Đồ án Bước đầu nghiên cứu phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp. từ phụ phế phẩm có hoạt tính kháng nấm sinh aflatoxin

74 trang thiennha21 12/04/2022 5670

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Bước đầu nghiên cứu phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp. từ phụ phế phẩm có hoạt tính kháng nấm sinh aflatoxin", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_buoc_dau_nghien_cuu_phan_lap_tuyen_chon_vi_khuan_bacil.pdf

Nội dung text: Đồ án Bước đầu nghiên cứu phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp. từ phụ phế phẩm có hoạt tính kháng nấm sinh aflatoxin

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đƣợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. Sinh viên thực hiện luận văn Trần Chi Phúc
LỜI CÁM ƠN Đầu tiên, con xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến cha mẹ và gia đình đã luôn bên cạnh, cổ vũ, động viên và giúp đỡ con mỗi khi gặp khó khăn trong suốt quá trình quá trình học tập và thực hiện Đồ án. Em xin cám ơn thầy, cô thuộc khoa CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MÔI TRƢỜNG, Trƣờng Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ dạy và truyền đạt cho em đầy rất kiến thức trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Đặc biêt, em chân thành cám ơn cô Ts. Nguyễn Hoài Hƣơng đã tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn và truyền đạt cho em rất nhiều kiến thức trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện đồ án. Em cũng xin cám ơn quý thầy, cô phụ trách Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, Khoa CÔNG NGHỆ SINH HỌC – THỰC PHẨM – MÔI TRƢƠNG, Trƣờng Đại Học Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp cho em thực hiện và hoàn thành Đồ án tốt nghiệp của mình. Tôi xin cám ơn sự giúp đỡ rất nhiệt tình của các cộng sự và tất cả các bạn làm việc tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học đã giúp đỡ cho tôi trong suốt quá trình thực hiện Đồ án tốt nghiệp của mình. TP. Hồ Chi Minh, ngày tháng năm 2014. Trần Chí Phúc
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH ẢNH v MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Độc tố nấm mốc 3 1.2. Độc tố aflatoxin 3 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu 3 1.2.2. Tính chất vật lý và phân loại 4 1.2.3. Sự tạo thành aflatoxin do nấm mốc 5 1.2.4. Cơ chế gây độc của aflatoxin 7 1.2.5. Độc tính của aflatoxin 8 1.2.6. Giới hạn mức cho phép độc tố aflatoxin 10 1.2.7. Tình hình nhiễm độc aflatoxin 11 1.2.8. Phương pháp phát hiện aflatoxin 12 1.3. Phƣơng pháp khử nhiễm aflatoxin 15 1.3.1. Phương pháp vật lý học 15 1.3.2. Phương pháp hóa học 17 1.3.3. Phương pháp sinh học 18 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. Thời gian – địa điểm nghiên cứu 20 2.2. Vật liệu - Thiết bị - Hóa chất 20 2.2.1. Vật liệu 20 2.2.2. Thiết bị và dụng cụ 20 2.2.3. Môi trường – Hóa chất 20 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 22 i
Đồ án tốt nghiệp 2.3.1. Phương pháp luận 22 2.3.2. Bố trí thí nghiệm 23 2.3.3. Một số phương pháp khảo sát sinh hóa vi khuẩn 34 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1. Phân lập các chủng khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo cách tiếp cận thứ nhất 40 3.1.1. Khảo sát khả năng đối kháng các chủng khuẩn phân lập với nấm bằng phương pháp đồng nuôi cấy trên môi trường hỗn hợp 40 3.1.2. Khảo sát khả năng đối kháng với nấm của dịch ly tâm canh trường nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường hỗn hợp 42 3.2. Phân lập các chủng khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo cách tiếp cận thứ hai. 43 3.2.1. Khảo sát khả năng đối kháng các chủng khuẩn phân lập với nấm mốc trên môi trường PDA 47 3.2.2. Khảo sát khả năng ức chế khả năng sinh aflatoxin của các chủng khuẩn phân lập với nấm trên môi trường CCA 48 3.3. Khảo sát sinh hóa của chủng khuẩn phân lập đƣợc 50 3.3.1. Nhuộm bào tử 50 3.3.2. Thử nghiệm Simmon citrate 51 3.3.3. Thử nghiệm catalase 52 3.3.4. Thử nghiệm protease 52 3.3.5. Thử nghiệm chitinase 53 3.3.6. Thử nghiệm lên men carbohydrate 53 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 57 4.1. Kết luận 57 4.2. Đề nghị 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC ii
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC VIẾT TĂT A.O.A.C: Association of Analytical Communities CCA: coconut cream agar Ctv: cộng tác viên ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FDA: Food and Drug Administration HPTLC : high ferformane thin layer chromatography TLC NA: Nutrient agar NB: Nutrient broth PDA: Potato dextrose agar PDB: Potato dextrose broth ppb: parts per billion TFA: Tryfloacetic acid TLC: Thin layer chromatographi UV: Ultraviolet iii
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG TRANG Bảng 1.1. Tính chất hóa lý một số aflatoxin 5 Bảng 1.2. Một số loài nấm có khả năng sinh aflatoxin 6 Bảng 1.3. Ảnh hƣởng của aflatoxin có mặt trong thức ăn đến các biểu hiện bệnh lý ở vật nuôi 9 Bảng 1.4. Giới hạn aflatoxin ở 1 số nƣớc theo tiêu chuẩn FDA 10 Bảng 1.5. Những quy định tạm thời cho phép trong thức ăn chăn nuôi và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam 11 Bảng 1.6. Các phƣơng pháp khử nhiễm aflatoxin bằng con đƣờng sinh học 16 Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái và nguồn gốc các chủng vi khuẩn phân lập 40 Bảng 3.2. Kết quả thử nghiệm sinh hóa vi khuẩn CS1b. 51 iv
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH TRANG Hình 1.1. Cơ chế tác dụng của aflatoxin B1 ở mức tế bào gan. 7 Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát phân lập tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm sinh aflatoxin 23 Hình 2.2. Sơ đồ trình bày chi tiết phân lập tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm mốc theo cách tiếp cận thứ nhất 24 Hình 2.3. Sơ đồ trình bày chi tiết phân lập tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm mốc theo cách tiếp cận thứ hai 29 Hình 3.1. Kết quả đối kháng của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc trên môi trƣờng hỗn hợp. 41 Hình 3.2. Kết quả đối kháng nấm của các dịch tăng sinh trên môi trƣờng PDA 44 Hình 3.3. Chủng vi khuẩn CS1a phân lập từ trái cà phê. 45 Hình 3.4. Chủng vi khuẩn CS1b phân lập từ trái cà phê. 46 Hình 3.5. Kết quả đối kháng nấm của các dịch ly tâm canh trƣờng với nấm mốc trên môi trƣờng PDA. 48 Hình 3.6. Kết quả ức chế sự phát triển và khả năng tổng hợp aflatoxin của nấm mốc bởi dịch ly tâm canh trƣờng vi khuẩn trên môi trƣờng CCA. 49 Hình 3.7. Kết quả nhuộm bào tử khuẩn CS1b 51 Hình 3.8. Thử nghiệm Simmon citrate. CS1b cho kết quả dƣơng tính 51 Hình 3.9. Thử nghiệm catalase. CS1b cho kết quả dƣơng tính. 52 Hình 3.10. Thử nghiệm protease. Chủng CS1b cho kết quả dƣơng tính. 52 Hình 3.11. Kết quả thí nghiệm chintinase. Chủng CS1b cho kết quả âm tính. 53 Hình 3.12. Kết quả lên men Glucose. Chủng CS1b cho kết quả dƣơng tính 54 Hình 3.13. Kết quả lên men Lactose. Chủng CS1b cho kết quả âm tính 54 Hình 3.14. Kết quả lên men Sucrose. Chủng CS1b cho kết quả âm tính. 55 Hình 3.15. Kết quả lên men Sucrose. Chủng CS1b cho kết quả âm tính 55 v
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề - Mycotoxin hay độc tố nấm mốc là nhóm độc chất tự nhiên do nấm mốc sản xuất ra trong quá trình phát triển. Ngƣời ta đã phát hiện ra hàng ngàn loại mycotoxin (đƣợc sinh ra chủ yếu bởi 3 nhóm nấm mốc chính là Aspergillus, Penicillium và Fusarium), trong đó phải kể đến là aflatoxin. Aflatoxin vừa gây độc cấp tính (ở liều lƣợng lớn có thể gây chết một số loài gia súc, gia cầm) vừa gây độc mãn tính (ở liều lƣợng thấp tích tụ ở gan, gây rối loạn chức năng, suy giảm miễn dịch, thoái hóa gan thận ). Một số nghiên cứu cũng chứng minh rằng aflatonxin là nguyên nhân gây ung thƣ cho động vật thí nghiệm, do đó có thể rất nguy hiểm đối với con ngƣời. Nhóm độc tố aflatoxin sinh ra chủ yếu bởi hai loài nấm mốc là Aspergillus flavus và Aspergillus parisiticus. Các loài nấm mốc này có mặt rất nhiều ở một số loại lƣơng thực nhƣ ngô, lạc và một vài loại hạt có chứa dầu. Trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm tƣơng đối cao nhƣ nƣớc ta, việc bảo quản nguồn lƣơng thực sau thu hoạch cũng nhƣ các nguồn nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi là hết sức cần thiết. Nếu không có điều kiện bảo quản thích hợp sẽ là điều kiện rất thuận lợi cho sự xâm nhập và phát triển của nấm mốc sinh aflatoxin. Ngoài việc làm giảm chất lƣợng dinh dƣỡng cho lƣơng thực là nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi, mà còn gây tích tụ độc tố trong chính các nguồn này. Điều này sẽ gây ra những tổn thất rất lớn cho ngành chăn nuôi nói chung và cho ngƣời nông dân nói riêng. Bên cạnh đó, việc sử dụng các nguồn lƣơng thực và thực phẩm có tích tụ độc tố aflatoxin sẽ ảnh hƣởng không nhỏ đến sức khỏe ngƣời tiêu dung. - Nhận ra đƣợc tình hình thực tế đó, các nhà khoa trong nƣớc và thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu nhằm giải quyết vấn đề này. Các tác nhân nhƣ vật lí, hóa học đã đƣợc đƣa ra thí nghiệm nhằm làm mất hiệu lực của aflatoxin. Đặc biệt, xu hƣớng đang đƣợc chú trọng hiện nay là dựa vào các tác nhân vi sinh vật. Các loài nấm mốc (Rhizopus stolonifer, Rhizopus arrhizus), vi khuẩn (Bacillus subtilis, Bacillus pulimus ) đã đƣợc thử nghiệm khả năng làm giảm aflatoxin và đã thu đƣợc những kết quả khá khả quan. 1
Đồ án tốt nghiệp - Vì những lí do thực tiễn nhƣ trên, chúng tôi quyết định chọn đề tài: “ Bƣớc đầu nghiên cứu phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp. từ phụ phế phẩm có hoạt tính kháng nấm sinh aflatoxin.” Trong khóa luận tốt nghiệp này. 2. Mục đích - Phân lập và tuyển chọn đƣợc các vi khuẩn có khả năng kháng nấm. 3. Mục tiêu đề tài - Bƣớc đầu phân lập tuyển chọn Bacillus spp. từ phụ phế phẩm có khả năng kháng nấm sinh aflatoxin. 4. Nôi dung đồ án - Phân lập các chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm mốc sinh aflatoxin. - Sàng lọc và tuyển chọn vi khuẩn dựa trên hoạt tính đối kháng và hoạt tính ức chế sinh tổng hợp aflatoxin của nấm mốc. - Định danh sơ bộ vi khuẩn và xác định cơ chế kháng nấm mốc sinh aflatoxin bằng các thử nghiệm sinh hóa. 5. Kết cấu đồ án - Chƣơng I: Tổng quan tài liệu – nội dung chƣơng đề cập đến các nội dung liên quan đến tài liệu nghiên cứu. - Chƣơng II: Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu – nội dung chƣơng đề cập đến các dụng cụ, thiết bị và các phƣơng pháp nghiên cứu trong đồ án. - Chƣơng III: Kết quả và thảo luận – nội dung chƣơng đƣa ra những kết quả mà đề tài thực hiện đƣợc và đƣa ra những thảo luận, biện chứng cho kết quả thu đƣợc. - Chƣơng IV: Kết luận và đề nghị - nội dung chƣơng tóm lại những kết quả mà đề tài đạt đƣợc và đề nghị cho những hƣớng cần cải thiện thêm trong đề tài. 2
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Độc tố nấm mốc: - Độc tố nấm mốc hay còn gọi là mycotoxin là những hợp chất có phân tử nhỏ, khá bền trong các điều kiện, là sản phẩm của sự trao đổi chất thứ cấp trong quá trình phát triển của loài vi nấm. Các mycotoxin dễ dàng xâm nhập và giữ đƣợc độc tính trong các chuỗi thức ăn do cực kỳ khó khăn để loại bỏ hoặc tiêu diệt. - Độc tố nấm mốc đƣợc phát hiện lần đầu liên vào năm 1960, sau cái chết hàng loạt của hàng trăm cá thể tại các trang trại gà tây ở Anh. (T. Asao và ctv,1963; F.Wu và P. Khlangwiset, 2010) - Cho đến nay có trên 300 loại độc tố nấm mốc đã đƣợc phát hiện và nghiên cứu. Nhƣng chỉ có 20 loại độc tố nấm mốc có độc tính gây hại. - Bệnh nấm mốc ở ngƣời và động vật đều không có khả năng lây lan vì chúng do tác nhân độc tố (hóa học) gây ra.Tuy nhiên, hầu nhƣ tất các sản phẩm thực vật đều có thể là cơ chất cho sự phát triển của nấm mốc và sự tạo mycotoxin tiếp theo, và vì thế nó có khả năng nhiễm trực tiếp cho thực phẩm của con ngƣời. Khi gia súc ăn các thức ăn có nhiễm mycotoxin, chúng không chỉ chịu tác dụng trực tiếp mà còn là nguồn mang mycotoxin vào sữa, thịt, và nhƣ vậy tạo sự nhiễm mycotoxin tiếp theo cho con ngƣời. 1.2. Độc tố aflatoxin: 1.2.1. Lịch sử nghiên cứu: - Aflatoxin là mycotoxin đƣợc phát hiện sớm nhất vào năm 1961 bởi nhà khoa học Butler. Qua việc xác định đƣợc loài Aspergillus flavus tiết ra độc tố gây chết hàng loạt gà tây ở Anh, ông đặt tên cho độc tố này là aflatoxin (độc tố sinh ra bởi Aspergillus flavus). (W.H Butler, 1964) - Các công trình nghiên cứu sau đó đã xác nhận rằng Aflatoxin đƣợc tạo bởi nấm Aspergillus flavus và có thể là nguyên nhân gây khối u ở gan động vât. (Halver, 1969; Wales, 1970; New, 1987 trích dẫn bởi Chaver-Sanchelez, 1994). 3
Đồ án tốt nghiệp - Từ đó trở đi có nhiều công trình nghiên cứu về độc tố Aflatoxin. Các nhà khoa học cũng đã xác định đƣợc công thức phân tử và công thức cấu tạo của Aflatoxin. 1.2.2. Tính chất vật lý và phân loại: - Aflatoxin là một nhóm khoảng 20 chất là sản phẩm trao đổi bởi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Bốn nhóm aflatoxin chính đƣợc tạo ra trong tự nhiên là B1, B2, G1 và G2. Bốn chất đƣợc phân biệt trên cơ sở màu phát quang của chúng. B là chữ viết tắt của Blue (màu xanh nƣớc biển), và G là chữ viết tắt của Green (màu xanh lá cây). Aflatoxin B1 và B2 trong sữa bò đƣợc chuyển hóa và gọi là aflatoxin M1 và aflatoxin M2 (M là chữ viết tắt của Milk). (F. Wu và P. Khlangwiset, 2010) - Trong bốn loại aflatoxin, aflatoxin, aflatoxin B1 đƣợc tìm thấy ở nồng độ cao nhất, sau đó là G1, còn B2 và G2 tồn tại ở nồng độ thấp hơn chúng có công thức cấu tạo nhƣ sau: O O O O O O O O OCH3 O O OCH3 Aflatoxin B1 Aflatoxin B2 O O O O O O OH OH O O OCH3 O O OCH3 Aflatoxin M1 Aflatoxin M2 O O O O O O O O O O OCH3 O O OCH3 Aflatoxin G2 Aflatoxin G1 4
Đồ án tốt nghiệp - Các aflatoxin tan trong methanol, acetone và chloroform, không tan trong dung môi không phân cực. Aflatoxin tƣơng đối không ổn định khi tiếp xúc với ánh sáng, đặc biêt là khi tiếp xúc với tia cực tím, các tác nhân oxy hóa, trong các dung môi phân cực hay trong các dung dịch có pH nhỏ hơn 3 hay lớn hơn 10. Aflatoxin có nhiệt độ nóng chảy từ 2370C (G1) đến 2990C (M1), nhƣng không bị phá hủy trong điều kiện nấu ăn bình thƣờng. Có thể phân hủy hoàn toàn chúng bằng nồi hấp tiệt trùng có bổ sung thêm ammoniac hoặc xử lý bằng chất tẩy rữa. Bảng 1.1 Tính chất hóa lý của một số aflatoxin. Công Trọng Điểm nóng Aflatoxin thức phân lƣợng Huỳnh quang chảy (0C) tử phân tử B1 C17H12O6 312 268-269 Xanh lam B2 C17H14O6 314 268-289 Xanh lam G1 C17H12O7 328 244-246 Xanh lục G2 C17H14O7 330 229-231 Xanh lục M1 C17H12O7 328 299 Xanh lam tím M2 C17H14O7 320 293 Tím Nguồn: Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003 1.2.3. Sự tạo thành aflatoxin do nấm mốc: - Sự tạo thành aflatoxin chủ yếu đƣợc tìm thấy ở hai chủng nấm mốc Asp.flavus và Asp. parasiticus. Các chủng tạo aflatoxin của Asp. flavus là rất phổ biến và thƣờng đƣợc phân lập từ các nguồn khác nhau nhƣ lạc, hạt bông, hạt gạo, lúa Theo số liệu của Schoroder và Boller (1976), có từ 20-98% các chủng phân lập của Asp. flavus có khả năng tạo aflatoxin. - Ngoài hai loài Asp. flavus và Asp. parasiticus còn có một số loài khác cũng có khả năng sinh aflatoxin nhƣng yếu hơn nhƣ Asp. nominus (C.P. Kurtzman và ctv, 1987) và Asp. bombycis (S.W. Peterson và ctv,2001). 5
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.2 Một số loài nấm mốc có khả năng sinh aflatoxin. Aflatoxin Loài nấm mốc Tác giả B1 B2 G1 G2 Aspergillus flavus + + Sargeant và ctv, 1961 Aspergillus parasiticus + + + + Coduer và ctv, 1963 Aspergillus nomius + + + + Kurzman vad ctv, 1987 Aspergillus oryzae + Basappa và ctv, 1967 Aspergillus niger + Kulik và Holaday, 1967 Aspergillus wentii + Kulik và Holaday, 1967 Aspergillus ruber + Kulik và Holaday, 1967 Aspergillus ostianus + + Scot và ctv, 1968 Aspergillus orchraceus + Van Walbeck và ctv, 1968 Penicillium puberulum + + + + Kulik và Holaday, 1967 Penicillium variabile + Kulik và Holaday, 1967 Penicillium frequentans + Kulik và Holaday, 1967 Penicillium citrinum + Kulik và Holaday, 1967 Rhizopus sp. + Van Walbeck và ctv, 1968 Nguồn: Phạm Hoàng Thái, 2007. - Có nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh độc tố aflatoxin nhƣ chủng nấm mốc, nhiệt độ, hoạt độ của nƣớc, các yếu tố môi trƣờng - Các nhiệt độ cực tiểu, tối thích, và cực đại cho sự tạo aflatoxin là 120C, 270C và 40 – 420C theo thứ tự. Một số chủng nấm mốc bị mất hoạt tính sau nhiều lần cấy chuyển liên tiếp trên môi trƣờng không thích hợp, nhƣng khả năng sinh độc tố cũng có thể tăng khi chủng nấm mốc đƣợc cấy chuyển trên môi trƣờng thích hợp. - Môi trƣờng có bổ sung nấm men hoặc peptone hoặc là các axit amin cùng với điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp (pH=5 – 5,4; nhiệt độ 26 – 280C) là điều kiện tốt nhất cho sự tạo thành độc tố aflatoxin. 6
Đồ án tốt nghiệp 1.2.4. Cơ chế gây độc của aflatoxin. - Aflatoxin có khả năng liên kết với DNA trong nhân tế bào. Sự liên kết này gây ức chế enzym polymerase của RNA. Nó gây tác dụng hạn chế trong tổng hợp RNA và ức chế polymerase t-RNA. Đây là nguyên nhân gây hạn chế sự tổng hợp protein trong tế bào. Ngƣời ta cũng đã chứng minh rằng vòng α,β -lacton không bão hòa có trong phân tử aflatoxin làm cho hợp chất này có hoạt tính gây ung thƣ và cũng chính vòng lacton này gây ức chế tổng hợp DNA trong nhân tế bào, do đó nó làm rối loạn tăng trƣởng bình thƣờng của tế bào (M.F.Nexterin và V.I.A. Vixarinova, 1971, trích dẫn bởi Lê Anh Phụng, 2001). - Để có thể gây độc với tế bào gan cũng nhƣ tạo khối u, aflatoxin phải trải qua một quá trình biến đổi sinh học phức tạp, tạo thành dạng 2,3 – dihydrodiol (aflatoxin B1 – dhd) ở trong gan. Theo Neal và cộng sự (1981), hợp chất này là nguyên nhân gây hủy hoại gan rất nhanh. Nhóm dialdehyde phản ứng với nhóm amin của protein để tạo thành kiềm ship (Shiff’s base), gây ức chế sinh sinh tổng hợp DNA và gây nhiễm độc cấp tính. (Hình 1.1) Hình 1.1 Cơ chế tác dụng của aflatoxin B1 ở mức tế bào gan. (Cliford và Rces,1967 trích dẫn bởi bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc, 2003) 7
Đồ án tốt nghiệp 1.2.5. Độc tính của aflatoxin: Theo Dƣơng Thanh Liêm (2002), aflatoxin gây ra những tác hại rất lớn cho cơ thể con ngƣời và động vật. Những tác hại đó nhƣ sau: - Gây tổn thƣơng tế bào gan: tất cả các trƣờng hợp xác nhận sự ngộ độc aflatoxin đều có bệnh tích giống nhau là gan của động vật bị nhiễm đều hƣ hại nặng. Tùy theo mức độ nhiễm ít hay nhiều, lâu hay mau mà bệnh tích trên gan có biểu hiện khác nhau. Biểu hiện chung là: ban đầu gan biến thành màu vàng tƣơi, mật sƣng. Sau đó gan sƣng to lên, mật căng phồng và bắt đầu nổi mụt nhỏ trên bề mặt gan làm cho nó gồ ghề đôi khi có những nốt hoại tử màu trắng. Sau cùng do nhiễm khuẩn mà gan trở nên bở, dễ bể. - Thận cũng bị sƣng to làm cho việc bài thải chất độc ra khỏi cơ thể trở nên khó khăn. Từ đó làm cho triệu chứng ngộ độc trở nên trầm trọng. - Bào mòn ống tiêu hóa nên làm giảm khả năng tiêu hóa các chất dinh dƣỡng trong thức ăn. Đôi khi cũng thấy tổn thƣơng ở miệng, làm cho thú khó lấy thức ăn. - Làm giảm khả năng đề kháng của động vật, ức chế hệ thống sinh kháng thể. Do đó khi nhiễm aflatoxin cơ thể rất mẫn cảm với các bệnh thông thƣờng, có thể gây tử vong cho thú. - Làm thay đổi hoạt động sinh lý bình thƣờng, gây rối loạn sinh sản. - Làm giảm sự thèm ăn đối với thức ăn do sự phát triển của nấm mốc làm mất mùi thức ăn. - Làm thay đổi thành phần dinh dƣỡng có trong thức ăn, giá trị dinh dƣỡng bị hạ thấp, làm vật nuôi chậm phát triển. - Làm giảm thấp sự sinh trƣởng và giá trị kinh tế của vật nuôi. Hậu quả cuối cùng là có thể gây chết cho vật nuôi. 8
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.3. Ảnh hƣởng của aflatoxin có mặt trong thức ăn đến các biểu hiện bệnh lý ở vật nuôi. (Allcroff, 1969 trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc, 2003) Lƣợng Thời aflatoxin kỳ Ảnh hƣởng tới Loại gia súc trong thức ăn nuôi Tổn thƣơng gan phát triển và hiệu hằng ngày dƣỡng quả thức ăn (mg/kg) (tuần) 0.14 12 Trung bình Bình thƣờng Lợn 0.28 12 Nhẹ Giảm sút (20-70kg) 0.41 12 Nhẹ Giảm sút Lợn 0.28 và 0.41 20 Nhẹ Giảm sút (40-100kg) Lợn 0.69 7 Trung bình Bình thƣờng (70-100kg) Lợn nái Suy giảm và một 0.3-0.55 4 Rõ (có chửa) số con chết Gà tây Chậm phát triển và 0.25 4 Rõ (1 ngày tuổi) giảm trọng lƣợng. 0.2 7 Nhẹ Gà thịt Giảm trọng lƣợng 0.42 7 Nhẹ (1 ngày tuổi) trong 3 tuần. 0.5 7 Nặng Vịt Đặc điểm điển hình Giảm trọng lƣợng, 0.03 4 (7 ngày tuổi) nhiễm aflatoxin. chết 50%. Bê Giảm trọng lƣợng 0.2 16 Trung bình (4 ngày tuổi) từ 0-3 tháng. Giảm lƣợng sữa. Bò sữa 1.5 4 Trung bình Aflatoxin M1 có mặt trong sữa 9
Đồ án tốt nghiệp 1.2.6. Giới hạn mức cho phép độc tố aflatoxin. - Trƣớc thực trạng nhiễm aflatoxin trên lƣơng thực, thực phẩm ở mức độ cao cũng nhƣ tính độc của aflatoxin đối với động vật kinh tế và ảnh hƣởng của nó đối với sức khỏe con ngƣời, nhiều quốc gia trên thế giới đã có những quy định giới hạn aflatoxin nhiễm trong lƣơng thực, thực phẩm. Bảng 1.4. Giới hạn aflatoxin ở một số nƣớc theo tiêu chuẩn của FDA Giới han Aflatoxin Nƣớc Loại thức ăn cho phép Bột ngô sử dụng làm thức ăn cho gia súc, 20 ppb gia cầm ở tất cả các giai đoạn khác nhau. Mỹ Hàm lƣợng tối đa cho phép trong thức ăn 20 ppb cho gia súc, gia cầm hoặc trong nguyên liệu bột ngô. Châu Âu 5 ppb Thực phẩm sử dụng cho ngƣời. Thực phẩm chế biến từ lạc bao gồm tổng số Canada 15ppb tất cả các loại độc tố aflatoxin B1, B2, G1, G2 Thực phẩm chế biến từ dầu đậu tƣơng và Úc 15 ppb lạc. 10 ppb Cho tất cả các loại thực phẩm chứa B1. Nhật Cho các loại nguyên liệu chế biến thức ăn 100 ppb chăn nuôi. 30 ppb Tất cả các loại lƣơng thực, thực phẩm. Châu Á 120 ppb Trong các sản phẩm từ lạc. - Tại Việt Nam, Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn cũng đã ra quy định về hàm lƣợng tối đa aflatoxin B1 và hàm lƣợng tổng số các aflatoxin (B1+ B2 + G1+ G2) đƣợc tính bằng mg trong 1kg thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gia súc, gia cầm (ppb). 10
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.5. Những quy định tạm thời cho phép trong thức ăn chăn nuôi và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam. (Tài liệu của Vụ KHKT và CLSP Bộ Nông nghiệp và PTNT) Tổng số Aflatoxin Lƣợng Aflatoxin Nguyên liệu B1 + B2 + G1 + B1 tối đa (ppb) G2 (ppb) Ngô hạt 100 150 Sắn khô 50 100 Đậu tƣơng 50 100 Cám gạo 50 100 Bột cá 10 20 Thức ăn cho gà (1 – 21 ngày tuổi) 10 30 Thức ăn cho gà (nhóm còn lại) 30 50 Thức ăn cho vịt (1 – 21 ngày tuổi) 5 10 Thức ăn cho vịt (nhóm còn lại) 10 20 Thức ăn cho lơn con (1 – 60 ngày tuổi) 20 50 Thức ăn cho lợn (nhóm còn lại) 100 200 Bò nuôi lấy sữa 20 50 1.2.7. Tình hình nhiễm độc aflatoxin. - Aflatoxin có mặt trong rất nhiều sản phẩm nông nghiệp, đặc biệt là các loại hạt có dầu nhƣ lạc, đậu tƣơng và ngô (Blaney, 1985 trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc, 2003). Ở vùng Đông Nam Á và ở Úc, tỷ lệ nhiễm aflatoxin trong sản phẩm nông nghiệp là rất đáng kể. - Nhiễm aflatoxin là do điều kiện bảo quản kém, việc xâm nhập của sâu mọt trong bảo quản cũng tạo điều kiện thuận lợi cho sự lây lan và phát triển nhanh chóng của Aspergillus flavus. Trong điều kiện thuận lợi, Asp. flavus có thể tăng nhanh chỉ sau 3 – 7 ngày bảo quản. 11
Đồ án tốt nghiệp - Nhiễm độc aflatoxin ở lợn là một vấn đề quan trọng, gây thiệt hại khá lớn cho ngành chăn nuôi. Tại miền Bắc Carolina – Mỹ, theo nghiên cứu của Smith (1976) trong số 94 trƣờng hợp phát hiện aflatoxin có trong thức ăn chăn nuôi thì có đến 83 trƣờng hợp gây ngộ độc ở lợn, 7 trƣờng hợp ở bò và 4 trƣờng hợp ở gia cầm. Hàm lƣợng aflatoxin trung bình có trong thức ăn chăn nuôi là 389 ppb và ở ngô nguyên liệu làm thức ăn là 518 ppb. (Trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê thị Ngọc Diệp, 2003) - Ở khu vực Đông Nam Á, theo nhận xét của Ginting (1985) và Widiastut (1988), ngô và thức ăn cho gia cầm nhiễm aflatoxin với hàm lƣợng lên tới 200 ppb. Ở Úc, theo Barry J. Balaney, trong 161 mẫu thức ăn cho gia cầm đƣợc phân tích thì có 13 mẫu chứa aflatoxin, trong đó có 4 mẫu nhiễm aflatoxin với hàm lƣợng lên đến 50 ppb. (Trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê thị Ngọc Diệp, 2003). 1.2.8. Phƣơng pháp phát hiện aflatoxin: 1.2.8.1. Phương pháp phá t quang sinh hoc̣ : - Dùng tia cực tím tạo ra huỳnh quang màu vàng xanh sáng từ acid kojic (acid này đƣợc tạo ra do cùng một loại nấm sản sinh aflatoxin, chỉ gián tiếp phát hiện sự có mặt của aflatoxin). Phƣơng pháp này không thông duṇ g vì ít chính xác. 1.2.8.2. Phương pháp "ELISA test": - Dƣạ trên nguyên tắc kháng thể kháng nguyên p hát hiện aflatoxin (và các độc tố khác) thông qua những phƣơng tiện phát hiện nhanh, rẻ, dễ thực hiện, sử dụng kháng thể để "bắt" (có lựa chọn) độc tố đặc biệt đã đƣợc tách chiết từ hạt hay các thành phần của thƣ́ c ăn . Sau khi chiết, sẽ sử dụng bộ kiểm tra và thêm chất chỉ thị màu. Cƣờng độ màu sắc sẽ chỉ thị có độc tố hay không. 1.2.8.3. Phân tích aflatoxin bằng phương pháp sắc kí.  Phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng (Thin layer chromatographi-TLC ) - Phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng đƣợc sử dụng rộng rãi để xác định hàm lƣợng aflatoxin lần đầu tiên vào những năm 1960. Ngƣời ta sử dụng các bản mỏng đƣợc tráng bởi silicagel để xác định aflatoxin. 12
Đồ án tốt nghiệp - Dung môi sử dụng cho dung dịch chạy bản mỏng là chloroforin: methnol và choloroform: aceton. Việc thêm nƣớc vào hệ thống dung môi sẽ làm tăng khả năng hòa tan aflatoxin. - Hệ dung môi gồm nƣớc: aceton: chloroform (1.5:12:88 v/v) đƣợc đánh giá có khả năng hòa tan aflatoxin tốt nhất. Các bản mỏng đã đƣợc chảy qua các dung môi chạy đƣợc đƣa vào bởi đèn tử ngoại (UV) 365nm. Các vết mẫu phân tích tạo màu huỳnh quang xanh da trời hay xanh lá cây. Và có độ dài Rf đƣợc so sánh với các vết của aflatoxin tiêu chuẩn. Phƣơng pháp này có thể đƣợc xác định lƣợng từ 0.3-0.4 mg. - Nhƣợc điểm của phƣơng pháp là phụ thuộc vào ngƣời phân tích. Khi so sánh giữa mẫu và các vết của độc tố chuẩn có thể có sự sai lệch kết quả từ 20-30%. - Hội hóa học phân tích (A.O.A.C-1980) đã lƣu ý tới phƣơng pháp phân tích định lƣợng sử dụng TLC. Phƣơng pháp này đƣợc mở rộng thành chƣơng trình phân tích mẫu của tổ chức nghiên cứu ung thƣ thế giới. Các kết quả của chƣơng trình phân tích trên đã chứng nhận sự chính xác của phân tích bằng TLC vì sai số rất cao. Khẳng định sự có mặt của aflatoxin: - Một số chất đƣợc tách ra từ mẫu đôi khi dễ nhầm lẫn với aflatoxin, dẫn đến sự khẳng định sai lệch. Phƣơng pháp khẳng định sự có mặt của aflatoxin trực tiếp thực hiện trên bản sắc kí. Dựa vào sự biến đổi của aflatoxin thành các đồng phân có màu huỳnh quang khác so với huỳnh quang ban đầu, cả aflatoxin chuẩn và aflatoxin có trong mẫu phân tích đều chuyển sang cùng một đồng phân. - Thử nghiệm khẳng định sự có mặt của aflatoxin trong mẫu phân tích đƣợc phát hiện bởi Przybylski (1975) và Verhulsdonk (1977) và đƣợc hội phân tích hóa học Hoa Kì (A.O.A.C) công nhận. - Aflatoxin B1 đƣợc đƣợc acid hóa để trở thành đồng phân aflatoxin B2a. Đồng phân này có màu huỳnh quang màu xanh và có độ dài Rf thấp hơn so với độ dài Rf của aflatoxin B1. Theo phƣơng pháp của Przybylski, aflatoxin Bi đƣợc chuyển thành aflatoxin B2a nhờ acid Tryfloacetic (TFA) phun trực tiếp lên các bản mỏng trƣớc khi chạy trong dung môi. 13
Đồ án tốt nghiệp - Acid sufuric làm thay đổi màu huỳnh quang xanh da trời của aflatoxin B1 thành màu vàng. Thử nghiệm này nhằm khẳng định sự không có mặt của aflatoxin nếu vết nghi ngờ không chuyển thành màu vàng.  Sắc kí lớp mỏng hiệu suất cao (high ferformane thin layer chromatography-HPTLC): - Do những khiếm khuyết trong phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng đơn thuần ở các khâu nhƣ chiết tách mẫu phân tích, chạy mẫu trong dung môi, phƣơng pháp HPTLC có tính thuyết phục cao hơn ở 3 khía cạnh sau: đƣa mẫu lên bản mỏng một cách tự động, cải thiện đƣợc sự đồng nhất cả lớp hấp phụ, chạy bản mỏng trong dung môi có kiểm soát. - Quá trình đƣa mẫu vào bản mỏng đƣợc tự động hóa, do đó các vết đƣợc định đúng vị trí và đo lƣờng độ huỳnh quang của vết cũng bằng máy densitometess. - Thể tích mẫu đƣợc dùng trong HPTLC có thể bằng 1l so với 5-10l mẫu trong phƣơng pháp TLC, nhƣ vậy sẽ làm giảm đi rất nhiều diện tích của vết (=1mm). Nồng độ chất chuẩn có thể cần 5 pg trong phân tích bằng HPTLC, do đó có thể xác định tới 30 pg (0.03 g) aflatoxin B1 ở lạc. - Sử dụng kĩ thuật HPTLC làm tăng tính thuyết phục của phƣơng pháp TLC nhƣ một phƣơng pháp định lƣợng aflatoxin có hiệu quả nhất.  Phƣơng pháp sắc kí lỏng cao áp (high ferformane liquid chromatogaphy - HPLC): - Hệ thống phân tích high ferformane tự động HPLC là hệ thông phân tích đắt tiền, chọn lọc, dùng định lƣợng Aflatoxin. Phƣơng pháp HPLC sử dụng cả hai pha: Pha bình thƣờng và pha phản. - Hệ thống này dựa trên sự hấp thụ tia tím (UV) và xác định cƣờng độ huỳnh quang. - Mẫu phân tích đƣợc tách bằng chloroform: nƣớc. Ly tâm chất tác dụng làm sạch qua silicagel pha bình thƣờng sử dụng cột nhồi silicagel 0.5m và pha động sử dụng benzen: acetonitrit: acid formic. Giới hạn xác định là 0.5 m/kg. 14
Đồ án tốt nghiệp - Husst (1984) đã sử dụng pha phản kết hợp với TFA đồng phân để xác định đƣợc các Aflatoxin B1, B2, G1, G2 ở nồng độ 5pg. - Davis (1980) cũng sử dụng pha phản để xác định huỳnh quang của đồng phân iot của Aflatoxin B1.  Phƣơng pháp sắc kí cột. - Phƣơng pháp cột mini nhằm xác định nhanh aflatoxin có trong mẫu. Phƣơng pháp này đơn giản, ít tốn kém, chỉ xác định định tính. - Kĩ thuật nhồi cột mini là cột sắc kí bằng hạt thủy tinh hay chất dẻo có kích thƣớc khoảng 3-6 mm chiều rộng và 20 cm chiều dài. Dung dịch chiết tách đƣợc làm sạch bằng dung môi, dung môi và hòa tan trong một lƣợng nhỏ benzen hay chloroform. Cột đƣợc nhồi silicagel nhƣ một chất hấp thụ và quan sát dƣới ánh sáng tử ngoại (uv) để xác định màu huỳnh quang xanh chỉ ra sự có mặt của aflatoxin. - Nhiều tác giả nhƣ Davis và cộng sự (1981), Holaday (1976), Holaday và Lansden(1975) đã cải tiến phƣơng pháp này nhằm phát hiện nhanh aflatoxin trong mẫu. Phƣơng pháp cột mini của Romes (1975) đã đƣợc A.O.A.C (1980) công nhận. Aflatoxin đƣợc tách bằng aceton và nƣớc (85: 45), các chất tạp đƣợc loại trên gel cacbonat đồng và chloric sắt. Sau đó, aflatoxin đƣợc tách ra bằng một pha nƣớc với chloroform. - Chloroform tách đƣợc đƣa vào cột có chứa một lớp bột nhôm trung tính, silicagel và florisil ở phía dƣới, sunfat canxi khô ở cả trên và dƣới. Cột đƣợc chạy trong choloroform và aceton (9:1) để giữ aflatoxin trên đỉnh của lớp flosisil. 1.3. Phƣơng pháp khử nhiễm aflatoxin: 1.3.1. Phương pháp vật lý học: - Phân hủy aflatoxin bằng không khí nóng: dùng không khí nóng thổi qua nguyên liệu có chứa aflatoxin để làm giảm thiểu lƣợng aflatoxin đã đƣợc nhiều tác giả nghiên cứu, phƣơng pháp này đã đem lại nhiều kết quả đáng kể. Nếu nhiệt độ không khí nóng đƣa vào là 100 - 1450C ở ngô hạt thì lƣợng aflatoxin B1 có thể giảm từ 877 ppb còn 452 ppb, từ 378 ppb còn 213 ppb. 15
Đồ án tốt nghiệp - Nếu tăng nhiệt độ lên tới 1650C có thể làm cho lƣợng aflatoxin B1 giảm từ 66 - 67%.(Lee, 1969; Waltking, 1971; Elkady, 1981; Frank, 1974; trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003). - Phân hủy aflatoxin bằng hấp ƣớt ở áp suất cao: phƣơng pháp hấp ƣớt ở nhiệt độ cao dƣới áp lực hơi nƣớc đem lại kết quả khả quan hơn. Quá trình này phá hủy nhanh chóng vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin. Theo Rehana (1979) nhận thấy nếu gạo nhiễm aflatoxin từ 400 - 4000 ppb đƣợc hấp ƣớt trong 5 phút ở 1200C (thêm nƣớc vào gạo tỷ lệ là 1:4) có thể làm giảm hàm lƣợng aflatoxin đến 68%. Ở đậu phộng có độ ẩm 10%, chứa 7000 ppb aflatoxin B1 đƣợc hấp ƣớt ở 1200C trong 4 giờ giảm còn 370 ppb. Ở hàm lƣợng aflatoxin thấp (760 ppb) đƣợc hấp ở 1,5 atm trong vòng một giờ đã phân hủy hoàn toàn aflatoxin. (Rehana, 1979 trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003) - Làm giảm aflatoxin bằng các chất hấp phụ hoặc kết dính độc tố: các chất hấp phụ thƣờng là các chất vô cơ hoặc hữu cơ (tự nhiên hoặc nhân tạo) có hoạt tính bề mặt cao. Các chất có khả năng hấp phụ aflatoxin gồm: than hoạt tính, một số polymer hữu vô cơ có bản chất aluminosilicat nhƣ bentonite, HSCAS (Hydrated sodium calcium alumino-silicate), một số chất sét đặc biệt (kaolin, sepiolite, clinoptilolite, zeolite), một số polymer hữu cơ tự nhiên (alfalfa) hoặc nhân tạo (nhựa trao đổi ion, polyvinyl polypyrrolidone). Những chất này không đƣợc hấp phụ qua ruột mà đƣợc bài thải ra ngoài. (Charmley, 1994; trích dẫn bởi Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003) - Tách aflatoxin bằng dung môi hữu cơ: đây là phƣơng pháp có thể áp dụng đối với thức ăn và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi, do ít có khả năng tạo sản phẩm khác có hoạt tính từ aflatoxin và có thể thu hồi đƣợc dung môi mà không ảnh hƣởng đến thành phần dinh dƣỡng của thức ăn. - Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đã thu đƣợc bằng việc dùng hệ thống chiết suất bao gồm hỗn hợp hexan – metanol, hexan – etanol, hexan – etanol - nƣớc, và hexan –aceton - nƣớc. Hệ thống bao gồm 54% aceton, 44% hexan và 2% nƣớc (tính theo trọng lƣợng) là hệ thống thành công nhất đƣợc tìm thấy, có thể đồng thời 16
Đồ án tốt nghiệp loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12% - 15% dầu và dƣ lƣợng lipid gần bằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40μg/kg. - Phân hủy aflatoxin bằng các tia bức xạ: aflatoxin rất mẫn cảm với tia cực tím. Ở bƣớc sóng 365 nm, khả năng hấp phụ của aflatoxin đạt cực đại. Okonkwo (1978) nhận thấy, lƣợng aflatoxin ở bắp (150 ppb và 250 ppb) có thể giảm tới 30% và 16% trong 10 giờ tiếp xúc với ánh nắng mặt trời. (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003). 1.3.2. Phương pháp hóa học: - Phƣơng pháp sử dụng các chất oxi hóa-khử: các chất oxy hóa-khử nhƣ natrihypochloride (NaOCl), hydroperoxide (H2O2) đƣợc sử dụng để làm mất độc tính của aflatoxin. Tuy nhiên sử dụng NaOCl để xử lý hạt nhiễm aflatoxin có thể làm mất màu sắc của hạt và biến chất các acid amin. Khí ozon (O3) cũng đƣợc thử nghiệm về khả năng phân hủy aflatoxin trong mẫu và đạt đƣợc hiệu quả tốt, song có bằng chứng là chất lƣợng các thành phần của thức ăn bị giảm đặc biệt là protein, vitamin. - Phƣơng pháp sử dụng các chất kiềm: hydroxit amon (NH4OH) và hyroxit natri (NaOH) là 2 chất kiềm đƣợc sử dụng làm vô hoạt afaltoxin. Các chất này đều có hoạt tính mạnh, có thể phá vỡ vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin. - Phƣơng pháp sử dụng khí NH3: nhiều thí nghiệm đã chứng minh hiệu quả của việc dùng khí NH3 làm vô hoạt aflatoxin. Xử lý ngô bằng khí NH3 đƣợc đặc biệt quan tâm ứng dụng hơn cả. Ngƣời ta nhận thấy, nếu hàm lƣợng NH3 là 0,5 - 1,5% và nhiệt độ bên ngoài là 250C, trong 14 ngày tiếp xúc, lƣợng aflatoxin từ 200ppb có thể giảm xuống còn 10 ppb (theo Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003). 17
Đồ án tốt nghiệp 1.3.3. Phương pháp sinh học: - Mặc dù các biện pháp phòng chống nấm mốc sinh độc tố đã đƣợc khuyến cáo áp dụng, nhƣng sự nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở mức độ cao quá giới hạn là không thể tránh đƣợc trong những điều kiện bảo quản bất lợi. Vấn đề khử nhiễm aflatoxin bằng con đƣờng sinh học nhằm thay thế cho biện pháp khử nhiễm aflatoxin bằng các hóa chất có giá thành cao và làm biến đổi phẩm chất lƣợng lƣơng thực nên khó áp dụng vào thực tiễn bảo quản đƣợc chứng minh là các phƣơng pháp hứa hẹn nhất. Khử nhiễm độc tố aflatoxin bằng phƣơng pháp sinh học có thể đƣợc định nghĩa nhƣ sự phân giải bằng enzyme hay chuyển hóa sinh của các độc tố nấm mốc trực tiếp nhờ vi sinh vật. Bảng 1.6. Các phƣơng pháp khử nhiễm aflatoxin bằng con đƣờng sinh học. Tên vi khuẩn Đối tƣợng Cơ chế khử nhiễm Tác giả Bacillus pumilus Aspergillus Sử dụng các sản phẩm trao đổi C. Munimbazi parasiticus chất ngoại bào, sinh ra trong quá và trình nuôi cấy B. pumilus, ức chế LB.Bullerman, sự phát triển và quá trình tổng 1997. hợp độc chất aflatoxin của nấm Asp. parasiticus. Streptomyces sp. Aspergillus Streptomyces sp. tổng hợp đƣợc M. Ono và parasiticus Aflastatin A, là hợp chất có bản ctv ,1996. chất là protein, ức chế 1 số T. Kondo và enzyme esterase tham gia quá ctv, 2001. trình tổng hợp độc chất aflatoxin của nấm Asp. parasiticus. Achromobacter Aspergillus A. xylosoxidan tổng hợp PS. Yan và xylosoxidans parasiticus Cyclo(L-leucyl-L-prolyl), là 1 ctv, 2004. cyclodipeptide, ức chế sự phát triển và sự tổng hợp aflatoxin của nấm Asp. parasiticus. 18
Đồ án tốt nghiệp Tên vi khuẩn Đối tƣợng Cơ chế khử nhiễm Tác giả Lactobacillus Aspergillus Sử dụng các sản phẩm trao đổi I. Chang và JD. Kim, casei flavus chất ngoại bào, sinh ra trong quá 2007. trình nuôi cấy L. casei, ức chế sự phát triển và quá trình tổng hợp độc chất aflatoxin của nấm Asp. flavus. Bacillus subtilis Aspergillus B. subtilis tổng hợp các enzyme R. Thakaew flavus ngoại bào nhƣ protease, và ctv, 2013. chitinase, β-1,3-glucanase làm ức chế sự phát triển của nấm Asp. flavus. 19
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian – địa điểm nghiên cứu - Thời gian: từ ngày 7 - 4 - 2014 đến ngày 30 - 6 - 2014. - Địa điểm: phòng thí nghiệm vi sinh khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trƣờng, trƣờng Đại học Công nghệ TP.HCM. 2.2. Vật liệu – thiết bị - hóa chất 2.1.1. Vật liệu - Nguồn nấm đối kháng: là chủng nấm Aspergillus sp.X3 có khả năng tổng hợp aflatoxin, do sinh viên Nguyễn Vân Hƣơng phân lập đƣợc từ đậu phộng. (Xem phụ lục B) - Nguồn mẫu phân lập vi khuẩn: Mẫu hạt đậu phộng đƣợc mua từ chợ. Mẫu vỏ đậu phộng. Mẫu hạt cà phê đƣợc lấy từ Đà Lạt. Mẫu trái cà phê đƣợc lấy từ Đà Lạt. Mẫu đât trồng rau tại Quận 12 TP. Hồ Chí Minh. 2.1.2. Thiết bị và dụng cụ - Thiết bị: tủ ủ, tủ cấy, nồi hấp tiệt trùng (autoclave), máy li tâm, cân phân tích, máy soi UV, máy nƣớc cất, bếp từ, kính hiển vi quang học, - Dụng cụ: ống nghiệm, đĩa petri, cốc thủy tinh (bacher), bình tam giác (erlen), ống đong, pipet thủy tinh, micropipet, đầu típ, ống li tâm eppendorf, que cấy, đèn cồn, bông y tế, bông không thấm, bao PE, 2.1.3. Môi trường - Hóa chất 2.1.3.1. Môi trường (Xem phụ lục A) - Môi trƣờng Potato Dextrose Broth (PDB). - Môi trƣờng Potato Dextrose Agar (PDA). - Môi trƣờng tăng sinh Nutrient Broth 1 _ NB1 (bổ sung tơ nấm) - Môi trƣờng tăng sinh Nutrient Broth (NB) - Môi trƣờng Nutrient Agar (NA). 20
Đồ án tốt nghiệp - Môi trƣờng Coconut Cream Agar (CCA). - Môi trƣờng Simmon Citrate. - Môi trƣờng Phenol red carbohydrate broth. - Môi trƣờng kiểm tra hoạt tính. Môi trƣờng Casein 1%. Môi trƣờng Chitin 1%. 2.1.3.2. Hóa chất - Dịch chiết khoai tây - Dịch tơ nấm - Dịch nƣớc cốt dừa - D- Glucose - Peptone - Cao thịt (meat extract) - Casein - Chitin - NaCl - Agar - Chloramphenicol - Phenol red - Thuốc nhuộm: crystal violet, lugol, malachite green, fushin. - Hydro peroxide (H2O2) 30%. 21
Đồ án tốt nghiệp 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp luận. - Để thực hiện đề tài bƣớc đầu phân lập vi khuẩn Bacillus spp. có hoạt tính kháng nấm, chúng tôi sử dụng hai cách tiếp cận. Cách tiếp cận thứ nhất, vi khuẩn đƣợc phân lập từ nguồn mẫu là nông sản (hạt cà phê, đậu phộng) bị nhiễm nấm. Sau đó khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn với nấm sinh aflatoxin bằng phƣơng pháp đồng nuôi cấy. Cách tiếp cận thứ hai, nguồn mẫu nông sản (trái cà phê, vỏ đậu phộng, đất trồng) bị nhiễm nấm, đƣợc tăng sinh trên môi trƣờng có chứa chất cảm ứng là sinh khối nấm mốc và đƣợc sàng lọc dựa trên khả năng kháng nấm sinh aflatoxin của từng mẫu tăng sinh. Sau đó phân lập chủng thuần khiết và khảo sát khả năng đối kháng với nấm của dịch ly tâm canh trƣờng của mỗi chủng thuần khiết. 22
Đồ án tốt nghiệp 2.3.2. Bố trí thí nghiệm. 23
Đồ án tốt nghiệp 2.3.2.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo cách tiếp cận thứ nhất. 24
Đồ án tốt nghiệp  Tăng sinh: - Mục đích: Phục hồi những vi khuẩn còn lại trong mẫu sau quá trình thu thập là vận chuyển. - Môi trƣờng sử dụng là môi trƣờng NB đƣợc hấp khử trùng ở 1210C, 1atm trong 15 phút. - Cân chính xác 1 g mẫu cho vào bình tam giác chứa 9ml môi trƣờng NB đã hấp khử trùng. Tăng sinh lắc ở 150 vòng/phút trong 48h.  Pha loãng mẫu: - Mục đích: Làm giảm mật độ vi khuẩn có mặt trong dịch tăng sinh mẫu, giúp cho việc phân lập riêng lẻ từng tế bào vi khuẩn dễ hàng hơn. - Chuẩn bị các ống nƣớc muối sinh lý (nồng độ NaCl 0.85%) có thể tích 9ml đƣợc hấp khử trùng ở 1210C, 1atm trong 15 phút. - Hút 1ml dịch tăng sinh cho vào ống thứ nhất chứa 9ml nƣớc muối sinh lí, ta đƣợc dịch có nồng độ pha loãng 10-1 so với mẫu. Tiếp tục hút 1ml từ ống thứ nhất cho vào ống thứ hai chứa 9ml nƣớc muối sinh lí, ta đƣợc dịch có nồng độ pha loãng 10-2 so với mẫu. Tiếp tục tiến hành tƣơng tự cho đến nồng độ cần thiết.  Phân lập: - Mục đích: Phân tách riêng các chủng vi khuẩn có trong dịch mẫu tăng sinh, giúp cho việc chọn lọc các chủng vi khuẩn đồng nhất. - Môi trƣờng sử dụng là môi trƣờng NA đƣợc hấp khử trùng 1210C, 1atm trong 15 phút. Đƣợc phối vào đĩa petri đã đƣợc hấp khử trùng, mỗi đĩa khoảng 15ml. - Cấy mẫu phân tách khuẩn lạc riêng rẽ: tiến hành cấy trang mẫu ở các độ pha loãng 10-5,10-6,10-7. Mỗi nồng độ tiến hành cấy trang 3 đĩa, sau đó đƣợc ủ ở 370C trong 24 – 48h. - Quan sát hình thái khuẩn lạc sau thời gian ủ, ghi nhận kết quả. Cấy ria làm thuần các chủng khuẩn cho hình thái khuẩn lạc khác nhau trên đĩa môi trƣờng NA. 25
Đồ án tốt nghiệp - Khi các chủng khuẩn đã thuần tiến hành giữ giống trong ống thạch nghiêng môi trƣờng NA hoặc giữ giống lạnh sâu trong eppendorf, phục vụ cho những thí nghiệm tiếp theo.  Bảo quản giữ giống vi sinh vật - Mục đích: lƣu trữ và bảo quản các chủng phân lập đƣợc, đảm bảo nguồn giống để thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu có liên quan đến vi khuẩn. Có thể giữ giống bằng hai cách, giữ giống ống thạch nghiêng hoặc giữ giống lạnh sâu. - Giữ giống ống thạch nghiêng: phƣơng pháp giữ giống đơn giản, vi khuẩn đƣợc cấy trên môi trƣờng thạch nghiêng trong ống nghiệm và đặt trong điều kiện thích hợp để phát triển. Sau đó đƣợc bảo quản trong tủ mát (khoảng 3-50C). Quá trình này cần đƣợc lặp lại sau một thời gian bảo quản nhất định (tùy vào từng nhóm vi khuẩn), đảm bảo vi khuẩn không bị chết do môi trƣờng không còn dinh dƣỡng hoặc bị già. Trong nghiên cứu này, vi khuẩn đƣợc cấy lƣu giữ trong ống thạch nghiêng môi trƣờng NA (đƣợc hấp khử trùng và để nguội tạo bề mặt nghiêng). Ủ ở 370C trong 24 giờ, sau đó bảo quản trong tủ mát. Tiến hành cấy chuyển định kì 1 lần mỗi tháng. - Giữ giống lạnh sâu (giữ giống eppendorf hoặc giữ giống glycerol): vi khuẩn đƣợc lƣu dữ trong điều kiện lạnh sâu. Trong điều kiên này, tê bào vi khuẩn có thể bị phá vỡ khi bi lạnh đông ở nhiệt độ rất thấp và khi làm rã đông, làm tan mẫu (do tế bào vi khuẩn bị hinh thành mạng tinh thể nƣớc khi làm lạnh sâu). Để khắc phục điều này ngƣời ta bổ sung chất làm giảm tốc độ lanh đông và rã đông nhƣ glycerol. Vi khuẩn không thể tiến hành trao đổi chất nhƣ bình thƣờng nhƣng vẫn tồn tại trong chất bảo quản. Thời gian lƣu giữ của phƣơng pháp này thƣờng là khá dài (có thể từ 3-5 tháng). Trong nghiên cứu này, vi khuẩn đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng NB trong 24 giờ, hút 2ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf. Sau đó ly tâm (4000 vòng/ phút trong 15 phút), loại bỏ dich trong thu sinh khối còn lại trong eppendorf. Bổ sung 0.9 ml nƣớc muối sinh lí rồi trộn đều. Bổ sung 0.6 ml glycerol rồi tiếp tục trộn đều. Cuối cùng tiến hành bảo quản lạnh sâu ở nhiệt độ -15oC. (Lưu ý: eppendorf, nước muối sinh lí và đầu tip cần được hấp khử trùng trước khi thực hiện thao tác). 26
Đồ án tốt nghiệp  Khảo sát khả năng đối kháng các chủng khuẩn phân lập với nấm bằng phƣơng pháp đồng nuôi cấy trên môi trƣờng hỗn hợp. - Mục đích: khảo sát khả năng ức chế nấm mốc của các chủng vi khuẩn phân lập. Từ đó chọn ra những chủng khuẩn có khả năng tiết ra hoạt chất kháng nấm. - Tiến hành: Các chủng vi khuẩn đã phân lập cấy vào bình tam giác chứa 10ml môi trƣờng NB đã hấp khử trùng. Lắc tăng sinh ở 150 vòng/phút trong 24 giờ. Môi trƣờng sử dụng là môi trƣờng hỗn hợp (tỉ lệ NA : PDA là 1:2) đƣợc hấp khử trùng ở 1210C, 1atm trong 15 phút. Đƣợc phối vào đĩa petri đã đƣợc hấp khử trùng, mỗi đĩa khoảng 15ml. Khi thạch đã đông, bơm 0.1 ml dịch tăng sinh vi khuẩn vào đĩa. Trang đều trên bề mặt thạch. Đối chứng là đĩa môi trƣờng chỉ cấy nấm và không bơm dịch tăng sinh vi khuẩn. Cấy nấm mốc vào giữa đĩa môi trƣờng đã trang dịch tăng sinh vi khuẩn. Ủ 300C trong 4 ngày. Đọc kết quả dựa vào sự phát triển của nấm mốc trong đĩa thí nghiệm và đĩa đối chứng chỉ cấy nấm.  Khảo sát khả năng đối kháng với nấm của dịch ly tâm canh trƣờng nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng hỗn hợp. - Mục đích: khảo sát khả năng ức chế nấm mốc của sản phẩm trao đổi chất có mặt trong canh trƣờng tăng sinh các chủng vi khuẩn phân lập. Từ đó chọn ra những chủng khuẩn có khả năng tiết ra hoạt chất kháng nấm. - Tiến hành: Các chủng vi khuẩn đã phân lập cấy vào bình tam giác chứa 10ml môi trƣờng NB đã hấp khử trùng. Lắc tăng sinh ở 150 vòng/phút trong 24 giờ. Môi trƣờng sử dụng là môi trƣờng hỗn hợp (tỉ lệ NA : PDA là 1:2) đƣợc hấp khử trùng ở 1210C, 1atm trong 15 phút. Sau đó phối vào đĩa petri đã đƣợc hấp khử trùng, mỗi đĩa khoảng 15 ml. 27
Đồ án tốt nghiệp Khi đĩa môi trƣờng hỗn hợp đã đông, cấy nấm mốc vào tâm đĩa môi trƣờng. Đồng thời đục lỗ thạch ở 4 góc cách đều điểm cấy nấm. Sau đó ủ đĩa ở 300C trong 24h. Dịch tăng sinh vi khuẩn sau 24h đƣợc đem đi li tâm ở 10000 vòng/phút trong 15 phút. Thu dịch trong và loại bỏ sinh khối. Tiến hành bơm 0.1ml dịch sau li tâm vào 4 lỗ của đĩa thạch đã ủ nấm đƣợc 24h. Đối chứng là đĩa nấm không thêm vào dịch li tâm ở 4 giếng thạch. Sau đó đĩa đƣợc tiếp tục ủ 300C trong 72h. Đọc kết quả đối kháng dựa vào sự phát triển của nấm mốc trong đĩa thí nghiệm và đĩa đối chứng chỉ cấy nấm. 28
Đồ án tốt nghiệp 2.3.2.2. Phân lập và tuyển chọn các chủng khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo cách tiếp cận thứ hai. 29
Đồ án tốt nghiệp  Xử lí mẫu: - Mục đích: Loại bỏ các tế bào vi khuẩn không có khả năng sinh bào tử, giữ lại những vi khuẩn có khả năng sinh bào tử tồn tại trong mẫu. - Cân chính xác 1 gam mẫu, sau đó tiến hành xử lý nhiệt 800C trong 10 phút.  Phƣơng pháp nuôi cấy thu tơ nấm. - Mục đích: thu nhận tơ nấm để bổ sung vào môi trƣờng, tạo nguồn cơ chất cảm ứng cho các vi khuẩn có thể sử dụng đƣợc. - Tiến hành: Môi trƣờng sử dụng là môi trƣờng PDB, đƣợc phối vào mỗi bình tam giác 10ml, hấp khử trùng 1210C, 1atm trong 15 phút. Dùng que cấy thu bào tử nấm từ ống thạch nghiêng, cấy vào các bình môi trƣờng PDB, lắc tăng sinh 150 vòng / phút trong 24 giờ. Lọc dịch nuôi cấy, thu nhận tơ nấm. Hòa trộn vào nƣớc cất tạo huyền phù tơ nấm (10 g/l). Hấp khử trùng và bảo quản ở tủ mát (4-60C).  Tăng sinh: - Mục đích: Phục hồi những vi khuẩn còn lại trong mẫu sau quá trình xử lý mẫu. Đồng thời tăng lên số lƣợng các chủng khuẩn có khả năng đối kháng vói nấm mốc, do trong môi trƣờng ta có bổ sung thêm tơ nấm mốc đƣợc xem là chất cảm ứng. - Môi trƣờng sử dụng là môi trƣờng NB1 đƣợc hấp khử trùng ở 1210C, 1atm trong 15 phút. - Mẫu đƣợc xử lí xong cho vào bình tam giác chứa 9ml môi trƣờng NB1 đã hấp khử trùng. Tăng sinh lắc ở 150 vòng/phút trong 48h.  Ly tâm loại bỏ dịch trong: - Mục đích: phá vỡ tế bào các chủng khuẩn có mặt trong dịch tăng sinh. Chỉ thu nhận các hợp chất có khả năng kháng nấm sinh ra trong giai đoạn tăng sinh. - Hút 2ml dịch tăng sinh sau 48 giờ cho vào eppendoft, li tâm ở 10000 vòng/phút trong 15 phút. Thu dịch trong và loại bỏ sinh khối. (Lưu ý: eppendoft và đầu tip cần được hấp vô trùng ở 121 0C, 1atm trong 15 phút) 30
Đồ án tốt nghiệp  Chọn lọc mẫu: - Mục đích: Chọn lọc đƣợc những mẫu sau quá trình tăng sinh có chứa hợp chất có khả năng kháng nấm mốc. Dựa vào hình ảnh nấm mốc sau khi nuôi cấy, chọn lọc đƣợc những mẫu tăng sinh có khả năng chứa hợp chất kháng nấm. - Môi trƣờng sử dụng là môi trƣờng PDA đƣợc hấp khử trùng ở 1210C, 1atm trong 15 phút. Sau đó phối vào đĩa petri đã đƣợc hấp khử trùng, mỗi đĩa khoảng 15 ml. - Khi đĩa môi trƣờng PDA đã đông, cấy nấm mốc vào tâm đĩa môi trƣờng. Đồng thời đục lỗ thạch ở 4 góc cách đều điểm cấy nấm. Sau đó ủ đĩa ở 300C trong 24h. - Tiến hành bơm 1ml dịch sau li tâm vào 4 lỗ của đĩa thạch đã cấy nấm đƣợc 24h. Đối chứng là đĩa nấm không thêm vào dịch li tâm ở 4 lỗ thạch. Sau đó đĩa đƣợc tiếp tục ủ 300C trong 24 – 72 giờ. Đọc kết quả đối kháng dựa vào sự phát triển của nấm mốc trong đĩa thí nghiệm và đĩa đối chứng chỉ cấy nấm. - Lưu ý: Mỗi dịch mẫu tăng sinh tiến hành lập lại 3 lần. Kết quả so với đối chứng. Cần bơm dịch vừa ngập lỗ thạch, tránh để dịch bị tràn khỏi giếng.  Pha loãng mẫu tăng sinh: thực hiện tƣơng tự phƣơng pháp pha loãng mẫu trình bày ở mục 2.3.2.1  Phân lập: - Mục đích: Phân tách riêng các chủng vi khuẩn có trong dịch mẫu tăng sinh, giúp cho việc chọn lọc các chủng vi khuẩn đồng nhất. - Môi trƣờng sử dụng là môi trƣờng NA đƣợc hấp khử trùng 1210C, 1atm trong 15 phút. Đƣợc phối vào đĩa petri đã đƣợc hấp khử trùng, mỗi đĩa khoảng 15ml. - Cấy mẫu phân tách khuẩn lạc riêng rẽ: tiến hành cấy trang mẫu ở các độ pha loãng 10-5,10-6,10-7. Mỗi nồng độ tiến hành cấy trang 3 đĩa, sau đó đƣợc ủ ở 370C trong 24 – 48 giờ. 31
Đồ án tốt nghiệp - Quan sát hình thái khuẩn lạc sau thời gian ủ, ghi nhận kết quả. Cấy ria làm thuần các chủng khuẩn cho hình thái khuẩn lạc khác nhau trên đĩa môi trƣờng NA. - Khi các chủng khuẩn đã thuần tiến hành giữ giống trong ống thạch nghiêng môi trƣờng NA hoặc giữ giống lạnh sâu trong eppendorf, phục vụ cho những thí nghiệm tiếp theo. (thực hiện tƣơng tự phƣơng pháp bảo quản giống vi sinh vật trình bày ở mục 2.3.2.1)  Khảo sát khả năng đối kháng với nấm của dịch ly tâm canh trƣờng nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng PDA. - Mục đích: khảo sát khả năng ức chế nấm mốc của các chủng vi khuẩn phân lập và chất cảm ứng bổ sung vào môi trƣờng NB1. Từ đó chọn ra những chủng khuẩn có khả năng tiết ra hoạt chất kháng nấm. - Tiến hành: Các chủng vi khuẩn đã phân lập cấy vào bình tam giác chứa 10ml môi trƣờng NB1 đã hấp khử trùng. Cho lắc trên máy lắc ở 150 vòng/phút trong 24 giờ. Đối chứng khảo sát là môi trƣờng NB1 không cấy khuẩn. Môi trƣờng sử dụng là môi trƣờng PDA đƣợc hấp khử trùng ở 1210C, 1atm trong 15 phút. Sau đó phối vào đĩa petri đã đƣợc hấp khử trùng, mỗi đĩa khoảng 15 ml. Cấy nấm mốc vào tâm đĩa môi trƣờng PDA đã đƣợc chuẩn bị trƣớc. Đồng thời đục lỗ thạch ở 4 góc cách đều điểm cấy nấm. Sau đó ủ đĩa ở 300C trong 24 giờ. Dịch tăng sinh vi khuẩn sau 24 giờ đƣợc đem đi li tâm ở 10000 vòng/phút trong 15 phút. Thu dịch trong và loại bỏ sinh khối. Tiến hành bơm 0.1ml dịch sau li tâm vào 4 lỗ của đĩa thạch đã ủ nấm đƣợc 24 giờ. Đối chứng khảo sát là đĩa nấm đƣợc bơm 0.1ml môi trƣờng NB1 không cấy khuẩn vào 4 giếng thạch. Đối chứng là đĩa nấm không thêm vào dịch li tâm ở 4 giếng thạch. Sau đó đĩa đƣợc tiếp tục ủ 300C trong 24 – 72 giờ. Đọc kết quả đối kháng dựa vào sự phát triển của nấm mốc trong đĩa thí nghiệm và đĩa đối chứng chỉ cấy nấm. 32
Đồ án tốt nghiệp  Khảo sát khả năng ức chế khả năng tổng hợp aflatoxin từ nấm mốc của dịch ly tâm canh trƣờng các chủng khuẩn phân lập trên môi trƣờng CCA. - Mục đích: khảo sát khả năng ức chế tổng hợp aflatoxin từ nấm mốc của các chủng vi khuẩn phân lập trên môi trƣờng CCA. Từ đó chọn ra những chủng khuẩn có khả năng ức chế sự tổng hợp aflatoxin từ nấm mốc. - Tiến hành: Các chủng vi khuẩn đã phân lập cấy vào bình tam giác chứa 10ml môi trƣờng NB1 đã hấp khử trùng. Lắc tăng sinh ở 150 vòng/phút trong 24 giờ. Môi trƣờng sử dụng là môi trƣờng CCA đƣợc hấp khử trùng ở 1210C, 1atm trong 15 phút. Sau đó phối vào đĩa petri đã đƣợc hấp khử trùng, mỗi đĩa khoảng 15ml. Khi môi trƣờng đã đông, cấy nấm mốc vào tâm đĩa môi trƣờng CCA. Đồng thời đục lỗ thạch ở 4 góc cách đều điểm cấy nấm. Sau đó ủ đĩa ở 300C trong 24 giờ. Dịch tăng sinh sau 24 giờ đƣợc đem đi li tâm ở 10000 vòng/phút trong 15 phút. Thu dịch trong và loại bỏ sinh khối. Tiến hành bơm 0.1ml dịch sau li tâm vào 4 lỗ của đĩa thạch đã cấy nấm đƣợc 24 giờ. Đối chứng là đĩa nấm không thêm vào dịch li tâm ở 4 giếng thạch. Sau đó đĩa đƣợc tiếp tục ủ 300C trong 24 – 72 giờ. Đọc kết quả đối kháng dựa vào sự phát triển của nấm mốc trong đĩa thí nghiệm và đĩa đối chứng chỉ cấy nấm. 33
Đồ án tốt nghiệp 2.3.3. Một số phương pháp khảo sát sinh hóa vi khuẩn. 2.3.3.1. Nhuộm Gram - Mục đích: xác định nhóm của vi khuẩn là vi khuẩn Gram âm (Gram- genative) hay vi khuẩn Gram dƣơng (Gram-positive). Đồng thời việc nhuộm gran còn cho phép ta quan sát rõ hình thái tế bào vi khuẩn. - Nguyên tắc: vi khuẩn Gram dƣơng bắt màu tím, vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng. Đối với vi khuẩn Gram dƣơng, do có thành tế bào đƣợc cấu tạo bởi lớp peptidoglycan dày nên khả năng giữ màu rất cao khi đƣợc nhuộm bằng phức hợp tím tinh thể - iod (crystal violet - lugol), việc xử lí tiếp với cồn 960 làm cho lớp peptidoglycan mất nƣớc, từ đó làm giảm khoảng trống giữa các phân tử và thành tế bào không thể bắt màu fushin. Đối với vi khuẩn Gram âm, thành tế bào cấu tạo bởi lớp peptidoglycan mỏng và thƣờng có lớp đôi lipid bên ngoài. Khi đƣợc xử lí với cồn 960, lớp đôi lipid bên ngoài sẽ bị hòa tan. Lớp peptidoglycan mỏng không thể giữ đƣợc màu của phức chất tím tinh thể - iod. Cuối cùng tế bào bắt màu hồng khi đƣợc nhuộm với fushin ở bƣớc sau. - Tiến hành: Dùng que cấy vòng thu sinh khối (ở dạng rắn hoặc lỏng) đặt vào vết bôi trên lame. Hơ nhẹ trên đèn cồn để cố định tế bào. Nhỏ 1-2 giọt tím tinh thể (crystal violet) để yên trong 30 giây. Rửa nƣớc 5 giây. Nhỏ 1-2 giọt lugol để yên trong 60 giây. Rửa nƣớc 5 giây. Rửa côn 960 20 giây. Rửa nƣớc 5 giây. Nhỏ 1-2 giọt fushin để yên trong 30 giây. Rửa nƣớc 5 giây. Soi kính ở độ phóng đại X1000. 34
Đồ án tốt nghiệp 2.3.3.2. Nhuộm bào tử - Mục đích: xác định khả năng sinh bào tử của vi khuẩn. Bào tử là yếu tố giúp vi khuẩn có thể chống chịu tốt hơn với các tác nhân bất lợi từ bên ngoài: tia cực tím, tia gama, nhiệt độ môi trƣờng quá cao, chất khử trùng, môi trƣờng thiếu dinh dƣỡng - Nguyên tắc: trong điều kiện đun nóng thuốc nhuộm malachite green xâm nhập vào nội bào tử làm chúng bắt màu lục. Khi rữa vết bôi bằng nƣớc cất, tế bào dinh dƣỡng sẽ mất màu chỉ bào tử giữ màu lục. Khi nhuộm bổ sung với fushin, tế bào bắt màu hồng để dễ dàng phân biệt khi soi kính. - Tiến hành: Dùng que cấy vòng thu sinh khối (ở dạng rắn hoặc lỏng) đặt vào vết bôi trên lame. Hơ nhẹ trên đèn cồn để cố định tế bào. Nhỏ 2-3 giọt malachite green, đặt lên trên bacher nƣớc cất đun soi, để yên trong 10 phút. Rửa nƣớc 30 giây. Nhỏ 2-3 giọt fushin để yên trong 30 giây. Rửa nƣớc 5 giây. Soi kính ở độ phóng đại X1000. 2.3.3.3. Thử nghiệm Simmon citrate - Mục đích: xem xét khả năng vi khuẩn có thể sử dụng citrate là nguồn carbon duy nhất hay không. - Nguyên tắc: vi khuẩn biến dƣỡng citrate là nguồn carbon, tạo thành CO2 làm kiềm hóa môi trƣờng. Mặt khác, các vi khuẩn này thƣờng dung ammonium làm nguồn đạm duy nhất. Sự phân giải muối ammonium sinh ra ammoniac (NH3) làm kiềm hóa môi trƣờng. Việc bổ sung chất chỉ thị pH với vai trò làm chất chuyển màu môi trƣờng khi có sự thay đổi pH của môi trƣờng. 35
Đồ án tốt nghiệp - Trong thí nghiệm này, môi trƣờng đƣợc bổ Bromothymol Blue là chất chỉ thị pH. Khi môi trƣờng kiềm hóa (pH > 7.2) chỉ thị chuyển màu xanh dƣơng, khi môi trƣờng acid hóa (pH < 6.0) chỉ thị giữ nguyên màu xanh lá. - Tiến hành: Môi trƣờng sử dụng là môi trƣờng Simmon Citrate bổ sung chỉ thị Bromothymol Blue, phối vào ống nghiệm đƣợc hấp khử trùng ở 1210C, 1atm trong 15 phút. Môi trƣờng để nguội tạo bề mặt nghiêng. Dùng que cấy thu sinh khối vi khuẩn, cấy ria trên bề mặt môi trƣờng thạch nghiêng. Ủ ở 370C theo dõi trong 24 – 48 giờ. Quan sát chuyển màu môi trƣờng. Thử nghiệm dƣơng tính: môi trƣờng chuyển màu xanh dƣơng. Thử nghiệm âm tính: môi trƣờng giữ nguyên màu môi trƣờng ban đầu. 2.3.3.4. Thử nghiệm Catalase - Mục đích: xác định khả năng tổng hợp enzyme catalase của vi sinh vât. Enzyme catalase đƣợc tổng hợp ở vi sinh vật hiếu khí và kị khí tùy nghi. Với tác là phân hủy H2O2 (hydro peroxide) chất làm ngộ độc tế bào. - Nguyên tắc: H2O2 30% với sự có mặt của enzyme catalase sẽ xuất hiện phản ứng phân hủy tạo thành H2O và O2 bay lên (hiện tƣơng sủi bọt khí). Catalase 2 H2O2 2 H2O + O2 - Tiến hành: Dùng que cấy thu sinh khối vi khuẩn (ở dạng rắn hoặc lỏng) đặt lên lame. Nhỏ vài giọt H2O2 30% lên trên, quan sát sau 1-2 giây. Phản ứng dƣơng tính xuất hiện bọt khí, phản ứng âm tính không có bọt khí. 36
Đồ án tốt nghiệp 2.3.3.5. Thử nghiệm protease - Mục đích: xác định khả năng vi sinh vật tổng hợp đƣợc enzyme protease phân hủy cơ chất casein. - Nguyên tắc: casein có thể đƣợc xem là một nguồn carbon và năng lƣợng cho vi khuẩn. Nhƣng vì casein không thể thẩm thấu qua màng tế bào (casein là một loại protein sữa) nên vi khuẩn phải tiết ra enzyme protease, phân hủy casein thành các amino acid để có thể dễ dàng vận chuyển vào bên trong tế bào. Casein đƣợc phối trộn với môi trƣờng dinh dƣỡng, tạo cho môi trƣờng có màu trắng đục. Khi thời gian ủ, nếu vi khuẩn có thể tiết ra enzyme protease sẽ tạo ra một vòng phân giải (vùng trong suốt bao chung quanh vi khuẩn). Nếu không môi trƣờng chung quanh vi khuẩn sẽ vẫn bị đục. - Tiến hành: Môi trƣờng sử dụng là môi trƣờng huyền phù casein 1% bổ sung 1.5% agar, đƣợc hấp khử trùng ở 1210C, 1atm trong 15 phút. Sau đó phối vào đĩa petri đã đƣợc hấp khử trùng, mỗi đĩa khoảng 15ml. Khi thạch đã đông, tiến hành đục lỗ tạo 3 giếng thạch. Vi khuẩn đƣợc cấy vào bình tam giác chứa 10ml môi trƣờng NB đã hấp khử trùng. Cho lắc trên máy lắc ở 150 vòng/phút trong 24h. Bơm dịch tăng sinh vào 2 trong 3 giếng thạch (giếng còn lại làm đối chứng). Ủ ở 370C theo dõi trong 48h. Vi khuẫn đƣợc cho là có hoạt tính protease khi môi trƣờng xung quanh giếng thạch tạo thành vùng trong suốt. Có thể tráng qua bề mặt bằng dung dịch TCA 5% để phát hiện kết quả rõ rang hơn. 2.3.3.6. Thử nghiệm chitinase. - Mục đích: xác định khả năng vi sinh vật tổng hợp đƣợc enzyme chitinase phân hủy cơ chất chitin. - Nguyên tắc: chitin đƣợc phối trộn vào môi trƣờng dinh dƣỡng. Khi vi sinh vật sử dụng enzyme chitinase để phân giải chitin thành dạng có cấu trúc mạnh ngắn hơn là các n-acetyl-D-glucosamie, hợp chất này không có phản ứng màu với lugol. Do đó khi cho thuốc thử lugol, độ lớn của vòng trong suốt không bắt màu lugol. 37
Đồ án tốt nghiệp - Tiến hành: Môi trƣờng sử dụng là môi trƣờng huyền phù chitin 1% bổ sung 1.5% agar, đƣợc hấp khử trùng ở 1210C, 1atm trong 15 phút. Sau đó phối vào đĩa petri đã đƣợc hấp khử trùng, mỗi đĩa khoảng 15ml. Khi thạch đã đông, tiến hành đục lỗ tạo 3 giếng thạch. Vi khuẩn đƣợc cấy vào bình tam giác chứa 10ml môi trƣờng NB đã hấp khử trùng. Cho lắc trên máy lắc ở 150 vòng/phút trong 24h. Bơm dịch tăng sinh vào 2 trong 3 giếng thạch (giếng còn lại làm đối chứng). Ủ ở 370C theo dõi trong 48h. Vi khuẩn đƣợc cho là có hoạt tính chitinase khi môi trƣờng xung quanh giếng thạch tạo thành vùng sáng không bắt màu thuốc thử lugol. 2.3.3.7. Thử nghiệm khả năng lên men các nguồn carbohydrate. - Mục đích: khảo sát khả năng sử dụng (lên men) các nguồn carbohydrate đặc hiệu trong môi trƣờng nuôi cấy để tạo acid và có thể sinh hơi. - Nguyên tắc: lên men là quá trình oxy hóa khử mà chất nhận điện tử cuối cùng không phải là oxy mà là chất hữu cơ khác. Sản phẩm cuối cùng của quá trình lên mên carbohydrate thƣờng acid hữu cơ, alcohol, CO2 (tùy thuộc vào dòng vi sinh vật, cơ chất lên men, thời gian, nhiệt độ và pH môi trƣờng). Trong các trƣờng hợp, sản phẩm tạo ra đều làm giảm pH môi trƣờng. Các thí nghiệm chuyển hóa carbohydrate đƣợc tiến hành trên các môi trƣờng rắn hay lỏng. Môi trƣờng nuôi cấy đƣợc bổ sung thêm chất chỉ thị, thƣờng là chất chỉ thị pH để phát hiện các sản phẩm làm thay đổi pH sinh ra trong quá trình chuyển hóa. Các chất khí sinh ra sẽ đƣợc bẫy lại tạo bọt khí trong ống Durham (trong trƣờng hợp sử dụng môi trƣờng lỏng) hoặc làm vỡ thạch khi cấy trong môi trƣờng thạch sâu (trong trƣờng hợp sử dụng môi trƣờng rắn). - Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng môi trƣờng Phenol red carbohydrate broth, với chất chỉ thị là Phenol red. Môi trƣờng chuyển màu vàng khi pH 8.2 và giữ màu cam trong môi trƣờng trung tính. 38
Đồ án tốt nghiệp - Tiến hành: Môi trƣờng Phenol red carbohydrate broth đƣợc pha riêng làm 2 phần dung dịch, tạm gọi là dung dịch môi trƣờng cơ sở và dung dịch bổ sung carbohydrate. Phần dung dịch môi trƣờng cơ sở, cân các chất (ngoại trừ nguồn carbohydrate) nhƣ trong thành phần môi trƣờng, khuấy trộn trong 800ml nƣớc cất. Phần dung dịch bổ sung carbonhydate, hòa tan 10g carbohydrate trong 200ml nƣớc cất vô trùng. Phối vào ống nghiệm 4.5ml dịch môi trƣờng cơ sở có bổ sung ống Durham để phát hiện khí tạo thành. Hấp khử trùng ở 121 0C trong 15 phút. Làm nguội môi trƣờng về khoảng 42 – 50 0C trƣớc khi bổ sung dịch carbohydrate. Dịch carbohydrate đƣợc khử trùng bằng cách lọc vô trùng qua màng có kích thƣớc lỗ là 0.45 µm. Bổ sung vào ống nghiệm 0.5ml dịch lọc, lắc nhẹ để trộn đều. Môi trƣờng sẽ có màu đỏ nhạt. Dùng que cấy thu sinh khối vi khuẩn (ở dạng rắn hoặc lỏng) cấy vào ống nghiệm môi trƣờng. Ủ ở 37 0C theo dõi trong 24 – 48 giờ. Thử nghiệm có kết quả dƣơng tính (vi khuẩn có khả năng lên men nguồn carbohydrate), môi trƣờng chuyển sang màu vàng. Kết quả âm tính, môi trƣờng chuyển sang màu đỏ hoặc tím. 39
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập các chủng khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo cách tiếp cận thứ nhất. - Các nguồn mẫu: hạt cà phê, đậu phộng nhiễm nấm đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng NB sau 24 giờ. Sau đó tiến hành phân lập mẫu tăng sinh, chúng tôi thu đƣợc 5 chủng vi khuẩn (3 chủng trong mẫu đậu phộng và 2 chủng trong mẫu cà phê). Hình thái khuẩn lạc của các chủng phân lập đƣợc thể hiện qua bảng 3.1. Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái và nguồn gốc các chủng vi khuẩn phân lập. Tên chủng Nguồn phân lập Hình thái khuẩn lạc Tròn, lồi, tâm có màu trắng đục, CP1 Hạt cà phê kích thƣớc khuẩn lạc nhỏ. Tròn, lồi, có màu trắng đục, kích CP2 Hạt cà phê thƣớc khuẩn lạc nhỏ. Tròn, lồi, nhăn, có màu vàng sậm, V1 Đậu phộng kích thƣớc khuẩn lạc lớn. Tròn, lồi, nhăn, có màu vàng nhạt, V2 Đậu phộng kích thƣớc khuẩn lạc nhỏ. Tròn, lồi, bóng, tâm có màu trắng VK2 Đậu phộng đục, kích thƣớc khuẩn lạc lớn. - Từ các chủng vi khuẩn vừa phân lập đƣợc, chúng tôi tiếp tục tiến hành có khảo sát hoạt tính kháng nấm. 3.1.1. Khảo sát khả năng đối kháng các chủng khuẩn phân lập với nấm bằng phương pháp đồng nuôi cấy trên môi trường hỗn hợp. - 5 chủng vi khuẩn phân lập đƣợc tiền hành đối kháng với nâm mốc bằng phƣơng pháp đồng nuôi cấy trên môi trƣờng hỗn hợp. - Sau 4 ngày nuôi cấy, kết quả đối kháng với nấm mốc của các chủng khuẩn đƣợc thể hiện qua hình 3.1. Tại đĩa cấy vi khuẩn V2 (hình 3.1.C): Khuẩn lạc nấm mọc lan ra hết đĩa môi trƣờng. Tại đĩa cấy vi khuẩn VK2 (hình 3.1.B): Khuẩn lạc nấm phát triển kém hơn so với khuẩn lạc nấm trên đĩa đối chứng. 40
Đồ án tốt nghiệp Tại đĩa cấy vi khuẩn CP1, CP2 và V1 (hình 3.1.D, 3.1.E và 3.1.F): khuẩn lạc nấm hầu nhƣ không phát triển hay phát triển rất ít. Hình 3.1. Kết quả đối kháng của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc trên môi trƣờng hỗn hợp. A.Đối chứng chỉ cấy nấm. B. Thí nghiệm cấy vi khuẩn VK2. C. Thí nghiệm cấy vi khuẩn V2. D. Thí nghiệm cấy vi khuẩn V1. E. Thí nghiệm cấy vi khuẩn CP1. F. Thí nghiệm cấy vi khuẩn CP2. 41
Đồ án tốt nghiệp - Từ kết quả thí nghiệm, dựa vào sự ức chế sự phát triển nấm mốc trên mỗi đĩa thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy 4 trên 5 chủng vi khuẩn có khảng năng kháng đƣợc nấm. Đó là các chủng CP1, CP2 phân lập từ hạt cà phê và VK2, V2 phân lập từ đậu phộng. - Tiếp tục tiên hành khảo sát khả năng đối kháng của vi với nấm mốc bằng dịch ly tâm canh trƣờng nuôi cấy mỗi vi khuẩn. 3.1.2. Khảo sát khả năng đối kháng với nấm của dịch ly tâm canh trường nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường hỗn hợp. - 4 chủng vi khuẩn là: CP1, CP2, VK2 và V2 đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng NB sau 24 giờ để thu canh trƣờng. Sau đó ly tâm thu dịch trong loại bỏ sinh khối để tiến hành đối kháng với nấm mốc. - Sau thời gian nuôi cấy đối kháng, vì lí do khách quan (do nấm mốc xảy ra hiện tƣợng bay bào tử) nên làm ảnh hƣởng đến kết quả của thí nghiệm. Nhƣng do bản chất của các dịch ly tâm canh trƣờng nuôi cấy mỗi loại vi khuẩn không có khả năng ức chế nấm môc, nên trong các đĩa thí nghiệm khuẩn lạc nấm phát triển lấn át và phát trên toàn bền mặt đĩa thạch. - Tuy kết quả của khảo sát đối kháng theo phƣơng pháp đồng nuôi cấy cho kết quả khả quan (4 trên 5 chủng có khả năng lất át nấm mốc), nhƣng nồng độ chất kháng nấm trong canh trƣờng quá thấp để thấy khả năng kháng nấm trong dịch nuôi cấy loại bỏ tế bào. - Chúng tôi quyết định không tiếp tục thí nghiệm với các chủng vừa phân lập. Thay vào đó, chúng tôi sẽ phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn tù các nguồn mẫu khác và theo cách tiếp cận thứ hai. 42
Đồ án tốt nghiệp 3.2. Phân lập các chủng khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo cách tiếp cận thứ hai. - Do việc phân lập tuyển chọn theo cách tiếp cận thứ nhất không cho kết quả tốt, chúng tôi quyết định tiếp tục phân lập các chủng vi khuẩn trên các nguôn mẫu khác theo cách tiếp cận thứ hai. - Theo cách tiếp cận này, việc phân lập đƣợc thu hẹp do mẫu phân lập đã đƣợc sàng lọc (chỉ giữ lại những vi khuẩn hiếu khí sinh bào tử qua việc xử lý nhiệt nguồn mẫu 800C, 15 phút trƣớc khi tăng sinh và dựa trên khả năng khả năng kháng nấm của dịch ly tâm canh trƣờng tăng sinh các nguồn mẫu). Đồng thời quan trọng hơn cả là chúng tôi đã bổ sung tơ nấm nuôi cấy riêng làm chất cảm ứng, với hy vọng làm tăng khả năng phân lập các chủng khuẩn có khả năng kháng nấm. - Các nguồn mẫu: trái cà phê, vỏ đậu phộng và đất trồng rau đƣợc tăng sinh trong môi trƣờng NB1 (chứa tơ nấm) sau 24 giờ. Ly tâm dịch nuôi cấy, thu dịch trong tiến hành thử khả năng đối kháng. - Kết quả đối kháng trên môi trƣờng PDA của các mẫu tăng sinh sau 72 giờ khảo sát đƣợc thể hiện trong hình 3.2: Với mẫu tăng sinh trái cà phê, hình thái nấm mốc phát triển không đều nhƣ đĩa đối chứng. Khuẩn lạc nấm bị khuyết ở những vi trí tiếp xúc với giếng bơm dịch ly tâm mẫu tăng sinh. Nhƣ vậy dịch tăng sinh mẫu trái cà phê có khả năng có chứa hoạt tính kháng nấm. Chúng tối tiến hành pha loãng dịch tăng sinh mẫu, cấy trang để phân rẽ các chủng vi khuẩn. Với hai mẫu tăng sinh vỏ đậu phộng và đất trồng rau, hình thái nấm mốc phát triển bình thƣờng và tƣơng đối giống với đĩa nấm đối chứng. Tại điểm tiếp xúc với giếng bơm dịch ly tâm mẫu tăng sinh, khuẩn lạc nấm vẫn phát triển bình thƣờng. Nhƣ vậy dịch tăng sinh vi khuẩn từ hai mẫu vỏ đậu phộng và đất trồng rau không có khả năng kháng nấm. 43
Đồ án tốt nghiệp A1 B1 C1 1 A2 B2 C2 1 Hình 3.2. Kết quả đối kháng nấm của các dịch tăng sinh trên môi trƣờng PDA. A1. Mẫu trái cà phê. A2. Đối chứng chỉ cấy nấm. B1. Mẫu đất trồng rau. B2. Đối chứng chỉ cấy nấm. C1. Mẫu vỏ đậu phộng. C2. Đối chứng chỉ cấy nấm. - Từ dịch tăng sinh mẫu trái cà phê, chúng tôi cấy trang phân lập ở các nồng độ pha loãng 10-5,10-6,10-7 mẫu tăng sinh để phân rẻ các chủng vi khuẩn có chứa trong dịch tăng sinh. - Sau khi ủ 24 giờ, quan sát đĩa cấy và ghi nhận những chủng khuẩn có hình thái khuẩn lạc khác nhau. Tiến hành cấy ria làm thuần các chủng trên môi trƣờng NA. Kết quả, thu nhận đƣợc 2 chủng vi khuẩn có chứa trong dịch. Tiến hành nhuộm gram quan sát tế bào, quan sát hình thái khuẩn lạc trên kính hiển vi và giữ giống để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 44
Đồ án tốt nghiệp Chủng CS1a (Hình 3.3.): cầu khuẩn, gram dƣơng. Khuẩn lạc tròn bờ đều, tâm trắng đục, đƣờng kính > 0.5mm. Hình 3.3. Chủng vi khuẩn CS1a phân lập từ trái cà phê. 45
Đồ án tốt nghiệp Chủng CS1b (Hình 3.4.): trực khuẩn, gram dƣơng. Khuẩn lạc tròn, lồi ít, bờ không đều, trong suốt, đƣờng kính < 0.5mm, khuẩn lạc chuyển sang màu nâu sau 48h nuôi cấy trên thạch NA. Hình 3.4. Chủng vi khuẩn CS1b phân lập từ trái cà phê. 46
Đồ án tốt nghiệp 3.2.1. Khảo sát khả năng đối kháng các chủng khuẩn phân lập với nấm mốc trên môi trường PDA. - Từ kết quả từ thí nghiệm trên, chúng tôi tiếp tục khảo sát khả năng kháng nấm của hai chủng vi khuẩn CS1a và CS1b vừa phân lập đƣợc. - Việc khảo sát này nhằm chọn ra đƣợc khả năng kháng nấm từ hai chủng khuẩn. Việc sử dụng dịch ly tâm của canh trƣờng nuôi cấy vi khuẩn nhằm xem xét các sản phẩm trao đổi chất ngoại bào có phải là tác nhân kháng nấm mốc. - Song song việc khảo sát hoạt tính kháng nấm của hai vi khuẩn CS1a và CS1b, thí nghiệm còn xem xét việc bổ sung chất cảm ứng là tơ nấm mốc vào môi trƣờng có tác động đến sự phát triển của nấm mốc. - Sau thời gian 24 - 72 giờ khảo sát, kết quả đối kháng của 2 chủng vi khuẩn CS1a, CS1b và tác động của chất cảm ứng lên nấm mốc đƣợc thể hiện qua hình 3.5: So với đối chứng chỉ cấy nấm, hình thái nấm mốc trong đĩa cấy dịch ly tâm canh trƣờng tăng sinh chủng khuẩn CS1a, phát triển không có sự khác biệt. Tại các điểm bơm dịch ly tâm canh trƣờng, khuẩn lạc nấm vẫn phát triển bình thƣờng. Nhƣ vậy canh trƣờng tăng sinh khuẩn CS1a không có hoạt tính kháng nấm. So với đối chứng chỉ cấy nấm, hình thái nấm mốc trong đĩa cấy dịch ly tâm canh trƣờng tăng sinh chủng khuẩn CS1b, phát triển không bình thƣờng. Khuẩn lạc nấm bị khuyết ở những vi trí tiếp xúc với giếng bơm dịch ly tâm canh trƣờng. Nhƣ vậy trong canh trƣờng tăng sinh khuẩn CS1b có hoạt tính kháng nấm. So với đối chứng chỉ cấy nấm, hình thái nấm mốc trong đĩa cấy môi trƣờng NB1, phát triển không có sự khác biệt. Tại các điểm bơm dịch môi trƣờng, khuẩn lạc nấm vẫn phát triển bình thƣờng. Nhƣ vậy chất cảm ứng bổ sung vào môi trƣờng không tác động lên sự phát triển của nấm mốc. 47
Đồ án tốt nghiệp A1 B1 C1 A2 B2 C2 Hình 3.5. Kết quả đối kháng nấm của các dịch ly tâm canh trƣờng với nấm mốc trên môi trƣờng PDA. A1. Dịch ly tâm canh trƣờng khuẩn CS1a. A2. Đối chứng chỉ cấy nấm. B1. Dịch ly tâm canh trƣờng khuẩn CS1b. B2. Đối chứng chỉ cấy nấm. C1. Môi trƣờng NB1. C2. Đối chứng chỉ cấy nấm. - Kết quả cho thấy rằng, trong hai khuẩn phân lập đƣợc chỉ có chủng khuẩn CS1b có hoạt tính kháng nấm mốc. Và hoạt tính này là do sản phẩm trao đổi chất có mặt trong canh trƣờng tăng sinh vi khuẩn. - Với kết quả việc bổ sung chất cảm ứng là tơ nấm mốc vào môi trƣờng khảo sát làm đối chứng không phát hiện tác động lên sự phát triển của nấm mốc, chúng tôi khẳng định hoạt tính kháng nấm là do vi khuẩn phân lập đƣợc tổng hợp. 48
Đồ án tốt nghiệp 3.2.2. Khảo sát khả năng ức chế khả năng sinh aflatoxin của các chủng khuẩn phân lập với nấm trên môi trường CCA. - Từ kết quả từ thí nghiệm trên, chúng tôi tiếp tục khảo sát khả năng ức chế sự tổng hợp aflatoxin từ nấm, của chủng vi khuẩn CS1b vừa khảo sát ở thí nghiệm trên. - Việc khảo sát này nhằm xác định trong canh trƣờng nuôi cấy vi khuẩn có chứa hợp chất ức chế sự tổng hợp aflatoxin từ nấm mốc. Từ đó đƣa ra kết luận về khả năng tổng hợp đƣợc sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính ức chế tổng hợp aflatoxin từ nấm mốc. - Sau thời gian 24 - 72 giờ khảo sát, kết quả thí nghiệm ảnh hƣởng của vi khuẩn CS1b lên khả năng tổng hợp aflatoxin từ nấm mốc đƣợc thể hiện qua hình 3.5: So với đối chứng chỉ cấy nấm, hình thái nấm mốc trong đĩa cấy dịch ly tâm canh trƣờng tăng sinh chủng khuẩn CS1b, phát triển không bình thƣờng. Khuẩn lạc nấm bị khuyết ở những vi trí tiếp xúc với giếng bơm dịch ly tâm canh trƣờng. Thí nghiệm này tiếp tục chứng minh chủng CS1b có khả năng kháng nấm mốc ngay trên môi trƣờng CCA.(hình 3.6) 1 2 Hình 3.6. Kết quả ức chế sự phát triển và khả năng tổng hợp aflatoxin của nấm mốc bởi dịch ly tâm canh trƣờng vi khuẩn trên môi trƣờng CCA. 1.Đối chứng nấm. 2. Ly tâm canh trƣờng khuẩn CS1b. 49
Đồ án tốt nghiệp 3.3. Khảo sát sinh hóa của chủng khuẩn phân lập đƣợc. - Từ kết quả của các thí nghiệm sàng lọc trên, chúng tôi tiến hành khảo sát một số đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn CS1b. - Kết quả đƣợc ghi nhận vào bảng 3.2. Bảng 3.2. Kết quả thử nghiệm sinh hóa vi khuẩn CS1b. Thử nghiệm CS1b Bào tử + Simmon citrate + Catalase + Protease + Chitinase - Glucose + Lên men các nguồn Sucrose - Carbonhydate Manitol - Lactose - 3.3.1. Nhuộm bào tử - Do mẫu tăng sinh đã đƣợc xử lý nhiệt nên vi khuẩn phân lập đƣợc buộc phải có khả năng sinh bào tử. Việc nhuộm bào tử nhằm xác định khả năng sinh bào tử của vi khuẩn CS1b. - Sau 1 – 6 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng NA, chúng tôi tiến hành nhuộm bào tử vi khuẩn CS1b. Kết quả chúng tôi phát hiện bào tử vi khuẩn CS1b sinh ra vào ngày nuôi cấy thứ 6. (Hình 3.7) 50
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.7. Kết quả nhuộm bào tử khuẩn CS1b 3.3.2. Thử nghiệm Simmon citrate - Tiến hành cấy vi khuẩn CS1b vào ống nghiệm môi trƣờng Simmon citrate, một ống nghiệm làm đối chứng. Sau 24 – 48 giờ theo dõi, chúng tối nhận thấy chủng CS1b cho kết quả dƣơng tính (ống nghiệm môi trƣờng chuyển sang màu xanh dƣơng). Qua đó cho thấy chủng khuẩn CS1b sử dụng đƣợc citrate làm nguồn carbon. Hình 3.8. Thử nghiệm Simmon citrate. CS1b cho kết quả dƣơng tính. A.Ống nghiệm đối chứng âm. B.Ống nghiệm cấy chủng CS1b. 51
Đồ án tốt nghiệp 3.3.3. Thử nghiệm catalase - Ở vi khuẩn có enzyme catalase, khi tiếp xúc với hydroperoxide (H2O2) sẽ có hiện tƣợng sủi bọt khí. Vi khuẩn sẽ chuyển hóa H2O2 thành H2O và O2. - Kết quả thí nghiệm, sinh khối chủng CS1b cho kết quả dƣơng tính. Xuất hiện bọt khí nhỏ lên sinh khối CS1b vài giọt H2O2 30% (hình 3.9). Chứng tỏ CS1b có hệ enzyme catalase. Hình 3.9. Thử nghiệm catalase. CS1b cho kết quả dƣơng tính. 3.3.4. Thử nghiệm protease - Kết quả thử nghiệm, chủng CS1b phân giải đƣợc cơ chất casein làm xung quanh giếng thạch bị trong suốt. Thử nghiệm đƣợc khẳng định kết quả khi tráng một lớp TCA 5% vào đĩa thí nghiệm (hình 3.10). Hình 3.10. Thử nghiệm protease. Chủng CS1b cho kết quả dƣơng tính. 52
Đồ án tốt nghiệp - Thử nghiệm cho thấy chủng CS1b đã phân lập tổng hợp đƣợc hệ enzyme protease, đây có thể đƣợc xem là một trong các tác nhân ức chế phát triển của nấm mốc. 3.3.5. Thử nghiệm chitinase. - Kết quả thử nghiệm, chủng CS1b không phân giải đƣợc cơ chất chitin không tạo vòng sáng. Môi trƣờng bắt màu của lugol (hình 3.11). Hình 3.11. Kết quả thí nghiệm chintinase. Chủng CS1b cho kết quả âm tính. - Nhƣ vậy chủng CS1b không tổng hợp đƣợc enzyme chitinase. Vậy hoạt tính kháng nấm của chủng CS1b không phải là do chitinase. 3.3.6. Thử nghiệm lên men carbohydrate. - Sau 24 - 48 giờ nuôi cấy, trong số 4 nguồn đƣờng khảo sát, chủng CS1b chỉ cho kết quả dƣơng tính với đƣờng Glucose (môi trƣờng nuôi cấy chuyển màu vàng) và cho kết quả âm tính với ba nguồn carbohydrate là sucrose, lactose và manitol (môi trƣơng nuôi cấy chuyển sang màu đỏ). Kết quả đƣợc thể hiện qua hình 3.12; hình 3.13; hình 3.14; hình 3.15. - Kết quả thí nghiệm cho thấy vi khuẩn CS1b có khả năng lên men Glucose tạo aicd. Các sản phẩm acid này cũng có thể là tác nhân kháng lại sự phát triến nấm mốc. Từ đó chúng tôi xem xét việc có thể tiến hành bổ sung Glucose vào môi trƣờng nuôi cấy CS1b nhằm thu đƣợc các sản phẩm có hoạt tính kháng nấm. 53
Đồ án tốt nghiệp ĐC CS1b Hình 3.12. Kết quả lên men Glucose. Chủng CS1b cho kết quả dƣơng tính. ĐC CS1b Hình 3.13. Kết quả lên men Lactose. Chủng CS1b cho kết quả âm tính. 54
Đồ án tốt nghiệp ĐC CS1b Hình 3.14. Kết quả lên men Sucrose. Chủng CS1b cho kết quả âm tính. ĐC CS1b Hình 3.15. Kết quả lên men Sucrose. Chủng CS1b cho kết quả âm tính. 55
Đồ án tốt nghiệp - Nhƣ vậy kết quả thử nghiệm sinh hóa của chủng vi khuẩn CS1b phân lập đƣợc phần nào phù hợp đặc điểm sinh hóa với vi khuẩn Bacillus, vì vậy chúng tôi có thể kết luận đây là chủng Bacillus sp. - Qua có thử nghiệm hóa sinh, chúng tôi còn nhận thấy rằng khả năng ức chế tổng hợp aflatoxin cũng nhƣ sự phát triển của nấm mốc do các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn CS1b. Các sản phẩm này tuy không có hoạt tính chitinase nhƣng có thể kháng nấm theo cơ chế khác. Nhƣ là protease hoặc β- glucanase, hoặc các hợp chất hữu cơ khác. - Sau khi thử nghiệm hai phƣơng pháp tiếp cận để phân lập vi khuẩn kháng nấm từ phụ phế phẩm, chúng tôi nhận thấy không khó khăn nhiều khi phân lập đƣợc vi sinh vật kháng nấm trong tự nhiên. Tuy nhiên để nghiên cứu và sản xuất các hợp chất kháng nấm từ vi sinh vật thì chất cảm ứng đóng vai trò quan trọng. Trong thời gian thực hiện đề tài, chúng tôi đã sử dụng tơ nấm làm chất cảm ứng. Tuy nhiên chƣa sử dụng các đơn chất tạo nên sinh khối nấm để làm chất cảm ứng, từ đó rút ra kết luận về tác nhân kháng nấm của vi khuẩn. 56
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận - Thử nghiệm hai phƣơng pháp tiếp cân để phân lập vi khuẩn đối kháng nấm sinh aflatoxin cho thấy, muốn khảo sát khả năng kháng nấm của canh trƣờng vi khuẩn khi loại bỏ tế bào, cần nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng chứa chất cảm ứng thuộc sinh khối nấm mốc. - Bằng phƣơng pháp trên, một chủng vi khuẩn Bacillus sp. đƣợc phân lập trên trái cà phê nhiễm nấm, có khả năng tổng hợp chất kháng nấm sinh aflatoxin (Aspergillus sp.) 4.2. Đề nghị - Cần mở rộng nguồn phân lập khác nhƣ đất trồng, trái cây để tìm kiếm thêm các chủng vi khuẩn có hoạt tính kháng nấm. - Định danh vi khuẩn CS1b đến cấp loài nhờ sử dụng API kit hoặc giải trình tự gen 16S rRNA. - Cần tìm hiểu thêm về cơ chế tác động và các tác nhân vi khuẩn phân lập đƣợc ức chế sự phát triển và hình thành độc tố aflatoxin. - Cần có những nghiên cứu trích ly các hợp chất có trong canh trƣờng nuôi cấy vi khuẩn phân lập đƣợc, thu hợp chất tinh khiết có hoạt tính kháng nấm cao. - Nghiên cứu chỉ xem xét đến hoạt tính kháng nấm sinh aflatoxin, cần mở rộng khảo sát của chủng khuẩn Bacillus sp. phân lập đƣợc lên các nấm sinh độc tố khác nhƣ Fusarium, Aspergillus và Penicilium - Các thí nghiệm trong nghiên cứu chỉ dừng lại ở cấp độ in vitro. Cần thực hiện những thí nghiệm in vivo để xác định khả năng kháng nấm tốt hơn. 57
Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Đậu Ngọc Hào, Lê Thị Ngọc Diệp (2003). Nấm mốc và độc tố aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi. NXB nông nghiệp. [2] Dƣơng Thanh Liêm, Bùi Huy Nhƣ Phúc, Dƣơng Duy Đồng, (2002). Thức ăn và dinh dưỡng động vật. NXB nông nghiệp. [3] Lê Anh Phụng( 2001). Bệnh nhiễm độc aflatoxin và các phương pháp phát hiện aflatoxin. Chuyên đề cấp tiến sĩ Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. [4] Phạm Văn Tất (1996), Tác hại của Aflatoxin. Tạp chí thuốc và sức khỏe số 79 (1- 11 - 1996). [5] Phạm Hoàng Thái (2007). Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất, khảo sát khả năng ức chế sản sinh aflatoxin của các chủng phân lập được. Luận án tốt nghiệp Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tài liệu tiếng Anh. [6] Asao T., Buchi G., Adbel-Kader M.M., Chang S.B., Wick E.L., Wogan G.N. (1963). Aflatoxins B and G. Journal of American Chemical Society, 85, 1706- 1707. [7] Butler W.H, 1964. Acute toxicity of aflatoxin Bl in rats. B. J . Cancer 18:756. [8] Davis N.D., Iyer S.K., Diener U.L. 1987. Improved Method of Screening for Aflatoxin with a Coconut Agar Medium. Applied and Environmental Microbiology 53:1593-1595. [9] Kondo T., Sakurada M., Okamoto S., Ono M., Tsukigi H., Suzuki A., Nagasawa H., Sakuda S. (2001). Effects of aflastatin A, an inhibitor of aflatoxin production, on aflatoxin biosynthetic pathway anh glucose metabolism in Aspergillus parasiticus. J Antibiot (Tokyo) 54: 650-657. [10]Kurtzman C.P., Horn B.Q., Heseltine C.W. (1987). Aspergillus nomius, a new aflatoxin producing species related to Aspergillus flavus and Aspergillus tamari. Antonie van Leeuwenhoek 53: 147-158. 58
Đồ án tốt nghiệp [11]Munimbazi C., Bullerman LB. (1998). Inhibition of aflatoxin production of Aspergillus parasiticus NRRL 2999 by Bacillus pumilus. Mycopathologia 140: 163-169. [12]Ono M., Sakuda S., Suzuki A., Isogai A. (1997). Aflastatin A, a novel inhibitor of aflatoxin production by aflatoxingenic fungi. J Antibiot (Tokyo) 50: 111-118. [13]Peterson S.W., Ito Y., Horn B.W., Goto T. (2001). Aspergillus bombycis, a new aflatoxigenic species and genetic variation in its sibling species, A. monius. Mycologia 93: 689-703. [14]Wild CP., Gong YY. 2010. Mycotoxins and human disease: a largely ignored global health issue. Carcinogenesis 31:71-82. WHO (2008). World Health Statistics (2008). WHO Press, Geneva. [15]Wu F., Khlangwiset P. 2010. Health economic impacts and cost-effectiveness of aflatoxin reduction strategies in Africa: Case studies in biocontrol and postharvest interventions. Food Additives & Contaminants 27:496-509. [16]Yan PS., Song Y., Sakuno E., Nakajima H., Nakagawa H., Yabe K. (2004). Cyclo(L-leucyl-L-prolyl) produced by Achromobacter xylosoxidans inhibits aflatoxin production by Aspergillus parasiticus. Appl Environ Microbiol 70:7466-7473. 59
PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: THÀNH PHẦN MÔI TRƢỜNG SỬ DỤNG TRONG CÁC THÍ NGHIỆM. A.1. Thành phần môi trƣờng Potato Dextrose Agar (PDA) Môi trƣờng PDA D - Glucose 20 g Agar 20 g Dịch chiết khoai tây 1000 ml A.2. Thành phần môi trƣờng Potato Dextrose Broth (PDB) Môi trƣờng PDB D - Glucose 20 g Dịch chiết khoai tây 1000 ml Lưu ý: - Dịch chiết khoai tây: 200g khoai tây thái lát, cho thêm vào 1000ml đun sôi trong 30 phút, thu dịch chiết định mức lên 1000ml. Bảo quản ở tủ mát khi chƣa sử dụng. - Khi chỉ nuôi cấy nấm mốc, có thể bổ sung Chloramphenicol vào thành phần môi trƣờng với tỉ lệ 0.02%.
A.3. Thành phần môi trƣờng Nutrient Broth (NB) Môi trƣờng NB Peptone 5 g Meat extract 3 g NaCl 5 g Nƣớc cất 1000 ml A.4. Thành phần môi trƣờng Nutrient Broth_1 (NB1) Môi trƣờng NB1 Peptone 2.5 g Meat extract 1.5 g NaCl 2.5 g Nƣớc cất 500 ml Dịch tơ nấm (10g/l) 500 ml A.5. Thành phần môi trƣờng Nutrient Agar (NA) Môi trƣờng NA Peptone 5 g Meat extract 3 g NaCl 5 g Agar 20 g Nƣớc cất 1000 ml
A.6. Thành phần môi trƣờng Coconut Cream Agar (CCA) Môi trƣờng CCA Agar 20 g Dịch nƣớc cốt dừa 500 ml Nƣớc cất 500 ml Lưu ý: - Dịch nƣớc cốt dừa: 250g cơm dừa đƣợc trộn đều 5 phút trong 500ml nƣớc cất đun sôi . Lọc loại bỏ cặn. - Khi pha môi trƣờng, cần đun sôi hỗn hợp trƣớc khi khử trùng bắng autoclave. A.7. Thành phần môi trƣờng Simmon citrate Môi trƣờng Simmon citrate MgSO4 0.2 g NH4H2PO4 1 g K2HPO4 1 g Natri Citrate 2 g NaCl 5 g Bromothymol Blue 0.08 g Agar 15 g Nƣớc cất 1000 ml
A.8. Thành phần môi trƣờng Phenol Red Carbohydrate Broth Môi trƣờng Phenol Red Carbohydrate Broth Tryticase hoặc peptone 10 g NaCl 5 g Meat extract 1 g Phenol red 0.018 g (7.2 ml dung dịch Phenol red 0.25%) Nƣớc cất 1000 ml Carbohydrate A.9. Thành phần môi trƣờng Casein 1% Môi trƣờng CCA Agar 15 g Casein 10 g Đệm Phosphate (pH=7) 1000 ml
A.10. Thành phần môi trƣờng Chitin 1% Môi trƣờng CCA Agar 15 g Huyền phù chitin 2% 500 ml Đệm Phosphate (pH=7) 500 ml Lưu ý: - Huyền phù hóa chitin: lấy 10 g chitin hòa vào 100ml HCl đậm đặc. Khuấy đều trong 10 phút. Sau đó cho từ từ nƣớc cất đã làm lạnh đến 500ml, chitin huyền phù có màu trắng sữa. Để qua đêm trong ngăn mát tủ lạnh. Huyền phù sẽ đƣợc rửa bằng cách ly tâm (4000 vòng/10 phút) nhiều lần với dung dich có pH = 8 đến khi huyền phù đạt pH = 7. Bảo quản huyền phù trong tủ mát.
PHỤ LỤC B: HÌNH ẢNH NẤM MỐC ASPERGILLUS SP. X3 PHÂN LẬP TRÊN ĐẬU PHỘNG - Nấm Aspergillus sp. X3 đƣợc sinh viên Nguyễn Vân Hƣơng (lớp 11DSH04_ Đại học Công nghệ TP. Hồ Chi Minh) phân lập từ đậu phộng. - Trên môi trƣờng PDA, nấm Aspergillus sp. X3 có sợi nấm màu trắng, bào tử có màu vàng lục đến luc. - Định danh sơ bộ, X3 thuộc loài Aspergillus. Có hình thái lạc nấm và hình thái cuống bào tử tƣơng đối giống với các chủng Asp. flavus và Asp. parisiticus. - Trên môi trƣờng AFPA, Aspergillus sp. X3 làm hóa cam môi trƣờng. - Trên môi trƣờng CCA, Aspergillus sp. X3 phát huỳnh quang dƣới ánh sáng cực tím (UV) ở bƣớc sóng 365 nm.