Báo cáo Nghiên cứu ảnh hưởng của bức xạ gamma lên cây bạc hà (Mentha arvensis L.) In vitro

Nội dung text: Báo cáo Nghiên cứu ảnh hưởng của bức xạ gamma lên cây bạc hà (Mentha arvensis L.) In vitro

1. NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA BỨC XẠ GAMMA LÊN CÂY BẠC HÀ (Mentha arvensis L.) IN VITRO Học viên: Trần Lệ Trúc Hà GVHD: TS. Trần Thị Lệ Minh TS. Lê Quang Luân
2. NỘI DUNG Chương 1: GIỚI THIỆU Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chương 4: DỰ KIẾN KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 2
3. Đặt Vấn Đề • Tinh dầu được xem là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp • Con người cần sử dụng các chất có nguồn gốc tự nhiên nhằm bảo vệ sức khoẻ và môi trường • Phương pháp nuôi cấy in vitro là phương pháp hữu hiệu để nhân nhanh các giống cây trồng • Bức xạ gamma là một tác nhân hiệu quả trong việc cải tiến các đặc tính tốt 3
4. Chương 1: GIỚI THIỆU 1. Mục tiêu - Xây dựng quy trình nuôi cấy in vitro cây Bạc hà - Khảo sát ảnh hưởng của bức xạ gamma lên cây Bạc hà in vitro 2. Mục đích -Tạo cây Bạc hà có khả năng sản sinh tinh dầu bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro - Đánh giá khả năng chọn tạo giống cây Bạc hà bằng phương pháp chiếu xạ gamma kết hợp kĩ thuật nuôi cấy in vitro 4
5. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về Bạc hà Châu Á (Bạc hà Á) - Vị trí phân loại + Giới: Plantae + Ngành: Magnoliophyta + Lớp: Magnoliopsida + Bộ: Lamioles + Họ: Lamiaceae + Chi: Mentha + Tên khoa học: Mentha arvensis L. 5
6. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU - Nguồn gốc Bạc hà Á Được trồng từ rất lâu ở Nhật Bản và được trồng ở qui mô công nghiệp ở Ấn Độ - Đặc điểm hình thái Bạc hà Á Thân rỗng ruột khi già, lá là nguyên liệu chính để cất tinh dầu, rễ được cấu tạo từ thân ngầm dưới đất, hoa bồng hình chóp chiếm 4 – 6% tỉ lệ tinh dầu - Giống Bạc hà Á phổ biến ở Việt Nam + Bạc hà bản địa + Bạc hà di thực 6
7. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.2. Giới thiệu chung về tinh dầu Menthone Menthol C10H18O C10H20O 7
8. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU - Các phương pháp khai thác tinh dầu  Chưng cất + Chưng cất với nước + Chưng cất bằng nước và hơi nước + Chưng cất bằng hơi nước có nồi hơi riêng Trích ly bằng dung môi bay hơi Trích ly bằng dung môi không bay hơi + Ngâm + Hấp phụ + Động học 8
9. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.3. Phương pháp nhân giống in vitro - Khái niệm - Ý nghĩa + Không phụ thuộc vào thời tiết, không chiếm nhiều diện tích, có thể tiến hành ở bất kì thời điểm nào + Phục tráng giống + Có thể đáp ứng số lượng lớn trong thời gian ngắn + Dễ dàng bảo quản giống + Tiết kiệm chi phí vận chuyển + Vật liệu để nhân giống dồi dào + Góp phần tích cực cho công tác giống cây trồng + Dễ dàng trao đổi kết quả với các nước + Hiệu quả kinh tế cao 9
10. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.3. Phương pháp nhân giống in vitro -Ứng dụng + Tạo cây trồng sạch bệnh + Sản xuất cây đơn bội + Lai xa + Bảo quản nguồn gen 10
11. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU - Các phương pháp nuôi cấy in vitro . Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng . Nuôi cấy mô sẹo . Nuôi cấy tế bào đơn và thu nhận các chất có hoạt tính sinh học . Nuôi cấy protoplast - chuyển gen . Nuôi cấy hạt phấn đơn bội 11
12. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU - Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro . Mẫu cấy . Môi trường nuôi cấy . Điều kiện nuôi cấy (ánh sáng, nhiệt độ) - Môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy in vitro . Khoáng (đa lượng và vi lượng) . Amino acid . Nguồn carbon . Vitamin . Các chất điều hòa sinh trưởng . Một số các thành phần khác trong môi trường nuôi cấy12
13. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.4. Giới thiệu về tia gamma và những ứng dụng đối với cây trồng - Khái niệm bức xạ Bức xạ là sự phát năng lượng vào môi trường dưới dạng tia. Bất kỳ bức xạ nào có khả năng ion hóa các nguyên tử hay phân tử mà nó gặp trên đường đi đều coi là tia ion hóa Tia ion hóa được chia làm 2 loại: + Sóng điện từ: Tia Roentgen, tia gamma + Các hạt cơ bản: α, β, Proton, Neutron  Bức xạ gamma là bức xạ điện từ có độ xuyên mạnh 13
14. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU - Cơ chế gây đột biến của bức xạ ion hóa + Tác động lên nhiễm sắc thể, gây ra hiện tượng đột biến nhiễm sắc thể. + Tác động lên các nguyên tử của phân tử DNA + Tác động lên phân tử DNA nghỉ, ngoài thời kì nhân đôi + Tác động lên phân tử DNA đang trong thời kì nhân đôi + Tác động lên hệ thống tổng hợp và sửa chữa DNA + Ảnh hưởng phối hợp 14
15. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.4.5. Những thành tựu nghiên cứu về đột biến bằng phương pháp chiếu xạ a. Trên thế giới -Nghiên cứu thực nghiệm bằng tia X trên thực vật và trên vi khuẩn và đã tìm ra được những sinh vật biến dị nổi bật (Muller, 1925). -"Tia phóng xạ đã làm thay đổi các đặc điểm sinh trưởng, phát dục, hình thái tế bào, vật chất di truyền, đồng thời làm xuất hiện những biến dị có hại, có lợi hoặc trung tính trên nhiều loại cây trồng" (Humphrey, 1951; Rauling, 1958; William, 1960). - 1019 giống đột biến ở những cây có hạt được đưa vào sản xuất và 523 giống đột biến ở những cây lương thực và hoa kiểng (tổ chức phối hợp FAO/IAEA, 1964). - Khử các thành tố axit oligosacharide dưới vỏ đậu Hà Lan (Jammala Machaiah và Mrinal Pednekar, tại Trung tâm Nguyên tử Bhabha, 2002). 15
16. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU b. Trong nước - Đột biến hom Mía (Nguyễn Văn Vinh, 2002) - Kích thích hạt Sắn (Hoàng Hưng Tiến, 2003) - Nghiên cứu chiếu xạ gamma liều thấp lên mẫu Khoai tây giống và hoa Cúc (Nguyễn Tiến Thịnh, 2004) - Nghiên cứu gây đột biến giống Lan bằng tia gamma (Viện Khoa học Miền Nam, 2004). -Nghiên cứu chiếu xạ gây đột biến giống lúa cạn (Lê Xuân Thám, 2004). - Kích thích hạt giống hoa Kiết Tường, củ Lyli (Trần Thanh Hân, 2005). 16
17. Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm: 3/2009 – 12/2010 3.2. Vật liệu nghiên cứu - Giống cây: Bạc hà (Mentha arvensis L.) - Mẫu thí nghiệm: Mẫu nuôi cấy in vitro, mẫu chiếu xạ, mẫu trồng ở vườn ươm, mẫu chiết xuất tinh dầu -Thiết bị và dụng cụ: tủ cấy, nồi hấp, nguồn gamma 60Co - Hóa chất: MS, menthol, menthone chuẩn 17
18. Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3. Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Tạo cây Bạc hà in vitro hoàn chỉnh - Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của bức xạ gamma lên cây Bạc hà in vitro - Nội dung 3: Lựa chọn và đánh giá tính ổn định của các dòng biến dị phát hiện được 18
19. Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Nội dung 1: Tạo cây Bạc hà (Mentha arvensis L.) in vitro hoàn chỉnh + Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ javel và thời gian khử trùng thích hợp để khử trùng mẫu cấy Vật liệu: . Đốt thân Bạc hà mang chồi ngủ . Chất khử trùng: Javel Super (Công ty TNHH Mỹ Hảo) Cách tiến hành . Các thao tác ngoài phòng thí nghiệm . Các thao tác tiếp theo trong tủ cấy 19
20. Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm Mục đích thí nghiệm: khảo sát nồng độ javel và thời gian xử lý khử trùng Xác định nồng độ javel và thời thích hợp gian xử lý thích hợp nhất để khử Nghiệm Nồng độ Thời gian trùng mẫu đốt thân thức Javel : khử trùng Chỉ tiêu theo dõi: nước (phút) - Tỉ lệ mẫu sống (%) = (Tổng số 1(ĐC) 1:5 10 mẫu sống / tổng số mẫu cấy) x 100 2 1:4 10 - Tỉ lệ mẫu đạt (%) = (Tổng số 3 1:3 10 mẫu đạt / tổng số mẫu cấy) x 4 1:2 10 100 5 1:5 15  Thời gian theo dõi: 3 - 5 6 1:4 15 tuần 7 1:3 15 20 8 1:2 15
21. Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU + Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến sự hình thành callus từ lá Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ BA và NAA đến  Mục đích: Tìm ra nồng sự hình thành callus từ lá độ của NAA và BA tối ưu Nghiệm Nồng độ Nồng độ cho việc tạo callus thức NAA (mg/l) BA (mg/l)  Chỉ tiêu theo dõi : 1(ĐC) 0 0 2 0,5 0 - Phần trăm mẫu tạo callus 3 0,5 0,1 - Màu sắc và đặc điểm của 4 0,5 0,2 callus 5 0,5 0,25  Thời gian theo dõi: 3- 5 6 1,0 0 tuần 7 1,0 0,1 8 1,0 0,25 21
22. Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU + Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của BA lên khả năng tái sinh chồi từ callus của cây Bạc hà in vitro Bảng 3.3: Bố trí thí nghiệm khảo Mục đích: Xác định nồng độ sát nồng độ BA lên khả năng tái BA thích hợp đến sự tái sinh chồi sinh chồi cây Bạc hà in vitro cây Bạc hà Nghiệm thức Nồng độ BA  Chỉ tiêu theo dõi: (mg/l) - Tỉ lệ mẫu tạo chồi 1 (ĐC) 0 - Số chồi trên mẫu: Số chồi trung 2 0,5 bình trên 1 mẫu cấy 3 1 - Chiều cao chồi (cm): Đo từ mặt 4 1,5 thạch đến đỉnh sinh trưởng cao nhất của cụm chồi 5 2 -Số lá / chồi: Số lá trung bình trên 6 2,5 1 chồi 7 3  Thời gian theo dõi: 5 - 7 tuần 8 3,5 22
23. Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU + Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên khả năng hình thành rễ của cây Bạc hà in vitro Bảng 3.4: Bố trí thí nghiệm khảo Mục đích: Xác định nồng sát ảnh hưởng của NAA lên khả độ NAA thích hợp lên khả năng hình thành rễ của cây Bạc hà in vitro năng ra rễ cây Bạc hà Nghiện thức Nồng độ NAA Chỉ tiêu theo dõi: (mg/l) 1 (ĐC) 0 - Phần trăm chồi tạo rễ 2 0,3 - Số rễ trung bình trên 1 3 0,35 chồi 4 0,4 - Chiều dài rễ (cm): Đo từ 5 0,45 gốc đến hết chiều dài rễ 6 0,5  Thời gian theo dõi: 4 - 6 7 0,55 8 0,6 tuần 23
24. Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Nội dung 2: Khảo sát ảnh hưởng của bức xạ gamma lên cây Bạc hà in vitro a. Chiếu xạ gây kích thích Bảng 3.6: Bố trí thí nghiệm liều xạ gây kích thích lên cây Bạc hà in vitro Mẫu chồi Nghiệm Liều xạ Mẫu  Hệ số nhân chồi = tổng số thức (Gy) chồi hình thành / một mẫu cấy Callus Chồi  Sự tăng trưởng 1 0 3 3 + Chiều cao chồi (cm) 2 0,2 3 3 + Số lá trên chồi 3 0,5 3 3 Mẫu callus 4 1,0 3 3 Độ tăng sinh khối và khả năng 5 2,0 3 3 biệt hoá chồi 6 5,0 3 324
25. Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU b. Chiếu xạ gây biến dị Bảng 3.6: Bố trí thí nghiệm Chiếu xạ đợt 1  LD50 liều xạ gây biến dị lên cây Chiếu xạ đợt 2 Bạc hà in vitro Mẫu chồi Nghiệm Liều Mẫu  Hệ số nhân chồi = tổng số chồi thức xạ (Gy) Callus Chồi hình thành / một mẫu cấy  Sự tăng trưởng 1 0 3 3 + Chiều cao chồi (cm) 2 10 3 3 + Số lá trên chồi 3 20 3 3 - Lá: Tần số biến dị lá = (số cây có lá biến dị / số 4 40 3 3 cây quan sát)*100 + Màu sắc 5 50 3 3 + Hình dạng 6 60 3 3 + Kích thước 25 - Thân:
26. Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mẫu callus Mẫu callus sau khi chiếu xạ tiếp tục nuôi cấy và theo dõi độ tăng sinh khối, tỷ lệ sống và khả năng biệt hóa chồi.  Mục đích - Xác định sự ảnh hưởng của bức xạ gamma lên mẫu callus, chồi cây Bạc hà, qua đó xác định liều chiếu xạ gây gây kích thích và biến dị hiệu quả nhất. - Tạo các dòng Bạc hà biến dị có đặc tính mới so với giống gốc. 26
27. Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Nội dung 3: Lựa chọn và đánh giá các dòng biến dị phát hiện được + Chỉ tiêu theo dõi: . Theo dõi sinh trưởng và phát triển của cây từ khi trồng đến khi ra hoa rộ: Chiều cao cây, kích thước lá, hình dạng lá, khả năng đẻ nhánh, năng suất . Phân tích hàm lượng tinh dầu  Định tính và bán định lượng bằng sắc ký bản mỏng  Định lượng bằng sắc ký khí 27
28. Chồi Callus Khử trùng Tái sinh Chiếu xạ - Quy trình nuôi cấy in vitro cây Bạc hà - Giá trị LD50 - Các dòng Bạc hà Trồng trong Kết biến dị nhà lưới - Phương pháp quả dịnh tính và định lượng Menthol28
29. Chương 4 DỰ KIẾN KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC - Quy trình nuôi cấy in vitro cây Bạc hà - Giá trị LD50 của mẫu callus và chồi khi chiếu xạ tia gamma 60Co - Các dòng Bạc hà biến dị - Phương pháp định tính và bán định lượng Menthone và Menthol bằng sắc ký bản mỏng, định lượng bằng sắc ký khí 29