiết bị nhiều, đòi hỏi công Sử dụng ít thiết bị, chi phí thấp, không nghệ cao. đòi hỏi kỹ thuật cao. Lượng nước thải lớn, gây ô nhiễm môi Không có nước thải, ít ô nhiễm. trường. Theo Maurice Raimbault (1998), Có khả năng nhiều sản phẩm giá trị cao, như các enzyme, các chất chuyển hóa sơ cấp và thứ cấp, có thể được sản xuất trong SSF. Nhưng những tiến bộ trong kỹ thuật và các khía cạnh kinh tế - xã hội được yêu cầu bởi vì quá trình này phải sử dụng chất nền giá rẻ sẵn có ở địa phương, áp dụng công nghệ thấp ở khu vực nông thôn, và quy trình phải được đơn giản hóa. Tiềm năng tồn tại ở các nước đang phát triển, nhưng hợp tác chặt chẽ và trao đổi giữa các nước phát triển và các nước công nghiệp hóa được yêu cầu cho các ứng dụng nhiều hơn nữa của SSF. 31
42. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 1.4. Khái quát về Aspergillus spp. 1.4.1. Giới thiệu về Aspergillus spp. Aspergillus spp. thuộc: Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Eurotiales Họ: Trychocomaceae Chi: Aspergillus Aspergillus là một chi bao gồm hàng trăm loài nấm mốc được tìm thấy ở nhiều vùng khí hậu khác nhau trên toàn thế giới. Aspergillus lần đầu tiên được xếp vào danh mục năm 1729 bởi các linh mục và nhà sinh vật học người Ý Micheli. Aspergillus là loài hiếu khí cao và được tìm thấy trong hầu như ở tất cả các môi trường giàu oxy. Thông thường, nấm phát triển trên các bề mặt cơ chất giàu cacbon như monosaccharide và polysaccharide. Aspergillus là loài gây hư hỏng phổ biến của các loại thực phẩm giàu tinh bột (như bánh mì và khoai tây), và phát triển trong nhiều loài thực vật và cây. Ngoài ra, nhiều loài Aspergillus còn có khả năng phát triển trong môi trường có nguồn dinh dưỡng cạn kiệt. A. niger là một ví dụ điển hình, nó có thể được tìm thấy trên các bức tường ẩm ướt. Aspergillus có ý nghĩa quan trọng trong y tế và thương mại. Một số loài có thể gây nhiễm trùng ở người và động vật. Hơn 60 loài Aspergillus có liên quan đến tác nhân gây bệnh. Đối với con người, có một loạt các bệnh như nhiễm trùng tai ngoài, tổn thương da, viêm loét Các loài khác có ý nghĩa quan trọng trong quá trình lên men vi sinh thương mại. Một số thành viên của chi cũng là nguồn của các sản phẩm tự nhiên có thể được sử dụng trong y dược để điều trị bệnh của con người [43]. 32
43. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 1.4.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Aspergillus spp. Aspergillus là giống nấm mốc có khả năng sinh trưởng và phát triển mạnh trên nhiều điều kiện môi trường khác nhau. Chúng sống hoại sinh hoặc kí sinh, không có khả năng quang hợp tạo chất hữu cơ. Được xếp vào nhóm hiếu khí cao, có khả năng sử dụng và chuyển đổi đa dạng các nguồn cơ chất để phát triển. Nhiều nghiên cứu cho thấy chúng là một trong các giống nấm mốc có khả năng sống trong điều kiện độ ẩm thấp và nhiệt độ khắc nghiệt, chúng có thể mọc ở các môi trường có nồng độ đường cao, có pH acid và các cơ chất tương đối khô, nơi mà các vi sinh vật khác khó có khả năng phát triển. Trong tự nhiên chúng tồn tại và phát triển trên các loại cây hoa màu, cây ngũ cốc, những nơi có độ ẩm cao trong nhà, trên các loại lương thực được bảo quản không kĩ, gây ra các tình trạng thối rữa, hư hại lương thực [43]. Aspergillus có cấu tạo hệ sợi phân nhánh, khả năng phân nhánh nhanh, sợi nấm có vách ngăn chia sợi thành nhiều tế bào đường kính sợi nấm tương đối mảnh từ 5-7µm, phân nhánh và phát triển nhanh tạo hệ sợi nấm (hay còn gọi là hệ khuẩn ty). Có hai loại khuẩn ty: Khuẩn ty sinh dưỡng: Loại khuẩn ty này giúp nấm mốc bám chặt vào giá thể, có khả năng đâm sâu vào môi trường, tiết enzyme thủy phân và hấp thụ dinh dưỡng từ cơ chất. Khuẩn ty khí sinh: thường mọc trên bề mặt môi trường rắn, màu trắng, giúp nấm lấy oxy từ không khí. Khi già khuẩn ty chuyển từ màu trắng sang màu đặc trưng của bào tử đính và có chức năng sinh sản. Sinh sản sinh dưỡng: là hình thức sinh sản bằng khuẩn ty, khuẩn ty được hình thành từ bào tử hoặc các khuẩn ty ban đầu, bay theo gió lẫn vào môi trường và phát triển thành nấm mốc mới khi gặp điều kiện thuận lợi [51]. Sinh sản bằng bào tử: Aspergillus sinh sản bằng bào tử trần, khuẩn ty khi gặp điều kiện thích hợp sẽ hình thành các cuốn đính bào tử, cuốn này mang các nang bào tử được gọi là túi đỉnh, bào tử được hình thành trên đầu các thể bình trong túi đỉnh và nối dài nên được gọi là bào tử đính. Khi chín bào tử được phát tán vào trong 33
44. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. không khí, khi gặp điều kiện môi trường có độ ẩm thuận lợi bào tử sẽ nẩy mầm và phát triển thành nấm mới. Bào tử của Aspergillus thường có dạng hình tròn hoặc hình ovan [32]. 1.4.3. Một số ứng dụng của Aspergillus spp. Acid citric là một trong số nhiều sản phẩm được tổng hợp từ Aspergillus, được tổng hợp chủ yếu bởi A. niger được sử dụng rộng rãi trong ngành phụ gia thực phẩm, trong dược phẩm, hóa học. Acid citric được thêm vào các hỗn hợp tẩy rửa thay tripolyphophate để tạo ra các sản phẩm thân thiện với môi trường hơn. Có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme với hiệu suất cao, nên Aspergillus còn đóng một vai trò quan trọng trong công nghiệp enzyme. Các enzyme như α – amylase, glucoamylase, cellulase, pectinase, xylanase, hemicellulase, và protease là những enzyme được sản xuất nhiều nhất từ giống nấm này. α – amylase được sử dụng trong công nghiệp bánh, trong sản xuất các loại thức uống có chứa maltose được thủy phân từ tinh bột. Glucoamylase hay amyloglucosidase kết hợp với các loại amylase khác có khả năng thủy phân tinh bột tạo glucose hoặc các hỗn hợp đường dùng trong công nghiệp lên men. Xylanase được dùng để xử lý làm trong các loại nước ép trái cây trong công nghiệp thực phẩm, hoặc xử lý làm mềm các loại rau quả trong sản xuất thức ăn chăn nuôi, giúp cho quá trình tiêu hóa của các loại vật nuôi xảy ra dễ dàng hơn. Protease được sử dụng thủy phân một phần gluten có trong các loại bột, góp phần cùng các enzyme khác như xylanase làm cho bánh mềm và dễ nở hơn. Pectinase được ứng dụng rộng rãi để xử lý các loại nước ép từ quả, nó thủy phân một số thành phần làm cho nước ép có độ đồng nhất và trong hơn. Các nghiên cứu cho thấy một sự kết hợp giữa pectinase và cellulase sẽ làm tăng hiệu xuất thủy phân các polysacharide, làm tăng lượng đường thu hồi [51]. Ở các nước châu Á như Việt Nam, Nhật Bản, Trung Quốc . A. oryzae, Aspergillus sojae, và Aspergillus tamarii được sử dụng lên men tạo các loại nước chấm từ đậu tương, sử dụng để đường hóa gạo và các loại ngũ cốc khác tạo các thức uống có cồn. 34
45. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. Bên cạnh thế mạnh khả năng sinh tổng hợp enzyme, Aspergillus còn có khả năng sinh tổng hợp mạnh một số hợp chất thứ cấp như Penicillin, cyclosporin A, lovastatin [51]. 1.5. Khái quát về nguồn nguyên liệu cám gạo và vỏ trấu trong nước 1.5.1. Nguồn cám gạo trong nước Cám gạo là phụ phẩm chính thu được từ lúa sau khi xay xát và thường chiếm khoảng 10% trọng lượng lúa. Cám gạo được hình thành từ lớp vỏ nội nhũ, mầm phôi của hạt, cũng như một phần từ tấm. Cám gạo có màu sáng và mùi thơm đặc trưng. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của cám gạo biến động rất lớn, phụ thuộc nhiều vào kỹ thuật xay xát gạo. Tỷ lệ vỏ trấu sau khi xay xát ảnh hưởng nhiều tới hàm lượng protein, béo và xơ của cám gạo thành phẩm. Tỷ lệ protein trong cám gạo mịn có thể đạt 12 - 14%. Lượng protein thô ở cám gạo cao hơn so với ở bắp hạt (chỉ đạt 8,3%). Hàm lượng chất béo, xơ trong khoảng 13 - 14% và 7 - 8%. Tuy nhiên, theo kết quả phân tích đã công bố cho thấy các chỉ tiêu này biến động rất lớn. Cụ thể, hàm lượng béo thô khoảng 110 - 180g/kg vật chất khô (VCK) và lượng xơ biến động trong khoảng 90 - 120g/kg VCK. Theo báo cáo của Gene và ctv (2002) và Creswell (1987) qua phân tích nhiều mẫu cám gạo được thu thập từ các nước Đông Nam á cho thấy thành phần dinh dưỡng của chúng rất biến động. Hàm lượng chất béo có trong các mẫu cám gạo nói trên biến động từ 12 - 19% từ đó ảnh hưởng tới mức năng lượng của cám gạo. Trong khi đó hàm lượng xơ thô biến động từ 7,5 - 13% và làm giảm năng lượng của cám. Cám có hàm lượng béo cao nhưng mức năng lượng trao đổi (ME) thấp khoảng 2.850 Kcal/kg (NRC 1994, 1999) là do hàm lượng xơ thô cao. Chất lượng cám gạo biến đổi nhiều tùy thuộc vào tỷ lệ vỏ trấu còn lại sau khi xay xát. Vỏ trấu chiếm khoảng 20% trọng lượng hạt lúa và có hàm lượng silíc rất cao khoảng 210g/kg VCK, rất sắc nhọn nên dễ gây tổn thương thành ruột. Khẩu phần thức ăn hỗn hợp chứa đa phần là ngũ cốc và các phụ phẩm của chúng thường chứa rất nhiều NSP (Non Starch Polysaccharide). Cám gạo có các thành phần xơ chủ yếu như arabinoxylan, cellulose và lignin. Trong quá trình tiêu hóa của lợn, giá trị dinh 35
46. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. dưỡng của cám gạo phụ thuộc rất nhiều vào hàm lượng chất xơ và thành phần của chúng [6]. Bảng 1.9. Thành phần xơ và giá trị dinh dưỡng của các nguyên liệu [6]. Cám gạo Cám gạo Cám Chi tiêu Bắp nguyên Trích Lúa mì Bột mì lúa mì dầu dầu Protein (%) 8 13 15 12 16 16 DE (Kcal/kg) 3.525 3.100 2.250 3.350 2.520 2.965 Xơ thô (%) 2,2 8 11 2,5 11 9 Xơ tổng số (%) 9,5 19 27 10,5 44 27 NSP tổng số (%) 9 15 21 9,5 38,2 23,5 Cellulose (%) 2,0 5 7 2,5 11 8 Lignin (%) 0,5 4 6 1 5,8 3,5 Arabinoxylan (%) 3,7 9 11 5,5 21 15 (% không hoà tan) (94) (96) (97) (77) (99) (97) Arabinoxylan là những thành phần chủ yếu có trong cấu thành của xơ ở cám gạo. Chúng chiếm khoảng 60% tổng số NSP hiện diện. Đây là một loại đường đa do những đường đơn arabinose và xylose tạo nên nhờ các liên kết 1- 3, 1 - 4 glucoside, động vật có dạ dày đơn không thể tiêu hóa được chúng. Cám gạo cũng như các nguyên liệu có nguồn gốc thực vật khác thường chứa hàm lượng phốt pho khá cao ở dạng phytate. Mặc khác, gốc phốt phát từ phytate thường tạo liên kết với các chất như axít amin và chất khoáng làm giảm sự tiêu hóa các dưỡng chất này khi bổ sung vào khẩu phần. Thông thường có khoảng 2/3 hàm lượng phốt pho có trong những loại nguyên liệu thô được sử dụng làm thức ăn gia súc, hiện diện dưới dạng phytate. Cám gạo có lượng phốt pho khá cao nhưng trên 50% là ở dạng phytate. Động vật có dạ dày đơn khó tiêu hóa chất này do không sản xuất đủ lượng enzyme phytase nội sinh cần thiết [4]. 1.5.2. Nguồn vỏ trấu trong nước Việt nam là nước có nền văn minh lúa nước rất lâu đời, từ lâu cây lúa đã gắn liền với đời sống của nhân dân. Không những hạt lúa được sử dụng làm thực phẩm chính, mà các phần còn lại sau khi đã thu hoạch lúa cũng được người dân tận dụng trở thành những vật liệu có ích trong đời sống hàng ngày. Ví dụ rơm được sử dụng 36
47. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. lợp nhà, cho gia súc ăn, làm chất đốt, hoặc ủ làm phân. Trấu được sử dụng làm chất đốt hay trộn với đất sét làm vật liệu xây dựng Không những trấu được sử dụng làm chất đốt trong sinh hoạt hàng ngày mà còn được sử dụng như là một nguồn nguyên liệu thay thế cung cấp nhiệt trong sản xuất với giá rất rẽ. Trấu là lớp vỏ ngoài cùng của hạt lúa và được tách ra trong quá trình xay xát. Trong vỏ trấu chứa khoảng 75% chất hữu cơ dễ bay hơi. Chất hữu cơ chứa chủ yếu cellulose, lignin và Hemi – cellulose (90%), ngoài ra có thêm thành phần khác như hợp chất nitơ và vô cơ. Lignin chiếm khoảng 25 – 30% và cellulose chiếm khoảng 35 – 40%. Các chất hữu cơ của trấu là các mạch polycarbohydrat rất dài nên hầu hết các loài sinh vật không thể sử dụng trực tiếp được, nhưng các thành phần này lại rất dễ cháy nên có thể dùng làm chất đốt. Sau khi đốt, tro trấu có chứa trên 80% là silic oxyt, đây là thành phần được sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực [6]. 37
48. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 2.1. Vật liệu 2.1.1. Chủng giống Chủng nấm mốc A. oryzae – 1 (O1), A. oryzae – 2 (O2), A. niger – 1 (N1), A. niger – 3 (N3) và A. niger – 7 (N7) do Phòng thí nghiệm các chất có hoạt tính sinh học thuộc Bộ môn Sinh hóa – Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh cung cấp. Các chủng được bảo quản trên môi trường PGA – thạch nghiêng. 2.1.2. Cơ chất cảm ứng Chitosan dạng bột do Phòng thí nghiệm các chất có hoạt tính sinh học thuộc Bộ môn Sinh hóa – Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Thành Phố Hồ Chí Minh cung cấp. 2.1.3. Cơ chất nuôi cấy Cám gạo và trấu được mua từ nhà máy xay xát Giồng Trôm, Huyện Giồng Trôm, Tỉnh Bến Tre. 2.1.4. Hóa chất và thiết bị 2.1.4.1. Hóa chất - Hóa chất pha môi trường: K2HPO4, NaNO3, MgSO4. 7H2O, KCl, (NH4)2SO4, KH2PO4, Glucose công nghiệp, Agar. - Hóa chất pha thuốc nhuộm: + Lugol: KI, I2. + Methylene Blue: Methylene blue – trihydrate. - Hóa chất pha thuốc thử Bradford: Comasie Brilliant blue, Ethanol 99o, acid Phosphoric 85%. - Hóa chất pha thuốc thử DNS (acid 3,5 – dinitrosalicylic): DNS dạng bột, Sodium Potassium Tartrate, NaOH 2N. - Hóa chất dựng đường chuẩn Albumine: thuốc thử Bradford, Albumine. - Hóa chất dựng đường chuẩn glucosamine: thuốc thử DNS, D – glucosamine. - Hóa chất pha đệm acetate: CH3COOH, CH3COONa. 38
49. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 2.1.4.2. Thiết bị - Wiseclause ® Digital Fuzzy Control System, - Máy vortex - Buồng đếm Malassez, Đức. - Máy đo pH, Mettler Toledo, Thụy Sỹ - Cân phân tích, PioneerTM, Mỹ - Kính hiển vi quang học, - Máy ly tâm, Universal 32 – Hettich Zentrifugen, Đức - Máy quang phổ, CECIL – CE 1011 - Que cấy móc, que cấy vòng và các dụng cụ thí nghiệm khác. 2.1.5. Môi trường 2.1.5.1. Môi trường giữ giống Môi trường giữ giống là môi trường dùng để bảo quản giống. Giống trong môi trường được bảo quản bình thường ở nhiệt độ phòng và được cấy lưu 1 tháng 1 lần. Môi trường giữ giống dùng trong khóa luận này là môi trường PGA (Potato Glucose Agar). Thành phần: Khoai tây 200g Glucose 20g Agar 20g Khoai tây thái lát đun sôi vừa lửa trong 30 phút, thu lấy dịch chiết hòa tan cùng với glucose, thêm agar vừa đủ, thêm nước cất định mức 1000 ml. Nếu làm thạch nghiêng thì phải đun tan hết agar, sau đó phối vào khoảng 1/4 ống nghiệm, đậy nút bông. Hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút [7]. 2.1.5.2. Môi trường nhân giống Môi trường nhân giống được sử dụng là môi trường lúa. Thành phần: Lúa 10 g Dịch khoáng Czapek (*) 10ml 39
50. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. Lúa được xử lý sơ bộ bằng cách ngâm nước trong 3 giờ, sau đó vớt ra vò sạch, rửa lại bằng nước cất và để ráo tự nhiên. Cho vào bình nuôi cấy và bổ sung dịch khoáng Czapek. Hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. (*): thành phần dịch khoáng Czapek: K2HPO4 0,1%; NaNO3 0,2%; MgSO4 0,05%; KCl 0,05% [7]. 2.1.5.3. Môi trường kiểm tra hoạt tính enzyme a. Môi trường cấy điểm Môi trường cấy điểm dùng để kiểm tra hoạt tính chitosanase được sử dụng là môi trường Czapek dox agar – chitosan. Thành phần: Yeast extract 0,5% NaNO3 0,2% KH2PO4 0,1% KCl 0,05% MgSO4. 7H2O 0,05% FeSO4. 7H2O 0,001% Chitosan 1% Chitosan được hòa tan trong đệm acetate 0,5M, pH 5,5 [2]. b. Môi trường đục lỗ thạch Môi trường đục lỗ thạch dùng để kiểm tra định tính chitosanase từ dịch canh trường trích ly sau nuôi cấy. Môi trường được dùng trong thí nghiệm là môi trường Chitosan – agar. Thành phần: Chitosan 1% trong đệm acetate 0,5M, pH 5,0: 50ml Agar 20g Thêm nước cất đến 1000ml, hấp khử trùng 121oC trong 15 phút [2]. 40
51. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 2.1.5.4. Môi trường lên men bán rắn Cám gạo: 70% Trấu: 10% Chitosan: 10% Độ ẩm môi trường: 60% Độ ẩm được điều chỉnh bằng dịch khoáng ((NH4)2SO4: 0,2%; KH2PO4: 0,2%; MgSO4. 7H2O: 0,05%) [2]. 2.2. Phương pháp 2.2.1. Phương pháp xác định độ ẩm nguyên liệu Nguyên tắc: dựa trên nguyên lý làm khô mẫu đến trọng lượng khô không đổi. Khối lượng mẫu mất đi khi sấy mẫu đến trọng lượng khô không đổi là lượng nước có trong mẫu. Tiến hành: sấy khô và cân đĩa Petri đến khối lượng không đổi, sử dụng cân phân tích chính xác đến 0.5 mg. Cân 5g mẫu (độ chính xác đến 1 mg) cho vào đĩa Petri và đậy nắp lại. Đặt chén đựng mẫu vào tủ sấy, mở nắp Petri và sấy ở 105oC trong 4 giờ. Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 15 – 20 phút, rồi cân đĩa Petri với độ chính xác đến 1 mg. Đặt đĩa Petri sấy tiếp 30 phút nữa ở 105oC. Lấy ra, để nguội trong bình hút ẩm 15 – 20 phút và cân lại. Chênh lệch giữa hai lần cân không quá 5 mg, nếu vẫn chưa đạt thì cần phải sấy và cân lại [5]. Tính toán: Độ ẩm của mẫu (X) được tính theo công thức: 100 X = (m1 – m2) * (Công thức 1) Trong đó: M: khối lượng mẫu phân tích (g) m1: trọng lượng chén và mẫu trước khi sấy (g) m2: trọng lượng chén và mẫu sau khi sấy (g) X: độ ẩm của mẫu (%) 41
52. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 2.2.2. Phương pháp xác định trực tiếp số lượng bào tử 2.2.2.1. Cấy nhân sinh khối Cấy giống: mốc giống được lấy từ các ống cấy chuyền, dùng 10 ml dịch agar 0,1% đã vô trùng cho vào ống giống cấy chuyền, dùng que cấy vòng lướt nhẹ trên mặt thạch và đánh đều bào tử vào dịch agar. Cấy vào mỗi bình môi trường lúa 2 ml dịch huyền phù bào tử. Ủ ở nhiệt độ phòng trong khoảng 3 – 5 ngày, quan sát khi mà mốc ra bào tử đều khắp bình môi trường là được [5]. 2.2.2.2. Xác định số lượng bào tử bằng phương pháp đếm bằng buồng đếm hồng cầu Dùng buồng đếm hồng cầu Malassez để đếm tế bào nấm mốc. Malassez là một phiến kính hình chữ nhật, chia thành 3 khoảng ngang. Khoảng giữa là phần lõm phẳng, với chiều cao tính từ mặt phẳng lõm đến lamelle là 0,2 mm ± 1% (1/20 mm). Thể tích chứa trong 1 mm2 là 2 μl. Khu vực đếm hình chữ nhật có diện tích là 5 mm2. Khu vực này được chia thành 25 ô chữ nhật, diện tích mỗi ô là 0,25 x 0,20 mm (= 0,05 mm2). Mỗi ô chữ nhật này lại được chia ra thành 20 ô vuông nhỏ, với diện tích mỗi ô vuông là 0,0025 mm2 (1/400 mm2). Các bước tiến hành: - Mẫu được lấy từ các bình nhân giống. - Pha loãng mẫu ra các nồng độ: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5. - Dùng máy vortex để đánh đều bào tử, hút một lượng vừa đủ nhỏ vào rãnh buồng đếm để huyền phù bào tử theo lực mao dẫn lan vào khoảng giữa bề mặt buồng đếm và lamelle. Nếu xuất hiện bọt khí thì phải làm sạch buồng đếm và lamelle rồi tiến hành lại. - Để yên buồng đếm trong 2 phút để ổn định bào tử, sau đó đưa lên kính hiển vi đếm ở vật kính 40. Trên buồng đếm Malassez: đếm bào tử ở 5 ô trung bình của khu vực đếm (4 ô ở bốn góc và 1 ô ở giữa). Trong mỗi ô trung bình đếm cả 20 ô nhỏ. Trong mỗi ô nhỏ, đếm tất cả bào tử nằm gọn trong ô và những bào tử nằm ở cạnh trên và cạnh trái. Như vậy biết được số bào tử trong 100 ô nhỏ. Những bào tử 42
53. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. nằm ngay trên vạch ngoài thì đếm 2 tính 1, còn bào từ nào nằm giữa 2 vạch hoặc trên vạch thì 1 tính 1. Ở mỗi nồng độ pha loãng, bào tử nân được đếm 2 lần để tự kiểm chứng khả năng. Ghi nhận lại kết quả đếm được và tiến hành tính theo công thức [6]: ∗ 8000 ∗ 103 ∗ 10푛 N = (Công thức 2) Trong đó: N: số lượng bào tử trong 1 ml dịch huyền phù a: số lượng bào tử trong 5 ô chữ nhật (100 ô vuông nhỏ) b: số ô vuông nhỏ trong 5 ô chữ nhật (20 x 5 = 100 ô vuông nhỏ) 8000 = 400 x 20 (1/400 mm2: diện tích một ô vuông nhỏ; 1/20 mm: chiều cao từ mặt buồng đếm đến tấm lamelle) 103: số chuyển mm3 thành ml (1000 mm3 = 1 ml) 10n: độ pha loãng mẫu 2.2.3. Phương pháp cấy điểm trên môi trường thạch đĩa chọn chủng nấm mốc có hoạt tính chitosanase cao 2.2.3.1. Nguyên tắc Xác định khả năng phân giải chitosan của các chủng nấm mốc Aspergillus. Chủng có khả năng phân giải chitosan thì khi cho thuốc thử Lugol vào sẽ xuất hiện một vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc. Vòng càng lớn thì biểu hiện khả năng phân giải chitosan càng cao [6]. 2.2.3.2. Tiến hành Dùng que cấy móc, tiến hành cấy điểm các chủng nấm mốc lên môi trường thạch đĩa Czapek dox agar – chitosan. Nuôi ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 – 6 ngày. Tiến hành đo đường kính khuẩn lạc trước, sau đó cho vào đĩa thạch 5 ml Lugol, để yên trong 15 phút. Đổ lượng thuốc thử còn thừa ra và rửa lại đĩa thạch dưới vòi nước chảy nhẹ trong 3 phút, để ráo. Quan sát và đo đường kính vòng phân giải đường kính vòng phân giải càng lớn thì khả năng sinh tổng hợp chitosanase của chủng nấm mốc càng lớn [6]. 43
54. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 2.2.4. Phương pháp khuếch tán thạch đĩa Cấy các chủng nấm mốc lên môi trường lên men bán rắn, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng trong 96 giờ. Tiến hành trích ly enzyme với nước. Môi trường chitosan – agar sau khi hấp khử trùng, để nguội khoảng 45oC, đổ vào các đĩa petri (lượng môi trường phối vào các đĩa nên đều nhau và phải dày từ 2 – 3 mm). Chờ cho môi trường thạch đĩa đông lại, dùng dụng cụ đục lỗ đường kính 5 mm khoan thành 5 lỗ phân đều trên đĩa thạch. Nhỏ vào mỗi lỗ 20 μl dịch chiết enzyme (đánh dấu cho từng chủng). Để yên và ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Sau đó cho 5 ml thuốc thử Lugol vào, để yên trong 15 phút. Đổ lượng thuốc thử còn thừa ra và rửa lại đĩa thạch dưới vòi nước chảy nhẹ trong 3 phút, để ráo. Quan sát và đo đường kính vòng phân giải (mm), kích thước vòng phân giải tỷ lệ thuận với khả năng sinh tổng hợp chitosanase của nấm mốc [7]. 2.2.5. Phương pháp mô tả hình thái vi sinh vật 2.2.5.1. Quan sát đại thể Dùng que cấy móc vô trùng lấy một ít bào tử từ ống mốc giống cấy một điểm trên môi trường thạch đĩa PGA, ủ đĩa thạch trong 3 ngày ở nhiệt độ phòng. Quan sát hình dạng và màu sắc mặt trên và mặt dưới của khuẩn lạc [7]. 2.2.5.2. Quan sát vi thể Lót giấy thấm ở đáy của đĩa petri, đặt vào một miếng lame, gói giấy và hấp khử trùng. Thao tác vô trùng rót môi trường PGA lên 1/2 tấm lame, chờ cho thạch đông, làm ẩm giấy thấm bằng nước cất vô trùng. Dùng que cấy móc cấy một điểm lên phần thạch PGA trên lame, ủ đĩa petri ở nhiệt độ phòng. Sau 2 ngày, lấy miếng lame khỏi đĩa petri, nhộm phần đĩa không dính môi trường PGA với thuốc nhộm xanh methylen, đè nhẹ lamen lên phần sợi nấm đã nhộm. Quan sát dưới kính hiển vi (X40) cuốn sinh bào tử đính và vách ngăn tế bào [7]. 2.2.6. Phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn Việc giữ giống và hoạt hóa các chủng nấm mốc được tiến hành trên các môi trường đã giới thiệu ở mục 2.1.5. Thêm vào mỗi ống giống sau khi hoạt hóa 10 ml 44
55. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. dịch agar 0,1% (vô trùng). Dùng que cấy vòng (vô trùng) đánh nhẹ bào tử ở dạng huyền phù. Việc nuôi cấy nấm mốc tạo canh trường giàu enzyme được tiến hành trên môi trường lên men bán rắn đã giới thiệu ở mục 2.1.5.4. Cho vào mỗi bình nuôi cấy lượng cơ chất và thành phần như đã nêu và đem hấp khử trùng, chờ cho môi trường nguội thì cấy vào 2 ml dịch huyền phù bào tử [5]. 2.2.7. Phương pháp so màu với thuốc thử DNS (acid 3,5 – dinitrosalicylic) xác định hoạt tính chitosanase 2.2.7.1. Nguyên tắc Phương pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử DNS. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucosamin với thuốc thử sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu. Cho enzyme tác dụng với cơ chất là chitosan, sản phẩm tạo thành là glucosamin được bắt màu với thuốc thử DNS và đem đo mật độ quang ở bước sóng 575 nm [16]. 2.2.7.2. Tiến hành a. Dựng đường chuẩn glucosamin Từ dung dịch glucosamin chuẩn, pha các dung dịch glucosamin chuẩn có nồng độ từ 100 – 500 μg/ml như Bảng 2.1.: Bảng 2.1. Các bước tiến hành dựng đường chuẩn glucosamine. Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Hóa chất Dung dịch glucosamin 1 mg/ml (ml) 0 1 2 3 4 5 Nước cất (ml) 5 4 3 2 1 0 Nồng độ glucosamin (μg/ml) 0 100 200 300 400 500 Hút 0,5 ml dung dịch protein vừa pha loãng cho vào các ống nghiệm sạch và khô khác Dung dịch glucosamin (ml) 1 1 1 1 1 1 Thuốc thử DNS (ml) 4 4 4 4 4 4 45
56. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. Ống nghiệm 0 tương ứng với thời gian xuất phát ban đầu là 0 phút và được dùng làm ống đối chứng. Thực hiện phản ứng lần lượt ở các ống còn lại, các ống cách nhau 1 phút. Đem đun cách thủy ở 100oC trong 3 phút, làm nguội và đo OD ở bước sóng 575 nm. Dựng đường tuyến tính giữa nồng độ glucosamin (μg/ml) với mật độ quang ∆OD. Đối với mẫu thí nghiệm thì tiến hành thực hiện như Bảng 2.2.: Bảng 2.2. Các bước tiến hành xác định hoạt tính đối với mẫu thí nghiệm. Ống nghiệm 0 1 Hóa chất Chitosan 0,1 % (ml) 1 1 Dịch chiết enzyme (ml) 0 1 Để phản ứng xảy ra trong 30 phút ở nhiệt độ phòng Dừng phản ứng bằng cách đun cách thủy ở 100oC trong 3 phút. Dịch chiết enzyme (ml) 1 0 Thuốc thử DNS (ml) 4 4 Đun cách thủy ở 100oC trong 15 phút, để nguội, lọc và đo OD ở bước sóng 575 nm. b. Tính toán Dựa vào đồ thị đường chuẩn tính được nồng độ đường khử của mẫu, từ đó suy ra hoạt tính của enzyme theo công thức sau [16]: X ∗ 103 Hoạt tính = (UI/ml hay UI/mg) (Công thức 3) 215,6 ∗ 30 ∗ 1 Trong đó: X: là lượng đường khử tạo thành (mg) 103: hệ số chuyển đổi từ mol sang μmol 215,6: trọng lượng phân tử của 1 mol N – acetylglucosamin 30: thời gian phản ứng 30 phút 1: thể tích enzyme tham gia phản ứng (ml) 46
57. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 2.2.8. Phương pháp Bradford – xác định hàm lượng protein 2.2.8.1. Nguyên tắc Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassien Brilliant Blue khi tạo phức với protein. Trong dung dịch mang tính acid, khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp thu cực đại 465 nm, khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng 595 nm. Độ hấp thu ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp tới hàm lượng protein. Để xác định hàm lượng protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein đã biết nồng độ (thường là Bovine plasma γ-globulin hoặc Bovine serum albumin). Sau khi cho dung dịch thuốc nhuộm vào, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền đến 1 giờ. Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ ta được ODx, độ hấp thu này sẽ tỷ lệ với lượng protein trong mẫu. Thực hiện mẫu đối chứng với nước cất ODo. Tính giá trị ΔOD = ODx – ODo của mẫu. Lượng protein trong dung dịch được xác định bằng cách dựa vào đồ thị đường chuẩn albumin [16]. 2.2.8.2. Tiến hành a. Dựng đường chuẩn albumin Để dung dịch albumin chuẩn có các nồng độ từ 10 – 50 μg/ml, ta thực hiện như Bảng 2.3: Bảng 2.3. Các bước tiến hành dựng đường chuẩn albumine Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Hóa chất Dung dịch albumin 0,01 mg/ml (ml) 0 1 2 3 4 5 Nước cất (ml) 10 9 8 7 6 5 Nồng độ protein (μg/ml) 0 10 20 30 40 50 Hút 0,5 ml dung dịch protein vừa pha loãng cho vào các ống nghiệm tương ứng Dung dịch albumin (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Thuốc thử Bradford (ml) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 Ống nghiệm 0 tương ứng với thời gian xuất phát ban đầu là 0 phút và được dùng làm ống đối chứng. 47
58. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. Thực hiện phản ứng lần lượt ở các ống còn lại, các ống cách nhau 1 phút. Để yên sau 10 phút (theo thời gian của ống 0), tiến hành đo độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 595 nm. Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (μg/ml) với mật độ quang ∆OD. Mẫu thí nghiệm cũng được tiến hành tương tự như trên. Mẫu phải được pha loãng sao cho trị số mật độ quang nằm trong khoảng của đường chuẩn [16]. b. Tính toán Dựa vào đồ thị chuẩn, tính được nồng độ protein của mẫu, từ đó suy ra hoạt tính riêng của chế phẩm enzyme. Như vậy, hoạt tính của enzyme được tính theo đơn vị quốc tế UI, một UI là hoạt tính của enzyme xúc tác cho sự chuyển hóa 1 μmol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện thí nghiệm. Đối với chế phẩm enzyme, ngoài việc xác định mức độ hoạt động còn phải đánh giá mức độ tinh sạch. Đại lượng đặc trưng cho hoạt độ tinh sạch của chế phẩm enzyme là hoạt tính riêng. Hoạt tính riêng được tính như sau: Hoạt tính (UI/g hay UI/ml) Hoạt tính riêng (UI/mg protein) = Hàm lượng protein (mg/g hay mg/ml) (Công thức 4) 2.2.9. Phương pháp trích ly enzyme chitosanase Canh trường sau nuôi cấy được trộn đều bằng đũa thủy tinh, cân xác định trọng lượng. Tiến hành chiết với nước cho đến khi dịch chiết cuối cho kết quả âm tính khi thử hoạt tính với DNS. Cộng tất cả các thể tích nước dùng để chiết enzyme lại, từ đó suy ra thể tích nước cất cần dùng để chiết enzyme từ canh trường theo tỷ lệ xác định (canh trường : nước cất = w : ml). Tiến hành lọc và thu dịch lọc. Bảo quản dịch lọc trong tủ lạnh ở 4oC [5]. 48
59. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 2.2.10. Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý thống kê 2.2.10.1. Bố trí thí nghiệm Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố (CRD: Completely Randomized Design) 3 lần lặp lại. 2.2.10.2. Xử lý thống kê Số liệu thu được của các nghiệm thức được phân tích biến lượng đơn yếu tố (One – way Anova) để đánh giá sự khác biệt giữa chúng và phân nhóm xếp hạng, thao tác trên phần mềm Microsoft Excel. 2.2.11. Bố trí thí nghiệm 2.2.11.1. Thí nghiệm khảo sát chọn chủng nấm mốc sinh tổng hợp chitosanase cao a. Thí nghiệm định tính khả năng sinh tổng hợp chitosanase Tiến hành như các phương pháp đã nêu ở mục 2.2.3 và 2.2.4 để định tính khả năng sinh tổng hợp chitosanase của các chủng nấm mốc. b. Thí nghiệm định lượng Tiến hành nuôi cấy các chủng nấm mốc trên môi trường lên men bán rắn (mục 2.1.5.4) ở nhiệt độ phòng. Giống được cấy từ các ống thạch nghiêng, 2 ml huyền phù bào tử cho mỗi bình nuôi cấy. Sau 24 giờ nuôi cấy, tiến hành trích ly enzyme, xác định hoạt tính chế phẩm dịch chiết enzyme. * Kết thúc thí nghiệm này, sẽ chọn được một chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp chitosanase cao nhất. Chủng được chọn sẽ được tiến hành các thí nghiệm tiếp theo nhằm tối ưu hóa một số điều kiện nuôi cấy, để tạo ra điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp nhiều chitosanase nhất. 2.2.11.2. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất cảm ứng Tiến hành pha môi trường lên men bán rắn có tỷ lệ giữa các thành phần cơ bản như Bảng 2.4.: Bảng 2.4. Các nghiệm thức khảo sát nồng độ cơ chất cảm ứng lên khả năng sinh tổng hợp Chitosanase (NT: nghiệm thức, 1 – 6: thứ tự nghiệm thức, Chi*: chitosan). Thành phần NT NT NT NT NT NT môi trường 1 2 3 4 5 6 Cám:Trấu:Chi* 80:10:10 70:10:20 60:10:30 50:10:40 40:10:50 30:10:60 49
60. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. Độ ẩm môi trường được điều chỉnh về 60% bằng dịch khoáng (mục 2.1.5.4.). Tỷ lệ giống cấy là 2 ml huyền phù bào tử với mật độ bào tử là 4,6. 106 /ml. Sau 24 giờ nuôi cấy, thu chế phẩm, xác định hoạt tính enzyme và hàm lượng protein của dịch chiết enzyme. Từ chỉ số hoạt tính và hàm lượng protein – enzyme text được, chọn ra tỷ lệ cơ chất cảm ứng sinh tổng hợp chitosanase tốt nhất. 2.2.11.3. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của độ thoáng khí Độ thoáng khí của môi trường không những đóng vai trò là chất tạo xốp và giá thể mà còn ảnh hưởng đến độ ẩm môi trường cũng như sự phát triển của nấm. Trong thí nghiệm này, tiến hành thay đổi nồng độ trấu theo các dãy tuyến tính từ 5 – 20%, cùng với sự thay đổi này sẽ phải đồng thời giảm lượng cám gạo để đảm bảo khối lượng bình nuôi cấy đạt 100%. Nồng độ chitosan được giữ cố định ở 40%, độ ẩm môi trường 60%, cấy giống 2 ml dịch huyền phù bào tử mật độ 4,6. 106 bào tử/ml, nuôi cấy ở nhiệt độ phòng sau 24 giờ nuôi cấy thì tiến hành kiểm tra hoạt tính và hàm lượng protein trong từng nghiệm thức từ đó chọn ra nghiệm thức tốt nhất. 2.2.11.4. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường Độ ẩm vừa ảnh hưởng lên sự sinh trưởng, vừa ảnh hưởng đến sự trao đổi chất của vi sinh vật trong quá trình lên men bán rắn. Trong thí nghiệm này, độ ẩm được bổ sung và điều chỉnh bằng dịch khoáng để môi trường đạt các độ ẩm: 30%, 40%, 50%, 60% và 70%. Tỷ lệ cơ chất chitosan vừa được tối ưu được giữ cố định cùng các yếu tố khác. Tỷ lệ giống cấy là 2 ml huyền phù bào tử với mật độ bào tử là 4,6. 106/ml. Sau 24 giờ nuôi cấy, thu chế phẩm, xác định hoạt tính enzyme và hàm lượng protein của dịch chiết enzyme. Từ chỉ số hoạt tính và hàm lượng protein – enzyme tìm được, chọn ra độ ẩm tốt nhất để cảm ứng sinh tổng hợp chitosanase. 2.2.11.5. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống Dựa trên kết quả khảo sát tỷ lệ cơ chất cảm ứng và độ ẩm môi trường tối ưu. Chuẩn bị môi trường với các thông số đã xác định này, tiến hành cấy giống với mật 50
61. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. độ bào tử xác định là 4,6. 106 bào tử/ml theo các tỷ lệ khác nhau là: 0,5 ml; 1 ml; 1,5 ml; 2,0 ml; 2,5 ml và 3 ml. Sau 24 giờ nuôi cấy, thu chế phẩm, xác định hoạt tính enzyme và hàm lượng protein của dịch chiết enzyme. Từ chỉ số hoạt tính và hàm lượng protein – enzyme tìm được, chọn ra tỷ lệ cấy giống tốt nhất để cảm ứng sinh tổng hợp chitosanase. 2.2.11.6. Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy Sau khi đã xác định được các yếu tố môi trường tối ưu, trong thí nghiệm này, tiến hành nuôi cấy trên hệ môi trường được tối ưu với các mốc thời gian nuôi cấy khác nhau: 8 giờ, 16 giờ, 24 giờ, 32 giờ, 40 giờ, 48 giờ, 56 giờ, 64 giờ và 72 giờ. Kết thúc quá trình nuôi cấy theo các mốc thời gian, tiến hành thu chế phẩm, xác định hoạt tính enzyme và hàm lượng protein của dịch chiết enzyme. Từ chỉ số hoạt tính và hàm lượng protein – enzyme tìm được, chọn ra thời gian nuôi cấy tốt nhất để cảm ứng sinh tổng hợp chitosanase. 2.2.11.7. Nuôi cấy thu enzyme chitosanase Nuôi cấy chủng nấm mốc được chọn trên môi trường đã tối ưu hóa, tiến hành thu enzyme, kiểm tra hoạt tính và hàm lượng protein của enzyme thu được. 51
62. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 3.1. Khả năng sinh tổng hợp chitosanase từ năm chủng nấm mốc khảo sát 3.1.1. Định tính khả năng sinh tổng hợp chitosanase Tiến hành khảo sát khả năng phân giải chitosan trên môi trường định tính chitosanase theo mục 2.2.11.1 Kết quả thí nghiệm được ghi nhận và trình bày ở Bảng 3.1. Bảng 3.1: Đường kính vành khuyên phân giải chitosan theo phương pháp cấy điểm của các chủng O1, O2, N1, N3, N7. Đường kính vành khuyên Chủng Nhận xét chung phân giải (mm) Vành khuyên phân giải to, O1 63 ± 0,7 màu hơi vàng Vành khuyên phân giải to, O2 62 ± 0,6 màu sáng N1 35 ± 1,5 Màu hơi vàng N3 30 ± 0,9 Màu sáng, rõ N7 28 ± 0,9 Màu sáng, rõ * Nhận xét: - Cả 5 chủng khảo sát đều có khả năng phân giải chitosan, tuy nhiên khả năng sinh tổng hợp chitosanase không tương đồng. - Chủng N3 và N7 cho kết quả khảo sát thấp nhất trong cả năm chủng, điều này chứng tỏ về mặt định tính thì khả năng sinh tổng hợp chitosanase của 2 chủng này là rất thấp. - Chủng N1 tuy kết quả khảo sát có cao hơn chủng N3 và N7 nhưng sai số giữa các lần khảo sát tương đối lớn, điều này phần nào cho thấy khả năng phân giải chitosan của chủng này không ổn định. - Chủng O1 và O2 là hai chủng có kết quả khảo sát cao nhất trong cả năm chủng và khả năng sinh tổng hợp của hai chủng này cũng tương đồng nhau trong các lần thí nghiệm. - Tóm lại qua kết quả thí nghiệm định tính này có thể sơ bộ nhận thấy được khả năng sinh tổng hợp của từng chủng, quan trọng nhất là có thể định tính được chủng có khả năng sinh tổng hợp chitosanase cao trong các chủng khảo 52
63. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. sát (chủng O1 và O2). Ngoài ra, kết quả này cũng phần nào là sự đối chiếu cho kết quả định lượng tiếp theo. 3.1.2. Định lượng khả năng sinh tổng hợp chitosanase Tiến hành định tính khả năng sinh tổng hợp chitosanase như mục 2.2.11.1, kết quả thí nghiệm được ghi nhận trong Bảng 3.2: Bảng 3.2: Bán kính vòng thủy phân và hoạt tính chitosanase của các chủng nấm mốc sau 24 giờ nuôi cấy. Chủng Đường kính (mm) Hoạt tính enzyme (UI/g) O1 17,5 ± 0,5 0,089 ± 0,0277 O2 19,17 ± 0,2887 0,1632 ± 0,0153 N1 16,17 ± 0,7637 0,0545 ± 0,005 N3 12,17 ± 1,0408 0,0317 ± 0,001 N7 11,17 ± 1,0408 0,0199 ± 0,0049 0.18 0.1632 25 0.16 19.17 0.14 20 0.12 15 0.1 Hoạt tính (UI/g) 0.08 10 0.06 Bán kính vòng 0.04 5 thủy phân (mm) Hoạttính (UI/g canhtrường) 0.02 Đường kínhthủy vòng (mm) phân 0 0 O1 O2 N1 N3 N7 Chủng Biểu đồ 3.1: Biểu diễn bán kính vòng thủy phân và hoạt tính chitosanase của các chủng nấm mốc khảo sát sau 24 giờ nuôi cấy. * Nhận xét: từ Biểu đồ 3.1 có thể dễ dàng nhận thấy chủng O2 là chủng có khả năng sinh tổng hợp chitosanase cao nhất trong năm chủng khảo sát trên môi trường lên men bán rắn. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả định tính mục 3.1.1. Thực tế nuôi cấy trên môi trường bán rắn cũng cho thấy kết quả tương tự vì chủng O2 phát triển nổi bật so với 4 chủng khác. 53
64. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. Chính vì vậy, chủng O2 sẽ được chọn là đại diện để tiến hành các khảo nghiệm tiếp theo cho việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy. 3.2. Hình thái đại thể và vi thể của chủng O2 3.2.1. Hình thái đại thể Kết quả quan sát đại thể chủng O2 được ghi nhận ở Hình 3.1: Hình 3.1: Hình thái đại thể chủng O2, mặt trên khuẩn lạc trái) và mặt dưới khuẩn lạc (phải). * Nhận xét: tốc độ phát triển của chủng O2 trên môi trường PGA tương đối nhanh, tơ có dạng bông, khi còn non khuẩn lạc có màu trắng, khi tiếp tục phát triển, khuẩn lạc chuyển thành vàng hoa cau, đây là màu của bào tử đính. Màu khuẩn lạc sẽ tiếp tục xanh lên và sẽ đậm hơn khi bào tử già đi. Mặt sau khuẩn lạc không chuyển màu, điều này chứng tỏ chủng O2 không tiết sắc tố vào môi trường. 54
65. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 3.2.2. Hình thái vi thể Hình 3.2: Khuẩn ty (trái) và cuống sinh bào tử (phải) chủng O2 khi chưa nhuộm - ảnh được quan sát và ghi nhận ở vật kính 40. Hình 3.3: Khuẩn ty (trái) và cuống sinh bào tử (phải) chủng O2 khi nhuộm Methylene Blue - ảnh được quan sát và ghi nhận ở vật kính 40. * Nhận xét: khuẩn ty chủng O2 không màu, phân nhánh rất nhiều, có vách ngăn rõ rệt chia sợi thành nhiều bao tế bào (nấm đa bào), cuống bào tử rẽ nhánh từ các sợi khuẩn ty và mọc thẳng đứng. Đầu cuống bào tử phân thành nhiều sợi mọc tròn đều khắp cả cuống, đầu các sợi này có nhiều bào tử hình tròn đính vào nhau như sợi chuỗi (bào tử đính). 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase 55
66. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. Trong thí nghiệm này, tiến hành như trình tự đã nêu trong mục 2.2.11.2, kết quả được ghi nhận trong Bảng 3.3 và biểu diễn dưới dạng đồ thị (Đồ thị 3.2): Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase. Tỷ lệ cơ chất STT Hoạt tính enzyme (UI/g) (Cám : Trấu : Chitosan) 1 80 : 10 : 10 0,1436 ± 0,001 2 70 : 10 : 20 0,1636 ± 0,0088 3 60 : 10 : 30 0,1949 ± 0,0196 4 50 : 10 : 40 0,2458 ± 0,0132 5 40 : 10 : 50 0,1393 ± 0,0047 6 30 : 10 : 60 0,0594 ± 0,0170 0.3 0.2458 0.25 0.1949 0.2 0.1636 0.1436 0.15 0.1393 Hoạt tính (UI/g) 0.1 0.0594 Hoạttính (UI/g canhtrường) 0.05 0 80:10:10 70:10:20 60:10:30 50:10:40 40:10:50 30:10:60 Tỷ lệ (cám : trấu : chitosan / w : w : w) Biểu đồ 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase. * Nhận xét: từ kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase (Bảng 3.3) và Biểu đồ 3.2 dễ dàng nhận thấy tỷ lệ cám gạo : trấu : chitosan tương đương 50 : 10 : 40 theo khối lượng là nghiệm thức cho kết quả khảo sát hoạt tính chitosanase cao nhất. Điều này có nghĩa ở nồng độ tỷ lệ cám : trấu : chitosan = 50 : 10 : 40 là tỷ lệ cơ chất thích hợp để sinh tổng hợp nhiều chitosanase nhất trong các tỷ lệ thí nghiệm, hoạt tính đạt cao nhất trung bình là 56
67. Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp. 0,3342 (UI/g canh trường). Nếu tiếp tục tăng nồng độ chitosan lên thì hoạt tính enzyme theo kết quả thể hiện là giảm đi rất đáng kể. Trên thực tế khi quan sát khách quan về khả năng mọc của nấm giữa các nghiệm thức thì ở các nồng độ 50% và 60% mật độ nấm mọc tương đối thưa, điều này chứng tỏ ở các nồng độ này nấm có thể bị ức chế và làm chậm quá trình nẩy chồi của bào tử cũng như khả năng lan tơ. Mặt khác, vì trong thí nghiệm này mục đích quan trọng là tìm ra mối tương quan giữa nồng độ cám gạo và chitosan, cho nên khi tăng nồng độ chitosan lên thì cũng đồng nghĩa với việc phải giảm nồng độ cám gạo. Cám gạo là nguồn dinh dưỡng ban đầu rất quan trọng, nó có tác dụng làm cho nấm thích nghi tốt trong môi trường lên men khi chuyển từ môi trường nhân giống vào môi trường lên men. Việc giảm nồng độ cám gạo xuống cũng đồng nghĩa với việc làm cho pha thích nghi của nấm trở nên dài hơn. Đây cũng là một nguyên nhân có thể làm chậm sự phát triển của nấm trong môi trường có nồng độ chitosan cao và ít cám gạo. Tuy nhiên, nếu chỉ hoạt tính enzyme cao thôi thì vẫn chưa đủ căn cứ để kết luận. Bản chất của enzyme chính là protein, vì vậy hàm lượng protein trong dịch enzyme thu được cũng là một phần của điều kiện cần xét để có thể đưa ra kết luận chính xác. Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng đến hàm lượng protein Tỷ lệ cơ chất STT Hàm lượng Protein (mg/g) (Cám : Trấu : Chitosan) 1 80 : 10 : 10 0,0194 ± 0,0187 2 70 : 10 : 20 0,0503 ± 0,0146 3 60 : 10 : 30 0,0909 ± 0,0470 4 50 : 10 : 40 0,1214 ± 0,0152 5 40 : 10 : 50 0,0690 ± 0,0152 6 30 : 10 : 60 0,021 ± 0,0119 57