Đồ án Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic

110 trang thiennha21 12/04/2022 5720

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_xac_dinh_moi_truong_khao_sat_hoat_tinh_khang_nam_cua_v.pdf

Nội dung text: Đồ án Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH MƠI TRƯỜNG KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM CỦA VI KHUẨN LACTIC Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HỒI HƯƠNG Sinh viên thực hiện : PHAN THỊ NGỌC ÁI MSSV: 1051110045 Lớp: 10DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2014
Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đề tài nghiên cứu “Xác định mơi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic” do chính tơi thực hiện. Các số liệu và kết luận nghiên cứu trình bày trong đồ án này chƣa từng đƣợc cơng bố ở các nghiên cứu khác. Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình. Tp.Hồ Chí Minh, 8/2014 Sinh viên thực hiện Phan Thị Ngọc Ái
Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn tồn thể quý thầy cơ trƣờng Đại học Cơng Nghệ Tp.HCM đã tận tình dạy bảo em trong các năm học vừa qua. Xin chân thành cảm ơn các thầy cơ khoa Cơng Nghệ Sinh Học – Thực phẩm – Mơi Trƣờng trƣờng Đại học Cơng Nghệ Tp.HCM đã quan tâm chỉ bảo, nhiệt tình giảng dạy và cung cấp những kiến thức quý báo cho em trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. Em xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến cơ Nguyễn Hồi Hƣơng đã định hƣớng, tận tình hƣớng dẫn và quan tâm theo dõi em trong suốt quá trình làm đồ án tốt nghiệp. Em xin cảm ơn các thầy cơ quản lý phịng thí nghiệm đã tận tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện về thời gian giúp em hồn thành tốt đề tài này. Em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các bạn lớp 10DSH01 cùng các bạn thực hiện đề tài trong phịng thí nghiệm đã đồng hành cùng tơi trong suốt quãng đời sinh viên, động viên tinh thần và giúp đỡ tơi trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, anh chị em, những ngƣời đã luơn bên cạnh chia sẻ, quan tâm, kịp thời cổ vũ và động viên tinh thần, giúp em cĩ thêm nghị lực để hồn thành tốt đồ án này. Với khuơn khổ đồ án này khơng tránh khỏi những thiếu sĩt, rất mong đƣợc sự đĩng gĩp giúp đỡ của quý thầy cơ. Em xin chân thành cảm ơn! Tp. Hồ Chí Minh, 8/2014 Sinh viên thực hiện
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH iv MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 4 1.1 Tổng quan về nấm 4 1.1.1 Giới thiệu chung 4 1.1.2 Độc tố do nấm tiết ra 4 1.1.3 Tác hại của nấm 5 1.1.4 Một số chủng nấm mốc gây độc cho thực phẩm 6 1.1.5 Các biện pháp chống nấm sau thu hoạch 13 1.2 Tổng quan vi khuẩn lactic 15 1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic 15 1.2.2 Sản phẩm trao đổi chất và ứng dụng của vi khuẩn lactic 29 1.2.3 Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic 30 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.1 Địa điểm nghiên cứu 37 2.2 Thời gian thực hiện 37 2.3 Vật liệu nghiên cứu 37 2.3.1 Giống vi sinh vật 37 2.3.2 Hĩa chất và mơi trường sử dụng 37 2.4 Thiết bị và dụng cụ 38 2.4.1 Thiết bị 38 2.4.2 Dụng cụ 38 2.5 Phƣơng pháp luận 38 2.6 Phƣơng pháp nghiên cứu 40 2.6.1 Sơ đồ nghiên cứu 40 2.6.2 Thí nghiệm khẳng định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần khiết 41 2.6.3 Xác định mơi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm 42 i
Đồ án tốt nghiệp 2.6.4 Khảo sát khả năng kháng nấm Aspergillus niger của chủng vi khuẩnlactic 48 2.6.5 Phương pháp định danh và tuyển chọn 50 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 53 3.1 Định danh sơ bộ khảo sát sinh lý – sinh hĩa và sự thuần khiết của chủng vi khuẩn lactic 53 3.1.1 Nhuộm Gram 53 3.1.2 Nhuộm bào tử 54 3.1.3 Thử nghiệm khả năng sinh acid lactic bằng thuốc thử Uffelmann 55 3.1.4 Kiểm tra khả năng lên men đường và khả năng sinh khí 55 3.1.5 Xác định hàm lượng acid tổng 57 3.2 Xác định mơi trƣờng khảo sát hoạt tính nấm 58 3.2.1 Xác định mơi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm khơng ảnh hưởng lên sinh khối vi khuẩn lactic 59 3.2.2 Xác định mơi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm dựa vào khả năng tăng trưởng của nấm mốc 60 3.3 Khảo sát khả năng kháng Aspergillus niger của chủng vi khuẩn lactic 70 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74 4.1 Kết luận 74 4.2 Kiến nghị 74 PHỤ LỤC ii
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số chủng nấm Aspergillus độc thƣờng gặp trong thực phẩm và độc tố vi nấm do chúng sinh ra 8 Bảng 1.2. Chủng nấm mốc Fusarium và độc tố 10 Bảng 1.3. Một số chủng nấm Penicillium và độc tố của chúng 12 Bảng 1.4. Phân loại Lactobacillus (Sharpe 1981, Kandler và Weiss, 1986) 19 Bảng 1.5. Một số hợp chất xác định cĩ tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men 31 Bảng 1.6. Các lồi LAB khác nhau và sản xuất các chất kháng nấm 33 Bảng 3.1. % acid lactic của 5 chủng LAB trong 24 giờ nuơi cấy 57 Bảng 3.2. Kết quả định danh sơ bộ của các chủng phân lập 58 Bảng 3.3. Bảng theo dõi mật độ quang của vi khuẩn acid lactic trong 4 mơi trƣờng . 59 59 Bảng 3.4. Đƣờng kính (cm) và đặc điểm nấm Mucor sp.B1 trên 4 mơi trƣờng MRS cổ điển, MRS 1, MRS 2, MRS 3. 60 Bảng 3.5. Khả năng phát triển của nấm Mucor sp.B1 trên 4 mơi trƣờng nuơi cấy 62 Bảng 3.6. Đƣờng kính (cm) và đặc điểm nấm Aspergillus sp.X2 trên 4 mơi trƣờng MRS cổ điển, MRS 1, MRS 2, MRS 3 64 Bảng 3.7. Khả năng phát triển của nấm Aspergillus sp.X2 trên 4 mơi trƣờng nuơi cấy 65 64 Bảng 3.8. Đƣờng kính (cm) và đặc điểm nấm Aspergillus sp.Đ1 trên các mơi trƣờng MRS cổ điển, MRS 1, MRS 2, MRS 3 67 Bảng 3.9. Khả năng phát triển của nấm Aspergillus sp.X2 trên 4 mơi trƣờng nuơi cấy 68 Bảng 3.10. Tỉ lệ ức chế cực đại của vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 71 iii
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Chủng nấm Aspergillus 7 Hình 1.2. Chủng nấm Fusarium 10 Hình 1.3. Chủng nấm Penicillium 11 Hình 1.4. Hình dạng tế bào Lactobacillus 18 Hình 1.5. Hình dạng tế bào Streptococcus 20 Hình 1.6. Hình dạng tế bào Leuconostoc 21 Hình 1.7. Hình dạng tế bào Pediococcus 22 Hình 1.8. Hình dạng tế bào Bifidobacterium 23 Hình 1.9. Sơ đồ tổng quan nghiên cứu khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic 36 Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát nghiên cứu xác định mơi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm 40 Hình 2.2. Sơ đồ khẳng định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần khiết của chúng 41 Hình 2.3. Sơ đồ chọn lọc mơi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm dựa vào sinh khối vi khuẩn lactic 44 Hình 2.4. Sơ đồ chọn lọc mơi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm dựa vào khả năng tăng trƣởng của nấm mốc 46 Hình 2.5. Sơ đồ khảo sát khả năng kháng nấm Aspergillus niger của chủng vi khuẩn lactic 48 Hình 3.1. Kết quả nhuộm Gram của các chủng vi khuẩn 54 Hình 3.2. Kết quả nhuộm bào tử của các chủng vi khuẩn 54 Hình 3.3. Khả năng sinh acid lactic của các chủng vi khuẩn 55 Hình 3.4. Khả năng lên men đƣờng của vi khuẩn lactic 56 Hình 3.5. Đồ thị biểu hiện % acid lactic sinh ra của các chủng vi khuẩn lactic sau 24 giờ nuơi cấy 57 Hình 3.6. Đƣờng kính (cm) nấm Mucor sp.B1 trên 4 mơi trƣờng trong 7 ngày nuơi cấy 63 Hình 3.7. Đƣờng kính trung bình (cm) của nấm Aspergillus sp.X2 trên 4 mơi trƣờng trong 7 ngày nuơi cấy 66 iv
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.8. Đƣờng kính trung bình (cm) của nấm Aspergillus sp.Đ1 trên 4 mơi trƣờng trong 7 ngày nuơi cấy 69 Hình 3.9. Khả năng ức chế nấm Aspergillus niger của chủng Lactobacillus sp.L5 khi khơng pha lỗng 71 Hình 3.10.Tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus niger của chủng Lactobacillus sp.L5 từ 1 đến 20 lần pha lỗng 72 v
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Ngày nay, cùng với sự phát triển của xã hội, nhu cầu ăn uống của con ngƣời ngày càng đƣợc chú trọng, do đĩ vấn đề an tồn thực phẩm lại trở nên quan trọng hơn bao giờ hết. Vệ sinh an tồn thực phẩm trong cả nƣớc nĩi chung và của thực phẩm nĩi riêng đang là vấn đề xã hội bức xúc cần giải quyết kịp thời và cĩ hiệu quả. Theo thống kê hàng năm số ca ngộ độc thực phẩm đã tăng lên đáng kể trong bối cảnh xã hội đang phát triển, gây hoang mang cho ngƣời tiêu dùng. Trong đĩ ngộ độc do vi sinh vật chủ yếu là nấm mốc chiếm phần lớn, bắt nguồn nhiễm từ nơng sản, các sản phẩm thực phẩm, Cuộc sống cơng nghiệp với tốc độ vũ bão cuốn con ngƣời chúng ta vào vịng quay của các sản phẩm đơng lạnh, thức ăn nhanh mà hầu hết chúng đều đƣợc bảo quản bằng các chất hĩa học. Hàng trăm loại hĩa chất khác nhau đƣợc sử dụng cho mục đích bảo quản thực phẩm. Trong số đĩ loại sở hữu độc tính cao và bị hạn chế, cấm sử dụng đối với các loại đồ ăn, thực phẩm nhƣ: natri nitrate (NaNO3), lƣu huỳnh dioxit, muối diêm, hàn the, Tuy nhiên, những hĩa chất trên vẫn đƣợc sử dụng trái phép.Thậm chí, một số chất nhƣ natri benzoat và kali sorbate, hàn the cũng bị một số nhà sản xuất lạm dụng vƣợt liều. Theo các chuyên gia, việc sử dụng hĩa chất độc hại cĩ thể gây hậu quả nghiêm trong tới sức khỏe con ngƣời nhƣ ung thƣ, đột biến gene, quái thai, Trƣớc thực trạng đĩ, địi hỏi con ngƣời phải cĩ hƣớng giải quyết kịp thời để đảm bảo an tồn cho ngƣời tiêu dùng. Hƣớng giải quyết là sử dụng các lợi khuẩn từ vi khuẩn lactic để ức chế khả năng phát triển của nấm trong các loại thực phẩm. Do đĩ, chúng tơi xin đề xuất đề tài “Xác định mơi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm củavi khuẩn lactic”. 2. Tình hình nghiên cứu Cĩ rất nhiều cơng trình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật để tạo chế phẩm trong nơng nghiệp cả trong nƣớc và trên thế giới. 1
Đồ án tốt nghiệp Ở trong nƣớc cĩ các cơng trình nghiên cứu nhƣ sản xuất chế phẩm Sadi Bio 1 (là tên gọi của chế phẩm vi sinh Biomix 2) của Viện cơng nghệ Mơi trƣờng Việt Nam. Chế phẩm Sadi Bio 1 đƣợc sản xuất từ các chủng vi sinh vật hữu ích thuộc nhĩm xạ khuẩn Streptomyces ƣa ấm (nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu 15 -370C) sinh tổng hợp mạnh các enzym ngoại bào (xenlulaza, amylaza và proteinaza) cĩ khả năng sinh kháng sinh ức chế nấm mốc, vi khuẩn Gram âm. Ngồi ra, sản phẩm cịn chứa vi khuẩn Lactobacillus cĩ tác dụng ức chế mạnh các vi khuẩn gây bệnh (Coliform, Salmonella). Chế phẩm sinh học Sagi Bio-1 cĩ tác dụng xử lý mùi chuồng trại chăn nuơi và bãi chơn lấp chất thải. Ngồi nƣớc cĩ các cơng trình nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi khuẩn lactic cách ly từ Kim chi chống Aspergillus fumigatus của Jeong-Dong Kim của viện cơng nghệ sinh học cơng nghiệp thuộc đại học Inha, Inhcheon 402-75, Hàn Quốc. Ngồi ra cịn cĩ nhiều cơng trình nghiên cứu về hoạt động kháng nấm của vi khuẩn lactic ở nhiều nƣớc trên thế giới. 3. Mục đích ngiên cứu Xác định mơi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn lactic. Mục đích cuối cùng là sản xuất chế phẩm vi sinh vật LAB hay sản phẩm trao đổi chất của chúng để ức chế nấm mốc. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu - Khảo sát đặc điểm nuơi cấy của vi khuẩn thí nghiệm để khẳng định là vi khuẩn lactic và tính thuần khiết. - Xác định mơi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm khơng gây ảnh hƣởng lên sinh khối vi khuẩn lactic và khơng ảnh hƣởng lên khả năng tăng trƣởng của nấm mốc. - Khảo sát khả năng kháng nấm Aspergillus niger của chủng vi khuẩn lactic. 2
Đồ án tốt nghiệp 5. Phƣơng pháp nghiên cứu a. Phương pháp luận Cĩ nhiều phƣơng pháp khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp nấm mốc. Phƣơng pháp sử dụng hai mơi trƣờng khĩ thực hiện. Cĩ thể sử dụng một mơi trƣờng khảo sát, mơi trƣờng MRS là mơi trƣờng chuyên biệt biệt cho vi khuẩn lactic chứa nhiều tác nhân kháng nấm. Do đĩ chúng tơi cần xác định mơi trƣờng thí nghiệm kháng nấm sao cho vi khuẩn lactic tăng trƣởng cực đại và thành phần mơi trƣờng khơng ức chế sự phát triển của nấm mốc. Các thí nghiệm trong đồ án tốt nghiệp nhằm loại bỏ một số thành phần kháng nấm trong mơi trƣờng MRS mà vẫn giữ đƣợc khả năng tăng trƣởng cao của vi khuẩn lactic. b. Phương pháp xử lí số liệu - Sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị - Sử dụng phần mềm Statgraphics để xử lí số liệu 6. Kết quả đạt đƣợc của đề tài Tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn lactic cĩ hoạt tính kháng nấm tốt từ bộ sƣu tập vi khuẩn lactic phân lập từ nem chua. Xác định đƣợc mơi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm tốt. Đánh giá tỉ lệ ức chế của nấm trong thực phẩm của chủng vi khuẩn lactic. 3
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về nấm 1.1.1 Giới thiệu chung Giới nấm (Fungi) bao gồm những sinh vật nhân chuẩn tự dƣỡng cĩ thành tế bào bằng kitin (chitin).Phần lớn nấm phát triển dƣới dạng các dạng sợi đa bào đƣợc gọi là sợi nấm (hyphae) tạo nên hệ sợi (mycelium). Nấm thƣờng sinh sản qua bào tử hoặc qua hình thức sinh sản tự dƣỡng. Quá trình sinh sản cĩ thể là vơ tính hay hữu tính. Những đại diện tiêu biểu của nấm là nấm mốc, nấm men và nấm lớn (nấm quả thể). Phần lớn các nấm thƣờng khơng quan sát đƣợc bằng mắt thƣờng. Đa phần chúng sống trong đất, chất mùn, xác sinh vật chết, cộng sinh hoặc kí sinh trên cơ thể động vật, thực vật và nấm khác.Vi nấm đĩng vai trị quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân hủy các chất hữu cơ và khơng thể thiếu đƣợc trong chu trình chuyển hĩa và trao đổi vật chất. Nấm đƣợc sử dụng rất rộng rãi trong đời sống lẫn sản xuất.Nhiều lồi đƣợc sử dụng trong cơng nghệ thực phẩm, sử dụng làm thức ăn hoặc trong quá trình lên men.Nấm cịn đƣợc dùng để sản xuất chất kháng sinh trong y học và nhiều loại enzyme.Tuy nhiên, nhiều lồi nấm chứa các chất hoạt động sinh học đƣợc gọi là mycotocin, nhƣ ancaloit và polyketit, là những chất độc đối với động vật lẫn con ngƣời. 1.1.2 Độc tố do nấm tiết ra Độc tố nấm mốc (mycotoxin) là nhĩm hợp chất cĩ cấu trúc đa đạng, cĩ khối lƣợng phân tử nhỏ, đƣợc tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc đối với động vật cĩ vú, cá, gia cầm và con ngƣời. Hiện nay cĩ khoảng 300 lồi độc tố đƣợc phát hiện và nghiên cứu. Tuy nhiên chỉ cĩ khoảng 20 lồi độc tố cĩ trong thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng và liên 4
Đồ án tốt nghiệp quan đến an tồn thực phẩm. Đƣợc tạo bởi năm chi nấm là Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria và Claviceps, chúng bao gồm: - Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin ( B1, B2, G1, G2, M1, M2 ), ochratoxin A, stermatocystin, axit cyclopianxoic. - Các độc tố của Penicillium: Pautulin, ochratoxin A, citrinin, penitrem A và axit cyclopianzoic toxin, fumonisin, moniliformin, diacetocyscirpenon. - Các độc tố của Fusarium: deoxynivalenon, nivalenon, zearalenon, T-2 toxin. - Các độc tố của Alternaria: Axit tenuazoic, alternarion, methyl ether alternarion. - Các độc tố của Claviceps: Các alkaloid của nấm cựa gà Các độc tố gây độc chủ yếu và nguy hại là Aflatoxin. Chúng là độc tố vi nấm do nấm mốc Aspergillus flavus, A.parasiticus sản sinh, thƣờng gây ơ nhiễm trên một số hạt (nhƣ lạc). Phản ứng gây độc của chúng chủ yếu là trong gan. Nếu mức độ ơ nhiễm thấp sẽ tích lũy dần trong gan và làm giảm khả năng sinh sản của động vật và về dài lâu sẽ gây ung thƣ. Ngồi Aflatoxin, một số độc tố vi nấm thƣờng gặp là ochratoxin Penicillium và Aspergillus tiết ra. Độc tố zearalemon và tricothecenes chủ yếu do nấm Fusarium tiết, độc tố patulin lại do nấm Penicillium và Fumonisin tiết. 1.1.3 Tác hại của nấm 1.1.3.1 Tác hại của nấm gây ra cho người và động vật - Dị ứng hoặc ngộ độc do ăn hoặc tiếp xúc với nấm Cĩ khoảng 70 lồi nấm sinh bào tử là những tác nhân gây dị ứng. Chúng cĩ thể là nấm mốc trong nhà hay ngồi trời, đa phần là nấm sợi nhƣ các chi Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Helminthosporium, Epicoccum, Penicillium, Fusarium , chỉ cĩ vài lồi là nấm đơn bào nhƣ Candida, Rhodotorula, cĩ một số lồi là nấm lớn nhƣ Agaricus, Coprinus, Fomes, Ganoderma Bào tử nấm cĩ thể gây ra những chứng nhƣ hen suyễn , viêm mũi dị ứng, các bệnh nấm dị ứng phế 5
Đồ án tốt nghiệp quản phổi và viêm phổi quá mẫn. Ngộ độc do ăn phải nấm độc , cĩ thể từ rối loạn tiêu hố , ảo giác , hoặc trầm trọng cĩ thể tử vong. - Nấm kí sinh trên cơ thể ngƣời gây bệnh trực tiếp Những lồi cĩ thể gây bệnh cho ngƣời thuộc các chi nhƣ Aspergillus, Candida, Cryptococcus, Histoplasma và Pneumocystis. Chúng cĩ thể gây ra các bệnh ngồi da ở ngƣời nhƣ nấm chân, nấm mĩng, nấm tĩc, hắc lào, lang ben, cho đến những bệnh nguy hiểm cĩ thể gây chết ngƣời nhƣ viêm màng não (nấm Cryptococcus) hay viêm phổi do nấm Pneumocystis carinii. 1.1.3.2 Tác hại của nấm gây ra cho thực vật Những lồi nấm gây bệnh trên cây trồng cĩ thể gây thiệt hại lớn cho ngành nơng nghiệp và lâm nghiệp.Ví dụ nhƣ nấm đạo ơn (Magnaporthe oryzae) gây bệnh cho lúa.Những lồi gây bệnh cho cây thuộc các chi Fusarium, Ustilago, Alternaria và Cochliobolus. Chúng làm thối rễ, tổn thƣơng các bộ phận của cây trồng, hoa, quả, làm giảm năng suất hoặc chất lƣợng sản phẩm nơng nghiệp do bị ẩm mốc, 1.1.4 Một số chủng nấm gây độc cho thực phẩm Trong hệ vi khuẩn, nấm mốc thiên nhiên (fungal flora) cĩ 3 chủng giống nấm mốc chiếm ƣu thế đã và đang gây độc cho thực phẩm là Aspergillus, Fusarium và Penicillium thƣờng tiết độc tố vi nấm vào thực phẩm vào thời gian trƣớc, trong và sau khi thu hoạch ngũ cốc, hạt cĩ dầu, đậu đỗ, Cĩ 4 tác động gây độc của độc tố vi nấm là: Độc cấp tính, mãn tính, gây đột biến và quái thai. Phổ biến nhất là độc cấp tính, làm hƣ gan và rối loạn chức năng hoạt động của thận, cĩ thể gây chết đối với trƣờng hợp nặng. Các độc tố vi nấm tác động lên hệ thần kinh, ở nồng độ thấp gây tê liệt động vật và ở nồng độ cao cĩ thể gây tổn thƣơng não và chết. Nhiều cơng trình thử nghiệm đã xác định độc tố vi nấm cĩ thể gây ung thƣ, đạc biệt là ở gan. Qua thử nghiệm trên động vật nuơi trong nhà đã xác định cĩ một số độc tố vi nấm gây rối loạn tới sự sao chép AND và gây hậu quả là đột biến hoặc quái thai. 6
Đồ án tốt nghiệp 1.1.4.1 Chi Aspergillus Hình 1.1.Nấm Aspergillus Đã xác định trên 100 lồi, phát triển rộng rãi trong thiên nhiên, nhất là những nơi cĩ nguồn gốc thực vật bị hƣ hại, thối rữa. Một số chủng thƣờng gặp trong thực phẩm của con ngƣời, đặc biệt là hạt ngũ cốc và hạt đậu. Nhiều lồi thuộc chi Aspergillus phân bố rộng rãi trên các cơ chất trong tự nhiên, trong các sản phẩm nơng cơng nghiệp, ở nhiều vùng địa lí khác nhau trên thế giới. Một số lồi, đặc biệt lồi A.oryzae đã đƣợc dùng rộng rãi trong cơng nghệ lên men truyền thống để chế biến thực phẩm ở nhiều nƣớc châu Á nhƣ Việt Nam (làm tƣơng), Trung Quốc, Nhật Bản, Indonexia, Philipin, v.v Hiện nay cơng nghệ sinh học sử dụng một số lồi thuộc chi Aspergillus chủ yếu là các lồi A.niger, A.oryzae trong cơng nghiệp sản xuất enzyme (α – amylaza, glucoamylaza, pectinaza, proteaza, cellulaza), trong cơng nghiệp chế biến thực phẩm, cơng nghiệp sản xuất một số acid hữu cơ nhƣ acid citric, acid gluconic, Một số lồi khác cĩ khả năng tạo thành các chất kháng sinh nhƣ A.fumigatus tạo thành fumagilin cĩ tác dụng trên Entamoebae histolyca, A.humicola, A.nidulans tạo thành lần lƣợt humicolin, nidulin cĩ tác dụng ức chế đối với một số lồi vi nấm, A.candidus tạo thành candidulin, A.oryzae, A.tamatii và một số lồi khác tạo thành acid kojic cĩ tác dụng ức chế một số vi khuẩn, , trong đĩ đƣợc ứng dụng trong cơng nghiệp dƣợc phẩm chỉ cĩ lồi A.fumigatus để sản xuất fumagilin làm thuốc chữa lị amip. Nhiều lồi thuộc chi nấm này cĩ hoạt tính biến đổi sinh học, một số lồi tạo 7
Đồ án tốt nghiệp thành các độc tố (mycotoxin), đặc biệt đáng chú ý là các lồi tạo thành các độc tố gây ung thƣ gan nhƣ các lồi A.flavus, A.parasiticus tạo thành aflatoxin, A.versicolor tạo thành sterigmatocystin. Bảng 1.1.Một số lồi nấm Aspergillus độc thƣờng gặp trong thực phẩm và độc tố vi nấm do chúng sinhra (Nguồn: Vi sinh vật thực phầm, 2003) Điều kiện Lồi nấm Tác động của Thực phẩm Độc tố vi nấm phát triển và mốc gây độc độc tố bị ơ nhiễm tiết độc tố Các lồi nấm mốc gây độc quan trọng Khả năng gây nhiễm rộng Độc cấp tính Sản sinh độc tố trong thực đối với gan, xơ tại 12-400C, aw phẩm lạc, Aflatoxin B1 gan, ung thƣ = 0,85-0,99 ngơ, hạt và B2 (gan), quái (Tối ƣu aw = bơng, hạt cĩ thai, gây ức 0,98-0,99) pH A.flavus dầu và các chế miễn dịch = 3,0-8,0. loại quả sung, vả. Gây thối hĩa Acid hoại tử và tê cyclopiazonic liệt nhiều tổ chức cơ thể Khơng phổ Aflatoxin B1, A.parasiticus Giống A.flavus Giống A.flavus biến tại châu B2, G1 và G2 Á Sản sinh độc tố Thực phẩm tại nhiệt độ tối bảo quản tại A.ochraceus Ochratoxin A ƣu 25-300C. các nƣớc Hoại tử thận nhiệt đới, cà 8
Đồ án tốt nghiệp (đặc biệt trong phê. lợn), gây quái thai, ức chế miễn dịch. Phát triển 9- Sterigmatocyst 390C (tối ƣu Thực phẩm A.versicolor Ung thƣ gan in 270C) aw = bảo quản 0,74-0,99 Các lồi nấm mốc gây độc ít quan trọng hơn Thực phẩm nguồn gốc Gây tê liệt Phát triển tại Fumitremorgen thực vật bị A.fumigatus (chuột bạch và 10-150C, tối Verruculogen biến chất hƣ chuột nhắt) thiểu aw 0,85 hỏng; phân hỗn hợp. Trong hạt ngũ Phát triển ƣa cốc, hạt cĩ Gây tê liệt A.terreus Territrem nhiệt, tối thiểu dầu, đậu đỗ (chuột nhắt) aw 0,8 vùng nhiệt đới Cytochalasin Lúa mạch A.clavatus các chất khác Gây tê liệt Malt gây tê liệt Eurotium Gây nhiễm chevalieri Trong hạt ngũ Echinulin thức ăn thừa bỏ Ƣa khơ E.amsteloda cốc cĩ dầu của gia súc mi 9
Đồ án tốt nghiệp 1.1.4.2 Chi Fusarium Hình 1.2.NấmFusarium Tác động chính là làm cho thân rễ cây khơ héo, thối rữa và mục, gặp nhiều trên cây cà phê, thơng, cọ dừa, lúa mỳ, ngơ và cỏ Fusarium cĩ thể gây ơ nhiễm trên hạt ngũ cốc và quả chín khi cĩ lƣợng nƣớc hoạt tính aw cao và tiết độc tố trƣớc hoặc sau ngày thu hoạch cây trồng. Độc tố gây vụ ngộ độc lớn nhất năm 1942-1948 đã làm chết 100000 ngƣời thuộc Liên bang Xơ Viết, do nguyên nhân ATA (bệnh giảm bạch cầu). Fusarium đã tiết độc tố T-2 và trichothecenes. Hiện đã biết trên 50 loại và gần đây năm 1988 đã phát hiện fumonisin do 4 chủng tiết là F.sporotrichioides, F.equiseti, F.graminearum và F.moniliforme. Liều LD50 của T-2 toxin là 3-4mg/kg TLCT chuột và lợn. Lƣợng độc tố fumonisin B2 trong ngơ tại Nam Phi và Trung Quốc đã gây ung thƣ thực quản trên ngƣời. Bảng 1.2.Các lồi nấm mốc Fusarium và độc tố (Nguồn: Vi sinh vật thực phẩm, 2003) Thực phẩm dễ bị Lồi Độc tố Tác động gây độc nhiễm Độc tố T-2 và Bệnh khơng bạch F.sporotrichiodes Ngũ cốc vùng trichothecenes cầu do ngộ độc ăn và F.poae nhiệt đới khác uống với nhiều triệu 10
Đồ án tốt nghiệp chứng khác nhau T-2 nivaleno, butenolid, Bệnh bạch cầu ức Phổ biến trong F.equiseti diacetoxyscirpenol chế đáp ứng miễn các loại cây trồng và trichothecenes dịch khác Lợn bỏ ăn rối loạn Ngơ (cùi ngơ bị F.graminearum Fumonisin sinh sản, ngƣời rối thối rữa), lúa mì loạn đƣờng tiêu hĩa (thân bị thối rữa) Ngơ (ở khắp mọi Bệnh của ngựa, phù nơi). Phối hợp với F.monoliforme phổi của lợn, ung một số bệnh trên F.proliferatum thƣ thực quản trên ngƣời ở châu Phi, ngƣời Trung Quốc, Iran 1.1.4.3 Chi Penicillium Hình 1.3.Nấm Penicillium Đƣợc phát hiện gây độc và sản sinh độc tố cáh đây 100 năm ở loại gạo khơng xay cĩ màu vàng đã làm chết chĩ, thỏ và chuột với triệu chứng ngộ độc là tê liệt 11
Đồ án tốt nghiệp thần kinh trung ƣơng. Năm 1910, Nhật Bản đã cấm khơng đƣợc bán lúa và gạo bị nhiễm mốc hoa vàng. ChiPenicillium là một quần thể lớn với trên 150 lồi đã đƣợc xác định, Trong đĩ cĩ 50 lồi hoặc hơn đƣợc coi là phổ biến. Chúng cĩ tính độc mạnh, độc tố quan trọng đƣợc tiết từ các chủng trên tích lũy trong thực phẩm là Penitrem A (P.crustosum), Roquefortin, độc tố PR toxin (P.roqueforti) và ochretoxin A (P.verrucosum). Gần đây các nhà khoa học đã thống kê cĩ tới 32 lồi đã tiết 27 độc tố vi nấm gây độc cho động vật và ngƣời, chủ yếu tác động lên gan và thần kinh gây tê liệt cơ thể dẫn đến chết. Bảng 1.3. Một số lồiPenicillium và độc tố của chúng (Nguồn: Vi sinh vật thực phầm, 2003) Tác động gây độc Thực phẩm dễ bị Lồi Độc tố tố nhiễm Lồi gây nhiễm độc quan trọng nhất Tác động gây liệt Trong thực phẩm P.crustosum Penitrem và thần kinh (động chế biến, bảo quản vật nuơi trong nhà) lạnh. Giống tác động Phomat, thịt chế Roquefortin P.roqueforti độc strychnin biến, bánh từ lúa PR toxin (chĩ) mạch Ngũ cốc (đặc biệt Gây bệnh thận là đại mạch) tại P.verrucosum Ochratoxin A (lợn) vùng khí hậu ơn hịa, thịt chế biến. Lồi gây nhiễm độc ít quan trọng hơn Gạo bảo quản tại Beri beri đau tim P.citreonigrum Ctreoviridin Nhật và Hàn cấp (Nhật) Quốc. 12
Đồ án tốt nghiệp Phổ b iến trong P.citrinum Citrinin Suy thận nhiều loại thực phẩm. Islanditoxin Gây bệnh gạo lúa Cyclochlorotin Tác dụng gây độc vàng nhƣng tác P.islandicum Luteokyrin gan và thận dụng gây độc chƣa Erythroskyrin rõ ràng. 1.1.5 Các biện pháp chống nấm sau thu hoạch và hiện nay Cơng nghệ sau thu hoạch ảnh hƣởng đến chất lƣợng nơng sản theo các mức độ khác nhau ở các giai đoạn của quy trình cơng nghệ. Để thực phẩm cĩ thởi gian sử dụng dài hơn và đảm bảo chất lƣợng tốt, các phƣơng pháp bảo quản từ đơn giản nhất nhƣ ƣớp muối, phơi khơ, đến các phƣơng pháp hiện đại nhƣ chiếu xạ, thanh trùng, tiệt trùng đã đƣợc sử dụng. Chúng đều dựa trên một số nguyên lý bảo quản nơng sản, thực phẩm nhƣ: - Kích thích hoạt động của các vi sinh vật và enzyme đặt biệt - Loại bỏ bớt các vi sinh vật và các chất gây nhiễm bẩn thực phẩm - Ức chế hoạt động của các enzyme và vi sinh vật gây hƣ hỏng thực phẩm - Tiêu diệt các vi sinh vật và làm mất hoạt tính của các enzyme Do đĩ, để đảm bảo vấn đề an tồn vệ sinh thực phẩm cho ngƣời tiêu dùng, con ngƣời đã cĩ những biện pháp cụ thể nhằm ngăn chặn các ngộ độc do nấm gây ra sau thu hoạch nhƣ sau: - Đối với nơng sản: Do nhiệt độ nơng sản lúc thu hoạch cao là nguyên nhân làm cho trao đổi chất của nơng sản tăng, làm giảm sút chất lƣợng nhanh chĩng. Do đĩ, nên thu hái nơng sản vào lúc cĩ nhiệt độ thấp nhất trong ngày và nhanh chĩng đƣa chúng vào nơi râm mát. Bên cạnh đĩ, nên thu hoạch nơng sản đúng độ chín để đạt chất lƣợng cảm quan và dinh dƣỡng tốt nhất. Loại bỏ các thành phần khơng cần thiết bị hƣ thối, dập nát trên rau quả và đảm bảo sự ổn định trong quá trình vận chuyển. 13
Đồ án tốt nghiệp - Với lƣợng thực nhƣ gạo, ngơ, lúa mì: phải bảo quản và giữ ở nơi khơ ráo, thống mát để khơng bị nhiễm mốc. - Với những thực phẩm thực vật nhƣ lạc, vứng, cà phê: đây là những thực phẩm dễ hút ẩm và dễ mốc nên muốn bảo quản tốt, chúng cần đƣợc phơi khơ, giữ nguyên vỏ và đƣợc đựng trong các dụng cụ sạch kín nếu để lâu, thỉnh thoảng phải đem phơi khơ lại. Yêu cầu độ ẩm của hạt dƣới 15%. - Với nƣớc chấm nhƣ xì dầu, tƣơng: Cần kiểm tra vệ sinh các xí nghiệp sản xuất nƣớc chấm và các cửa hàng mua bán. (Kiểm tra vệ sinh mơi trƣờng (chủ yếu là khơng khí). Kiểm tra vệ sinh nƣớc chấm. Ngồi các chỉ tiêu vệ sinh đã đƣợc qui định cho một mẫu nƣớc chấm và một mẫu khơng khí, cịn phải chú ý phát hiện sự cĩ mặt của các lồi nấm sinh độc tố nhƣ Aspergillus flavus, A.parasiticus và A.fumigatus). - Đối với hạt: Nên thu hoạch vào lúc thời tiết mát mẻ, khơ ráo. Các biện pháp bảo quản nhƣ tách hạt, phơi sấy, phân loại và làm sạch hạt, xử lý hĩa chất để ức chế hoạt động trao đổi chất của nơng sản, hoạt động của dịch hại, bao gĩi hợp lý. - Thƣờng xuyên kiểm tra nguyên liệu trƣớc trƣớc khi sử dụng. - Kiểm tra, khống chế độ ẩm và nhiệt độ thích hợp trong quá trình dự trữ nguyên liệu, nơng sản. - Bảo quản nguồn nguyên liệu nơi khơ ráo - Kiểm sốt và khử trùng cơn trùng, sâu mọt, chuột trong kho: cơn trùng hơ hấp đốt chất dinh dƣỡng sinh ra H2O làm hỏng nguyên liệu giúp nấm mốc phát triển, đồng thời khi di chuyển chúng đã mang theo bào tử nấm phát tán nhanh trong kho. - Sử dụng hĩa chất chống nấm mốc: cĩ nhiều hĩa chất hĩa học khác nhau cĩ thể khống chế sự nhiễm nấm mốc trong thức ăn. Hiện nay cĩ thể nĩi chất tƣơng đối an tồn khơng độc hại và cĩ hiệu lực cao ngăn chặn sự phát triển nấm mốc trong thức ăn là acid probionic và các muối của nĩ. 14
Đồ án tốt nghiệp - Vơ hiệu hĩa độc lực mycotoxin bằng phƣơng pháp vật lý và hĩa học: ngồi các biện pháp nhƣ xử lý nhiệt, ánh sáng, sử dụng ozone để oxi hĩa mycotoxin và sử dụng chất kiềm NH3. 1.2 Tổng quan về vi khuẩn lactic 1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic 1.2.1.1 Giới thiệu chung Từ lâu vi khuẩn lactic đã đƣợc con ngƣời ứng dụng rộng rãi để chế biến các loại thức ăn chua (sữa chua, muối dƣa, muối cà, ), ủ chua thức ăn cho gia súc hoặc để sản xuất acid lactic và các loại muối của acid lactic. Từ năm 1780, lần đầu tiên nhà hĩa học ngƣời Thụy Điển Scheele đã tách đƣợc acid lactic từ sữa bị lên men chua. Năm 1875, L.Pasteur đã chứng minh đƣợc rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt động của một nhĩm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic. 21 năm sau đĩ (1878), Lister đã phân lập đƣợc vi khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactic (ngày nay gọi là Streptococcus lactic) và đến năm 1881 ngành cơng nghiệp lên men nhờ vi khuẩn lactic đã đƣợc hình thành. Vi khuẩn lên men lactic gọi là vi khuẩn lactic, chúng đƣợc Pasteur tìm ra từ sữa bị chua. Vi khuẩn lactic luơn đƣợc cơng nhận là an tồn để sử dụng trong quá trình lên men thực phẩm truyền thống (Diop et al., 2007). Vi khuẩn lactic là một nhĩm các vi khuẩn Gram dƣơng cĩ một sự thống nhất về hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hĩa và sự trao đổi chất. Chẳng hạn nhƣ chúng là trực khuẩn ngắn hay que (rod) và cầu khuẩn (cocci) khơng hơ hấp, khơng sinh bào tử. Chúng thƣờng đƣợc tìm thấy trong các chất bị phân hủy và sản phẩm chứa lactic đƣợc tạo ra nhƣ là sản phẩm chủ yếu của sự trao đổi chất và là kết thúc của quá trình lên men carbohydrat. Vì vậy LAB đƣợc dùng trong thực phẩm lên men, acid hĩa ức chế sự tăng trƣởng của tác nhân gây hƣ hỏng. Vi khuẩn lactic cĩ thể lên men các loại đƣờng monosaccarit và disacarit nhƣng khơng phải tất cả các vi khuẩn lactic đều lên men đƣợc bất kỳ loại disacarit nào, một số khơng lên men đƣợc 15
Đồ án tốt nghiệp saccaroza, một số khơng sử dụng đƣợc lactose, các vi khuẩn lactic khơng lên men đƣợc tinh bột (trừ chủng Lactobacillus delbruceckii) và các polysaccarit khác. LAB cĩ rất nhiều hình dạng khác nhau:dạng trực khuẩn ngắn hay dạng đơn, đơi hoặc xếp thành chuỗi; hình cầu hoặc cầu trực khuẩn ở dạng đơn, đơi, đám hoặc xếp thành chuỗi. Ngồi ra, vi khuẩn lactic cịn cĩ dạng hình que. Đặc biệt khuẩn lạc tỏ ra mùi chua của acid. Khuẩn lạcvi khuẩn lactic trên mơi trƣờng thạch thƣờng nhỏ (đƣờng kính 2 – 5 mm), cĩ bờ đều, láng và lồi, mờ đục khơng cĩ chất màu.Lactobacilli khơng tạo mùi đặc trƣng trên mơi trƣờng nuơi cấy thơng thƣờng. Tuy nhiên, chúng gĩp phần tạo hƣơng vị trong những thực phẩm lên men bằng cách sản xuất nhiều hợp chất dễ bay hơi nhƣ diacetyl và những dẫn xuất của nĩ, thậm chí chúng tạo H2S và các amin trong phơ mai (Wood B.J.B and Holzapfel W.H. 1995). Vi khuẩn lactic cĩ hoạt tính protease phân hủy protein thành peptit, acid amin, hoạt tính này ở các lồi khác nhau thì khác nhau, thƣờng ở trực khuẩn là cao hơn. Chúng chịu đƣợc trạng thái khơ hạn, bền vững với CO2 và etylic, nhiều lồi vẫn sống đƣợc trong mơi trƣờng 10 -15% cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn bền với NaCl, cĩ thể sống trong mơi trƣờng từ 7 – 10% NaCl. Vi khuẩn lactic ƣa ấm cĩ nhiệt độ sinh trƣởng tối thích trong khoảng 25 – 350C, nhĩm ƣa nhiệt cĩ nhiệt độ tối thích 40 – 450C, nhĩm ƣa lạnh phát triển tốt ở nhiệt độ tƣơng đối thấp ( <= 50C). Khi gia nhiệt đến 60 – 800C thì hầu hết bị chết sau 10 – 30 phút. Một số vi khuẩn lactic cĩ khả năng tạo thành màng nhầy, một số khác cĩ khả năng đối kháng với thể hoại sinh và các vi sinh vật gây bệnh hoặc làm thối rữa thực phẩm. Nhƣ vậy, ngồi khả năng tạo ra acid lactic, các lồi này cịn sinh ra các hợp chất cĩ hoạt tính kháng sinh (Bacteriocin). Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic thƣờng gặp trong khơng khí, đất, nƣớc, nhƣng chủ yếu là ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm (rau, quả, sữa, thịt, ) một số tìm thấy trong đƣờng tiêu hĩa của ngƣời và động vật. 16
Đồ án tốt nghiệp Hầu hết các vi sinh vật sinh acid lactic đều thuộc họ Lactobacillaceae và đƣợc xếp vào 4 chi: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và Leuconostoc. Ngày nay ngƣời ta bổ sung vào nhĩm vi khuẩn lactic những chủng vi khuẩn thuộc giống Bifidobacterium. Theo bảng phân loại đƣợc sữa đổi hiện nay, vi khuẩn lactic gồm khoảng 20 giống thuộc họ Lactobacillaceae, chúng thƣờng cĩ dạng hình cầu (hoặc ovan) và hình que, trong đĩ các giống chủ yếu nhất là: Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Tetragenococcus, Vagococcus và Weisslella. Trong khĩa phân loại của Bergey 1957, giống Bifidobacterum cũng đƣợc xếp vào nhĩm vi khuẩn lactic, trong đĩ chúng đƣợc xem nhƣ là Lb.bifidum mặc dù Bifidobacterium khơng phù hợp với các mơ tả chung của vi khuẩn lactic mà chúng liên quan nhiều hơn đến nhĩm Actinomycetaceae - một nhĩm vi khuẩn gram dƣơng và cĩ con đƣờng lên men khác với vi khuẩn lactic. Việc phân loại vi khuẩn lactic vào các chi khác nhau phần lớn là dựa trên hình thái sinh học, chế độ và con đƣờng lên men khác nhau, tăng trƣởng ở nhiệt độ khác nhau, qui trình sản xuất acid lactic, khả năng phát triển ở nồng độ muối cao, và chịu đƣợc acid hoặc kiềm. Phân loại theo con đƣờng hĩa học nhƣ thành phần acid béo và các thành phần của thành tế bào, ngồi ra phƣơng pháp sinh học di truyền hiện đại cũng đƣợc sử dụng trong phân loại. 1.2.1.2 Đặc điểm hình thái một số giống LAB chủ yếu Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà ngƣới ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình cầu và hình que. Kích thƣớc của chúng thay đổi tùy từng lồi. 17
Đồ án tốt nghiệp  Giống Lactobacillus Hình 1.4.Hình dạng tế bào Lactobacillus Bảng phân loại khoa học giống Lactobacillus: - Giới: Vi khuẩn - Ngành: Firmicutes - Lớp: Bacilli - Bộ: Lactobacillales - Họ: Lactobacillaceae - Giống: Lactobacillus Chi Lactobacillus hiện nay bao gồm hơn 125 lồi nhƣ: L.acidophilus, L.brevis, L.casei, L.fermentum, L.plantarum, L.bulgaricus, Giống Lactobacillus (viết tắt Lb) là những trực khuẩn khơng sinh bào tử thuộc lớp vi khuần Gram dƣơng. Tế bào Lactobacilluscĩ dạng hình que thƣờng dài và thon, khơng di động, Gram dƣơng, hiếm khí tạo sắc tố (màu gỉ sắc và màu đỏ gạch) (Makarova và cộng sự, 2006).Tùy vào điều kiện của mơi trƣờng sống mà hình dạng của chúng thay đổi từ hình que ngắn đến dài, sắp xếp thành chuỗi hay đứng riêng lẽ. Các lồi Lactobacillus đƣợc tìm thấy các sản phẩm lên men từ động vật và thực vật, đặc biệt là trong các sản phẩm sữa, trong ruột, trong hệ tiêu hĩa, hệ bài tiết và hệ sinh dục ngƣời. Các loại thực phẩm lên men nhƣ sữa chua và thực phẩm chức năng cũng cĩ chứa các vi khuẩn này. 18
Đồ án tốt nghiệp Các vi khuẩn lactic thuộc nhĩm này thƣờng sử dụng nhƣ: Lactobacillus pasterian, Lactobacillus brevis, Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus sake, plantarum. Sự phân chia của vi khuẩn lactic dựa vào các sản phẩm của quá trình trao đổi chất của carbohydrate, các lồi Lactobacillus cĩ thể chia thành 3 nhĩm nhƣ bảng 1.4. - Nhĩm I: Lên men đồng hình bắt buộc, chúng đƣợc gọi là Thermobacterium, cĩ fructose – 1,6 – diphosphate aldolase (FDP aldolase) nhƣng khơng cĩ phosphoketolase. Chúng lên men đƣợc hexose để tạo acid lactic nhƣng khơng lên men đƣợc pentose, chúng phát triển ở 450C. - Nhĩm II: Lên men dị hình tùy ý, chúng đƣợc gọi là Streptobacterium (cĩ FDP aldolase và cảm ứng phosphoketolase). Tuy nhiên, hexose là lên men đồng hình và pentose đƣợc chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acetic. - Nhĩm III: Lên men dị hình bắt buộc, chúng đƣợc gọi là Betabacterium (cĩ phosphoketolase nhƣng khơng cĩ FDP aldolase), quá trình trao đổi chất cả hexose và pentose lên men dị hình. Bảng 1.4.Phân loại Lactobacillus (Sharpe 1981, Kandler và Weiss, 1986) Đặc điểm Nhĩm I Nhĩm II Nhĩm III Lên men pentose - + + Tạo CO2 từ glucose - - + a a Tạo CO2 từ gluconate - + + Sự hiện diện FDP + + - aldolase Sự hiện diện - +b + phosphoketolase Một vài đại diện L.acidophilus L.casei L.brevis L.delbrueckii L.curvatus L.buchneri L.halveticus L.plantarum L.fermentum L.salivarius L.sake L.reuteri 19
Đồ án tốt nghiệp Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn Lactobacillus cĩ vai trị hữu ích trong điều trị hoặc ngăn ngừa nhiễm nấm, nhiễm trùng đƣờng ruột, hội chứng ruột kích thích, tiêu chảy do dùng thuốc kháng sinh, tiêu chảy khi đi du lịch, tiêu chảy do nhiễm khuẩn Clotridium difficile, tình trạng khơng dung nạp Lactose, bệnh về da nhƣ: bang đỏ do sốt, chàm, mụn trứng cá, viêm loét da và ngăn ngừa nhiễm trùng đƣờng hơ hấp.  Giống Streptococcus Hình 1.5.Hình dạng tế bào Streptococcus Phân loại: - Giới: Vi khuẩn - Ngành: Firmicutes - Lớp: Bacilli - Bộ: Lactobacillales - Họ: Streptococcaceae - Giống: Streptococcus Giống Streptococcus (viết tắt Sc.) (Billiroth, 1874) thuộc họ Streptococcaceae (Trivisan, 1889) thuộc lớp vi khuẩn Gram dƣơng (firmibacteria), cĩ dạng hình trịn hoặc hình ovan, ít khi kéo dài thành dạng que. Sau khi phân chia theo một phƣơng chúng thƣờng xếp riêng biệt, cặp đơi hoặc chuỗi ngắn. Chúng là loại vi khuẩn khơng nha bào, khơng di động và thƣờng khơng tạo sắc tố, vỏ tế bào của một số lồi cĩ thể nhận thấy trong điều kiện nhất định, đƣờng kính cầu khuẩn 0.5-1μm. 20
Đồ án tốt nghiệp Các lồi thuộc giống Streptococcus thƣờng sống hoại sinh trong đất, bề mặt cây, da ngƣời, ruột Giống Streptococcus bao gồm các lồi: S. agalactiae, S. anginosus, S. bovis, S. canis, S. equi, S. iniae, S. mitis, Dựa vào nhĩm kháng nguyên N mà đƣợc chia thành 2 nhĩm: - Nhĩm cĩ kháng nguyên N (Sc. Mesophiles): Streptococcus Mesophiles bao gồm các lồi chủ yếu Streptococcus lactis và Streptococcus cremoris. - Nhĩm khơng cĩ kháng nguyên N (Sc. Thermophiles): Streptococcus thermophiles khác với Streptococcus lactis ở chỗ chúng sinh trƣởng ở nhiệt độ tối ƣu là 42-430C và cĩ thể chịu đƣợc ở 600C trong 30 phút, các chủng này khơng cĩ khả năng tạo kháng nguyên N, mẫn cảm với NaCl (Nguyễn Thành Đạt, 2001). Trong năm 2002, nhiều vi sinh vật trƣớc đây đƣợc coi là Treptococcus đƣợc tách ra thành các chi enterococcus (Facklam R. October 2002). Hiện tại cĩ hơn 20 lồi ghi nhận trong chi này.  Giống Leuconostoc Leuconostoc citreum Hình 1.6.Hình dạng tế bào Leuconostoc Phân loại: - Giới: Bacteria - Ngành: Firmicutes - Lớp: Bacilli 21
Đồ án tốt nghiệp - Bộ: Lactobacillales - Họ: Leuconostocaceae - Giống: Leuconostoc Giống Leuconostoc (viết tắt là Ln.) (Van Thieghem, 1878) thuộc lớp cầu khuẩn Gram dƣơng.Chúng cĩ hình dạng hơi dài hoặc hình ovan đơn lẻ, cặp đơi hay dạng chuỗi ngắn, đƣờng kính từ 0.5-0.8µm và chiều dài khoảng 1.6µm. Trong mơi trƣờng nhất định nhƣ nƣớc trái cây hoặc rau quả cĩ tính acid, tế bào cĩ thể kéo dài thành dạng nhọn hay dạng que.Chúng là một lồi kỵ khí khơng bắt buộc.Sau khi phân chia chúng thƣờng sắp xếp thành chuỗi, khơng tạo thành đám tập trung. Phần lớn chúng lên men lactic dị hình theo con đƣờng hexoso-monophosphat. Các vi khuẩn thuộc giống Leuconostoc khơng làm đơng tụ sữa, chuyển hĩa fructose thành mannitol, đƣợc tìm thấy trong lên men sữa và rau quả. Giống Leuconostoc bao gồm các lồi nhƣ: L. carnosum, L. citreum, L. durionis, L. fallax, L. fructosum, L. garlicum, L. gasicomitatum, L. gelidum, L. inhae, L. kimchii, L. lactis, Những cầu khuẩn lên men lactic dị hình ở đây đƣợc chia thành 4 nhĩm theo phƣơng pháp lai DNA-DNA. Những lồi thƣờng gặp trong lên men lactic nhƣ: Ln.mesenteroides subsp. mesenteroides, Ln. mesenteroides subsp dextrainicum, Ln. mesenteroides subsp cremoris, Ln.lactis, Ln. paramesenteroides, Ln. oenos (Nguyễn Thành Đạt, 2001).  Giống Pediococcus Hình 1.7.Hình dạng tế bào Pediococcus 22
Đồ án tốt nghiệp Phân loại: - Giới: Bacteria - Ngành: Firmicutes - Lớp: Bacilli - Bộ: Lactobacillales - Giống: Pediococcus Giống Pediococcus (viết tắt là Pc.) là những tứ cầu hoặc dạng song cầu khuẩn, cĩ khi đơn lẻ hoặc thậm chí chuỗi ngắn, Gram dƣơng, khơng di động, catalase âm, cĩ hoạt tính thủy phân protein rất yếu. Chúng là vi khuẩn kỵ khí khơng bắt buộc. Giống Pediococcus bao gồm các lồi nhƣ: P. acidilactici, P. cellicola, P. claussenii, L. damnosus, P.ethanolidurans, P. inopinatus, P. parvulus, P. pentosaceus, P.stilesii, Quá trình trao đổi chất chủ yếu là quá trình lên men đồng hình, khơng cĩ khả năng chuyển hĩa nitrate thành nitrite, khả năng phân hủy protein kém, vì vậy chúng cĩ nhu cầu rất cao về thành phần dinh dƣỡng từ mơi trƣờng. Lồi điển hình là Pediococcus cerevisiae (Balcke, 1884).  Giống Bifidobacterium Hình 1.8.Hình dạng tế bào Bifidobacterium 23
Đồ án tốt nghiệp Giống Bifidobacterium (Orla Jensen, 1924) là những trực khuẩn kị khí khơng sinh bào tử, Gram dƣơng, bất động khi mới phân lập chúng là những trực khuẩn cĩ thể phân nhánh dạng Y, V tập hợp thành khối. Sau nhiều lần cấy chuyển chúng trở thành trực khuẩn thẳng hoặc hơi cong. Trƣớc đây, ngƣời ta xếp giống này trong Lactobacillus (ví dụ Lb.bifidus) nhƣng theoBergey’s 1986 thì chúng đƣợc tách thành giống riêng mang tên Bifidobacterium và xếp vào họ Actinomycetaceae. Chúng lên men lactic dị hình, sản phẩm chính là acid acetic và acid lactic (tỷ lệ 3:2) cùng với một lƣợng nhỏ acid formic, ethanol, acid succinic. Nhƣng khác với các vi khuẩn lên men dị hình khác là khơng sinh CO2 (Scardovi, 1986), catalase âm tính, nitrat dƣơng tính, indole và galatine âm tính. Chúng là những cơ thể ƣa ấm, sinh thƣởng ở nhiệt độ 31-410C, khơng chịu đƣợc pH 4.5-5 (Nguyễn Thành Đạt, 2001). 1.2.1.3 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật cĩ yêu cầu dinh dƣỡng cao. Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì cĩ nhu cầu dinh dƣỡng khác nhau. Để sinh trƣởng bình thƣờng, ngồi nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cở bản nhƣ nguồn carbon, nitơ một phần dƣới dạng các acid amin, photphat và lƣu huỳnh mà chúng cịn cĩ nhu cầu về một số vitamin, các chất sinh trƣởng và chất khống. - Nhu cầu dinh dưỡng cacbon Vi khuẩn lactic cĩ thể sử dụng đƣợc nhiều loại hydratcacbon từ các monosaccarit ( glucoza, fructoza, manoza ) và các disaccarit ( saccaroza, lactoza, maltoza ). Một số lồi vi khuẩn lactic cĩ thể sử dụng đƣợc dextrin và tinh bột (William và Wilkins, 1986). Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng lƣợng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ nhƣ acid citric, lactic, pyruvic, fumaric, acetic, - Nhu cầu dinh dưỡng nitơ Mỗi lồi vi khuẩn khác nhau cĩ nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau. Phần lớn vi khuẩn lactic khơng thể sinh tổng hợp đƣợc các chất hữu cơ phức tạp cĩ chứa nitơ. 24
Đồ án tốt nghiệp Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trƣởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ cĩ sẵn trong mơi trƣờng. Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic cĩ thể sử dụng nhƣ: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton, Hiện nay, cao nấm men là nguồn nitơ đƣợc sử dụng nhiều nhất và cĩ hiệu quả nhất.Tuy nhiên ở quy mơ cơng nghiệp ngƣời ta khơng sử dụng nguồn nitơ này vì rất tốn kém. - Nhu cầu về vitamin Vitamin đĩng vai trị là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các lồi vi khuẩn lactic khơng cĩ khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung vào mơi trƣờng các loại vitamin. Các chất chứa vitamin thƣờng sử dụng nhƣ nƣớc chiết từ khoai tây, ngơ, cà rốt hay dịch tự phân nấm men - Nhu cầu các chất hữu cơ khác Ngồi các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic cịn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển nhƣ các bazơ nitơ hay các acid hữu cơ. Một số acid hữu cơ cĩ ảnh hƣởng thuận lợi đến tốc độ sinh trƣởng của vi khuẩn lactic nhƣ acid citric, acid oleic. Nên hiện nay ngƣời ta sử dụng các muối citrat, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần mơi trƣờng nuơi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic. Tƣơng tự nhƣ hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng cĩ những tác động quan trọng đến sự sinh trƣởng của tế bào. Nên ngƣời ta thƣờng sử dụng acid acetic dƣới dạng các muối acetat để làm chất đệm cho mơi trƣờng khi nuơi cấy vi khuẩn lactic. - Nhu cầu các muối vơ cơ khác Để đảm bảo cho sinh trƣởng và phát triển đày đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vơ cơ. Nhằm cung cấp các nguyên tố khống nhƣ đồng, sắt, natri, kali, photpho, lƣu huỳnh, magie, mangan.Đặc biệt là magie và mangan, vì nĩ tham gia và đảm bảo chức năng hoạt động của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào. 25
Đồ án tốt nghiệp - Nhu cầu dinh dưỡng oxy Lactobacilli là những vi khuẩn vi hiều khí ((microaerophile), sinh trƣởng trên bề mặt mơi trƣờng thạch ở điều kiện kỵ khí, một số lồi là vi khuẩn kỵ khí. (Wood B.J.B and Holzapfel W.H. 1995). Vi khuẩn lactic vừa cĩ khả năng sống đƣợc trong mơi trƣờng cĩ oxy, vừa sống đƣợc trong mơi trƣờng khơng cĩ oxy. Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với trong điều kiện kị khí. 1.2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men – quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic Trong cơng nghiệp, vật liệu dùng để làm mơi trƣờng cho vi sinh vật phát triển cần đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dƣỡng, khơng cĩ độc tố, cho hiệu suất thu hồi là lớn nhất và giá thành rẻ (Lƣơng Đức Phẩm, 2004). Mỗi nguồn dinh dƣỡng cung cấp khơng chỉ ảnh hƣởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuơi cấy mà cịn ảnh hƣởng khơng nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm sinh khối sau này.  Thành phần mơi trƣờng nuơi cấy Vi khuẩn lactic thuộc loại vi sinh vật dị dƣỡng. Nguồn năng lƣợng cần thiết cho hoạt động sống và phát triển của chúng là nguồn năng lƣợng do trao đổi chất với mơi trƣờng bên ngồi. Thành phần mơi trƣờng MRS (Phụ lục A) để nuơi cấy vi khuẩn lactic cĩ chứa nhiều chất dinh dƣỡng và dễ bị tạp nhiễm cũng ảnh hƣởng đến quá trình nuơi cấy vi khuẩn lactic. Ngồi ra, để duy trì sự sống, điều hịa các quá trình chuyển hĩa trong tế bào, chúng cần sử dụng nguồn glucid cĩ trong mơi trƣờng dinh dƣỡng làm nguồn carbon (chủ yếu là đƣờng lactose), nguồn nitơ (pepton, acid amin), vitamin, muối khống và các yếu tố vi lƣợng. Vì vậy, ta cần bổ sung các nguồn dinh dƣỡng trên với liều lƣợng thích hợp nhất giúp vi khuẩn lactic phát triển tốt, nâng cao hiệu suất lên men. 26
Đồ án tốt nghiệp - Ảnh hưởng nguồn cacbon Cacbon là yếu tố chính trong các hợp chất hữu cơ xây dựng nên cơ thể của mọi lồi sinh vật. Các loại vi khuần khác nhau thì địi hỏi nguồn cacbon khác nhau. Sự phát triển của vi khuẩn lactic với mỗi loại đƣờng khác nhau sẽ tạo ra các tế bào cĩ đặc điểm hình thái và sinh lý khác nhau nên khả năng chống chịu sẽ khác nhau trƣớc những áp lực của các quá trình xử lý sau này. - Ảnh hưởng nguồn nitơ Nitơ là một nguyên tố cần thiết cho sự sống của tất cả các vi sinh vật. Vật chất cơ bản của tế bào (protein, acid nucleic, ) đều chứa nitơ. Vì vậy, nitơ đĩng vai trị quan trọng trong quá trình sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn. Mỗi lồi vi khuẩn khác nhau cĩ nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau. Phần lớn vi khuẩn lactic khơng thể tổng hợp đƣợc các chất hữu cơ phức tạp cĩ chứa nitơ nên chúng địi hỏi nguồn nitơ cĩ sẵn trong mơi trƣờng. - Ảnh hưởng từ nguồn vitamin Vitamin giữ vai trị quan trọng trong sinh trƣởng và phát triển của của Lactobacilli nên rất cần thiết cho hoạt động sống của các lồi vi khuẩn lactic. Tùy vào từng loại vi khuẩn mà cĩ những vitamin khác nhau. Tốc độ sinh trƣởng của vi khuẩn lactic phụ thuộc vào nồng độ các vitamin. Tuy nhiên, đa số các lồi vi khuẩn lactic khơng cĩ khả năng sinh tổng hợp vitamin. Nhiều loại acid amin đƣợc xem là khơng thể thay thế, mà bắt buộc phải cĩ trong mơi trƣờng. - Ảnh hưởng của các muối vơ cơ và chất kích thích sinh trưởng Các muối vơ cơ và các chất khống chiếm một lƣợng rất nhỏ nhƣng lại cĩ ảnh hƣởng rất lớn sự sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn. Chẳng hạn, đối với Lactobacillus Mn2+, Mg2+, Fe2+ làm tăng cƣờng sự phát triển của vi khuẩn lactic. Hay Ca2+ tham gia vào cấu trúc enzyme protease thủy phân một số protein là nguồn dinh dƣỡng nuơi tế bào. Mg2+ là chất hoạt động trong quá trình lên men lactic, nĩ giúp vi khuẩn lactic sử dụng các loại đƣờng tốt hơn. 27
Đồ án tốt nghiệp Các chất chứa acid béo cĩ trong mơi trƣờng cũng ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn. Chúng kích thích sinh trƣởng và đĩng vai trị trong quá trình lạnh đơng.Ví dụ Tween 80 làm thay đổi một số acid béo trong tế bào vi khuẩn lactic, ảnh hƣởng đến khả năng chịu lạnh và khả năng chống chịu muối mặn của vi khuẩn lactic (Ho Phuong Ha và Michelle Cartherine Adems, 2007).  Yếu tố mơi trƣờng - Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng, ảnh enzyme của tế bào vi sinh vật. Khi nhiệt độ nuơi cấy quá cao hay quá thấp đều cĩ thể gây ức chế các enzyme, làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất, dẫn đến ảnh hƣởng đến quá trình sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn. Nhiệt độ càng cao thì sự lên men càng mạnh. Phần lớn vi khuẩn lactic sinh trƣởng tốt nhất ở nhiệt độ 30 – 400C. Một số cĩ thể sinh trƣởng dƣới 150C và thậm chí một số dịng cĩ thể sinh trƣởng dƣới 50C (Wood B.J.B and Holzapfel W.H, 1995). - Ảnh hưởng của pH Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh acid làm pH mơi trƣờng giảm, và khi nĩ giảm tới mức nào đĩ nĩ sẽ ức chế chính sự phát triển của vi khuẩn lactic. Do đĩ, cần phải luơn điều chỉnh pH về khoảng tối thích cho vi khuẩn trong suốt quá trình nuơi. Để lên men nhanh và trọn vẹn, phạm vi pH tối ƣu phải nầm giữa 5,5 và 6,0. - Ảnh hưởng của nồng độ acid Acid là sản phẩm chính của quá trình lên men lactic do hoạt động sống của vi khuẩn lactic tạo nên. Các vi khuẩn này chịu đƣợc acid, tuy nhiên với lƣợng acid tích lũy trong mơi trƣờng ngày một nhiều sẽ ức chế chúng. Để giúp vi khuẩn lactic phát triển bình thƣờng khơng bị chính sản phẩm do hoạt động của chúng để tạo ra, ngƣời ta cho vào mơi trƣờng các chất đệm thích hợp với một lƣợng đủ để trung hịa lƣợng acid sinh ra thơng thƣờng chất đệm này là CaCO3. 28
Đồ án tốt nghiệp - Vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình lên men Hệ vi sinh vật tạp nhiễm, thƣờng ảnh hƣởng xấu đến quá trình lên men ở những mức độ khác nhau cĩ thể phá hủy các tế bào giống hoặc phá vỡ tế bào quá trình trao đổi chất cần thiết cho sự tạo thành sản phẩm lên men. 1.2.2 Sản phẩm trao đổi chất và ứng dụng của vi khuẩn lactic  Quá trình trao đổi chất: Quá trình trao đổi chất và năng lƣợng của vi khuẩn lactic thực hiện thơng qua việc lên men lactic. Dựa vào khả năng lên men lactic từ glucose, ngƣời ta chia vi khuẩn lactic làm hai nhĩm: - Vi khuẩn lên men lactic đồng hình: Lên men đồng hình là quá trình lên men trong đĩ cĩ các sản phẩm acid lactic tạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lƣợng nhỏ acid acetic, acetol, di-acetiyl. Phƣơng trình chung biểu diễn quá quá trình lên men: 4 C6H12O6 2 CH3CHOHCOOH + 21,8.10 J Trong quá trình lên men lactic đồng hình, glucoza đƣợc chuyển hĩa theo chu trình EMP (Embden-Mayerhoff), vi khuẩn sử dụng tất cả loại enzyme aldolase cho quy trình này, cịn hydro tách ra khi dehydro hĩa triozophophat đƣợc chuyển đến pyruvat. Vì trong vi khuẩn lên men lactic đồng hình khơng cĩ enzyme cacboxylase cho nên acid pyruvic khơng thủy phân hủy nữa mà tiếp tục khử thành acid lactic. - Lên men lactic dị hình Lên men lactic dị hình là quá trình lên men trong đĩ ngồi các sản phẩm phụ nhƣ acid acetic, ethanol, acid succinic,CO2. Phƣơng trình chung biễu diễn quá trình len men: 29
Đồ án tốt nghiệp C6H12O6 CH3CHOHCOOH + HOOC(CH2)COOH + CH3COOH + C2H5OH + CO2 Trong đĩ, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%, rƣợu etylic và acid acetic 10% các loại khí 20%, đơi khi khơng cĩ các khí mà thay vào đĩ là sự tích lũy một lƣợng lớn acid formic. Nhƣ vậy, trong quá trình lên men lactic dị hình cĩ nhiều sản phẩm phụ khác nhau đáng kể đƣợc tạo thành, chứng tỏ quá trình này phức tạp hơn nhiều so với quá trình lên men lactic đồng hình. Theo quan điểm tiến hĩa sinh lý trong vi sinh vật học, ngƣời ta cho rằng lên men lactic đồng hình là hƣớng tiến hĩa độc lập của lên men dị hình.  Ứng dụng của vi khuẩn lactic: Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn carbohydrat khác nhau, hoạt tính kháng nhiều loại vi sinh vật cĩ hại mà các chủng vi khuẩn lactic đƣợc ứng dụng nhiều trong cơng nghệ lên men truyền thống và ngày càng đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau nhƣ trong cơng nghiệp, nơng nghiệp, mơi trƣờng, y dƣợc và nhiều nhất là trong chế biến bảo quản thực phẩm. Khi ứng dụng trong bảo quản thực phẩm, chúng giúp giảm việc sử dụng các chất hĩa học cũng nhƣ cƣờng độ xử lý nhiệt, cĩ thể thay thế các chất bảo quản thực phẩm, làm cho thực phẩm sau bảo quản vẫn giữ đƣợc trạng thái tự nhiên và đảm bảo tính chất cảm quan và dinh dƣỡng, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng về tính an tồn, độ tƣơi ngon, thực phẩm ăn liền, thực phẩm chế biến tối thiểu và gia tăng sản phẩm cĩ tính cảm quan mới lạ nhƣ giảm tính acid hoặc giảm nồng độ muối (De Vuyst, Leroy, 2007). Vi khuẩn lactic cịn sản sinh bacteriocin ức chế vi khuẩn, đƣợc sử dụng trong bảo quản sinh học. Ngồi ra, chúng cịn sản sinh các chất hay các phân tử nhỏ cĩ hoạt tính kháng nấm nhƣ reuretin, acid lactic, 1.2.3 Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic Các vi khuẩn lactic (LAB) cĩ thể sản xuất một số chất kháng sinh nhƣ acid lactic và reuterin, ngồi ra cịn cĩ các acid hữu cơ, peroxit hydro, bacteriocin kháng 30
Đồ án tốt nghiệp khuẩn và các loại peptide kháng nấm. LAB đã đƣợc biết đến trong nhiều năm và đĩng vai trị quan trọng trong việc sản xuất của một loạt các thực phẩm lên men. Lợi ích sức khỏe của LAB đƣợc biết là ảnh hƣởng tích cực nhất định trong đƣờng tiêu hĩa của con ngƣời (Cogan và cộng sự năm 1995,; Hafidh và cộng sự, 2010).Lồi Lactobacillus đã đƣợc báo cáo là cĩ hoạt tính kháng nấm khi đánh giá bằng khảo nghiệm thạch lớp phủ chống lại loạt các nấm hƣ hỏng. Hoạt động kháng nấm của L.coryniformis cornyformis subsp ổn định khi bị nung nĩng ở nhiệt độ cao và độ pH 3-4,5 (Magnusson và Schnurer, 2001). Hầu hết các nghiên cứu khả năng kháng nấm của LAB là do việc sản xuất một loại protein kháng nấm hoặc hợp chất proteinaceous và một số các LAB nhƣ L. plantarum và L. sanfrancisco đặc biệt sản xuất acid hữu cơ với các đặc tính kháng nấm (Corsetti và cộng sự năm 1998; Lavermicocca và cộng sự, 2003.). Hiện nay, hợp chất bảo quản sinh học (biopreservative) duy nhất - nisin cĩ thể đƣợc thêm vào thực phẩm sản phẩm của vi khuẩn acid lactic (Gardiner và cộng sự, 2000;.Corcoran và cộng sự, 2004.). Nghiên cứu về tiềm năng kháng nấm của LAB đã xác định đƣợc một số hợp chất cĩ tác dụng ức chế chống lại nấm mốc và các lồi nấm men khác nhau (Corsetti và cộng sự năm 1998, (Bảng 1.5).; Lavermicocca và cộng sự, 2000;.Niku-Paavola và cộng sự, 1999; Magnusson, 2003; Sjogren và cộng sự, 2003.Sjogren, 2005). Bảng 1.5.Một số hợp chất đƣợc xác định cĩ tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men Hợp chất đƣợc xác định Nguồn sản xuất giống Tham khảo 4-hydroxy-phenyllacticacid Lactobacillusplantarum (Lavermicoccavà 3-phenyllacticacid 21B cộng sự, 2000) 3-hydroxydecanoicacid 3-hydroxydodecanoicacid Lactobacillusplantarum (Sjưgren và cộng 3-hydroxytetradecanoicacid MiLAB14 sự , 2003) 3-hydroxy-5-cis-dodecenoicacid 31
Đồ án tốt nghiệp cyclo(Gly-Leu) (Niku-Paavola methylhydantoin Lactobacillusplantarum và cộng sự, mevalonolactone VTTE-78076 1999) Caproic-, propionic-, buturic-, acetic-, Lactibacillus (Corsetti và cộng formic- and n-valeric sanfranciscensis CB1 sự, 1998) acid. Corsetti và cộng sự báo cáo về tác dụng ức chế nấm của LAB khác đƣợc phân lập từ bộtnhàochua làLactobacillus sanfranciscensis CB1 ( Corsetti và cộng sự , 1998). Họ phát hiện ra một hỗn hợp của acid hữu cơ là bổ trợ về tác dụng ức chế của dịng này (acetic , caproic , formic , propionic, butyric và acid n- valeric ), trong đĩ acid caproic dƣờng nhƣ quan trọng nhất. Tất cả các chất này đƣợc xác định là những hợp chất cĩ phân tử lƣợng thấp , nhƣng cũng cĩ những báo cáo của các hợp chất protein khơng xác định với hoạt động kháng nấm rộng ( Gourama và Bullerman ,1997; Magnusson và Schnürer , 2001). Một peptide giống nhƣ bacteriocin cĩ hiệu lực kìm nấm Candida albicans đã đƣợc báo cáo bởi Okkers và cộng sự.( Okkers và cộng sự , 1999). Ngồi các sản phẩm trên, cũng cĩ một số báo cáo về các chủng kháng nấm LAB mà các hợp chất hoạt động chƣa đƣợc đặc trƣng (De MUYNCK và cộng sự, 2004;. Florianowicz năm 2001; Laitila và cộng sự, 2002; Makanjuola, Tymon và Springham năm 1992; Roy và cộng sự, 1996; Schwenninger và cộng sự, 2005). Nghiên cứu về LAB chống nấm cho thấy việc sản xuất các chất ức chế nấm xảy ra ở nhiều lồi khác nhau.Lồi thuộc chi Lactobacillus đƣợc báo cáo trong phần lớn các nghiên cứu (Bảng 1.6). 32
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.6. Các lồi LAB khác nhau và sản xuất các chất kháng nấm Lồi và nguồn gốc phân Bản chất hĩa học Tài liệu tham khảo lập (Laitila và cộng sự, 2002; Lavermicocca và cộng sự dipeptides vịng hydroxy Lactobacillus plantarum: 2000; Makanjuola, acid béo 3-phenyl lactic thức ăn ủ chua, bột nhào Tymon và Springham, acid hợp chất phân tử chua, mạch nha, bia, rau 1992; Niku-Paavola và nhỏ khác cộng sự, 1999; Sjưgren và cộng sự, 2003) Caproic-, procionic-, Lactobacillus (Corsetti và cơng sự, buturic-, acetic- formic- sanfranciscensis: bột chua 1998) và n-valeric acid Lactobacillus coryniformis: (Magnusson và Schürer, protein thức ăn ủ chua 2001) Lactobacillus lactis: khơng (Florianowicz, 2001; Roy rõ phomát dày Cheddar từ và cộng sự, 1996) nguyên liệu sữ trâu (Florianowicz, 2001; Lactobacillus casei: chƣa rõ protein Gourama và Bullerman, 1997) Lactobacillus reuteri: ruột reuterin (Chung và cộng sự, 1989) lợn Lactobacillus pentosus: âm Protein dạng Bacteriocin (Okkers và cộng sự, 33
Đồ án tốt nghiệp đạo 1999) Lactobacillus paracasei: sữa (Schwenninger và cộng tƣơi, xúc xích sự, 2005 Ngồi sự ức chế tăng trƣởng thực tế của nấm, LAB cũng cĩ thể ức chế sản phẩm đặc biệt của độc tố nấm mốc (Gourama và Bullerman, 1997) hoặc làm bất động độc tố thơng qua liên kết với bề mặt của chúng (El-Nezami và cộng sự, 2004). Các hợp chất kháng nấm và phƣơng thức hoạt động Chất ức chế tăng trƣởng nấm cĩ tầm quan trọng cả trong việc kiểm sốt tác nhân gây bệnh của con ngƣời và động vật, và trong cơng tác phịng chống nấm mọc trong thực phẩm và các vật liệu khác. Các phƣơng thức hoạt động của kháng sinh chống nấm hiện nay là rất quan trọng cho sự ức chế nấm. Nhiều chất trong số các chất này đƣợc dành riêng cho sử dụng lâm sàng nhƣng một số đang đƣợc sử dụng trong sự kiểm sốt của nấm gây bệnh thực vật. Thuốc kháng sinh đƣợc xác định là chất đƣợc sản xuất bởi các vi sinh vật cĩ tác dụng diệt hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật khác ở nồng độ thấp. Phƣơng pháp khảo sát khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic Để phân lập tuyển chọn đƣợc các vi khuẩn nĩi chung và vi khuẩn lactic nĩi riêng cĩ khả năng kháng nấm, tiến trình thí nghiệm đƣợc trình bày trên hình 1.9. Bước 1: đầu tiên vi khuẩn lactic đƣợc nuơi cấy trong mơi trƣờng lỏng và canh trƣờng (bao gồm cả tế bào) đƣợc sử dụng để khảo sát khả năng ức chế tăng trƣởng nấm mốc bằng phƣơng pháp nuơi cấy trên đĩa thạch. Nếu kết quả dƣơng tính, ngƣời ta bắt đầu tìm hiểu khả năng kháng nấm của các sản phẩm trao đổi chất tế bào. Bước 2: dịch nuơi cấy sau ly tâm loại bỏ tế bào đƣợc sử dụng để khảo sát khả năng ức chế nấm mốc trên đĩa thạch. Nếu kết quả dƣơng tính cĩ thể tiến hành trích ly các hợp chất kháng nấm theo bƣớc 3. Bước 3: các hợp chất kháng nấm cĩ thể là enzyme (protease, beta-glucanase, chitinase, cellulase) hoặc các hợp chất hữ cơ phân tử nhỏ khác. Trích ly các hợp 34
Đồ án tốt nghiệp chất này bằng phƣơng pháp thích hợp và thử hoạt tính các phân đoạn riêng biệt.Trƣờng hợp cĩ một số phân đoạn dƣơng tính, tiến hành tiếp bƣớc 4. Bước 4: là bƣớc tinh sạch từng phân đoạn, xác định cấu trúc phân tử và khối lƣợng phân tử, cũng nhƣ độ tinh sạch bằng một số phƣơng pháp phân tích nhƣ sắc ký bản mỏng (TLC), sắc ký lỏng cao áp (HPLC), khối phổ (MS), cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) và khẳng định khả năng kháng nấm của hợp chất tinh sạch. Nhƣ vậy trong suốt sơ đồ thí nghiệm, phƣơng pháp đƣợc áp dụng là định tính khả năng kháng nấm theo một trong những phƣơng pháp sau: Phương pháp đối kháng trực tiếp (đối kháng che phủ): phƣơng pháp che phủ nhƣ mơ tả của Magnusson và Schnurer (2001). LAB đƣợc cấy thành hai dịng 2 cm trên đĩa thạch MRS và ủ kị khí ở 370C trong 24 giờ. Sau đĩ chúng đƣợc phủ lên bằng 10ml chiết xuất malt thạch mềm cĩ chứa 105 bào tử/ml nấm và ủ hiếu khí ở 300C trong 48 giờ. Sau 48 giờ nuơi cấy, vùng ức chế sẽ đƣợc đo. Phƣơng pháp này về kỹ thuật khĩ thực hiện vì phải dùng hai mơi trƣờng. Phương pháp sử dụng sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn đối kháng nấm mốc (phương pháp đục lỗ thạch): LAB đƣợc cấy vào mơi trƣờng MRS và ủ ở 370C trong 24 giờ. Dịch sau ly tâm của LAB thu đƣợc sau khi tiến hành ly tâm sẽ đƣợc lọc qua màng lọc vơ trùng. Tiến hành đục lỗ thạch trong mơi trƣờng thạch MRS, đƣờng kính lỗ thạch là 5mm. Thêm 60ml dịch nuơi cấy sau ly tâm của LAB vào lỗ thạch. Sau đĩ, phần nhỏ của sợi nấm 5 ngày tuổi đƣợc nuơi trong mơi trƣờng PDA sẽ đƣợc đặt trong lỗ thạch cĩ chứa dịch LAB sau ly tâm. Các đĩa thạch đƣợc ủ ở 300C trong 24, 48 và 72 giờ. Hoạt động ức chế đƣợc xác định bằng đƣờng kính của các sợi nấm. 35
Đồ án tốt nghiệp Canh trƣờng nuơi Khảo sát đối cấy LAB (lỏng) kháng với nấm Dịch trong sau ly Khảo sát đối tâm kháng với nấm Trích ly bằng dung Khảo sát đối mơi thu các phân kháng với nấm đoạn TLC HPLC Xác định hoạt chất Khảo sát đối MS trong từng phân kháng với nấm NMR đoạn Hoạt chất kháng nấm Hình 1.9. Sơ đồ tổng quát nghiên cứu khả năng kháng nấm của vi khuẩn nĩi chung và vi khuẩn lactic nĩi riêng 36
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm đƣợc tiến hành tại phịng thí nghiệm vi sinh khoa Cơng Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Mơi trƣờng trƣờng Đại Học Cơng Nghệ TP.HCM. 2.2 Thời gian thực hiện Đề tài đƣợc thực hiện từ 07/04/2014 đến ngày 30/06/2014 2.3 Vật liệu nghiên cứu 2.3.1 Giống vi sinh vật Các giống vi khuẩn lên men lactic Lactobacillus sp.L2, Lactobacillus sp.L3, Lactobacillus sp.L4, Lactobacillus sp.L5, Lactobacillus sp.L6 do phịng thí nghiệm vi sinh thuộc khoa Cơng Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Mơi Trƣờng trƣờng Đại Học Cơng Nghệ TP.HCM cung cấp. 2.3.2 Hĩa chất và mơi trường sử dụng 2.3.2.1 Hĩa chất - Các hĩa chấtdùng để pha các loại thuốc nhuộm: Tím kết tinh (Crystal violet), iod ethanol 95%, aceton, safranin, lục malachite, thuốc nhuộm fushin, xanh metylen, FeCl3, NaOH. - Các hĩa chất dùng để pha mơi trƣờng MRS – broth, MRS cải tiến, mơi trƣờng Czapek cĩ bổ sung chất kháng sinh và mơi trƣờng NA. - Các hĩa chất để pha các loại thuốc thử: Thuốc thử Uffelmann, thuốc thử bromophenol (BPB), thuốc thử phenolphthalein. - Các loại đƣờng: Saccharose, Maltose, 2.3.2.2 Mơi trường nuơi cấy - Mơi trƣờng MRS broth và MRS agar - Mơi trƣờng NA 37
Đồ án tốt nghiệp - Mơi trƣờng Czapek 2.4 Thiết bị và dụng cụ 2.4.1 Thiết bị - Tủ cấy vi sinh (Brlad France) - Tủ ủ (Memmert Germany) - Tủ lạnh Toshiba - Tủ sấy (Memmert Germany) - Máy đo quang phổ (UV – Vis) specific 20 genesis (USA) - Máy đo pH Horiba (Nhật Bản) - Máy ly tâm (Tuttligen Germany) - Kính hiển vi quang học Olympus (Nhật Bản) - Autoclave (Memmert – Đức) - Cân phân tích (Orbital Germany) - Bếp từ (Billy – England) - Máy nƣớc cất (Branstead USA). 2.4.2 Dụng cụ - Ống nghiệm, đĩa petri, erlen, cốc thủy tinh, bình định mức, ống đong, đũa thủy tinh. - Pipet thủy tinh 5ml, 10ml, 20ml, pipetman 100 - 1000µl. - Que cấy, que trang, kẹp gấp thạch, que đục lỗ thạch, đèn cồn, eppendorf 1ml, ống ly tâm lớn. - Bơng thấm nƣớc, bơng khơng thấm nƣớc, giấy lọc, lame, lamell, bao nilong hấp, giây thun, giấy gĩi đĩa, giá đỡ ống nghiệm, rổ nhựa. 2.5 Phƣơng pháp luận Cĩ nhiều phƣơng pháp khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp nấm mốc. Phƣơng pháp sử dụng hai mơi trƣờng khĩ thực hiện. Cĩ thể sử dụng một mơi trƣờng khảo sát, mơi trƣờng MRS là mơi trƣờng chuyên biệt cho vi khuẩn lactic 38
Đồ án tốt nghiệp chứa nhiều tác nhân kháng nấm. Do đĩ chúng tơi cần xác định mơi trƣờng thí nghiệm kháng nấm sao cho vi khuẩn lactic tăng trƣởng cực đại và thành phần mơi trƣờng khơng ức chế sự phát triển của nấm mốc. Các thí nghiệm trong đồ án tốt nghiệp nhằm loại bỏ một số thành phần kháng nấm trong mơi trƣờng MRS mà vẫn giữ đƣợc khả năng tăng trƣởng cao của vi khuẩn lactic. Để đạt đƣợc mục tiêu trên, nội dung đồ án gồm những yêu cầu sau: Mục tiêu 1:Khảo sát đặc điểm nuơi cấy của vi khuẩn thí nghiệm để khẳng định là vi khuẩn lactic và tính thuần khiết và tuyển chọn chủng vi khuẩn lên men lactic mạnh, cĩ khả năng sinh nhiều acid lactic. - Định danh sơ bộ bằng phƣơng pháp cổ điển - Tuyển chọn theo khả năng tổng hợp acid lactic Mục tiêu 2: Xác định mơi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm - Chọn lọc mơi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm khơng gây ảnh hƣởng lên sinh khối vi khuẩn lactic. - Chọn lọc mơi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm khơng gây ảnh hƣởng lên khả năng tăng trƣởng của nấm mốc. Mục tiêu 3: Khảo sát hoạt tính kháng nấm Aspergillus niger của chủng vi khuẩn lactic. 39
Đồ án tốt nghiệp 2.6 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.6.1 Sơ đồ nghiên cứu Nội dung nghiên cứu đƣợc thực hiện trên sơ đồ sau: Khảo sát đặc điểm nuơi cấy của vi khuẩn thí nghiệm để khẳng định là vi khuẩn lactic và tính thuần khiết Xác định mơi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm khơng gây ảnh hƣởng lên sinh khối vi khuẩn lactic Xác định mơi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm khơng gây ảnh hƣởng lên khả năng tăng trƣởng của nấm mốc Khảo sát khả năng kháng Aspergillus niger của vi khuẩn lactic Hình 2.1.Sơ đồ tổng quát nghiên cứu xác định mơi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm 40
Đồ án tốt nghiệp 2.6.2 Thí nghiệm khẳng định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần khiết Quy trình thí nghiệm: Chủng vi khuẩn lactic trong bộ sƣu tập phân lập từ nem chua Tăng sinh trong mơi trƣờng MRS broth đã đƣợc hấp khử trùng trùng ở 1210C trong 30 phút, ủ 370C trong 24 giờ Quan sát hình Cấy chuyển sang MRS thái khuẩn lạc agar Nhuộm Gram Cấy giữ Khảo sát đặc điểm nuơi cấy Nhuộm bào tử giống của chủng vi khuẩn lactic Khả năng sinh acid lactic Lên men đƣờng Xác định hàm lƣợng acid tổng Khẳng định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần khiết Hình 2.2.Sơ đồ khẳng định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần khiết của chúng 41
Đồ án tốt nghiệp Thuyết minh quy trình: Nguyên tắc: Các chủng vi khuẩn lactic đƣợc phân lập từ nem chua cĩ thể bị suy yếu và nhiễm các lồi vi khuẩn khác trong quá trình bảo quản. Do đĩ, chúng tơi tiến hành thí nghiệm này nhằm khẳng định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần khiết của chúng. Tiến hành: Khảo sát đặc điểm nuơi cấy và hình thái khuẩn lạc: Các chủng vi khuẩn lactic trong bộ sƣu tập phân lập từ nem chua đƣợc tăng sinh trong mơi trƣờng MRS broth và ủ ở 370C trong 24 giờ. Sau 24 giờ nuơi cấy, tiến hành cấy chuyển sang mơi trƣờng MRS agar để quan sát hình thái khuẩn lạc vi khuẩn lactic. Tiếp theo, tiến hành khảo sát các đặc điểm nuơi cấy của chủng vi khuẩn lactic, bao gồm các phƣơng pháp: nhuộm gram, nhuộm bào tử, khả năng sinh acid lactic, lên men đƣờng và tuyển chọn vi khuẩn lên men lactic sinh acid lactic cao bằng xác định hàm lƣợng acid tổng. Mơi trƣờng giữ giống: Sau khi đã khẳng định chủng vi khuẩn lactic và tính thuần khiết của chúng, tiến hành cấy chuyển khuẩn lạc sang mơi trƣờng MRS agar trong ống thạch nghiên, ủ ở 370C trong 24 đến 48 giờ và bảo quản trong tủ lạnh phịng thí nghiệm. 2.6.3Xác định mơi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm Nguyên tắc: Mơi trƣờng MRS bao gồm các thành phần đáp ứng nhu cầu tăng trƣởng của vi khuẩn lactic và ức chế sự phát triển của nấm mốc. Nên loại bỏ một số thành phần (natri acetate, citrate amon) chống mốc, chống bacteriofac sẽ làm giảm khả năng tăng trƣởng về mặt lý thuyết của vi khuẩn lactic. Để thử nghiệm khả năng kháng nấm tốt của chủng vi khuẩn lactic thì mơi trƣờng thử nghiệm kháng nấm phải đảm bảo sao cho vi khuẩn lactic tăng trƣởng cực đại và thành phần mơi trƣờng khơng ức 42
Đồ án tốt nghiệp chế sự phát triển của nấm mốc. Do đĩ, chúng tơi tiến hành hai thử nghiệm là khảo sát hoạt tính kháng nấm dựa vào sinh khối vi khuẩn lactic và khảo sát hoạt tính kháng nấm dựa vào khả năng phát triển của nấm mốc để chọn lọc mơi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm. Tiến hành thử nghiệm với chủng Lactobacillus sp.L5. 43
Đồ án tốt nghiệp 2.6.3.1 Chọn lọc mơi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm dựa vào sinh khối vi khuẩn lactic Ống giống gốc Tăng sinh trong mơi trƣờng MRS broth đã đƣợc hấp khử trùng trùng ở 1210C trong 30 phút, ủ 370C trong 24 giờ Cấy vào mơi trƣờng khảo sát với tỉ lệ 1% Mơi trƣờng Mơi trƣờng Mơi trƣờng Mơi trƣờng MRS 3 MRS cổ điển MRS 1 (bỏ MRS 2 (bỏ (bỏ natri acetate và natri acetate) citrate amon) citrate a mon) Ủ ở 370C trong 24 giờ Ly tâm 10000 vịng/phút trong 10 phút Đo OD 610nm Mơi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm Hình 2.3.Sơ đồ chọn lọc mơi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm dựa vào sinh khối vi khuẩn lactic 44
Đồ án tốt nghiệp Thuyết minh quy trình: Mơi trƣờng theo dõi sinh khối vi khuẩn gồm các mơi trƣờng sau: MRS cổ điển, MRS 1 (bỏ natriacetate), MRS 2 (bỏ citrate amon), MRS 3 (bỏ natri acetate và citrate amon). Đầu tiên, chủng vi khuẩn lactic Lactobacillus sp.L5 đƣợc tăng sinh ở 370C trong 24 giờ. Pha 50ml các mơi trƣờng MRS và hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút và tiến hành cấy giống từ chủng vi khuẩn L5 đã đƣợc tăng sinh trƣớc với tỷ lệ 1%. Đem ủ ở 370C trong 24 giờ. Sau 24 giờ, hút 1ml ở mỗi ống nghiệm ở các mơi trƣờng vào eppendorf và đem ly tâm với tốc độ 10000v/phút trong 10 phút. Đƣa về thể tích ban đầu bằng nƣớc muối sinh lí. Tiến hành đo OD, mỗi mơi trƣờng ta tiến hành đo OD với 5 lần lặp lại ở bƣớc sĩng 610nm. Đối với một số vi sinh vật, OD chỉ tuyến tính với nồng độ tế bào khi nồng độ này thấp. Vì vậy, chỉ nên nhận giá trị OD khi OD 0,4 thì tiến hành pha lỗng bằng nƣớc muối sinh lý NaCl 0,85%. 45
Đồ án tốt nghiệp 2.6.3.2 Chọn mọc mơi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm dựa vào khả năng tăng trưởng của nấm mốc Mơi trƣờng Mơi trƣờng Mơi trƣờng Mơi trƣờng MRS MRS cổ điển MRS 1 (bỏ MRS 2 (bỏ 3 (bỏ natri acetate natri acetate) citrtaete và citrtaete amon) amon) Khử trùng trong 1210C trong 30 phút Đổ đĩa Mucor sp.B1 Aspergillus sp.X2 Cấy nấm Aspergillus sp.Đ1 Ủ ở nhiệt độ phịng trong 24 giờ Đo đƣờng kính tăng trƣởng của nấm Mơi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm Hình 2.4.Sơ đồ chọn lọc mơi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm dựa vào khả năng tăng trƣởng của nấm mốc 46
Đồ án tốt nghiệp Thuyết minh quy trình: Do khả năng phát triển của mỗi loại nấm khác nhau, phụ thuộc vào thành phần mơi trƣờng. Do đĩ, chúng tơi chọn ra 3 loại nấm cĩ khả năng phát triển mạnh, trong đĩ cĩ hai lồiAspergillus là Aspergillus sp.X2 và Aspergillus sp.Đ1, và một lồi Murco là Mucor sp.B1 để khảo sát. Mơi trƣờng khảo sát sự tăng trƣởng của nấm gồm các mơi trƣờng: MRS cổ điển, MRS 1 (bỏ natriacetate), MRS 2 (bỏ citrate amon), MRS 3 (bỏ natri acetate và citrate amon). Chuẩn bị 3 loại nấm là Mucor sp.B1, Aspergillus sp.X2 và Aspergillus sp.Đ1 Pha 100ml mỗi mơi trƣờng và tiến hành đỗ đĩa. Tiến hành cấy từng loại nấm vào các đĩa petri cĩ chứa các mơi trƣờng trên. Mỗi loại nấm cấy lặp lại 3 lần. Đĩa đối chứng là đĩa nấm trên mơi trƣờng MRS cổ điển. Sau khi cấy để yên ở nhiệt độ phịng trong 24 giờ và quan sát, đo đƣờng kính nấm mỗi ngày trong một tuần. Nguồn gốc và đặc điểm của 3 loại nấm Mucor sp.B1, Aspergillus sp.X2 và Aspergillus sp.Đ1 (xem Phụ lụcB). 47
Đồ án tốt nghiệp 2.6.4 Khảo sát khả năng kháng nấm Aspergillus niger của chủng vi khuẩn lactic Quy trình thí nghiệm: Ống giống gốc Tăng sinh trong mơi trƣờng MRS cải tiến broth đã đƣợc hấp khử trùng ở 1210C trong 30 phút và ủ ở 370C trong 24 giờ Pha lỗng từ 1 – 20 lần Cấy trang Đĩa nấm Cấy điểm Đĩa petri chứa mơi Aspergillus trƣờng MRS cải tiến niger agar Ủ ở nhiệt độ phịng và đo đƣờng kính tăng trƣởng của nấm Tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus niger của chủng vi khuẩn lactic Hình 2.5.Sơ đồ khảo sát khả năng kháng nấm Aspergillus niger của chủng vi khuẩn lactic 48
Đồ án tốt nghiệp Thuyết minh quy trình: Nguyên tắc : Trên thực tế, bản thân mơi trƣờng MRS đã bao gồm những thành phần ức chế nấm mốc. Nên phải loại bỏ các thành phần kháng nấm để xác định rằng khi loại bỏ các chất kháng nấm thì mơi trƣờng đĩ cĩ cịn kháng nấm khơng và từ đĩ đánh giá đƣợc khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic. Tiến hành thử nghiệm với chủng Lactobacillus sp.L5. Tiến hành : Chủng Lactobacillus sp.L5 đƣợc tăng sinh trong mơi trƣờng MRS cải tiến ở 370C trong 24 giờ với tỉ lệ cấy giống 1%. Sau 24 giờ, tiến hành đo OD 610nm, đƣa OD hiệu chỉnh về bằng 5 để đảm bảo độ chính xác giữa các lần thí nghiệm. Tiến hành pha lỗng ra các nồng độ khác nhau (pha lỗng từ 1÷20 lần). Hút 0,1ml từ các độ pha lỗng khác nhau vào các đĩa petri chứa mơi trƣờng MRS cải tiến và tiến hành cấy trang. Mỗi nồng độ pha lỗng thử nghiệm trên 3 đĩa. Sau khi cấy trang ta tiến hành cấy điểm bào tử nấm Aspergillus niger vào các đĩa. Mẫu đối chứng là đĩa chứa mơi trƣờng MRS cải tiến đƣợc cấy trang bằng chính mơi trƣờng MRS cải tiến, khơng cĩ huyền phù tế bào và đƣợc cấy điểm bào tử nấmAspergillus niger. Sau khi cấy, các đĩa petri đƣợc để ở nhiệt độ phịng và quan sát, đo đƣờng kính sự phát triển của nấm Aspergillus niger mỗi ngày, đến khi nấm Aspergillus niger mọc đầy đĩa đối chứng. Phần trăm ức chế đƣợc tính theo cơng thức: Dđc − Dtn ỉ푙ệứ ℎế % = x 100 Ddc Trong đĩ: Dđc: là đƣờng kính (cm) đĩa nấm đối chứng Dtn: là đƣờng kính (cm) đĩa thí nghiệm Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Statgraphics. 49
Đồ án tốt nghiệp 2.6.5 Phương pháp định danh và tuyển chọn 2.6.5.1 Nhuộm Gram Mục đích: Dựa vào cấu trúc vách tế bào giúp ta phân biệt vi khuẩn thuộc 2 nhĩm lớn: vi khuần Gram dƣơng (Gram – positive) và vi khuẩn Gram âm (Gram – negative). Ngồi ra nhuộm Gram cho phép ta quan sát rõ hình thái tế bào hơn so với soi vi khuẩn sống. Tiến hành: Sử dụng phƣơng pháp Hucker cải tiến. Vi khuẩn đem nhuộm gram phải là vi khuẩn mới cấy truyền sau 24 giờ. Ngƣợc lại vi khuẩn già cho kết quả sai lệch. Kết quả:Vi khuẩn gram dƣơng bắt màu tím, vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng. 2.6.5.2 Nhuộm bào tử Mục đích: Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử: dày, chắc, khĩ bắt màu, chứa nhiều lipid. Trƣớc hết xử lý để tế bào chất dễ bắt màu bằng nhiệt và axit.Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm cĩ hoạt tính mạnh. Tẩy màu tế bào chất của tế bào và nhuộm nĩ bằng thuốc nhuộm khác bổ sung. Nhờ đĩ tế bào chất của bào tử và tế bào chất bắt màu phân biệt. Theo sơ đồ Bergey thì chủng LAB khơng sinh bào tử. Do đĩ việc xác định này nhằm loại bỏ các vi khuẩn Gram dƣơng sinh bào tử nhƣ Bacillus sp. Và Clostridium spp. Tiến hành: Dùng phƣơng pháp Schaeffer – Fulton. Kết quả: Bào tử cĩ màu lục, tế bào cĩ màu đỏ. 2.6.5.3 Thử nghiệm khả năng sinh acid lactic Mục đích: Kiểm tra khả năng sinh acid lactic của vi khuẩn trong quá trình trao đổi chất của chúng. Tiến hành: Sử dụng thuốc thử Uffelmann: 10 giọt dung dịch phenol và 1 giọt FeCl3 1% thu đƣợc dung dịch màu tím. Nhỏ vài giọt dung dịch thuốc thử Uffelmann cĩ màu tím lên khuẩn lạc trên đĩa thạch. Nếu cĩ acid lactic, dung dịch sẽ chuyển sang màu vàng nhạt. Mẫu đối chứng là vi khuẩn Bacillus sp. 50
Đồ án tốt nghiệp 2.6.5.4 Thử nghiệm khả năng lên men đường Mục đích : Kiểm tra vi sinh vật cĩ khả năng lên men các loại đƣờng nào. Tiến hành : Mơi trƣờng MRS broth với lƣợng đƣờng glucose lần lƣợt thay thế bằng các loại đƣờng cần kiểm tra. Phân mơi trƣờng vào các ống nghiệm, mỗi ống 10ml. Đặt vào mỗi ống nghiệm 1 ống nhỏ (ống Durham) lộn ngƣợc đầu để hứng khí CO2 sinh ra nếu vi khuẩn cĩ khả năng lên men đƣờng. Khử trùng trong 15 phút ở 1210C. Cấy vi khuẩn mới hoạt hĩa vào các ống nghiệm, đặt ở 370C, theo dõi hiện tƣợng sinh acid sau 1-3 ngày. Cĩ trƣờng hợp cần dùng paraffin để bịt kín nút bơng và theo dõi trong 14-30 ngày. Kết quả : Nếu vi khuẩn cĩ khả năng lên men đƣờng (sinh acid) chất chỉ thị BPB (Bromophenol Blue) sẽ chuyển sang màu vàng lục. 2.6.5.5 Xác định hàm lượng acid tổng Mục đích : Xác định hàm lƣợng acid tồng bằng phƣơng pháp quy về acid lactic để xác định hàm lƣợng acid lactic sinh ra từ các chủng vi khuẩn lactic thử nghiệm nhằm chọn ra chủng vi khuẩn lactic mạnh nhất để kháng nấm. Hàm lƣợng acid trong dịch lên men cĩ thể định lƣợng bằng dung dịch kiềm chuẩn nhờ cĩ sự đổi màu của dung dịch thuốc thử Phenolphatalein. Tiến hành : Định lƣợng acid lactic bằng dung dịch NaOH 0,1N với chất chỉ thị Phenolphtalein 1% : Cho vào bình tam giác 10ml dịch lên men vi khuẩn, thêm 2 – giọt Phenolphtalein và chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt. Sử dụng máy đo pH để chuẩn độ đến khi pH đạt 8,6 và ghi nhận kết quả. Kết quả : Hàm lƣợng acid tổng đƣợc quy về acid lactic theo cơng thức : 퐕퐍퐚퐎퐇 퐱 , 퐱 퐱 % 풊풅 풍 풕풊 = 퐱 Trong đĩ : 51
Đồ án tốt nghiệp VNaOH : Thể tích NaOH 0,1N chuẩn độ đƣợc 10 : Số ml dịch Dx đƣợc đem đi chuẩn độ 0,1 : Nồng độ NaOH dùng để chuẩn độ 1000 : Hệ số chuyển đổi ra g 90 : Mỗi ml NaOH chuẩn độ tƣơng đƣơng với 90 mg acid lactic trong dịch Dx. 52
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG III : KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Định danh sơ bộ khảo sát sinh lý – sinh hĩa và sự thuần khiết của chủng vi khuẩn lactic Các chủng vi khuẩn lactic từ bộ sƣu tập phân lập từ nem chua đƣợc bảo quản trong phịng thí nghiệm. Tuy nhiên, trƣớc khi đƣa vào sử dụng phải khẳng định sau thời gian bảo quản, chúng cĩ phải là vi khuẩn lactic hay khơng. Vi khuẩn lactic phải đáp ứng các điều kiện : là vi khuẩn gram dƣơng, hình que hoặc hình cầu, khơng sinh bào tử, cĩ khả năng sinh acid lactic Các phƣơng pháp sinh lý – sinh hĩa sau sẽ chứng minh đƣợc vi khuẩn lactic đạt đƣợc những yêu cầu đĩ. 3.1.1 Nhuộm Gram Vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram dƣơng, hình que (giống Lactobacillus) hoặc hình cầu (giống Streptococcus) nên ta tiến hành nhuộm Gram với các tế bào đã đƣợc tăng sinh 24 giờ trong mơi trƣờng MRS broth, vì khi già vi khuẩn lactic đều bắt màu nhƣ vi khuẩn Gram âm. Kết quả nhuộm Gram đƣợc đối chiếu với vi khuẩn Bacillus subtilis Gram dƣơng và E.coli Gram âm. Kết quả thu đƣợc 5 chủng vi khuẩn Lactobacillus sp.L2, Lactobacillus sp.L3, Lactobacillus sp.L4, Lactobacillus sp.L5, Lactobacillus sp.L6 đều là vi khuẩn Gram dƣơng. Xem hình 3.1. a) b) 53
Đồ án tốt nghiệp c) Hình 3.1.Kết quả nuộm Gram của các chủng vi khuẩn a) Vi khuẩn E.coli Gram âm (-) bắt màu hồng đỏ b) Vi khuẩn Bacillus subtilis Gram (+) bắt màu xanh tím c) Vi khuẩn lactic Gram dƣơng (+) bắt màu xanh tím 3.1.2 Nhuộm bào tử Theo sơ đồ định danh của Bergey thì LAB khơng sinh bào tử nên nhuộm bào tử giúp loại bỏ các vi khuẩn Gram dƣơng sinh bào tử nhƣ Bacillus spp. Và Clostridium spp. và đây cũng là đặc điểm nhận dạng của chúng. Kết quả sau khi nhuộm bào tử đƣợc đối chiếu với vi khuẩn Bacillus subtilis Gram dƣơng. Kết quả thu đƣợc các tế bào các chủng sau khi nhuộm đều bắt màu đỏ của thuốc nhuộm bổ sung. Nhƣ vậy cả 5 chủng vi khuẩn lactic khơng sinh bào tử.Xem hình 3.2. a) b) Hình 3.2. Kết quả nhuộm bào tử của các chủng vi khuẩn a) Vi khuẩn Bacillus subtilis sinh bào tử màu xanh b) Vi khuẩn lactic khơng sinh bào tử 54
Đồ án tốt nghiệp 3.1.3 Thử nghiệm khả năng sinh acid lactic bằng thuốc thử Uffelmann Điều kiện của một vi khuẩn lactic là chúng phải cĩ khả năng sinh acid lactic, vì vậy để đảm bảo ta tiến hành thử nghiệm các chủng vi khuẩn đĩ cĩ sinh acid lactic hay khơng bằng thuốc thử Uffelmann. Sử dụng chủng Bacillus subtilis khơng acid và khơng làm đổi màu tím của thuốc thử, làm đối chứng âm. Cho thuốc thử trực tiếp lên khuẩn. Quan sát mẫu vi khuẩn phân lập đều làm đổi màu thuốc thử từ màu tím sang màu vàng. Kết quả: Các chủng phân lập đều cĩ khả năng sinh acid lactic.Xem hình 3.3 a) b) Hình 3.3. Khả năng sinh acid lactic của các chủng vi khuẩn a) Vi khuẩn Bacillus subtilis khơng sinh acid lactic b) Vi khuẩn lactic sinh acid lactic 3.1.4 Kiểm tra khả năng lên men đường và khả năng sinh khí Tất cả các LAB trong thí nghiệm đều lên men glucose tổng hợp acid lactic.Theo cơ chế trao đổi chất, LAB cĩ thể thuộc nhĩm lên men đồng hình hoặc nhĩm lên men dị hình. Đối với nhĩm lên men đồng hình, acid lactic là sản phẩm lên men duy nhất do glucose chuyển hĩa thành pyruvate theo con đƣờng Embden- Meyerhoff (đƣờng phân), sau đĩ pyruvate chuyển thành acid lactic nhờ lactate dehydrogenase. Đối với nhĩm lên me dị hình, glucose chuyển hĩa theo con đƣờng pentose phosphate tạo ra sản phẩm trung gian 6-phosphogluconate, sau đĩ enzyme 6-phosphogluconate dehydrogenase tạo thành CO2 và đƣờng 5C (ribulose-5- phosphate). Tiếp theo các LAB nhờ enzyme phosphoketolase chia con đƣờng trao đổi chất thành hai nhánh giống hệt đƣờng phân tạo thành pyruvate rồi lên men sinh 55
Đồ án tốt nghiệp acid lactic; nhánh kia tạo thành ethanol. Vì vậy con đƣờng trao đổi chất này cịn đƣợc gọi là con đƣờng 6-PG/PK (6-phosphogluconate/ phosphoketolase). Nhƣ vậy, khi lên men nếu chỉ sinh acid, khơng sinh khí thì LAB thuộc nhĩm lên men đồng hình.Ngƣợc lại nếu cả acid và khí tạo thành LAB thuộc nhĩm lên men dị hình. Ngồi ra, các LAB khác nhau cĩ thể lên men các đƣờng khác nhau.Dựa vào điều kiện nhƣ trên mà ta cĩ thể tiến hành thử nghiệm khả năng lên men hai loại đƣờng glucose và sucrose. Kết quả: Chủng sau khi nuơi cấy 24 giờ đều cĩ khả năng lên men đƣờng glucose và sucrose tổng hợp acid với nồng độ lớn. Tất cả các chủng đều là lên men đồng hình. a) b) c) Hình 3.4.Khả năng lên men đƣờng của vi khuẩn lactic a) Các chủng vi khuẩn lactic Lactobacillus sp.L2 – L6 khơng sinh hơi b) Chủng vi khuẩn lactic cĩ khả năng lên men đƣờng glucose c) Chủng vi khuẩn lactic cĩ khả năng lên men đƣờng sucrose 56
Đồ án tốt nghiệp 3.1.5 Xác định hàm lượng acid tổng Để thử nghiệm mơi trƣờng khảo sát kháng nấm tốt, chúng tơi tiến hành thử nghiệm xác định hàm lƣợng acid tổng để tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic cĩ khả năng sinh acid lactic cao, cĩ hoạt tính kháng nấm tốt. Kết quả: Hàm lƣợng % acid lactic các chủng vi khuẩn lactic Lactobacillus sp.L2, Lactobacillus sp.L3, Lactobacillus sp.L4, Lactobacillus sp.L5 và Lactobacillus sp.L6 đƣợc nuơi cấy ở 370C trong 24 giờ trong mơi trƣờng MRS broth: Bảng 3.1.%acid lactic của 5 chủng LAB trong 24h nuơi cấy Chủng L2 L3 L4 L5 L6 % acid 1,5075 1,566 1,512 1,656 1,593 lactic L6 1,593 L5 1,656 L4 1,512 % acid lactic L3 1,566 Chủng vi vi Chủng khuẩn L2 1,5075 1,4 1,45 1,5 1,55 1,6 1,65 1,7 % acid lactic (%) Hình 3.5. Đồ thị biểu hiện % acid lactic sinh ra của các chủng vi khuẩn lactic sau 24 giờ nuơi cấy Kết quả thí nghiệm trên cho thấy chủng L5 là vi khuẩn lên men lactic, đặc biệt hàm lƣợng acid tổng sau lên men đƣợc quy về acid lactic đạt khá cao là 1,656%; chủng L2 và L4 là thấp nhất. Do đĩ, chúng tơi chọn L5 57
Đồ án tốt nghiệp (Lactobacillussp.L5) là vi khuẩn lên men lactic mạnh nhất để khảo sát khả năng kháng nấm trên mơi trƣờng MRS cải tiến. Bảng 3.2.Kết quả định danh sơ bộ của các chủng phân lập Khả năng Khả năng lên men Nhuộm Nhuộm Chủng sinh acid đƣờng Sinh khí Gram bào tử lactic Glucose Sucrose L2 + - + + + - L3 + - + + + - L4 + - + + + - L5 + - + + + - L6 + - + + + - Chú thích: dấu “ – ” là kết âm tính, dấu “ + ” là kết quả dƣơng tính. Qua bƣớc định danh sơ bộ theo phƣơng pháp cổ điển, chúng tơi khẳng định đƣợc các chủng phân lập từ nem chuaLactobacillus sp.L2, Lactobacillus sp.L3, Lactobacillus sp.L4, Lactobacillus sp.L5, Lactobacillus sp.L6 đều là vi khuẩn lactic và đều thuần khiết. Và ta xác định đƣợc chủng vi khuẩn lactic mạnh nhất sinh acid lactic cao là Lactobacillus sp.L5. 3.2 Xác định mơi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm Theo các nghiên cứu trƣớc, mơi trƣờng MRS bao gồm các thành phần dinh dƣỡng đáp ứng nhu cầu tăng trƣởng của vi khuẩn lactic và ức chế sự phát triển của nấm mốc. Nên loại bỏ một số thành phần (natri acetate, citrate amon) chống mốc, chống bacteriofac sẽ làm giảm khả năng tăng trƣởng về mặt lý thuyết của vi khuẩn lactic. Để thử nghiệm khả năng kháng nấm tốt thì mơi trƣờng kháng nấm phải đảm bảo sao cho vi khuẩn lactic tăng trƣởng cực đại và thành phần mơi trƣờng khơng ảnh hƣởng đến sự phát triển của nầm mốc. Do đĩ, chúng tơi tiến hành hai thử nghiệm là chọn lọc mơi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm dựa vào sinh khối vi khuẩn lactic và chọn lọc mơi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm dựa vào khả năng 58
Đồ án tốt nghiệp tăng trƣởng của nấm mốc để chọn lọc mơi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm. Tiến hành thử nghiệm với chủng Lactobacillus sp.L5. 3.2.1 Xác định mơi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm khơng ảnh hưởng lên sinh khối vi khuẩn lactic Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên4 mơi trƣờng MRS cổ điển, MRS 1 (bỏ natri acetate), MRS 2 (bỏ citrate amon), MRS 3 (bỏ natri acetate và citrate amon). Thơng thƣờng chủng vi khuẩn lactic đƣợc nuơi cấy trên mơi trƣờng MRS broth (MRS cổ điển). Mơi trƣờng này đảm bảo điều kiện đầy đủ dinh dƣỡng cho LAB nhƣng cĩ chứa những thành phần kháng nấm nhƣ citrate amon, natri acetate. Tiến hành khảo sát trên các mơi trƣờng lần lƣợt bỏ các chất kháng nấm để theo dõi khả năng tăng trƣởng của vi khuẩn lactic. Theo các nghiên cứu, LAB thuộc vi khuẩn yếm khí tùy nghi hoặc yếm khí chịu oxy, nên cĩ thể nuơi cấy tĩnh. LAB cĩ thể tăng trƣởng tốt trong nhiệt độ ủ thơng thƣờng ở 370C trong tủ ấm phịng thí nghiệm trong 24 giờ nuơi cấy, với tỉ lệ cấy giống 1%. Việc nuơi cấy chủng LAB đƣợc tiến hành với mỗi mơi trƣờng nuơi cấy với ba lần lặp lại lấy trung bình thơng qua bảng theo dõi mật độ quang (xem bảng 3.3). Bảng 3.3.Bảng theo dõi mật độ quang của vi khuẩn lactic trong 4 mơi trƣờng Mơi trƣờng OD 610nm OD hc % MRS cổ điển 0,389 ± 0,010 6,746 ± 0,400 100 MRS 1 0,364 ± 0,017 5,09 ± 0,248 75,45 MRS 2 0,353 ± 0,016 5,643 ± 0,263 83,65 MRS 3 0,355 ± 0,029 4,06 ± 0,078 60,18 Dựa vào kết quả thí nghiệm từ bảng 3.3, ta xác định đƣợc mơi trƣờng MRS 2 (bỏ citrate amon) đạt 83,65% lƣợng sinh khối vi khuẩn latic sau 24 giờ nuơi cấy là 59
Đồ án tốt nghiệp mơi trƣờng mà sinh khối vi khuẩn lactic đạt cực đại so với mẫu đối chứng là mơi trƣờng MRS cổ điển. 3.2.2 Xác định mơi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm dựa vào khả năng tăng trưởng của nấm mốc Thí nghiệm khảo sát sự tăng trƣởng nấm Aspergillus niger đƣợc thực hiện trên các mơi trƣờng MRS cổ điển, MRS 1 (bỏ natri acetate), MRS 2 (bỏ citrate amon) và MRS 3 (bỏ natri acetate và citrate amon). Để chọn mơi trƣờng tốt nhất để test kháng nấm, mơi trƣờng đĩ cần phải đảm bảo điều kiện sinh khối vi khuẩn lactic đạt cực đại và thành phần mơi trƣờng khơng ức chế sự phát triển của nấm. Chúng tơi chọn ra ba loại nấm cĩ khả năng phát triển mạnh để khảo sát, trong đĩ cĩ hai loại nấm Aspergillus là Aspergillus sp.X2 và Aspergillus sp.Đ1 và nấm Mucor sp.B1. Theo dõi sự phát triển của ba loại nấm trên các mơi trƣờng, quan sát và đo đƣờng kính nấm mỗi ngày. Kết quả đƣợc trình bày trong các bảng từ bảng 3.4 - 3.9. Bảng 3.4.Đƣờng kính (cm) và đặc điểm nấm Mucor sp.B1 trên 4 mơi trƣờng MRS cổ điển, MRS 1, MRS 2, MRS 3 Đƣờng kính Mơi trƣờng Ngày (cm) và đặc MRS Cổ MRS 1 MRS 2 MRS 3 điểm. điển Đƣờng kính 6,1 7,5 7,0 7,0 Nấm mọc Khá dày, Mỏng, thƣa, Mỏng, thƣa, 1 mỏng, thƣa, đều, sợi Đặc điểm sợi nấm màu sợi nấm sợi nấm màu nấm màu trắng. màu trắng. trắng. trắng. Đƣờng kính 9,0 8,3 9,0 9,0 Nấm mọc Nấm mọc Mọc khơng Mọc lan hết 2 Đặc điểm lan hết đĩa dày ở điểm đều nhau, đĩa nhƣng nhƣng cấy, sợi nấm càng xa rất thƣa và 60
Đồ án tốt nghiệp mỏng, màu trắng, điểm cấy mỏng. khơng đều chƣa cĩ sự càng mỏng nhau, chƣa xuất hiện bào dần. cĩ sự xuất tử nấm. hiện bào tử nấm. Mọc lan hết Mọc lan hết Mọc lan và Mọc lan và Đƣờng kính đĩa, phủ lên đĩa và lên phủ lên phủ lên thành đĩa. thành đĩa. thành đĩa. thành đĩa. Nấm phát triển khá Moc khá Cĩ sự xuất Nấm mọc 3 nhanh, bắt đều nhau, hiện bào tử thƣa, mỏng, đầu cĩ sự bào tử nấm Đặc điểm nấm màu đen chƣa cĩ sự xuất hiện màu đen bắt ở gần điểm xuất hiện bào tử nấm đầu xuất cấy. bào tử nấm. màu đen ở hiện. điểm cấy. Phủ hết đĩa, Phủ hết đĩa, Đƣờng kính Phủ hết đĩa lan lên mặt lan lên mặt Phủ hết đĩa trên đĩa. trên đĩa. Nấm phát Hầu nhƣ Nấm mọc Bào tử nấm 4 triển mạnh, khơng phát dày, bào tử nhiều hơn, bào tử màu triển, vẫn Đặc điểm nấm màu cĩ ở khắp đen nấm cĩ ở chƣa xuất đen nhiều đĩa, nấm khắp tồn hiện bào tử hơn. mọc dày. đĩa. nấm. Đƣờng kính Phủ hết đĩa Phủ hết đĩa Phủ hết đĩa Phủ hết đĩa 5 Nấm mọc Nấm phát Nấm rất Bào tử nấm Đặc điểm dày, bào tử triển rất tốt. phát triển. bắt đầu xuất 61
Đồ án tốt nghiệp nấm vẫn Bào tử nấm Bào tử nấm hiện thƣa chƣa nhiều màu đen xuất hiện thớt, mỏng. hơn. nhiều hơn. nhiều hơn, rõ rệt, dày. Đƣờng kính Phủ hết đĩa Phủ hết đĩa Phủ hết đĩa Phủ hết đĩa Nấm chậm Bào tử nấm Nấm mọc phát triển, Bào tử nấm chuyển sang dày hơn 6 Đặc điểm bào tử nấm cĩ ở khắp màu đen nhƣng bào khơng phát đĩa. nhiều và tử nấm vẫn triển nhiều dày hơn chƣa nhiều. Đƣờng kính Phủ hết đĩa Phủ hết đĩa Phủ hết đĩa Phủ hết đĩa Bào tử nấm Nấm hầu Nấm hầu nhƣ Nấm hầu 7 xuất hiện Đặc điểm nhƣ ngừng ngừng phát nhƣ ngừng khơng phát triển. triển. phát triển. nhiều. Bảng 3.5.Khả năng phát triển của nấm Mucor sp.B1 trên 4 mơi trƣờng nuơi cấy MRS cổ điển MRS 1 MRS 2 MRS 3 Trong đĩ : MRS 1: bỏ natri acetate MRS 2: bỏ citrate amon MRS 3: bỏ natri acetate và bỏ citrate amon 62
Đồ án tốt nghiệp 10 9 8 7 6 5 MRS cổ điển 4 MRS 1 3 Đƣờng kínhĐƣờng (cm) MRS 2 2 MRS 3 1 0 Thời gian (ngày) Hình 3.6. Đƣờng kính (cm) nấm Mucor sp.B1 trên các mơi trƣờng trong 7 ngày nuơi cấy Kết quả từ bảng 3.4, 3.5và hình 3.6 cho thấy nấm Mucor sp.B1 phát triển tốt trên cả 4 mơi trƣờng MRS. Ngày thứ nhất nấm phát triển tốt nhất trong mơi trƣờng MRS 1 (bỏ natri acetate) với đƣờng kính 7,5 cm. Tuy nhiên đến ngày thứ 2, nấm Mucor sp.B1 trên mơi trƣờng MRS 1 phát triển chậm hơn so với ba mơi trƣờng cịn lại. Từ ngày thứ 3 – 7 nấm đã mọc phủ hết trên các mơi trƣờng. Tuy nhiên, bào tử nấm chỉ xuất hiện ở mơi trƣờng MRS cổ điển, MRS 1 (bỏ natri acetate) và MRS 2 (bỏ citrate amon) vào ngày thứ 4. Mơi trƣờng MRS 3, tơ nấm phát triển, lan nhanh nhƣng rất thƣa và bào tử nấm xuất hiện rất chậm so với ba mơi trƣờng cịn lại. Nhìn chung, các ngày sau đĩ, bào tử nấm tiếp tục phát triển nhiều và rõ rệt hơn trên mơi trƣờng MRS 1 và MRS 2. Đối với loại nấm này, chúng tơi cĩ thể chọn 1 trong 4 mơi trƣờng để tiến hành khảo sát vì khơng cĩ sự khác biệt nhiều về tốc độ phát triển của nấm trên 4 mơi trƣờng. 63
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.6.Đƣờng kính (cm) và đặc điểm nấm Aspergillus sp.X2 trên 4 mơi trƣờng MRS cổ điển, MRS (1), MRS (2), MRS (3) Đặc điểm và Mơi trƣờng Ngày đƣờng kính MRS cổ điển MRS 1 MRS 2 MRS 3 (cm) Chƣa phát Chƣa phát Chƣa phát Chƣa phát 1 triển triển triển triển Đƣờng kính 1,5 ± 0,1 1,5 ± 0,1 1,5 ± 0,1 1,5 ± 0,1 Sợi nấm 2 Sợi nấm trắng, nấm Đặc điểm Sợi nấm trắng Sợi nấm trắng trắng mọc trịn, đều. Đƣờng kính 1,8 ± 0,1 2,3 ± 0,1 2,5 ± 0,5 2,4 ± 0,6 Nấm tiếp tục Nấm tiếp tục Nấm tiếp tục Nấm tiếp tục 3 phát triển. phát triển. phát triển. phát triển. Đặc điểm Bào tử nấm Bào tử nấm Bào tử nấm Bào tử nấm chƣa xuất chƣa xuất chƣa xuất chƣa xuất hiện hiện hiện hiện Đƣờng kính 2,3 ± 0,4 3,0 ± 0,3 3,2 ± 1,1 3,0 ± 0,6 Nấm mọc Sợi nấm màu dày, cĩ sự Sợi nấm Bào tử nấm trắng, bào tử xuất hiện trắng, trịn, màu xanh bắt 4 màu xanh nhiều bào tử đều. Bào tử Đặc điểm đầu xuất hiện xuất hiện nấm màu bắt đầu xuất ở ngay điểm nhiều ở điểm xanh ở điểm hiện ở điểm cấy nhƣng ít. cấy. cấy và vùng cấy. gần điểm 64
Đồ án tốt nghiệp cấy. Đƣờng kính 2,6 ± 0,4 3,2 ± 0,6 3,6 ± 1,3 3,3 ± 0,8 Nấm tiếp tục Nấm tiếp tục Nấm tiếp tục Nấm tiếp tục phát triển. phát triển. phát triển. phát triển. 5 Đặc điểm Bào tử nấm Bào tử nấm Bào tử nấm Bào tử nấm xuất hiện xuất hiện xuất hiện xuất hiện nhiều hơn. nhiều hơn. nhiều hơn. nhiều hơn. Đƣờng kính 2,9 ± 0,4 3,6 ± 0,7 3,8 ± 1,5 3,7 ± 1,1 Nấm cĩ phát Nấm cĩ phát 6 Nấm cĩ phát Nấm cĩ phát Đặc điểm triển nhƣng triển nhƣng triển nhƣng ít triển nhƣng ít ít ít. Đƣờng kính 3,2 ± 0,6 3,9 ± 0,8 4,2 ± 1,2 4,1 ± 1,3 Nấm khơng Nấm phát phát triển triển nhiều hơn, bào tử Nấm cĩ phát hơn, bào tử Nấm khơng 7 Đặc điểm nấm cĩ xuất triển hơn nấm màu phát triển hiện nhiều nhƣng rất ít. xanh cũng nhiều. hơn nhƣng rất xuất hiện ít. nhiều hơn. Bảng 3.7.Khả năng phát triển của Aspergillus sp.X2 trên 4 mơi trƣờng nuơi cấy MRS cổ điển MRS 1 MRS 2 MRS 3 65
Đồ án tốt nghiệp Trong đĩ : MRS 1: bỏ natri acetate MRS 2: bỏ citrate amon MRS 3: bỏ natri acetate và bỏ citrate amon 4,5 4 3,5 3 2,5 MRS cổ điển 2 MRS 1 1,5 1 MRS 2 0,5 MRS 3 0 Đƣờng kính trung bình (cm) bình kínhtrung Đƣờng Thời gian (ngày) Hình 3.7. Đƣờng kính trung bình (cm) của nấm Aspergillus sp.X2 giữa 4 mơi trƣờng trong 7 ngày nuơi cấy Kết quả từ bảng 3.6 và 3.7 và hình 3.7cho thấy: Nhìn chung nấm Aspergillus niger sp.X2 chậm phát triển trên cả 4 mơi trƣờng MRS. Ngày thứ nhất, nấm chƣa phát triển trên cả 4 mơi trƣờng. Ngày thứ 2, nấm Aspergillus sp.X2 phát triển đồng đều nhau trên 4 mơi trƣờng. Các ngày sau đĩ từ ngày 3 – 7 nấm phát triển trên mơi trƣờng MRS 2 (loại bỏ citrate amon) tốt hơn so với các mơi trƣờng cịn lại. Bào tử nấm bắt đầu xuất hiện cùng lúc trên cả 4 mơi trƣờng vào ngày thứ 4. Tuy nhiên bào tử nấm trên mơi trƣờng MRS 2 xuất hiện và phát triển nhanh hơn so với các mơi trƣờng cịn lại với đƣờng kính đạt từ 3,2 cm – 4,2 cm từ ngày 4 -7. Với loại nấm này, chúng tơi chọn mơi trƣờng MRS 2 (loại bỏ citrate amon) để tiến hành khảo sát. 66
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.8.Đƣờng kính (cm) và đặc điểm nấm Aspergillus niger sp.Đ1 trên 4 mơi trƣờng MRS cổ điển, MRS (1), MRS (2), MRS (3) Đặc điểm và Mơi trƣờng Ngày đƣờng kính MRS cổ MRS 1 MRS 2 MRS 3 (cm) điển Chƣa phát Chƣa phát Chƣa phát Chƣa phát 1 triển triển triển triển Đƣờng kính 2,5 ± 0,1 2,1 ± 0,3 2,5 ± 0,2 2,4 ± 0,3 Sợi nấm Sợi nấm Sợi nấm 2 trắng, mọc trắng, mọc trắng, mọc Sợi nấm Đặc điểm dày ở điểm dày ở điểm dày ở điểm trắng. cấy cấy cấy Đƣờng kính 3,1 ± 0,8 2,3 ± 0,2 3,4 ± 0,2 2,8 ± 0,1 Nấm cĩ phát Nấm cĩ phát Nấm cĩ phát Nấm cĩ phát 3 triển, bào tử triển, bào tử triển, bào tử triển, bào tử Đặc điểm nấm chƣa nấm chƣa nấm chƣa nấm chƣa xuất hiện xuất hiện xuất hiện xuất hiện Đƣờng kính 3,9 ± 1,8 2,4 ± 0,1 4,3 ± 0,5 3,2 ± 0,5 Nấm cĩ sự Nấm cĩ phát Nấm phát Nấm cĩ phát phát triển. triển nhƣng triển khá triển nhƣng 4 Đặc điểm Bào tử nấm rất ít, bào tử nhanh, bào tử rất ít, bào tử màu nâu bắt nấm chƣa nấm bắt đầu nấm chƣa đầu xuất hiện xuất hiện xuất hiện xuất hiện Đƣờng kính 4,5 ± 2,5 2,5 ± 0,2 4,7 ± 0,7 3,3 ± 0,3 Nấm tiếp tục Nấm tiếp tục Nấm tiếp tục Nấm cĩ phát 5 Đặc điểm phát triển. phát triển. phát triển. triển nhƣng Bào tử nấm Bào tử nấm Bào tử nấm rất ít, bào tử 67
Đồ án tốt nghiệp xuất hiện xuất hiện xuất hiện nấm chƣa nhiều hơn nhiều hơn nhiều hơn xuất hiện Đƣờng kính 5,1 ± 3,3 2,6 ± 0,4 5,6 ± 0,4 3,4 ± 0,1 Nấm phát Nấm cĩ phát Nấm tiếp tục Nấm cĩ phát triển nhanh. triển nhƣng phát triển. triển nhƣng 6 Đặc điểm Bào tử nấm rất ít. Bào tử Bào tử nấm rất ít, bào tử xuất hiện nấm chƣa xuất hiện nấm chƣa nhiều hơn xuất hiện nhiều hơn xuất hiện Đƣờng kính 5,5 ± 3,7 2,6 ± 0,4 7,4 ± 1,0 3,5 ± 0,0 Nấm phát Nấm phát Nấm cĩ phát Nấm phát triển nhƣng triển nhanh. triển nhƣng triển tốt. Bào rất ít. Bào tử 7 Đặc điểm Bào tử nấm rất ít. Bào tử tử nấm màu nấm màu nâu xuất hiện nấm chƣa nâu xuất hiện bắt đầu xuất nhiều xuất hiện nhiều. hiện nhƣng rất ít Bảng 3.9.Khả năng phát triển của nấm Aspergillus sp.Đ1 trên 4 mơi trƣờng nuơi cấy MRS cổ điển MRS 1 MRS 2 MRS 3 Trong đĩ : MRS 1: bỏ natri acetate MRS 2: bỏ citrate amon MRS 3: bỏ natri acetate và bỏ citrate amon 68
Đồ án tốt nghiệp 8 7 6 5 4 MRS cổ điển 3 MRS 1 2 MRS 2 1 0 MRS 3 Đƣờng kính trung bình (cm) bình kínhtrung Đƣờng Thời gian (ngày) Hình 3.8. Đƣờng kính trung bình (cm) của nấm Aspergillus sp.Đ1 trên 4 mơi trƣờng trong 7 ngày nuơi cấy Kết quả từ bảng 3.8, 3.9 và hình 3.8 cho thấy: Nhìn chung, nấm Aspergillus sp.Đ1 chậm phát triển trên cả 4 mơi trƣờng MRS. Ngày thứ nhất nấm chƣa phát triển trên cả 4 mơi trƣờng. Vào ngày 2, nấm phát triển nhanh hơn trên mơi trƣờng MRS cổ điển và MRS 2 (bỏ citrate amon) và chậm phát triển trên mơi trƣờng MRS 1 (bỏ natri acetate). Từ ngày 3 -7, nấm phát triển nhanh trên mơi trƣờng MRS 2 rõ rệt hơn 3 mơi trƣờng cịn lại với đƣờng kính trung bình từ ngày 3 đến ngày 7 là 3,4 – 7,4 cm và thấp nhất ở mơi trƣờng MRS 1 (bỏ natriacetate) với đƣờng kính trung bình 2,3 – 2,6 cm. Bào tử nấm bắt đầu xuất hiện trên mơi trƣờng MRS cổ điển và MRS 2 vào ngày thứ 4. Nhìn chung ở mơi trƣờng MRS 2, nấm Aspergillus sp.Đ1 phát triển tốt hơn, bào tử nấm xuất hiện nhiều và nhanh hơn so với ba mơi trƣờng cịn lại. Với loại nấm này, chúng tơi chọn mơi trƣờng MRS 2 (loại bỏ citrate amon) để tiến hành khảo sát. Từ kết quả của ba loại nấm Mucor sp.B1, Aspergillus sp.X2 và Aspergillus sp.Đ1 cho thấy hai loại nấm thuộc chiAspergillus chậm phát triển trên 4 mơi trƣờng. Hầu nhƣ ngày thứ nhất vẫn chƣa phát triển, trong khi đĩ, nấm Mucor sp.B1 phát triển tƣơng đối nhanh vào ngày một với đƣờng kính lớn nhất là 7,5 cm. Nhìn chung, ở mơi trƣờng MRS 2, bào tử nấm xuất hiện nhanh, và các loại loại nấm khảo sát 69
Đồ án tốt nghiệp phát triển tốt hơn trên mơi trƣờng MRS 2 (bỏ citrate amon) so với ba mơi trƣờng cịn lại là MRS cổ điển, MRS 1 (bỏ natri acetate) và MRS 3 (bỏ natri acetate và citrate amon). Từ kết quả của mục 3.2.1 và 3.2.2 ta loại đƣợc mơi trƣờng MRS 3 (bỏ natri acetate và citrate amon) vì sinh khối vi khuẩn lactic thấp và nấm phát triển chậm trên mơi trƣờng này. Mơi trƣờng MRS 2 (bỏ citrate amon) sinh khối vi khuẩn lactic đạt tốt nhất và nấm phát triển nhanh hơn so với hai mơi trƣờng cịn lại là MRS cổ điển và MRS 1 (bỏ natri acetate). Do đĩ, chúng tơi chọn mơi trƣờng MRS 2 (bỏ citrate amon) là mơi trƣờng MRS cải tiến đáp ứng yêu cầu cho thử nghiệm hoạt tính kháng nấm là sinh khối vi khuẩn lactic đạt cực đại và thành phần mơi trƣờng khơng làm ảnh hƣởng đến khả năng phát triển của nấm mốc. 3.3 Khảo sát khả năng kháng Aspergillus niger của chủng vi khuẩn lactic Chủng vi khuẩn lactic đƣợc tuyển chọn là chủng Lactobacillus sp.L5 Chủng vi khuẩn lactic từ lâu đƣợc biết đến với khả năng kháng nấm, LAB cĩ thể sản xuất một số chất kháng sinh (ví dụ nhƣ acid lactic, acid acetic và reuterin) để ức chế sự tăng trƣởng của nấm hƣ hỏng trong các sản phẩm thực phẩm và thức ăn.Nghiên cứu về tiềm năng kháng nấm của LAB đã xác định đƣợc một số hợp chất cĩ tác dụng ức chế chống lại nấm mốc khác nhau và các lồi nấm men. Thí nghiệm này nhằm đánh giá khả năng kháng nấm Aspergillus niger của vi khuẩn lactic Lactobacillus sp.L5. Kết quả quan sát khả năng mọc của nấm Aspergillus niger ở 20 lần pha lỗng đƣợc trình bày trong bảng 3.10. 70
Đồ án tốt nghiệp a) b) Hình 3.9. Khả năng ức chế nấm Aspergillus niger của chủng Lactobacillus khi khơng pha lỗng a) Mẫu đối chứng: Nấm Aspergillus niger mọc đầy đĩa petri b) Mẫu thí nghiệm: Nấm Aspergillus niger bị ức chế bởi chủng vi khuẩn lactic Bảng 3.10.Tỉ lệ ức chế cực đại của vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 Mật độ tế bào Ngày Độ pha lỗng (cfu/ml) 1 2 Khơng phalỗng 39,45×107 86,67a ± 11,55 2 lần 18,27×107 86,67a ± 23,09 3 lần 11,55×107 77,08abc ± 4,33 4 lần 9,44×107 85,16a ± 1,56 5 lần 7,71×107 85,94a ± 8,36 6 lần 7,09×107 69,18abcd ± 11,24 7 lần 6,33×107 80,95ab ± 32,99 8 lần 5,57×107 59,36cde ± 7,57 9 lần 4,68×107 50,36de ± 9,89 10 lần 3,97×107 65,43bcde ± 4,12 11 lần 3,51×107 54,48de ±7,56 12 lần 3,15×107 48,63e ± 10,44 13 lần 2,99×107 47,52e ± 7,98 71
Đồ án tốt nghiệp 14 lần 2,65×107 51,54de ± 4,34 15 lần 2,20×107 48,89e ± 1,92 16 lần 1,97×107 57,70de ± 7,46 17 lần 1,79×107 63,07bcde ± 7,63 18 lần 1,74×107 63,54bcde ± 11,35 19 lần 1,57×107 54,51de ± 10,41 20 lần 1,44×107 60,53cde ± 0,48 Các chữ cái đánh dấu sự sai khác cĩ ý nghĩa thống kê với mức ý nghĩa 0,05. Sau khi xử lí số liệu trân Statgraphics cho thấy ở ngày thứ 1 và 2 cho tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus niger tốt nhất. Độ pha lỗng cho tỉ lệ ức chế tốt nhất là khơng pha lỗng, 2, 3, 4, 5. 6 và 7 lần pha lỗng. Sinh khối thu đƣợc cho vào đƣờng chuẩn tế bào Lactobacillus spp. của nhĩm trƣớc với phƣơng trình đƣờng chuẩn là y = 8,652x – 0,295. Với x = OD 610nm, y là mật độ tế bào × 107 cfu/ml. 120% ab a kpl a 2 lần 100% a a 3 lần abc abcd 80% bcde 4 lần bcde bcde cde cde de de de de e 5 lần 60% e de e 6 lần 40% 7 lần 8 lần Tỉ lệ lệ cực chế ức Tỉ (%) đại 20% 9 lần 0% Độ pha lỗng (lần) 10 lần Hình 3.10.Tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus niger của chủng Lactobacillus sp.L5 từ 1 đến 20 lần pha lỗng (kpl: khơng pha lỗng) Chú thích: tỉ lệ ức chế trung bình của nghiệm thức 8 – 20 lần pha lỗng. 72