Đồ án Tối ưu hóa các cặp mồi microsatellite trong phân tích đa dạng di truyền cá tra (Pangasianodon hypophthamus)

76 trang thiennha21 12/04/2022 4100

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Tối ưu hóa các cặp mồi microsatellite trong phân tích đa dạng di truyền cá tra (Pangasianodon hypophthamus)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_toi_uu_hoa_cac_cap_moi_microsatellite_trong_phan_tich.pdf

Nội dung text: Đồ án Tối ưu hóa các cặp mồi microsatellite trong phân tích đa dạng di truyền cá tra (Pangasianodon hypophthamus)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP TỐI ƯU HÓA CÁC CẶP MỒI MICROSATELLITE TRONG PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthamus) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : BÙI THỊ LIÊN HÀ Sinh viên thực hiện : TẠ THANH THẾ MSSV: 1151110518 Lớp: 11DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2015
Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, hình ảnh và kết quả trong luận văn là trung thực. Nếu có bất kỳ sự gian dối nào, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. TP. HCM, ngày tháng năm 2015 Sinh viên, Tạ Thanh Thế iii
Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến quý thầy cô trong Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường đã tận tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho em trong những năm học qua. Những kiến thức mà em nhận được trên giảng đường đại học không chỉ là nền tảng cho quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp này mà còn là hành trang quý báu giúp em vững bước trong tương lai. Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II và Ths. Bùi Thị Liên Hà đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm và tạo điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp. Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn đến chị Lê Ngọc Thùy Trang cùng các bạn sinh viên tại phòng thí nghiệm Di Truyền Phân Tử đã nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ và động viên em trong suốt thời gian qua. Đồng thời, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến những người bạn đã là chỗ dựa vững chắc và cùng sát cánh bên nhau trong suốt những năm học qua. Cuối cùng, con gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến ba mẹ đã động viên và giúp đỡ con vượt qua những khó khăn trong cuộc sống và trong quá trình học tập. TP. HCM, ngày tháng năm 2015 Sinh viên, Tạ Thanh Thế iv
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ix DANH MỤC CÁC BẢNG xi DANH MỤC CÁC HÌNH xii MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Giới thiệu về cá Tra (Pangasianodon hypophthamus) 3 1.1.1. Hệ thống phân loại 3 1.1.2. Đặc điểm hình thái 4 1.1.3. Đặc điểm phân bố và sinh thái 6 1.1.3.1. Đặc điểm phân bố 6 1.1.3.2. Đặc điểm sinh sản 7 1.2. Tình hình chọn giống cá tra tại đồng bằng sông Cửu Long 8 1.2.1. Tình hình nuôi cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long 8 1.2.2. Tình hình chất lượng con giống cá Tra ở đồng bằng sông Cửu Long 8 1.2.3. Một số chương trình nghiên cứu liên quan đến cá tra 9 1.3. Ứng dụng di truyền phân tử vào trong chọn giống 10 1.3.1. Phân loại 10 1.3.2. RestrictionFragment Length Polymorphism (RFLP) 11 1.3.3. Amplifíed Fragment Length Polymorphism (AFLP) 12 v
Đồ án tốt nghiệp 1.3.4. Kỹ thuật RAPD (Random Amplifíed Polymorphism DNA) 13 1.3.5. Microsatellite (SSR) 13 1.4. Chỉ thị Microsatellite trong nghiên cứu đa dạng di truyền 14 1.4.1. Khái niệm về Microsatellite 14 1.4.2. Tính chất 15 1.4.3. Sự phát triển của primer Microsatellite 16 1.4.4. Giới hạn của Microsatellite 16 1.4.5. Các loại Microsatellite 18 1.4.6. Cơ chế hình thành microsatellite 18 1.4.7. Nguyên tắc phát hiện microsatellite bằng mồi microsatellite 19 1.4.8. Ưu và nhược điểm cùa microsatellite 21 1.4.8.1. Ưu điểm 21 1.4.8.2. Nhược điểm 21 1.4.9. Vai trò của microsatellite 22 1.4.10. Ứng dụng của microsatellite 23 CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 24 2.2. Vật liệu nghiên cứu 24 2.2.1. Nguồn mẫu 24 2.2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 24 2.2.2.1. Mồi 24 2.2.2.2. Thang 25 2.2.2.3. Các hóa chất sử dụng trong tách chiết DNA 26 2.2.2.4. Hóa chất sử dụng trong PCR 26 vi
Đồ án tốt nghiệp 2.2.2.5. Hóa chất sử dụng trong điện di agarose 27 2.2.2.6. Dụng cụ và thiết bị 27 2.3. Phương pháp nghiên cứu 27 2.3.1. Phương pháp thu và bảo quản mẫu 27 2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA 28 2.3.2.1. Quy trình 28 2.3.2.2. Điện di kiểm tra sản phẩm DNA tách chiết 28 2.3.3. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 29 2.3.3.1. Khái niệm 29 2.3.3.2. Nguyên tắc của phản ứng PCR 29 2.3.3.3. Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR 31 2.3.3.4. Ưu nhược điểm của phản ứng PCR 33 2.3.3.5. Ứng dụng 33 2.3.4. Phương pháp điện di trên gel agarose 33 2.3.4.1. Nguyên tắc 34 2.3.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng 35 2.4. Bố trí thí nghiệm 37 2.4.1. Thí nghiệm 1: tách chiết DNA 38 2.4.1.1. Tách chiết DNA 38 2.4.1.2. Kiểm tra DNA tách chiết 38 2.4.2. Thí nghiệm 2: tối ưu hóa phản ứng PCR 39 2.4.2.1. Thí nghiệm 2.1: khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite 39 2.4.2.2. Thí nghiệm 2.2: khảo sát nồng độ MgCl2 42 vii
Đồ án tốt nghiệp 2.4.2.3. Thí nghiệm 2.3: khảo sát nồng độ Taq DNA polymerase 42 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite. 43 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1. Kết quả tách chiết DNA 45 3.2. Kết quả tối ưu hóa phản ứng PCR 46 3.2.1. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite 46 3.2.2. Khảo sát nồng độ MgCl2 53 3.2.3. Khảo sát nồng độ Taq DNA polymerase 57 3.3. Khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite 58 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 60 4.1. Kết luận 60 4.2. Đề nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 viii
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT µg : Microgram µl : Microlite µM : Micromol/lite mM : Milimolar (milimol/lite) AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism ALP : Amplicon Length Polymorphism AP-PCR : Arbitrary Primer-PCR bp : Base pair DAF : DNA Amplification Fingerprinting DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate EBV : Estimated Breeding Value EDTA : Ethylene diamine tetraacetic acid g : Gram ha : Hecta kb : kilobases kg : Kilogram M : Ladder DNA mA : Miliampe mM : Milimolar (milimol/lite) nu : Nucleotide PCR : Polymerase chain reaction RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA RE : Restriction enzyme RFLP : RestrictionFragment Length Polymorphism SDS : Sodium Dodecyl Sulphate SNP : Single Nucleotide Polymorphism SSCP : Single Strand Conformation Polymorphism ix
Đồ án tốt nghiệp SSR : Simple Sequence Repeat (Microsatellite) STR : short tandem repeats STS : Sequence-Taqged Sites Ta : Annealing temperature Taq DNA polymerase: Thermos aquaticus DNA polymerase TBE : Tris Borate EDTA UV : Ultra Violet - tia cực tím V : Vôn VNTR : Variable Number Tamdem Repeat x
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Các loại marker DNA (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005). 11 Bảng 2.1. Thông tin 16 cặp mồi microsatellite dùng trong nghiên cứu. 24 Bảng 2.2. Các thông số điện di DNA bằng gel agarose. 36 Bảng 2.3. Gradient nhiệt độ lai cho 16 cặp mồi microsatellite. 40 Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của các mồi CB12, CB13, CB14, CB15, CB18, CB19. 40 Bảng 2.5. Chu trình nhiệt của mồi Pg –13, PSP – G565, PSP – G579, PSP – G593. 41 Bảng 2.6. Chu trình nhiệt của mồi Ph–7, Ph–9, Ph–21, Ph–25. 41 Bảng 2.7. Chu trình nhiệt của mồi Phy01, Phy03. 41 Bảng 2.8. Nồng độ MgCl2 khảo sát cho từng cặp mồi microsatellite. 42 Bảng 2.9. Nồng độ Taq DNA polymerase khảo sát. 42 Bảng 2.10. Thành phần buffer, dNTP, cặp mồi Microsatellite (Primer), DNA, Taq polymerase cho một phản ứng PCR. 43 Bảng 3.1. Nhiệt độ bắt cặp của các mồi sau khảo sát nhiệt độ tối ưu. 52 Bảng 3.2. Bảng kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 của 12 cặp mồi. 56 xi
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1.Cấu tạo răng vòm miệng của cá Tra nuôi (Roberts và Vidthayanon, 1991). 5 Hình 1.2. Cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus). 5 Hình 1.3. 2 đôi râu ở cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus); 1 đôi râu mép dài; 1 đôi râu hàm dưới ngắn. 5 Hình 1.4. Vị trí và hình dạng bong bóng khí của cá Tra. 6 Hình 1.5. Cấu tạo bong bóng khí của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) 6 Hình 1.6. Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân. 18 Hình 1.7. Cơ chế trượt lỗi trong quá trình sao mã. 19 Hình 1.8. Phát hiện microsatellite từ DNA tổng số. 20 Hình 1.9.Vùng flanking (vùng sườn) ở 2 bên trình tự microsatellite. 20 Hình 2.1. Thang chuẩn 100 bp. 26 Hình 2.2. Quy trình tách chiết DNA Salt extraction (Miller và ctv, 1988). 28 Hình 2.3. Các bước cơ bản của phàn ứng PCR. 30 Hình 2.4. Sơ đồ minh họa các bước trong quá trình điện di agarose gel. 35 Hình 2.5. Kết quả điện di với plasmid mạch vòng bên trái và plasmid cùng loại mạch thẳng ở bên phải. 36 Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm. 37 Hình 2.7. Chu trình nhiệt của máy PCR sau khi tối ưu nhiệt độ bắt cặp mồi microsatellite. 44 Hình 3.1. Kết quả tách chiết DNA 15 mẫu vây đuôi cá tra ngẫu nhiên cho 4 quần đàn G2–2001, G2–2002 , G2–2003, G3–2001. 45 Hình 3.2. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB12 46 Hình 3.3. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB13 47 Hình 3.4. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB14 47 Hình 3.5. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB15 48 Hình 3.6. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB18 48 xii
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.7. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB19 49 Hình 3.8. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi Phy01. 50 Hình 3.9. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi Phy03. 50 Hình 3.10. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi Ph–7. 51 Hình 3.11. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi Ph–21. 51 Hình 3.12. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi PSP–G579. 52 Hình 3.13. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi Pg–13. 52 Hình 3.14. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi CB14. 54 Hình 3.15.Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi CB15. 54 Hình 3.16. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi CB12. 55 Hình 3.17. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi CB13. 55 Hình 3.18. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi CB18. 55 Hình 3.19. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi CB19 55 Hình 3.20. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi Phy01. 55 Hình 3.21. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi Phy03. 56 Hình 3.22. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi Ph-7. 56 Hình 3.23. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi Ph-21. 56 Hình 3.24. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi PSP-G579. 56 Hình 3.25. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi Pg–13. 56 Hình 3.26. Kết quả điện di thay đổi nồng độ Taq DNA polymerase trên gel Agarose 2,5 % 57 Hình 3.27. Sản phẩm khuếch đại của mồi CB19 trên 12 mẫu cá tra. 59 Hình 3.28. Hình kiểm tra đa hình sản phẩm khuếch đại của các mồi CB13, CB14, CB18, CB19, Pg-13, Ph-7 trên 4 mẫu cá tra. 59 xiii
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Việt Nam đang là một trong năm nước đứng đầu thế giới về sản lượng nuôi trồng thủy sản. Sau nghề nuôi tôm thì nghề nuôi cá tra là một trong những nghề phát triển mạnh nhất trong thời gian qua ở vùng đồng bằng sông Cửu Long. Cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) là loài cá nước ngọt bản địa của Việt Nam và được biết phổ biến như là một biểu tượng thương mại của ngành nuôi trồng thủy sản nói riêng, đóng vai trò chủ chốt trong kim ngạch xuất khẩu thủy sản của Việt Nam. Hiện nay, nghề nuôi cá Tra sản xuất ngày càng phát triển và mở rộng dẫn đến nhu cầu con giống cá Tra càng tăng cao. Tuy nhiên, việc sản xuất và cung ứng giống cá tra tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long chủ yếu do người dân tự phát, tự cân đối nên chưa có sự phát triển đồng bộ giữa số lượng cũng như chất lượng con giống. Chất lượng con giống có chiều hướng suy giảm trong những năm trở lại đây với những biểu hiện như tỷ lệ dị hình cao, chậm lớn, dễ nhiễm bệnh và tỷ lệ sống thấp. Giá cá bột không có sự khác biệt giữa cá có cải thiện di truyền và cá tại địa phương. Từ đó ảnh hưởng tới vệc nuôi trồng và sản xuất của các hộ nuôi cá tra thương phẩm cũng như ảnh hưởng tới việc xuất khầu cá tra ra thị trường nước ngoài. Trước tình hình như vậy bên cạnh việc ban hành các thông tư và nghị định về nuôi chế biến và sản xuất cá tra thì hỗ trợ những trang thiết bị, máy móc cần thiết để phục vụ cho công tác kiểm soát chất lượng con giống, kiểm soát môi trường nuôi, đào tạo nghiệp vụ cho các cơ quan quản lý địa phương nhằm chủ động hơn trong nhiệm vụ quản lý cá tra giống là việc rất cần thiết. Với ý nghĩa thực tiễn và ý nghĩa khoa học như vậy, chúng tôi tiến hành thực hiền đề tài “Tối ưu hóa các cặp mồi microsatellite trong phân tích đa dạng di truyền cá Tra (Pangasianodon hypophthamus)”. Nghiên cứu này được hy vọng sẽ tạo tiền đề cho nghiên cứu tiếp theo trong việc phân tích đa dạng di truyền cá Tra 1
Đồ án tốt nghiệp nhằm góp phần vực dậy chất lượng con giống tra, nâng cao năng suất, tạo ra những sản phẩm có chất lượng đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường trong và ngoài nước. Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí Ngiệm Di Truyền Phân Tử, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. 2. Mục tiêu nghiên cứu Tối ưu hóa và tuyển chọn các cặp mồi microsatellite có tính đa hình cao từ 16 cặp mồi microsatellite. 3. Nội dung nghiên cứu Tách chiết DNA mẫu cá Tra từ 4 quần đàn khác nhau. Tối ưu hóa phản ứng PCR. Khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite. 2
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cá Tra (Pangasianodon hypophthamus) Bộ Siluriformes gồm có 36 họ, 477 giống, 3088 loài cá phân bố rộng khắp trên toàn thế giới. Trong 36 họ cá đã nêu có một số họ cá có giá trị kinh tế được nuôi và khai thác phổ biến như các họ: Ariidae (cá Úc), Bagridae (cá Chốt), Clariidae (cá Trê), Ictaluriidae (cá Nheo), Pangasiidae (cá Trơn), Plotosidae (cá Ngát), Silurudae (cá Leo) và Sisoridae (cá Chiên) (Carl và ctv, 2007). Cá Tra là loài cá kinh tế phổ biến ở khu vực châu Á và là một trong 30 loài cá thuộc họ Pangasiidae ( Pangasiidae được phát hiện đầu tiên trong thủy vực nước ngọt ở các quốc gia phụ cận khu vực hạ lưu của Ấn Độ Dương; sự đa dạng thành phần loài của họ cá này tập trung chủ yếu ở khu vực Đông Nam châu Á (Roberts và Vithayanon, 1991). Cá Tra có nguồn gốc từ Cambodia, Lào, Thái Lan và Việt Nam (www.fishbase.org). Ngoài ra, cá Tra còn được đưa vào nuôi rộng rãi khắp các nước Đông Nam Á. Kiến thức về sinh học và sinh thái học của loài này trong tự nhiên còn hạn chế (Hung và ctv, 2003). Cá Tra có tính ăn tạp và thức ăn chủ yếu là thực vật và một số loài động vật thân mềm (Vithayanon, 1993). Cá Tra phân bố tự nhiên ở vùng hạ lưu sông Mekong bao gồm các nước: Cambodia, Lào, Thái Lan, Việt Nam và chúng cũng được phát hiện ở sông Chao Praya – Thái Lan. 1.1.1. Hệ thống phân loại Theo hệ thống phân loại Roberts và Vidohayanon (1991) cá Tra thuộc : Giới: Animalia Linnaeus Ngành: Chordata Bateson Ngành phụ: Vertebrata Cuvier Tổng lớp: Osteichthyes Huxley Lớp: Actinopterygii Huxley Lớp phụ: Neopterygii Infraclass: Teleostei 3
Đồ án tốt nghiệp Tổng bộ: Ostaryphysi Bộ: Siluriformes Họ: Pangasiidae Bleeker Giống (chi): Pangasius Loài: Pangasius hypophthalmus Các đồng danh của loài cá Tra : Helicophagus hypophthalmus Pangasianodon hypophthalmus Pangasius hypophthalmus Pangasius pangasius Pangasius pleurotaenia Pangasius sutchi Tên loài Pangasianodon hypophthalmus được Rainboth sử dụng lần đầu vào năm 1996 để chỉ định cho loài cá Tra và sau đó được nhiều tác giả khác sử dụng phổ biến đến nay. Tuy nhiên tên khoa học Pangasius sutchi thì không còn sử dụng nữa. Tên đặt cho loài này khác nhau theo các nước trong vùng nó phân bố. Ở Campuchia là Trey pra (tên Khmer), Lào là Pa souay kheo, Pa suay, Thái là Pla saa wha, Pla suey và Việt Nam là Cá Tra (Nguyễn Văn Thường, 2008). 1.1.2. Đặc điểm hình thái Theo Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương (1993) cá Tra được mô tả như sau: Đầu rộng, dẹp bằng. Mõm ngắn, nhìn từ trên xuống chót mõm tròn. Miệng trước, rộng ngang, không co duỗi được có dạng hình vòng cung và nằm trên mặt phẳng ngang. Răng nhỏ mịn, răng vòm miệng chia thành 4 đám nhỏ, mỏng, nằm trên đường vòng cung, đôi khi bị che lấp bởi nếp da vòm miệng (Hình 1.1). 4
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.1.Cấu tạo răng vòm miệng của cá Tra nuôi (Roberts và Vidthayanon, 1991). Lỗ mũi sau gần lỗ mũi trước hơn mắt và nằm trên đường thẳng kẻ từ lỗ mũi trước đến cạnh trên của mắt. Có hai đôi râu, râu mép kéo dài chưa chạm đến gốc vi ngực, râu cằm ngắn hơn. Thân thon dài, phần sau dẹp bên. Đường bên hoàn toàn và phân nhánh, bắt đầu từ mép trên của lỗ mang đến điểm giữa gốc vi đuôi. Mặt sau của vi lưng, vi ngực có răng cưa hướng xuống gốc vi. Vi bụng kéo dài chưa chạm đến khởi điểm của gốc vi hậu môn. Hình 1.2. Cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus). Hình 1.3. 2 đôi râu ở cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus); 1 đôi râu mép dài; 1 đôi râu hàm dưới ngắn. 5
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.4. Vị trí và hình dạng bong bóng khí của cá Tra. Hình 1.5. Cấu tạo bong bóng khí của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus). 1.1.3. Đặc điểm phân bố và sinh thái 1.1.3.1. Đặc điểm phân bố Vùng phân bố tự nhiên của cá Tra giới hạn trong hạ lưu sông Mekong, bao gồm Cambodia, Lào, Thái Lan và Việt Nam, kể cả sông Chao Praya ở Thái Lan (Roberts và Vidthayanon, 1991; Poulsen và ctv, 2004). Theo Nguyễn Thị Thu Thủy (2009) có ít nhất hai quần thể lớn khác nhau được tìm thấy ở khu vực hạ lưu sông Mekong: Một quần thể ở khu thượng nguồn sông Mekong (Thái Lan, Lào). Quần thể này có thể mở rộng từ cửa sông Loei đi ngược lên biên giới Myanmar và Trung Quốc. 6
Đồ án tốt nghiệp Quần thể hạ nguồn là quần thể trội hơn, và chiếm ưu thế trong khắp khu vực phân bố của chúng, kéo dài từ đồng bằng sông Mekong ở Việt Nam, trong hệ thống hồ lớn Campuchia và ngược lên Khone Falls (Campuchia). Cũng có thể có một quần thể nhỏ hơn ở khu vục sông Xe Bang Fai và sông Songkhram. Quần thể này có thể trùng lặp một phần với quần thể nói trên do sự di cư chậm về phương diện không gian lẫn di truyền. 1.1.3.2. Đặc điểm sinh sản Cá Tra là loài cá di cư sinh sản, ngược dòng Mekong từ một vùng chưa rõ vào tháng 5 – 7 và quay lại dòng chính khi nước sông đổ về dâng ngập vào tháng 9 – 12. Ở phía Nam thác Khône, sự di cư ngược dòng của cá Tra xảy ra từ tháng 10 – 2 năm sau, cao điểm vào tháng 11 – 12. Sự di cư này xảy ra khi nước rút và xuất hiện rải rác theo sau đó là các hoạt động di cư theo chiều ngang của cá từ các vùng ngập nước trở về dòng Mekong vào cuối thới kỳ mùa lũ. Hoạt động di cư xuôi dòng của cá xảy ra vào tháng 5 – 8 từ Stung Treng đến Kandal ở Cambodia và sau đó đến hạ lưu sông Mekong ở Việt Nam. Trứng cá xuất hiện vào tháng 3 – 8 từ Stung Treng đến Kandal, cho thấy rằng sự di cư xuôi dòng của cá bao gồm cả hai hoạt động: di cư sinh sản và di cư dinh dưỡng và cuối cùng cá di chuyển đến các cánh đồng ngập nước ở Cambodia và Việt Nam trong mùa lũ. Ở Việt Nam, cá Tra thuộc đàn cá hạ lưu, phân bố rộng khắp trên sông Tiền và sông Hậu. Vào mùa mưa (tháng 5 – 6) cá Tra bột trôi theo dòng nước từ bãi đẻ ở đoạn giữa Kra – chê và thác Khône. Khi chúng đến biên giới giữa Cambodia và Việt Nam, cá sẽ dạt vào các vùng ngập nước ở đây. Sông Tonle Sap chảy theo chiều nguợc lại giúp cho cá bột có thể đi sâu vào vùng ngập thuộc hệ thống này. Sức sinh sản của cá tra là 120.000 – 145.700 trứng/kg cá cái (Huỳnh Quốc Khanh, 2009). 7
Đồ án tốt nghiệp 1.2. Tình hình chọn giống cá tra tại đồng bằng sông Cửu Long 1.2.1. Tình hình nuôi cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long Việt Nam đang là một trong năm nước đứng đầu thế giới về sản lượng nuôi trồng thủy sản. Sau nghề nuôi tôm thì nghề nuôi cá tra là một trong những nghề phát triển mạnh nhất trong thời gian qua ở vùng đồng bằng sông Cửu Long. Đây là loài cá nước ngọt bản địa của Việt Nam thường được nuôi trong ao hoặc trong lồng bè và xu hướng hiện nay chủ yếu là nuôi trong ao. Theo Tổng cục Thủy sản: ước tính tổng diện tích thả nuôi cá tra tháng 1/2015 là 1.701 ha, tăng nhẹ 3,5 % so với cùng kì năm 2014. Trong đó tỉnh Đồng Tháp có diện tích nuôi cá tra đạt 1.072 ha chiếm 63% diện tích nuôi cá tra, tăng 10,7% so với năm 2014. Sản lượng thu hoạch lũy kế tính ước tính đạt 73 nghìn tấn, năng suất bình quân đạt 300 tấn/ha, tăng 1,6 lần so với năng suất bình quân năm 2014, trong đó tỉnh Đồng Tháp có năng suất cao nhất đạt 410 tấn/ha và năng suất thấp nhất của Bến Tre đạt 205,2 tấn/ha. Đến đầu năm 2015, giá cá tra nguyên liệu tăng thêm 500 đồng/kg so với cuối tháng 12 năm 2014, phổ biến ở mức 24.000 – 25.000 đồng/kg tùy theo địa phương, doanh nghiệp và thời điểm. Sau khi trừ chi phí sản xuất, người nuôi có thể thu lãi từ 2.000 – 2.500 đồng/kg, tương đương lợi nhuận 600 – 900 triệu đồng/ha. Với mức giá này, khả năng diện tích nuôi cá tra thâm canh sẽ gia tăng trong thời gian tới. 1.2.2. Tình hình chất lượng con giống cá Tra ở đồng bằng sông Cửu Long Chất lượng cá tra giống là một trong những yếu tố quan trọng để nâng cao hiệu quả nghề nuôi cá tra thâm canh, từ đó góp phần phát triển bền vững nghề nuôi và chế biến cá tra xuất khẩu. Tuy nhiên, hiện nay cá tra giống vẫn chưa đạt yêu cầu về chất lượng mặc dù ngành chức năng các cấp đã có nhiều nỗ lực. Việc sản xuất và cung ứng giống cá tra tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long phần lớn do người dân tự phát, tự cân đối nên phát triển chưa đồng bộ giữa số lượng cũng như chất lượng. Chất lượng con giống có chiều hướng suy giảm trong những năm gần đây với những biểu hiện như tỷ lệ dị hình cao, chậm lớn, dễ nhiễm bệnh và tỷ lệ sống thấp. 8
Đồ án tốt nghiệp Năm 2014, cả nước có 230 cơ sở sản xuất giống cá tra, trên 4.000 hộ ương dưỡng cá giống trên diện tích 2.250 ha, sản xuất được hơn 2 tỷ con cá tra giống. Sản lượng cá tra giống tập trung nhiều nhất ở Đồng Tháp, An Giang, Cần Thơ, Tiền Giang. Tuy nhiên, tỷ lệ sống trong ương dưỡng khá thấp, tỷ lệ ương từ cá bột lên cá hương chỉ đạt 20 – 24 % và từ cá hương lên cá giống trung bình chỉ 21 % ( 1.2.3. Một số chương trình nghiên cứu liên quan đến cá tra Chương trình nghiên cứu sinh sản nhân tạo cá tra được bắt đầu từ năm 1978 với sự tham gia của nhiều Viện và trường Đại học trong khu vực (Đại học Nông Lâm, Viện NCNTTS II, Đại học Cần Thơ, tổ chức CIRAD (Pháp)). Thông qua sự tài trợ của SUFA_Bộ Thuỷ sản trong 5 năm (2001 – 2005), Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II đã thực hiện chương trình chọn giống về tính trạng tăng trưởng bằng phương pháp chọn lọc cá thể (2001 – 2004). Ba quần đàn gốc cho chọn giống năm 2001, 2002 (chọn theo tăng trưởng) và 2003 (chọn theo tỷ lệ philê) đã được hình thành. Hiệu quả của chọn lọc thực tế đã được tính toán trong năm 2006 – 2008. Các nghiên cứu thăm dò về sinh học phân tử nhằm đánh giá biến dị di truyền của cá tra cũng đã được tiến hành. Kỹ thuật microsatellite với 10 primer đặc hiệu cho cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long được phát triển bởi BIOTEC_Thái Lan để đánh giá biến dị cá đã được thực hiện trong năm 2004. Các primer đều cho kết quả đa hình, đặc biệt primer 10 cho kết quả đa hình rất cao. Kết quả này mở ra triển vọng sử dụng những primer để đánh giá biến dị di truyền và tìm ra chỉ thị liên kết với tính trạng có ý nghĩa về mặt kinh tế trên cá tra bằng kỹ thuật microsatellite. Đề tài ‘‘Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cá tra thương phẩm đạt tiêu chuẩn thịt trắng phục vụ xuất khẩu (2001 – 2003)”. Dự án sản xuất thử “Nuôi cá tra thâm canh đạt tiêu chuẩn xuất khẩu và giảm ô nhiễm môi trường” được thực hiện bởi Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II năm 2006 – 2007. 9
Đồ án tốt nghiệp Dự án ‘‘Thử nghiệm mô hình nuôi cá tra thương phẩm phục vụ xuất khẩu và hạn chế ô nhiễm môi trường, 2007 – 2008’’. Dự án “Xây dựng qui phạm thực hành nuôi cá tra tốt hơn (BMP) ở đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam” đã bắt đầu thực hiện từ năm 2007. 1.3. Ứng dụng di truyền phân tử vào trong chọn giống Di truyền phân tử là một lĩnh vực được quan tâm và được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu. Các kỹ thuật di truyền phân tử được sử dụng gồm các kỹ thuật về DNA, các kỹ thuật về tách dòng gene, về biểu hiện gene, về RNA và chủ yếu là RNA thông tin, về enzyme Các kỹ thuật về DNA hiện được sử dụng phổ biến là đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn (RestrictionFragment Lenth Polymorphism – RFLP) và các kỹ thuật dựa vào chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction – PCR) như: đa hình các đoạn DNA nhân ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphim DNA – RADP), đa hình độ dài các đoạn nhân chọn lọc (Amplified Frangment Length Polymorphism – AFLP), Microsatellite. 1.3.1. Phân loại Về bản chất, bất kỳ chuỗi mã DNA nào được dùng để phân biệt hai cá thể, hai dòng hoặc hai giống khác nhau đều có thể xem như một DNA marker. Những marker có tính chất như vậy rất cần thiết vì số lượng của chúng lớn hơn rất nhiều so với các marker hình thái, marker ở dạng protein (isoenzyme) (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005). Dựa vào kỹ thuật thực hiện các DNA marker có thể chia làm hai nhóm (Phạm Thành Hổ, 2005): Marker dựa trên cơ sở lai DNA: RFLP. Marker dựa trên sự khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR: ALP, AFLP, SSR, SSCP, RAPD. Dựa trên kiểu hình có thể chia DNA marker thành hai nhóm (Phạm Thành Hổ, 2005): 10
Đồ án tốt nghiệp Marker đồng trội: Những marker có thể phân biệt được cá thể đồng hợp tử và cá thể dị hợp tử. Bao gồm marker allozyme, Microsatellite, RFLP. Marker trội: Những marker không thể phân biệt những cá thể đồng hợp tử và dị hợp tử. Bao gồm RAPD, AFLP. Bảng 1.1. Các loại marker DNA (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005). Chỉ thị (marker) Tên đây đủ RAPD Random Amplified Polymorphic DNA AP-PCR Arbitrary Primer-PCR DAF DNA Amplification Fingerprinting AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism ALP Amplicon Length Polymorphism SSR Simple Sequence Repeat (Microsatellite) SSCP Single Strand Conformation Polymorphism RFLP RestrictionFragment Length Polymorphism SNP Single Nucleotide Polymorphism STS Sequence-Taqged Sites 1.3.2. RestrictionFragment Length Polymorphism (RFLP) Ngay từ klhi ra đời, RFLP một chỉ thị phân tử rất hữu dụng trong việc đánh giá đa dạng di truyền. RFLP được định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về kích thước các phân đoạn được tạo ra khi cắt DNA bằng các enzyme cắt giới hạn (Restriction enzyme – RE) khi có sự thay đổi trình tự trên DNA bộ nhân hoặc trong các bào quan khác (Wayne Powell và ctv,1996). Ngày nay, RFLP là kỹ thuật phân tích đa dạng di truyền được sử dụng phổ biến nhất. Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt 11
Đồ án tốt nghiệp giới hạn (RE) đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gene. DNA bộ gene sẽ được cắt bằng các enzyme cắt giới hạn, chạy điện di qua gel agarose, thấm qua màng lai và lai với một mẫu dò DNA (được đánh dấu phóng xạ) liên kết với một locus đặc biệt. Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau (Wayne Powell và ctv,1996). RFLP có ưu điểm là marker đồng trội cho phép phân biệt được cá thể đồng hợp và dị hợp. Do kích thước khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số lượng marker tạo ra nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu. Tuy nhiên do qui trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đối với sức khoẻ người nghiên cứu (do phải sử dụng phóng xạ đánh dấu), DNA yêu cầu có chất lượng cao đã làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật này. Cùng với sự phát triển kỹ thuật PCR, kỹ thuật RFLP trở nên đơn giản hơn. Một cặp mồi oligonucleotide có thể dùng khuếch đại một vùng DNA cần khảo sát, sau đó đoạn DNA được khuếch đại được cắt bằng các Restriction enzyme, điện di và phân tích trên gel nhuộm Ethidium bromide hoặc bạc. PCR – RFLP bỏ qua bước lai phóng xạ nên giá thành rẻ hơn và ít nguy hiểm hơn phương pháp RFLP. 1.3.3. Amplifíed Fragment Length Polymorphism (AFLP) AFLP được định nghĩa là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR. AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gene, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR. AFLP có thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng gene. Sự khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do những thay đổi của các base trong vùng trình tự mồi, hoặc thêm, mất đoạn ở giữa hai vị trí cắt ( Povvell và ctv, 1996; Winfield và ctv, 1998). Thông thường, trong AFLP sử dụng một cặp Restriction enzyme gồm một enzyme cắt thường xuyên và một enzyme cắt không thường xuyên. Enzyme cắt thường xuyên tạo ra những trình tự nhỏ và enzyme cắt không thường xuyên sẽ hạn chế số lượng các đoạn cắt. Cặp enzyme thường được dùng nhất là EcoRI – Msel. Sau khi cắt bằng cặp enzyme này, một trình tự nối mạch đôi (adaptor) sẽ được gắn vào hai đầu đoạn DNA cắt bằng enzyme ligase. Đoạn adaptor gồm 2 phần: phần 12
Đồ án tốt nghiệp trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme. Mồi của phản ứng PCR được thiết kế dựa trên trình tự adaptor và chứa một trình tự chọn lọc khoảng vài nucleotide. Chỉ những phân đoạn DNA nào chứa cả trình tự adaptor và trình tự nucleotide chọn lọc mới được khuếch đại, chính trình tự chọn lọc sẽ làm giảm sự xuất hiện sản phẩm PCR và làm đơn giản quá trình phân tích (Matthes và ctv, 1998; Karp và ctv, 1997). AFLP nhanh, không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được toàn bộ gene. Kỹ thuật này đòi hỏi ít lượng DNA ban đầu. Tuy nhiên, thông tin di truyền phải được biết rõ để chuẩn bị primer tương ứng, và AFLP là một marker trội, điều này làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp. 1.3.4. Kỹ thuật RAPD (Random Amplifíed Polymorphism DNA) Là phương pháp xác định sự đa hình về kích thước các đoạn DNA sau khi thực hiện PCR mẫu DNA thí nghiệm. Kỹ thuật cho phép phát hiện thể đa hình mà không cần biết trước thứ tự các nucleotide bằng cách dùng các primer tổng hợp, đơn, ngắn, dãy mã được thiết kế ngẫu nhiên để thực hiện PCR. Sau khi bắt cặp tại các vị trí chuyên biệt trên sợi DNA, primer tiến hành sự khuếch đại để tạo ra các đoạn có kích thước khác nhau, có khi lên tới 2 kb. Các đoạn với kích thước khác nhau được nhận biết bằng điện di. Một primer có thể tạo nên sự đa hình DNA giữa các cá thể và các đoạn đa hình có thể được dùng như những marker để xác định sự đa dạng di truyền. RAPD được xem như một phương pháp tạo sự đa hình DNA nhanh và hữu hiệu. Các bộ kit primer dùng cho RAPD đã được thương mại hóa trên thị trường và các primer cũng rất dễ được tổng hợp. Về trang thiết bị chỉ cần có máy PCR và hệ thống điện di. Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều kiện thí nghiệm, chương trình chạy PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hình cao (Harris, 1999). 1.3.5. Microsatellite (SSR) Rải rác ở những vị trí khác nhau trên bộ gene Eukaryote là những vùng có tính biến dị cao. Những vùng này có chứa các trình tự DNA gọi là VNTR (variable number tandem repeat) còn gọi là các tiểu vệ tinh. Các VNTR này đặc trưng bởi số 13
Đồ án tốt nghiệp lần lặp lại của trình tự lõi (đơn vị trình tự) DNA như: (AC)n, (AG)n, (AT)n, (TAT)n, (TCT)n, (CAG)n Do số lần lặp lại của mỗi microsatellite là khác nhau ở mỗi cá thể nên tính đa hình tạo ra khi sử dụng phương pháp này là rất cao. Dựa trên trình tự DNA, microsatellite được bảo tồn ở các cá thể cùng loài cho phép chúng ta thiết kế mồi để khuếch đại trình tự lặp lại trong toàn bộ kiểu gene, trình tự mồi sử dụng trình tự đặc hiệu ở hai đầu locus microsatellite. Kích thước các đoạn DNA được khuếch đại thường từ 100 – 200 bp. Kết quả tạo ra các đoạn DNA có chiều dài khác nhau phân tách trên gel polyacrylamide. 1.4. Chỉ thị Microsatellite trong nghiên cứu đa dạng di truyền 1.4.1. Khái niệm về Microsatellite Microsatellite (SSR marker): Một dạng của VNTR (variable number of tandem repeats) là chuỗi mã di truyền lặp lại rất đơn giản thường xảy ra ngẫu nhiên trên hầu hết genome thực vật (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005), là một đoạn DNA được mô tả đặc điểm bởi sự xảy ra của số lượng bản copy biến thiên (từ một vài bản lên đến 30 hay nhiều hơn) của dãy trong vòng 5 hoặc số bases ít hơn (gọi là đơn vị lặp lại). Một microsatellite điển hình có đơn vị lặp lại AC, xảy ra ở khoảng 100.000 vị trí khác nhau trong bộ genome động vật điển hình. Ở bất kì một vị trí nào (locus), thường xuyên có khoảng 5 – 7 “alleles” khác nhau, mà mỗi alleles có thể nhận biết tuỳ thuộc vào số đơn vị lặp lại. Những alleles này có thể phát hiện bởi PCR , sử dụng primers được thiết kế từ một dãy đơn và cũng có trên cả mặt kia của microsatellite. Khi sản phẩm PCR được chạy trên gel điện di, alleles được ghi nhận khác biệt về độ dài trong giá trị đến kích cỡ của đơn vị lặp lại, Microsatellite là một marker DNA chuẩn, chúng dễ dàng được phát hiện bằng PCR và chúng có khuynh hướng xác định vị trí bằng nhau từ đầu đến cuối của genome. Hàng ngàn SSR đã được lập bản đồ trong nhiều loài khác nhau. Tóm lại, microsatellite ngày nay trở thành một thuật ngữ chung nhất để miêu tả các trình tự lặp lại ngắn và ngẫu nhiên, thay vì sử dụng các thuật ngữ STR (short tandem repeats) hay VNTR (variable number of tandem repeats) (Edward, 1991). Microsatellite bao gồm các đoạn lặp lại ngắn từ 2 – 6 bp và kích thước tại mỗi locus 14
Đồ án tốt nghiệp là 20 – 100 bp. Microsatellite được tìm thấy trong tất cả cơ thể sống, đặc biệt là ở những cơ thể sống có bộ gene lớn và phân bố đều trên genome. Microsatellite có tính đa hình rất cao, là những codominant-alleles hay alleles đồng trội (bao gồm 2 loại: alleles đồng hợp và alleles dị hợp), nó có các tính chất cần thiết cho một marker. Tần số đột biến từ 104 – 5x106, tuân theo định luật Mendel. Vị trí của microsatellite trên nhiễm sắc thể có thể được xác định bằng PCR từ một lượng DNA rất nhỏ. Xác định microsatellite PCR trên một loài nào đó thì có thể áp dụng trên những loài khác có quan hệ họ hàng. 1.4.2. Tính chất Những markers này thường hiện diện với mức độ cao của hiện tượng đa hình, đặc biệt khi số lần lặp lại lớn hơn hoặc bằng 10. Trình tự được lặp lại thường đơn giản, bao gồm 2, 3 hoặc 4 nucleotides (tương ứng với việc lặp lại di-, tri-, và tetranucleotide), và có thể được lặp lại từ 10 đến 100 lần. Sự lặp lại của nucleotide CA xảy ra rất thường xuyên trong bộ gene người và các loài khác, và được hiện diện trong khoảng vài ngàn bases pair. Như vậy có sự xuất hiện thường xuyên của nhiều alleles tại vị trí microsatellite, kiểu gene trong phả hệ thường cung cấp đầy đủ thông tin về di truyền, trong đó alleles đặc thù của tổ tiên có thể được nhận biết dễ dàng. Bằng cách này, microsatellite là marker lý tưởng để xác định nguồn gốc, nghiên cứu di truyền quần thể và bản đồ tái tổ hợp. Nó còn là marker phân tử dùng để cung cấp đầu mối về những alleles có mối quan hệ gần nhau hơn. Microsatellite thường thay đổi với tỉ lệ đột biến tăng dần so với vùng trung tính khác của DNA. Tỉ lệ đột biến cao này có thể được giải thích bởi sự bắt cặp sai trong bộ phận trượt (slipped strand mispairing – sự giữ không đúng mục tiêu) trong suốt quá trình sao chép DNA trên một chuỗi đơn xoắn kép. Sự đột biến cũng xảy ra suốt quá trình tái tổ hợp trong quá trình giảm phân. Một vài lỗi sai mục tiêu được sửa bởi cơ chế đọc và sửa trong nhân, thế nhưng một vài đột biến có thể không được sửa chữa. Kích thước của đơn vị lặp lại, số lần lặp lại và sự hiện diện của sự lặp lại khác nhau là tất cả các yếu tố, cũng như là tính thường xuyên của sự dịch mã trong khu vực của DNA lặp lại. Sự gián đoạn của microsatellites, có thể do đột biến, 15
Đồ án tốt nghiệp có thể là nguyên nhân trong việc giảm sự đa hình. Tuy nhiên, cơ chế tương tự này thỉnh thoảng có thể dẫn đến sự khuếch đại không chính xác của microsatellites; nếu sự sai mục tiêu xảy ra sớm trong suốt quá trình PCR, thì chiều dài không chính xác của microsatellites có thể được khuếch đại. 1.4.3. Sự phát triển của primer Microsatellite Primer của microsatellite được phát triển bởi việc tạo dòng ngẫu nhiên một đoạn DNA từ những giống loài trọng tâm. Những đoạn này được chèn vào plasmid hoặc phage vector, và được chuyển tiếp vào vi khuẩn Escheria coli. Khuẩn lạc sau đó phát triển và được chụp lên phim với những trình tự nucleotide được đánh dấu huỳnh quang được lai với trình tự lặp lại của microsatellite, nếu nó có hiện diện trên đoạn DNA. Nếu dòng dương tính có thể thu được từ quy trình này, đoạn DNA được đọc trình tự và primers PCR sẽ được chọn từ vùng trình tự liên kết như vùng để xác định vị trí đặc trưng. Quy trình này liên quan đến những thử nghiệm thành công, khi trình tự lặp lại của microsatellites phải được dự đoán trước và primers được thu nhận ngẫu nhiên có thể không biểu hiện tính đa hình có ý nghĩa. Vị trí microsatellite được trải xuyên suốt genome và có thể được thu nhận từ sự thoái hoá DNA chung của những mẫu cũ hơn, khi đó là tất cả những chất nền cần thiết và hợp lí để khuếch đại thông qua PCR. Primer microsatellite đặc trưng cho một loài sẽ giúp phát hiện sự đa hình ở những vị trí tương đồng (cùng locus trên mỗi alleles) đối với từng cá thể trong loài. Điều này có thể thực hiện được là nhờ trình tự microsatellite và trình tự của vùng flanking – vùng nằm ở 2 bên trình tự microsatellite để thiết kế primer – được bảo tồn trong quá trình di truyền của loài. Vùng flanking rất quan trọng vì nó giúp phát hiện trình tự microsatellite đặc trưng ở mỗi locus trên nhiễm sắc thể. 1.4.4. Giới hạn của Microsatellite Microsatellite là marker phân tử hữu hiệu và đặc biệt trong nghiên cứu quần thể. Thế nhưng chúng không phải không có hạn chế. Microsatellite được phát triển cho những chủng đặc trưng, có thể được ứng dụng thường xuyên với những chủng 16
Đồ án tốt nghiệp có mối quan hệ họ hàng gần nhau. Tuy nhiên tỉ tệ phần trăm vị trí di truyền được khuếch đại thành công có thể bị giảm bởi sự gia tăng khoảng cách di truyền. Điểm đột biến trong vị trí bắt cặp của primer trong một loài nào đó có thể dẫn đến sự cố alleles không giá trị(null alleles), nơi mà primer microsatellite không thể đáp ứng để khuếch đại trong thí nghiệm PCR. Sự phân kì trong trình tự ở vùng liên kết có thể dẫn đến sự bắt cặp kém của primer, đặc biệt ở vùng 3’ nơi mà sự kéo dài bắt đầu. Sự khuếch đại ưu tiên của vị trí alleles đặc thù do sự cạnh tranh tự nhiên của PCR có thể dẫn đến việc cá thể dị hợp tử được ghi nhận từ đồng hợp tử (bộ phận không có giá trị) (Hayden và Sharp, 2001). Sự thất bại của phản ứng PCR có thể thu nhận kết quả khi sự sai khác ở vị trí đặc thù được khuếch đại. Tuy nhiên, ảnh hưởng sai khác của quần thể nhỏ và khả năng của sự liên kết giới tính cũng cần được xem xét để không đưa ra giá trị sai của alleles không giá trị do sự tăng tính đồng hình trong phân tích quần thể. Sự khác nhau trong kích thước alleles cũng không phản ánh sự khác nhau thật sự. Đột biến có thể có từ sự thêm vào hay mất đi của bases và toàn bộ microsatellite có thể chịu sự nén chặt về chiều dài. Tỉ lệ đột biến thì không có tiêu chuẩn để đánh giá. Vùng trung tính của một số vùng microsatellite còn đang nghi vấn, có lẽ do sự biến thiên tính trạng số lượng hoặc sự cố trong vùng exon của gene dưới sự chọn lọc. Khi sử dụng microsatellite để so sánh loài, vị trí đồng hình có thể dễ dàng khuếch đại trong những loài có quan hệ, thế nhưng số vị trí khuếch đại thành công trong suốt phản ứng PCR có thể giảm do sự tăng khoảng cách di truyền giữa các loài nghi vấn. Đột biến trong alleles microsatellite có thể bị ảnh hưởng xấu trong trường hợp có một đoạn alleles lớn hơn chứa nhiều bases hơn, và do đó có thể được dịch sai trong quá trình phiên mã DNA. Một alleles nhỏ hơn tham gia vào việc làm tăng kích thước, trong khi một alleles lớn hơn tham gia để làm giảm kích thước, khi mà chúng có thể là nguyên nhân cho sự giới hạn trên về kích thước; sự ép buộc này đã được xác định nhưng giá trị khẳng định là chưa chuyên biệt. Nếu có một sự khác biệt lớn về kích cỡ giữa alleles của cá thể, điều đó có thể làm tăng sự không bền vững trong sự tái tổ hợp ở quá trình giảm phân. 17
Đồ án tốt nghiệp Trong tế bào khối u – nơi mà sự kiểm soát trên phiên mã bị phá hủy, microsatellite có thể tăng thêm hay mất đi thường xuyên ở tỉ lệ đặc biệt cao trong mỗi chu kỳ nguyên phân. Do đó một dòng tế bào khối u có thể chỉ ra những đặc điểm khác biệt di truyền. 1.4.5. Các loại Microsatellite Căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2 – 6 lần) có : Mononucleotide SSR (A) AAAAAAAAAAA Dinucleotide SSR (GT) 6 GTGTGTGTGTGT Trinucleotide SSR (CTG) 4 CTGCTGCTGCTG Tetranucleotide SSR (ACTC) 4 ACTCACTCACTCACTC Trinucleotide SSR xuất hiện ít hơn dinucleotide SSR khoảng 10 lần, và tetranucleotide SSR còn hiếm hơn nữa (Ma và ctv, 1996). 1.4.6. Cơ chế hình thành microsatellite Cơ chế đột biến hình thành microsatellite vẫn chưa được hiểu biết một cách đầy đủ. Tuy nhiên di truyền học và các nghiên cứu khác cho rằng cơ chế xuất hiện và hình thành microsatellite là do 2 quá trình sau: Quá trình bắt chéo lỗi trong quá trình giảm phân (unequal crossing - over during meiosis). Quá trình này được mô tả trong hình 1.6. Hình 1.6. Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân. 18
Đồ án tốt nghiệp Quá trình trượt lỗi trong sao mã (replication slippage). Hình 1.7. Cơ chế trượt lỗi trong quá trình sao mã. Hình 1.7 mô tả quá trình trượt lỗi trong sao mã (replication slippage). Đây được coi là nguyên nhân chủ yếu và nó xảy ra trên mạch chậm (lagging strand). Quá trình này liên quan đến quá trình trượt lỗi của enzyme polymerase trên phân tử DNA mới tổng hợp mà phân tử enzyme polymerase không nhận biết được. Sự trượt lỗi này tạo ra một chỗ phình nhất thời có thể bị loại bỏ trong quá trình sửa lỗi hoặc là có thể kéo dài thêm ở mạch đối diện tạo thành một đoạn lặp lại dài hơn. 1.4.7. Nguyên tắc phát hiện microsatellite bằng mồi microsatellite Cách phổ biến nhất để phát hiện microsatellite là thiết kế mồi microsatellite đặc trưng cho một locus trong bộ gene. Vì vậy một cặp mồi microsatellite có thể áp dụng cho mọi cá thể trong loài, và cho những sản phẩm khuếch đại có kích thước khác nhau phụ thuộc vào chiều dài khác nhau của trình tự microsatellite. 19
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.8. Phát hiện microsatellite từ DNA tổng số. Hình 1.8 hai mồi của PCR (2 mũi tên màu xám) được thiết kế nằm ở vùng bảo toàn nằm 2 bên trình tự microsatellite. Nếu không có đoạn lặp lại nào, sản phẩm PCR sẽ có chiều dài là 100 bp. Vì vậy, dựa vào kích thước của sản phẩm PCR chúng ta có thể tính được số lần lặp lại của dinucleotide “CA” trong mỗi trình tự microsatellite (như trong ví dụ này “CA” có 8 lần lặp lại với chiều dài sản phẩm PCR là 116 bp) Hình 1.9.Vùng flanking (vùng sườn) ở 2 bên trình tự microsatellite. Mồi microsatellite đặc trưng cho một loài sẽ giúp phát hiện sự đa hình ở những vị trí tương đồng (cùng locus trên mỗi alleles) đối với từng cá thể trong loài. Điều này có thể thực hiện được là nhờ trình tự microsatellite và trình tự của vùng flanking (vùng sườn – vùng nằm ở 2 bên trình tự microsatellite để thiết kế mồi) được bảo tồn trong quá trình di truyền của loài. Vùng sườn rất quan trọng vì nó giúp phát hiện trình tự microsatellite đặc trưng ở mỗi locus trên nhiễm sắc thể. 20
Đồ án tốt nghiệp Sản phẩm PCR sau đó được phân tích bằng điện di trên gel. Thông thường sản phẩm PCR có 2 vạch, 1 vạch chính và 1 vạch phụ nhỏ hơn vạch chính 2 bp (Murray và ctv, 1993). Sự xuất hiện của vạch phụ là do quá trình trượt lỗi của DNA polymerase (Tautz, 1989), vạch phụ có thể gây trở ngại cho việc xác định kích thước chính xác của vạch chính, nhưng vạch phụ cũng có thể được xem như một dấu hiệu để nhận biết sản phẩm khuếch đại đúng là microsatellite. Bằng cách này thì chúng ta cũng xác định được kích thước của sản phẩm PCR đồng thời đếm được số lần lặp lại của các nucleotide trên mỗi alleles. 1.4.8. Ưu và nhược điểm cùa microsatellite 1.4.8.1. Ưu điểm Microsatellite có số đơn vị trình tự lõi từ 1 – 6bp, số lần lặp lại của microsatellite khoảng 70 lần. Do số lần lặp lại của mỗi microsatellite là khác nhau ở mỗi cá thể nên tính đa hình tạo ra khi sử dụng kỹ thuật này là rất cao. Microsatellite có khả năng phân biệt các cá thể khi có sự kết hợp các locus được kiểm tra nên kỹ thuật này rất hữu dụng trong các thí nghiệm dòng chảy gene và phân tích mối quan hệ huyết thống. Microsatellite là marker đồng trội, do đó dị hợp tử có thể dễ dàng được xác định. Tính đồng trội của microsatllite gia tăng sự hiệu quả và độ chính xác của những phép tính toán di truyền quần thể so với những marker khác như: AFLP và RAPD. Hơn nữa, việc xác định dị hợp tử ở thế hệ F1 sẽ làm cho những phân tích phả hệ, sự lai giống, dòng chảy gene trở nên dễ dàng hơn. 1.4.8.2. Nhược điểm Xác định trình tự đặc hiệu hai đầu locus microsatellite là bước đầu tiên rất quan trọng trong kỹ thuậtnnày. Do đó, việc sử dụng microsatellite gặp phải nhược điểm lớn là phải xác định trình tự đặc hiệu cho mỗi locus đa hình. Không thể áp dụng phân tích trên một hệ thống lớn bao gồm nhiều loài có quan hệ di truyền xa nhau. 21
Đồ án tốt nghiệp 1.4.9. Vai trò của microsatellite Rất nhiều microsatellite đã được tìm thấy ở phần phía trên các vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã, và một số có quan hệ với vùng mã hoá. Chức năng rõ rệt của những vùng như vậy vẫn còn chưa biết rõ ràng, mặc dù người ta tìm thấy chúng tồn tại giữa các vùng exon và có liên quan tới các bệnh di truyền. Microsatellite được dùng như một marker di truyền để nghiên cứu về di truyền quần thể, quan hệ tiến hóa, lập bản đồ gene. Tuy nhiên có rất nhiều chứng cứ cho rằng trình tự microsatellite cũng đóng vai trò là yếu tố mang mã hoặc nhân tố điều hòa. Microsatellite được tìm thấy khắp nơi ở phần trước vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã, và một số đã được tìm thấy có quan hệ với vùng mã hoá. số lượng khác nhau của các đoạn lặp lại của microsatellite ở vùng mã hoá có quan hệ với sự biểu hiện của gene và chức năng của gene. Ở một số trường hợp, sự thay đổi (mất hoặc thêm) các đơn vị lặp lại của microsatellite cũng làm thay đổi chức năng hoạt động của promotor. Vị trí của microsatellite gần hay xa promotor cũng làm hoạt động của promotor thay đổi. Vùng điều khiển có chứa microsatellite hoạt động như một nhân tố thúc đẩy quá trình phiên mã và những đột biến mất đoạn microsatellite đã làm giảm chức năng của gene. Microsatellite cũng liên kết với các protein bám mà các protein này có chức năng bám dính vào các trình tự khởi động của gene, khi trình tự này được giải phóng thì gene được khởi động và sao mã. Điều này chỉ ra rằng microsatellite hoạt động như một yếu tố điều hòa trong quá trình sao mã, ảnh hưởng đến quá trình sao mã thông qua ảnh hưởng đến protein bám. Rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng ảnh hưởng thúc đẩy của microsatellite và protein bám dính của nó là một chức năng của các đoạn lặp lại trong một vùng microsatellite đặc biệt nào đó. Như một trình tự mang mã, microsatellite đã được tìm thấy biểu hiện ở rất nhiều protein và sự khác nhau về số lần lặp lại của các trình tự trong microsatellite có thể dẫn đến sự khác nhau về chức năng của protein và hoạt động của gene, do đó có thể ảnh hưởng đến chức năng sinh lý cũng như sự phát triển của cơ thể. 22
Đồ án tốt nghiệp Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng có sự ảnh hưởng của chiều dài khác nhau của microsatellite đến hình thái và sự phát triển ở mức độ cơ quan được tổng kết lại như một yếu tố chức năng của hệ gene. Những tính chất đặc biệt của microsatellite như sự đột biến điểm dẫn đến những giả thiết cho rằng microsatellite có thể là một nguồn chủ yếu tạo nên sự đa dạng về di truyền số lượng và quá trình tiến hóa thích nghi (Kashi và ctv, 1997). Nó cho phép một quần thể có thể khôi phục lại nguồn đa dạng di truyền đã bị mất trong quá trình chọn lọc, nó hoạt động như một “núm điều chỉnh” mà qua đó những gene đặc biệt có thể điều chỉnh nhanh chóng các phản ứng thay đổi ít hay nhiều trong quá trình đòi hỏi của tiến hóa (King và ctv, 1997). Do vậy microsatellite là một nguồn rất quan trọng trong việc nghiên cứu đa dạng di truyền và làm cơ sở cho sự thay đổi của tiến hóa. 1.4.10. Ứng dụng của microsatellite Trong việc xác định cấu trúc quần thể (đặc biệt là các quần thể tự nhiên) từ các loài khác nhau như vi sinh vật, thực vật, động vật có vú, côn trùng,chim Đặc biệt là việc xác định cấu trúc xã hội và liên kết giữa các cá thể, cấu trúc quần thể của các loài có nguy cơ bị thu hẹp hoặc phát triển, xác định mức độ đồng huyết của quần thể. Trong chuẩn đoán bệnh: vì DNA microsatellite thay đổi về chiều dài trong sự phát triển của một số bệnh ung thư. Nên chúng là những marker rất hữu ích trong việc dò tìm, phát hiện ung thư sớm. Tính đa hình của microsatellite hữu ích trong nghiên cứu các liên kết để định vị những gene chiụ trách nhiệm về nhiều sự mất trật tự di truyền học. 23
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Địa điểm nghiên cứu: đề tài được thực hiện tại Phòng Thí Ngiệm Di Truyền Phân Tử, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II (116 Nguyễn Đình Chiểu, Phường Đakao, Quận 1, TP. Hồ Chí Minh). Thời gian nghiên cứu: đề tài được thực hiện từ tháng 04/2015 đến tháng 07/2015. 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Nguồn mẫu Mẫu vây đuôi cá Tra sử dụng trong nghiên được cung cấp bởi Trung tâm quốc gia giống thủy sản nước ngọt Nam Bộ tại xã An Thái Trung, huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang. 2.2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 2.2.2.1. Mồi Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê dưới bảng sau: Bảng 2.1. Thông tin 16 cặp mồi microsatellite dùng trong nghiên cứu. Loci Sequencing 5’-3’ Size range Ta (0C) R 5’ATCTGGGTCAAAATGATTGGAAC 3’ CB12 300 52,1 F 5’ GCGATAQAGACAGAGAGTCATGG 3’ R 5’ CTCCATTTACAGACCATCCGTAQ 3’ CB13 300 57,2 F 5’ GTGTGTCAAGTTGGGATCATGG3’ R 5’ GGAAGAAAATCATCTGACTGCAC3’ CB14 250 52,1 F 5’ ATACAAACCTCTGAAATGGGTTC 3’ R 5’ CCCTTAQTCCGAATTACTGGAAGC3’ CB15 250 57,8 F 5’CGGGGGAGTGTTGTCTGTCAG 3’ R 5’TATACCTGCTGGGAGAATGGATG3’ CB18 350 52,5 F 5’AGAAGGAACGCTGGACTGAGG3’ 24
Đồ án tốt nghiệp R 5’CAGACATGAGGAGGATGAAGACG3’ CB19 250 52,1 F 5’TCGAGAGTCTGAAGCACAAACC 3’ F-5’-GTAAACAGAGCCACCTGCGG-3’ Phy01 154 - 160 66 R-5’-CAGATCCACACCCACAACACC-3’ F-5’-TAQGAGTCAGGAGTCGC-3’ Phy03 166 - 194 54 R-5’-TGCAACGGTAACAAACC-3’ F-5’-GGAGGAGCAGCTTCAGAGTC-3’ Ph-7 153 57,1 R-5’-AGCGTGTCATGAAGAGGGTG-3’ F-5’-TTGCGTGATGACTTTGCGTG-3’ Ph-9 175 61 R-5’-ACGATGGCTTCAGTTACGCATC-3’ F-5’-CGATGAGCAGGAACGACATG-3’ Ph-21 115 57,1 R-5’-AGCACTCTGTCCATCCATCC-3’ F-5’-GGTGAAGAGGCTCCATGAAG-3’ Ph-25 133 59,1 R-5’-TGTACCCAGAGTCATCAGATCC-3’ F-5’-GAGAGGGGGTGAAATAATGATAQG-3’ PSP-G579 300 54,3 R-5’-ATGGTTCTCCTGCAAGCAATGTCT-3’ F-5’-ACCGGGTTTTAQAGTGACG-3’ PSP-G565 250 52 R-5’-GTGGGACAAAGGGAAAAGTG-3’ F-5’-ATTGTCTATTGCTGCTGGATACCA-3’ PSP-G593 250 50 R-5’-GATTTTTGCCTTTGTTCTCCTGAG-3’ F-5’-GTTTTCCATCCAGGTTGTTTTCC-3’ Pg-13 350 54,3 R-5’-TAAGTCCATGTGGGTTTCCTCTG-3’ 2.2.2.2. Thang Thang DNA được để xác định kích thước DNA các mẫu cá Tra. Kích thước thang sử dụng trong nghiên cứu là 100 bp. 25
Đồ án tốt nghiệp Hình 2.1. Thang chuẩn 100 bp. 2.2.2.3. Các hóa chất sử dụng trong tách chiết DNA Dung dịch tách chiết 1 (Solution 1): 50 mM Tris – HCl pH 8; 20 mM EDTA pH 8; 2 % SDS. Dung dịch tách chiết 2 (Solution 2): dung dịch NaCl bão hòa 6 M. Proteinase K. Ethanol 70 %. Ethanol tuyệt đối. 2.2.2.4. Hóa chất sử dụng trong PCR 10X PCR buffer (Fermentas). 25 mM MgCl2 (Fermentas). 10 mM dNTP mix (Fermentas). Taq DNA polymerase 5 U/l (Fermentas). Primer 100M (Sigma). DNA mẫu (tách chiết từ mẫu vây). 26
Đồ án tốt nghiệp 2.2.2.5. Hóa chất sử dụng trong điện di agarose Agarose (Bio basic). TBE 1X. 6X DNA Loading Dye (Promega). 100 bp DNA Ladder (Promega). 2.2.2.6. Dụng cụ và thiết bị Kéo, kẹp cắt mẫu. Bể điều nhiệt. Đèn cồn. Máy ủ. Cốc thủy tinh 100 ml, 1000 Máy cất nước siêu sạch. ml. Micropipet các loại: 100 – Eppendorf 0,2 ml; 1,5 ml; 2 1000 µl; 0,5 – 10 µl; 10 – 100 ml. µl; (Bio – Rad). Đầu tip các loại. Máy ly tâm lạnh. Máy vortex. Máy PCR (Bio – Rad). Cân điện tử MS 204. Máy điện di (Bio – Rad). Trip 8, 12. Máy chụp ảnh điện di (Bio – Plates 96 well PCR. Rad). Lò viba. Lò vi sóng (Electrolux – Thụy Máy hút và tủ cấy vô trùng Điển). (Astec Microflow). Tủ mát (40C), tủ âm (-250C) Máy khuấy từ gia nhiệt. (Sanyo – Nhật). 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp thu và bảo quản mẫu Mẫu vây đuôi của cá được cắt, rửa bằng cồn 96 % và được bảo quản trong cồn 70 % (mẫu luôn ngập trong cồn), riêng biệt trong từng eppendorf 1,5 ml (đã được hấp vô trùng). Mẫu được lưu trữ ở nhiệt độ 40C cho đến khi tiến hành tách chiết DNA và được tiến hành thay cồn định kỳ 3 tháng/lần. 27
Đồ án tốt nghiệp 2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA 2.3.2.1. Quy trình Tách chiết DNA tổng số dựa trên quy trình tách chiết DNA Salt extraction (Miller và ctv, 1988). Hình 2.2. Quy trình tách chiết DNA Salt extraction (Miller và ctv, 1988). 2.3.2.2. Điện di kiểm tra sản phẩm DNA tách chiết Tiến hành điện di mẫu DNA tách chiết trên gel Agarose 1 %, trong dung dịch đệm TBE 1X ở hiệu điện thế 100 V, cường độ dòng diện 400 mA trong 30 phút. 28
Đồ án tốt nghiệp Sau khi chạy điện di xong, đưa gel vào máy chụp ảnh DNA. Dưới tia UV, Ethidium Bromide liên kết với sợi đôi DNA sẽ phát quang và tạo thành các vạch trên gel. Dựa vào khoảng cách 2 vạch, có thể ước tính được khối lượng. Độ tinh sạch của DNA tách chiết được tính bằng cách tính tỷ lệ OD260 nm/OD280 nm. Nếu tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,7 – 2,2 thì mẫu tách chiết được xem là sạch. Nếu tỷ lệ <1,7 là mẫu nhiễm nhiều protein. 2.3.3. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 2.3.3.1. Khái niệm Kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp – Polymerase Chain Reaction), được Karry Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Phát minh này nhận được giải Nobel về hóa học vào năm 1993. PCR là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các đoạn DNA với tốc độ nhanh, độ chính xác cao và được thực hiện trong máy chu trình nhiệt (máy PCR). Nhờ kỹ thuật PCR mà với lượng nhỏ DNA mẫu ban đầu ta có thể thu được đủ lượng DNA cần thiết để tiến hành các thí nghiệm về DNA. Cho đến nay, kỹ thuật PCR được coi là phương pháp nền tảng quan trọng của công nghệ di truyền (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003). Mục đích của việc sử dụng phương pháp PCR trong nghiên cứu này là để khuếch đại sản phẩm đặc hiệu từ các chỉ thị microsatellite khác nhau, nhầm chọn ra những cặp mồi tốt nhất. 2.3.3.2. Nguyên tắc của phản ứng PCR Kỹ thuật tổng hợp DNA ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao chép DNA trong cơ thể. Tuy nhiên, PCR dùng nhiệt độ cao (94°C) để tháo xoắn DNA, kết hợp với enzyme DNA polymerase chịu nhiệt và hệ thống điều nhiệt thích hợp cho từng giai đoạn của phản ứng tổng hợp cùng với các đoạn primer được thiết kế chủ động (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003). 29
Đồ án tốt nghiệp PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (25 – 35 chu kỳ) nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước: Bước 1: Biến tính (denaturing): 60 giây(thời gian có thể dài hoặc ngắn hơn tùy theo độ dài DNA mẫu). Nhiệt độ 94 – 950C, trong, DNA mẫu bị biến tính từ sợi kép thành sợi đơn dưới tác dụng của nhiệt độ. Bước 2: Gắn primer (annealing): 30 giây. Nhiệt độ 50 – 600C (tùy thuộc vào độ dài của cặp primer). Ở bước này cặp primer gắn chuyên biệt vào sợi DNA đích (sợi đơn). Bước 3: Kéo dài (extending): 30 giâyNhiệt độ 720C, là nhiệt độ thích hợp cho Taq polymerase hoạt động giúp tổng hợp sợi DNA mới từ primer (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005). Sau 25 – 35 chu kỳ, phản ứng tiếp tục giai đoạn ủ ở 720C trong 5 – 20 phút để hoàn thiện các sản phẩm PCR. Kết quả cuối cùng là đoạn DNA khuôn mẫu được khuếch đại lên gấp nhiều lần (xem hình 2.3) với tổng số DNA khuếch đại là mx2n (với m là số DNA đích ban đầu và n là số chu kỳ) (Trịnh Đình Đạt, 2006). Hình 2.3. Các bước cơ bản của phàn ứng PCR. 30
Đồ án tốt nghiệp 2.3.3.3. Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR Theo Trịnh Đình Đạt (2006) thì cần lưu ý các chỉ tiêu:  Mẫu DNA Mẫu DNA sẽ được tách chiết từ nhiều bộ phận khác nhau của đối tượng nghiên cứu bằng nhiều phương pháp khác nhau. Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch, nhưng nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA lấy trực tiếp từ dịch chiết tế bào. PCR còn cho phép khuếch đại những mẫu DNA không được bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần như: vết máu để lâu, tinh dịch đã khô, hóa thạch Số lượng DNA cần cho một phản ứng PCR vào khoảng 5 – 10 ng.  Taq polymerase Ban đầu, khi chưa sử dụng enzyme Taq polymerase người ta phải thêm DNA polymerase trong từng chu kỳ nhân bản, vì DNA polymerase cần cho quá trình tổng hợp DNA nhưng không chịu được nhiệt độ lớn hơn 900C ở giai đoạn biến tính tách hai sơi của phân tử DNA. Năm 1988, Taq polymerase được phát hiện, đây là một loại DNA polymerase bền với nhiệt, được phân lập từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở suối nước nóng. Với enzyme này thì chỉ cần cho một lần Taq polymerase là được. Nồng độ Taq polymerase được sử dụng thông thường là 0,5 – 5 đơn vị/100 µl dung dịch phản ứng. Nếu nồng độ quá cao, những sản phẩm không mong muốn có thể xuất hiện làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ quá thấp thì sẽ không đủ lượng enzyme để xúc tác tạo lượng sản phẩm PCR theo ý muốn. Trong phản ứng PCR thì Taq polymerase có khuynh hướng thêm một nucleotide loại A vào đầu tận cùng 3’ của sản phẩm PCR, điều này rất quan trọng trong việc tạo dòng (TA – cloning) và nó sẽ bị loại thải đi nếu sự gắn kết xảy ra ở đầu tận cùng là đầu bằng (blunt end ligation). Ngoài ra có thể làm gia tăng hoạt tính của Taq polymerase bằng cách sử dụng kết hợp với một số enzyme khác: Tli hoặc Pfu, 31
Đồ án tốt nghiệp Theo Trần Thị Thu Hương (2007):  Primer và nhiệt đô lai: Primer là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt sự khuếch đại đặc trưng và hiệu quả cao. Việc chọn primer phải tuân thủ một số nguyên tắc sau: Trình tự primer được chọn sao cho không có sự bắt cặp giữa primer “xuôi” và “ngược”, không xuất hiện cấu trúc “kẹp tóc” (các phần khác nhau của một primer bắt cặp với nhau). Tm của primer xuôi và ngược không cách biệt quá xa, tránh các cặp G – C lặp lại nhiều lần. Primer đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng các trình tự lặp lại trên gene. Trình tự khuếch đại không quá lớn (< 1 kb).  Số lương chu kỳ của phản ứng PCR: số chu kỳ cho 1 phản ứng tùy thuộc lượng mẫu ban đầu. số chu kỳ không quá 40 chu kỳ. Nếu vượt quá, hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do: Sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng. Xuất hiện sản phẩm phụ ức chế phản ứng. Các bản sao vừa được tổng hợp bắt cặp với nhau  Các thảnh phần khác Nồng độ bốn loại dNTP không quá 20 – 200 µM/ mỗi loại nu. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến hiện tượng “kí sinh”. Sự mất cân bằng thành phần các Nu làm tăng lỗi sao chép của polymerase. Dung dịch buffer: tạo môi trường tối ưu nhất cho Taq polymerase hoạt động. 2+ 2+ Ion kim loại Mg : nồng độ Mg cũng là nhân tố ảnh hưởng lớn đến quá 2+ 2+ trình PCR, Mg cần cho DNA polymerase chức năng, nếu nồng độ Mg 2+ thấp thì không được hoạt hóa thành công, nồng độ Mg cao làm phản ứng PCR mất tính đặc hiệu và quá nhiều sản phẩm tạo ra. Không có quy luật 32
Đồ án tốt nghiệp chung cho nồng độ Mg2+ trong phản ứng PCR. Do đó, nồng độ Mg2+ phải được xác định cho từng phản ứng qua các thử nghiệm. 2.3.3.4. Ưu nhược điểm của phản ứng PCR  Ưu điểm: Cho kết quả chính xác, nhanh, khếch đại lượng đủ DNA cần thiết cần cho các thí nghiệm chỉ từ một lượng nhỏ DNA.  Nhược điểm: có thể cho kết quả dương tính giả: trong một số trường hợp vi sinh vật gây bệnh đã chết hoặc chưa đủ lượng gây bệnh thì phản ứng PCR vẫn cho kết quả dương tính. 2.3.3.5. Ứng dụng Theo Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003) và Nguyễn Thị Lang (2002), PCR được sử dụng rất phổ biến trong các lĩnh vực sinh học với các ứng dụng như: Sản xuất mẫu dò. Tách nhanh chóng, chính xác từng gene, từng đoạn DNA riêng biệt Là kỹ thuật nền cho các nghiên cứu di truyền phân tà như: xác định trình tự gene, đa hình DNA, xác định marker phân tử cho chọn giống, phát hiện đột biến gene. Chẩn đoán nhanh, nhạy các bệnh di truyền, bệnh nhiễm trùng (virus, vi khuẩn, nấm ). Xác định giới tính động vật ở giai đoạn phôi thai. Khôi phục gene của các sinh vật cổ cách đây hàng triệu năm. Xác định nguồn gốc hài cốt, quan hệ họ hàng, xác định cá thể dùng trong việc xác định huyết thống, trong khoa học hình sự. 2.3.4. Phương pháp điện di trên gel agarose Agarose có khối lượng phân tử xấp xỉ 120.000 Da, là một trong hai thành phần chính của agar chiếm khoảng 70 %, phần kia là agaropectin chiếm khoảng 30 %. Agarose là một polymer mạch thẳng không bị sulphate hóa chứa hai gốc xen kẽ nhau là D–galactose và 3,6–anhydro–L–galactose. 33
Đồ án tốt nghiệp Agarose gel là một chất trong suốt hoặc trong mờ, tạo thành khi hỗn hợp agarose và nước (hoặc đệm điện di) được đun nóng tới >100oC và sau đó được làm lạnh; dạng gel xuất hiện ở khoảng 40 – 45oC. Bản chất quá trình đông lại của agarose là phản ứng trùng hợp gắn nhiều gốc monomer tạo thành polymer nhờ nhiệt độ. Các chuỗi polymer liên kết chéo với nhau tạo thành một hệ thống mạng lưới với kích thước các mắt lưới tùy thuộc vào nồng độ agarose và phản ứng polymer hoá. 2.3.4.1. Nguyên tắc Các phân tử nucleic acid có khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dượng của hệ điện di trong một điên trường có điện thế và cường độ thích hợp . Tốc độ dịch chuyển của các phân tử trong gel phụ thuộc vào kích thước, cấu hình phân tử, nồng độ gel, lực điện trường Vị trí của DNA trong gel được xác định trực tiếp: các băng DNA trong gel được nhuốm ở nồng độ thấp của thuốc nhuộm huỳnh quang ethidium bromide (EtBr) và có thể phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại. Điện di trên gel agarose được xem là phượng pháp tối ưu nhất dùng để phân tích, xác định và tinh sạch các đoạn DNA. 34
Đồ án tốt nghiệp Hình 2.4. Sơ đồ minh họa các bước trong quá trình điện di agarose gel. 2.3.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng Theo Mạc Văn Trọng (2007), cần lưu ý một số yếu tố sau:  Kích thước của phân tử: các phân tử DNA có kích thước càng lớn (khối lượng phân tử lớn) thì tốc độ dịch chuyển càng chậm. Các phân tử DNA mạch thẳng sợi đôi đi qua bản gel ở các tốc đố tỷ lệ nghịch với hàm log10 của khối lượng phân tử của chúng.  Nồng đô agarose: Đoạn DNA mang kích thước khác nhau dịch chuyển ở các tốc độ khác nhau qua các bản gel chứa các nồng độ agarose khác nhau. 35
Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.2. Các thông số điện di DNA bằng gel agarose. Kích thước đoạn DNA (kb) sử dụng có Hàm lượng agarose trong gel (%) hiệu quả 0,5  0,8 1  10 0,9  2,0 0,5  5 2,1  2,5 0,1  0,5  Cấu hình DNA Các DNA dạng vòng đóng, vòng đứt và mạch thẳng có cùng một khối lượng phân tử sẽ dịch chuyển trên gel agarose ở các tốc độ khác nhau. DNA của các plasmid mạch vòng dịch chuyển nhanh hơn DNA của plasmid cùng loại nhưng có dạng mạch thẳng. Hình 2.5. Kết quả điện di với plasmid mạch vòng bên trái và plasmid cùng loại mạch thẳng ở bên phải.  Thành phần base và nhiệt độ: điện di DNA trên gel agarose không bị ảnh hưởng rõ bởi thành phần base của DNA hoặc nhiệt độ. 36
Đồ án tốt nghiệp 2.4. Bố trí thí nghiệm Nguồn mẫu Tách chiết DNA Tối ưu hóa phản ứng PCR Khảo sát nhiệt Khảo sát nồng Khảo nồng độ độ bắt cặp của độ MgCl2 Taq DNA các cặp mồi polymerase microsatellit e Khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite. Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm. 37
Đồ án tốt nghiệp 2.4.1. Thí nghiệm 1: tách chiết DNA 2.4.1.1. Tách chiết DNA Cách tiến hành: - Mẫu vây đuôi cá được cắt nhỏ cho vào eppendorf 1,5 ml và thêm 500 µl dung dịch solution 1,5 µl proteinase K rồi votex nhanh. - Ủ các eppendorf trên ở 550C trong 2 giờ (hoặc qua đêm). - Sau khi ủ tiến hành chuyển các eppendorf sang đá đã chuẩn bị sẵn để trên đá 10 phút. - Thêm 250µl dung dịch solution 2, trộn đều và để trên đá 5 phút. - Tiến hành ly tâm 8000 vòng/phút ở 40C trong 15 phút và cẩn thận hút 300µl dịch nổi vào các eppendorf mới. - Thêm 600µl ethanol 100 % lạnh và tiến hành ủ ở 550C trong 2 giờ rồi tiến hành ly tâm 11000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút. - Loại bỏ dịch nổi và rửa DNA trong eppendorf bằng 500 µl ethanol 70 % và ly tâm 11000 vòng/phút ở 40C trong 5 phút. - Cẩn thận loại bỏ dịch nổi và làm khô các eppendorf bằng máy gia nhiệt ở 550C hoặc để qua đêm ở nhiệt độ phòng. - Thêm 100µl TE và bảo quản ở –250C. 2.4.1.2. Kiểm tra DNA tách chiết  Chuẩn bị gel agarose 1% Cân 1,5g agarose cho vào 150 ml dung dịch TBE 1X, lắc đều và đun nhiều lần bằng lo vi ba cho đến khi agarose tan hoàn toàn (nếu quá trình đun mất nước quá nhiều thì phải thêm nước cho đủ 150 ml). Để nguội đến 50 – 600C rồi tiến hành thêm 7,5 µl Ethidimum bromide, lắc đều và đổ gel vào khuôn đã cài lượt sẵn (không để có bọt khí). Đợi 15 – 20 phút để gel đông hoàn toàn, tháo lượt và cho gel vào bồn điện di (để gel ngập trong dung dịch đệm TBE 1X).  Nạp mẫu 38
Đồ án tốt nghiệp Dùng micropipette hút 3 µl dung dịch nạp mẫu (Bromophenol blue) trộn với 7 µl sản phẩm PCR rồi bơm vào giếng trên bản gel. Bơm thang chuẩn vào bản giếng. Chạy ở điện thế 100 V trong 30 phút.  Phát hiện vạch DNA sản phẩm Sau khi chạy điện di, các phân tử DNA đã được nhuộm bởi Ethium Bromide. Bản gel được cho vào máy chụp UV và hình ảnh sẽ hiển thị trên màn hình máy vi tính, sản phẩm DNA là những vạch trắng. 2.4.2. Thí nghiệm 2: tối ưu hóa phản ứng PCR 2.4.2.1. Thí nghiệm 2.1: khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite Để cho cặp mồi có thể bắt cặp một cách hoàn toàn đặc hiệu trên sợi DNA khuôn thì phải duy trì giai đoạn bắt cặp của chu kỳ nhiệt ở nhiệt độ tối ưu cho sự bắt cặp của mồi, gọi là nhiệt độ bắt cặp (Ta). Vì vậy việc khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi là cần thiết để phản ứng PCR. Sử dụng 3 mẫu DNA tách chiết tốt nhất trong phần tách chiết để thực hiện thí nghiệm này. Đối với mỗi mồi, thực hiện phản ứng PCR 8 mẫu với gradian nhiệt độ bắt mồi trong Bảng 2.4, dao động điều chỉnh theo nhiệt độ bắt cặp của các mồi theo lý thuyết. Kết quả được kiểm tra trên gel Agarose 2,5 %, TBE 1X, hiệu điện thế180 V, cường độ dòng điện 400 mA trong thời gian 60 phút để xác dịnh vạch sản phẩm tốt nhất. 39
Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.3. Gradient nhiệt độ lai cho 16 cặp mồi microsatellite. Dãy nhiệt độ khảo sát 1 2 3 4 5 6 7 8 Mồi CB12, CB14, 500C 51,40C 52,90C 54,30C 55,70C 57,10C 58,60C 600C CB18, CB19 CB13, CB15 550C 56,40C 57,90C 59,30C 60,70C 62,10C 63,60C 650C Ph–7, Ph–9, 550C 56,40C 57,90C 59,30C 60,70C 62,10C 63,60C 650C Ph–21, Ph– 25 Phy01 600C 61,40C 62,90C 64,30C 65,70C 67,10C 68,60C 700C Phy03 500C 51,40C 52,90C 54,30C 55,70C 57,10C 58,60C 600C Pg–13, PSP– 500C 51,40C 52,90C 54,30C 55,70C 57,10C 58,60C 600C 565, PSP– G579, PSP– G593 Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của các mồi CB12, CB13, CB14, CB15, CB18, CB19. Chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian 1 95 4 phút 95 30 giây 30 Ta 30 giây 72 30 giây 1 72 5 phút 1 8 ∞ 40
Đồ án tốt nghiệp Bảng 2.5. Chu trình nhiệt của mồi Pg –13, PSP – G565, PSP – G579, PSP – G593. Chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian 1 94 5 phút 94 40 giây 34 Ta 30 giây 72 1 phút 20 giây 1 72 20 phút 1 8 ∞ Bảng 2.6. Chu trình nhiệt của mồi Ph–7, Ph–9, Ph–21, Ph–25. Chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian 1 94 3 phút 94 30 giây 30 Ta 30 giây 72 30 giây 1 72 2 phút 1 8 ∞ Bảng 2.7. Chu trình nhiệt của mồi Phy01, Phy03. Chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian 1 95 4 phút 95 45 giây 30 Ta 30 giây 72 30 giây 1 72 10 phút 1 8 ∞ 41
Đồ án tốt nghiệp 2.4.2.2. Thí nghiệm 2.2: khảo sát nồng độ MgCl2 Sử dụng mẫu DNA tách chiết tốt nhất ở phần tách chiết để thực hiện thí nghiệm này. Đối với mỗi mồi thực hiện 5 phản ứng PCR với thể tích MgCl2 (25 mM) thay đổi lần lượt là 1 – 1,5 – 2 – 2,5 – 3 µl tương ứng với nồng độ MgCl2 trong hỗn hợp phản ứng PCR là: 1,25 – 1,875 – 2,5 – 3,125 – 3,75 mM và nhiệt độ Ta là nhiệt độ thích hợp nhất cho quá trình bắt mồi đã được xác định ở thí nghiệm trên (vì tổng thể tích phản ứng PCR luôn là 20 µl nên thể tích của nước cất cho mỗi mẫu lần lượt là 11,75 – 11,25 – 10,75 – 10,25 – 9,75 µl). Kết quả được kiểm tra trên gel Agarose 2,5 %, TBE 1X, hiệu điện thế180 V, cường độ dòng điện 400 mA trong thời gian 60 phút để xác dịnh vạch sản phẩm tốt nhất. Bảng 2.8. Nồng độ MgCl2 khảo sát cho từng cặp mồi microsatellite. Phản ứng 1 2 3 4 5 Thể tích MgCl2 (µl) 1 1,5 2 2,5 3 Nồng độ MgCl2 (mM) 1,25 1,875 2,5 3,125 3,75 Thể tích H2O (µl) 11,75 11,25 10,75 10,25 9,75 2.4.2.3. Thí nghiệm 2.3: khảo sát nồng độ Taq DNA polymerase Nếu nồng độ Taq DNA polymerase quá cao, những sản phẩm không mong muốn có thể xuất hiện làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ quá thấp thì sẽ không đủ lượng enzyme để xúc tác tạo lượng sản phẩm PCR theo ý muốn. Vì vậy cần tiến hành khảo sát nồng độ Taq DNA polymerase để phản ứng PCR được tối ưu. Bảng 2.9. Nồng độ Taq DNA polymerase khảo sát. Phản ứng 1 2 3 4 Thể tích Taq DNA polymerase (µl) 0,25 0,3 0,35 0.4 Nồng độ Taq DNA polymerase (U) 1,25 1,5 1,75 2 42
Đồ án tốt nghiệp Phản ứng được tiến hành trên máy luân nhiệt iCycle (Bio – rad ) đã được cài đặt sẵn chu trình nhiệt. Các thành phần phản ứng PCR là không đổi, chỉ thay đổi thể tích Taq DNA polymerase. Thể tích của mỗi phản ứng là 20 µl. Sản phẩm khuếch đại, sau đó tiến hành điện di trên gel agarose 2,5 %, hiệu điện 180 V, cường độ dòng điện là 400 mA trong thời gian 60 phút, TBE 1X, thể tích mẫu là 7 µl. Dùng thang M kích thước 100 bp để so sánh kích thước DNA, với thể tích thang M là 5 µl. Sau khi chạy điện di xong, gel được đưa vào máy chụp ảnh DNA để kiểm tra sản phẩm và chụp ảnh dưới ánh sang đèn UV. 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite Sau khi đã có kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các mồi, nồng độ Mg2+ tối ưu và hàm lượng DNA tối ưu cho mỗi cặp mồi của phản ứng PCR, tiếp tục thực hiện phản ứng PCR của các cặp mồi microsatellite đặc trưng cho cá Tra trên 10 mẫu DNA thuộc 4 quần đàn (G2–2001, G2–2002 , G2–2003, G3–2001), nhằm tiếp tục kiểm tra độ hoạt động của primer microsatellite, kiểm tra tính ổn định của phản ứng sau khi đã tối ưu hóa. Phản ứng PCR cho từng cặp mồi được tiến hành trên thiết bị luân nhiệt PCR iCycle (Bio – rad). Tổng thể tích cho mỗi phản ứng là 20 µl, bao gồm các thành phần : buffer, dNTP, primer, Taq polymerase, MgCl2, DNA khuôn, nồng độ và thể tích của từng thành phần được thể hiện dưới bảng 2.11. Bảng 2.10. Thành phần buffer, dNTP, cặp mồi Microsatellite (Primer), DNA, Taq polymerase cho một phản ứng PCR. Thành phần Thể tích (µl) PCR buffer 10 X 2,5 dNTP 10 mM 1 MgCl2 25 mM Nồng độ tối ưu Forward Primer 10 µM 0,2 43
Đồ án tốt nghiệp Reverse Primer 10 µM 0,2 Taq polymerase 5 U/µl Nồng độ tối ưu DNA khuôn 50 ng/µl 1 Phản ứng PCR được thực hiện trong máy luân nhiệt PCR iCycle (Bio – rad) với chu kỳ nhiệt. Hình 2.7. Chu trình nhiệt của máy PCR sau khi tối ưu nhiệt độ bắt cặp mồi microsatellite. Sản phẩm khuếch đại, sau đó tiến hành điện di trên gel agarose 2,5 %, hiệu điện 180 V, cường độ dòng điện là 400 mA trong thời gian 60 phút, TBE 1X, thể tích mẫu là 7 µl. Dùng thang M kích thước 100 bp để so sánh kích thước DNA, với thể tích thang M là 5 µl. Sau khi chạy điện di xong, gel được đưa vào máy chụp ảnh DNA để kiểm tra sản phẩm và chụp ảnh dưới ánh sang đèn UV 44
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết DNA Tách chiết DNA là một bước khởi đầu rất quan trọng, vì nó quyết định sự thành công cho phản ứng PCR sau này. Sản phẩm tách chiết DNA chạy điện di trên gel Agarose 1% cho thấy nồng độ DNA tách chiết tương đối cao với kích thước khá đồng đều. Các vạch điện di khá rõ nét, sản phẩm DNA ít bị đứt gãy trong quá trình tách chiết (Hình 3.1). Hình 3.1. Kết quả tách chiết DNA 15 mẫu vây đuôi cá tra ngẫu nhiên cho 4 quần đàn G2–2001, G2–2002 , G2–2003, G3–2001. Kết quả hình ảnh 3.1 cho thấy sản phẩm tách chiết DNA chạy điện di trên gel agarose 1 % cho vạch DNA đều, nồng độ DNA khá cao. Sản phẩm DNA tách chiết ít bị đứt, gãy và các DNA cùng kích thước. Quy trình tách chiết DNA đạt hiệu quả nhờ sử dụng protinase K và dung dịch 1(Solution 1) có vai trò như một dung dịch đệm gồm Tris, EDTA, phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường, phân hủy các protein liên kết với DNA. Đồng thời, việc sử dụng hai lần Ethanol 70 % và 100 % cho hiệu quả rửa giải và loại bỏ tạp chất cao, hiệu quả kết tủa DNA cao, không bị lẫn tạp và nồng độ đủ lớn đảm bảo cho phản ứng PCR diễn ra. 45
Đồ án tốt nghiệp 3.2. Kết quả tối ưu hóa phản ứng PCR 3.2.1. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của các cặp mồi microsatellite Tiến hành tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp cho 16 cặp mồi microsatellite theo gradient nhiệt độ ở bảng 2.4 (bảng gradient nhiệt độ lai cho 16 cặp mồi microsatellite). Sau khi thực hiện khảo sát nhiệt độ bắt cặp của 16 cặp mồi microsatallite thì có 12 cặp mồi có thể bắt mồi và hoạt động ở các nhiệt độ lai của nó, sản phẩm PCR của các cặp mồi khá rõ ràng, ít sản phẩm không đặc hiệu. Trong 16 cặp mồi có 4 cặp mồi không thể bắt mồi và hoạt động ở nhiệt độ lai, sản phẩm khếch đại mờ dù đã tối ưu: Ph–9, Ph–25, PSP – G579, PSP – G593. Hình minh họa phản ứng PCR gradient nhiệt độ của các cặp mồi trên mẫu DNA cá tra có chất lượng DNA tinh sạch tốt. Hình 3.2. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB12. Từ kết quả hình 3.2 cho thấy sản phẩm khuếch đại của gradian nhiệt độ cho sản phẩm không đồng đều ở các nhiệt độ bắt mồi khác nhau. Vạch sản phẩm đậm, rõ nét dần từ nhiệt độ 500C đến 57,10C. Tuy nhiên khi nhiệt độ lên đến 58,60C và 600C thì vạch sản phẩm bắt đầu mờ. Điều này cho thấy rằng nhiệt độ quá thấp hay quá cao ảnh hưởng đến kết quả PCR của mồi CB12. Giếng số 5 ứng với nhiệt độ 55,70C cho vạch sản phẩm rõ, lượng sản phẩm nhiều nhất nên được chọn là nhiệt độ bắt mồi tốt nhất đối với mồi CB12, nhiệt độ này chênh lệch không quá lớn với nhiệt độ Ta chuẩn là 52,10C. 46
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.3. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB13. Từ kết quả hình 3.3 cho thấy sản phẩm khuếch đại của gradian nhiệt độ cho sản phẩm tương đối đều ở các nhiệt độ bắt mồi. Sản phẩm khếch đại DNA nhiều, vạch sản phẩm đậm. Tuy nhiên ở nhiệt độ 62,10C cho vạch sản phẩm rõ, ít sản phẩm phụ và đẹp nhất. 62,10C được chọn là nhiệt độ bắt mồi tốt nhất đối với mồi CB13, nhiệt độ này chênh lệch tương đối lớn với nhiệt độ Ta chuẩn là 57,20C. Hình 3.4. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB14. Từ kết quả hình 3.4 cho thấy sản phẩm khuếch đại của gradian nhiệt độ cho sản phẩm không đồng đều ở các nhiệt độ bắt mồi khác nhau. Các giếng từ 3 – 7 sản phẩm PCR có nhiệt độ bắt mồi từ 52,9 – 58,60C cho vạch sản phẩm khá rõ, lượng sản phẩm nhiều. Trong khi các còn lại cho vạch sản phẩm mờ có thể do không phù hợp với nhiệt độ bắt cặp. Tuy nhiên, ứng với giếng số 4 là nhiệt độ 54,30C cho vạch 47
Đồ án tốt nghiệp sản phẩm rõ, lượng sản phẩm nhiều nhất. Nên 54,30C được chọn là nhiệt độ bắt mồi tốt nhất đối với mồi CB14, nhiệt độ này chênh lệch không quá lớn với nhiệt độ Ta chuẩn 52,10C. Hình 3.5. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB15. Từ kết quả hình 3.5 cho thấy sản phẩm khuếch đại của gradian nhiệt độ cho vạch sản phẩm không đồng đều ở các nhiệt độ bắt mồi khác nhau. Trong 8 giếng ứng với 8 nhiệt độ bắt cặp chỉ có giếng số 5 ứng với nhiệt độ 60,70C cho vạch sản phẩm rõ, ít sản phẩm phụ và đẹp nhất. Trong khi các còn lại cho vạch sản phẩm mờ có thể do không phù hợp với nhiệt độ bắt cặp. Nên 60,70C được chọn là nhiệt độ bắt mồi tốt nhất đối với mồi CB15, nhiệt độ này chênh lệch tương đối lớn với nhiệt độ Ta chuẩn là 57,80C. Hình 3.6. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB18. 48
Đồ án tốt nghiệp Từ kết quả hình 3.6 cho thấy sản phẩm khuếch đại của gradian nhiệt độ cho sản phẩm không đồng đều ở các nhiệt độ bắt mồi khác nhau. Vạch sản phẩm khá mờ ở các nhiệt độ đầu và cuối của dãy gradian nhiệt độ (50, 51,4, 57,1, 600C). Riêng số 4 với nhiệt độ 54,30C cho vạch sản phẩm khếch đại khá đậm và rõ nét. Nên 54,30C được chọn là nhiệt độ bắt mồi tốt nhất đối với mồi CB18, nhiệt độ này chênh lệch tương đối lớn với nhiệt độ Ta chuẩn 52,50C. Hình 3.7. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi CB19. Từ kết quả hình 3.7 cho thấy sản phẩm khuếch đại của gradian nhiệt độ cho sản phẩm có vạch không đồng đều ở các nhiệt độ bắt mồi khác nhau. Trong 8 giếng ứng với 8 nhiệt độ bắt cặp chỉ có giếng số 2 ứng với nhiệt độ 51,40C cho vạch sản phẩm rõ, ít sản phẩm phụ và đẹp nhất. Trong khi các còn lại cho vạch sản phẩm mờ có thể do không phù hợp với nhiệt độ bắt cặp. Nên 51,40C được chọn là nhiệt độ bắt mồi tốt nhất đối với mồi CB19, nhiệt độ này chênh lệch không quá lớn với nhiệt độ Ta chuẩn là 52,10C. 49
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.8. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi Phy01. Từ kết quả hình 3.8 cho thấy sản phẩm khuếch đại của gradian nhiệt độ cho sản phẩm có cùng kích thước. Vạch sản đậm dần từ đầu nhiệt độ đầu đến nhiệt độ giữa và mờ dần từ nhiệt độ giữa tới cuối dãy gradian. Trong 8 giếng ứng với 8 nhiệt độ bắt cặp có giếng số 4 ứng với nhiệt độ 64,30C cho vạch sản phẩm rõ, ít sản phẩm phụ và đẹp nhất. Nên 64,30C được chọn là nhiệt độ bắt mồi tốt nhất đối với mồi Phy01, nhiệt độ này chênh lệch không quá lớn với nhiệt độ Ta chuẩn là 660C. Hình 3.9. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi Phy03. Từ kết quả hình 3.9 cho thấy sản phẩm khuếch đại của gradian nhiệt độ khá mờ có thể do điều kiện tối ưu chưa phù hợp. Vạch sản mờ dần từ đầu nhiệt độ đầu đến nhiệt độ cuối dãy gradian. Riêng giếng số 7 và 8 ứng với nhiệt độ 58,60C và 600C không xuất hiện vạch sản phẩm. Giếng số 3 ứng với nhiệt độ 52,90C vạch sản phẩm rõ, ít sản phẩm phụ và đẹp nhất. Nên 52,90C được chọn là nhiệt độ bắt mồi tốt nhất đối với mồi Phy03, nhiệt độ này chênh lệch không quá lớn với nhiệt độ Ta chuẩn là 540C. 50
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.10. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi Ph–7. Từ kết quả hình 3.10 cho thấy sản phẩm khuếch đại của gradian nhiệt độ khá đậm. Vạch sản phẩm đậm dần từ giếng 1(550C) đến giếng 8(650C). Riêng giếng số 5 với nhiệt độ 60,70C cho vạch sản phẩm đậm, rõ và ít sản phẩm đặc hiệu nhất. Nên 60,7oC được chọn là nhiệt độ bắt mồi tốt nhất đối với mồi Ph–7, nhiệt độ này chênh lệch hơi lớn với nhiệt độ Ta chuẩn là 57,10C. Hình 3.11. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi Ph–21. Từ kết quả hình 3.11 cho thấy sản phẩm khuếch đại của gradian nhiệt độ khá mờ ở tất cả các nhiệt độ bắt cặp. Tuy nhiên với giếng 5 với nhiệt độ 60,70C cho vạch sản phẩm đậm, rõ và ít sản phẩm đặc hiệu nhất. Nên 60,70C được chọn là nhiệt độ bắt mồi tốt nhất đối với mồi Ph–21, nhiệt độ này chênh lệch hơi lớn với nhiệt độ Ta chuẩn là 57,10C. 51
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.12. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi PSP–G579. Từ kết quả hình 3.12 cho thấy sản phẩm khuếch đại của gradian nhiệt độ cho sản phẩm tương đối đều ở các nhiệt độ bắt mồi. Sản phẩm khếch đại DNA nhiều, vạch sản phẩm đậm. Tuy nhiên giếng số 3 ứng với nhiệt độ 52,90C cho vạch sản phẩm rõ, ít sản phẩm phụ và đẹp nhất. Nên 52,90C được chọn là nhiệt độ bắt mồi tốt nhất đối với mồi PSP–G579, nhiệt độ này gần với nhiệt độ Ta chuẩn là 54,30C. Hình 3.13. Phản ứng PCR gradian nhiệt độ của cặp mồi Pg–13. Từ kết quả hình 3.13 cho thấy sản phẩm khuếch đại của gradian nhiệt độ cho sản phẩm không đều ở các nhiệt độ bắt mồi khác nhau. Sản phẩm khếch đại DNA có vạch đậm và nhiều. Tuy nhiên giếng số 4 ứng với nhiệt độ 54,30C cho vạch sản phẩm rõ, ít sản phẩm phụ và đẹp nhất. Nên 54,30C được chọn là nhiệt độ bắt mồi tốt nhất đối với mồi Pg–13, nhiệt độ này đúng với nhiệt độ Ta chuẩn là 54,30C. Bảng 3.1. Nhiệt độ bắt cặp của các mồi sau khảo sát nhiệt độ tối ưu. 52
Đồ án tốt nghiệp Ph- Ph- PSP- Pg- Mồi CB12 CB13 CB14 CB15 CB18 CB19 Phy01 Phy03 7 21 G579 13 Ta chuẩn 52,1 57,2 52,1 57,8 52,5 52,1 66 54 57,1 57,1 54,3 54,3 (0C) Ta thực tế 55,7 62,1 54,3 60,7 54,3 51,4 64,3 52,9 60,7 60,7 52,9 54,3 (0C) Sau khi tiến hành tối ưu hóa nhiệt độ bắt cặp cho 16 cặp mồi microsatellite theo gradient nhiệt độ. Nhiệt độ khảo sát trong nghiên cứu này không chênh lệch ở mức cho phép so với nhiệt độ khảo sát của các tác giả đã công bố, điều này chứng tỏ nhiệt độ mà nghiên cứu này khảo sát được là tối ưu cho từng cặp mồi phù hợp với điều kiện thiết bị và hóa chất tại nơi nghiên cứu. 3.2.2. Khảo sát nồng độ MgCl2 Theo kết quả từ nghiên cứu “Nghiên cứu chỉ thị vi vệ tinh (microsatellite) xác định huyết thống cá tra (Pagasius hypophthalmus)” của tác giả Nguyễn Hữu Ninh và Lưu Thị Hương Giang, năm 2012 ; và nghiên cứu “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật di truyền phân tử trong tạo giống thủy sản có giá trị kinh tế cao” của tác giả Phạm Anh Tuấn, năm 2005 cho thấy rằng nồng độ MgCl2 có ảnh hưởng đến phản ứng PCR. Nghiên cứu này đã tiến hành khảo sát nồng độ MgCl2 để tìm ra nồng độ xúc tác tốt nhất. Dựa trên kết quả nhiệt độ bắt cặp tối ưu đã được xác định ở bảng 3.1 (Bảng nhiệt độ bắt cặp của các mồi sau khảo sát nhiệt độ tối ưu), tiếp tục tối ưu hóa nồng độ MgCl2 cho 12 cặp mồi microsatellite. Như vậy dựa vào bảng 2.9 (Bảng nồng độ MgCl2 khảo sát cho từng cặp mồi microsatellite) thay vì tối ưu hóa nồng độ xúc tác của MgCl2 thì tối ưu hóa thể tích xúc tác của MgCl2 sau đó suy ra nồng độ tương ứng. Kết quả tối ưu cho thấy ở các thể tích khác nhau thì MgCl2 đều có khả năng xúc tác cho phản ứng PCR với các mồi để tạo ra sản phẩm. Các kết quả được chọn sau 3 lần lặp lại phản ứng. 53
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.14. Phản ứng tối ưu nồng độ Hình 3.15.Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi CB14. MgCl2 của cặp mồi CB15. Hình 3.14 và 3.15 là hai hình minh họa cho phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của hai cặp mồi CB14 và CB15. Ở hình số 3.14, các vạch sản phẩm ở 3 giếng ứng với thể tích MgCl2: 1, 2; 2,5 µl tương đối đều nhau nhưng không rõ nét, còn giếng ứng với thể tích 1,5 và 3 µl thì không có vạch sản phẩm khếch đại, chứng tỏ rằng nồng độ MgCl2 chưa tối ưu. Điều này cho thấy các nồng độ MgCl2 này không phù hợp cho cặp mồi microsatellite CB14. Trong 3 giếng có vạch sản phẩm khếch đại thì giếng có thể tích MgCl2 1 µl ứng với nồng độ là 1,25 mM đậm hơn chứng tỏ nồng độ MgCl2 1,25 mM là nồng độ tối ưu cho cặp mồi microsatellite CB14. Ở hình 3.15, giếng số 3, 4 và 5 không có vạch sản phẩm khếch đại nên thể tích và nồng độ MgCl2 ứng với 3 giếng trên không tối ưu lắm. Vạch sản phẩm khếch đại ở giếng số 1 khá rõ nét nên thể tích MgCl2 là 1 µl tương ứng với nồng độ MgCl2 là 1,25 mM thích hợp cho mồi CB15. Tương tự, thực hiện phản ứng cho các mồi còn lại được kết quả nồng độ MgCl2 tối ưu và hình minh họa như sau: 54
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.16. Phản ứng tối ưu nồng độ Hình 3.17. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi CB12. MgCl2 của cặp mồi CB13. Hình 3.18. Phản ứng tối ưu nồng độ Hình 3.19. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi CB18. MgCl2 của cặp mồi CB19 Hình 3.20. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi Phy01. 55
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.21. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi Phy03. Hình 3.22. Phản ứng tối ưu nồng độ Hình 3.23. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi Ph-7. MgCl2 của cặp mồi Ph-21. Hình 3.24. Phản ứng tối ưu nồng độ Hình 3.25. Phản ứng tối ưu nồng độ MgCl2 của cặp mồi PSP-G579. MgCl2 của cặp mồi Pg–13. Bảng 3.2. Bảng kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 của 12 cặp mồi. 56
Đồ án tốt nghiệp PSP- Phy0 Phy0 Ph- Pg- Mồi CB12 CB13 CB14 CB15 CB18 CB19 Ph-7 G57 1 3 21 13 9 Thể tích MgCl2 2,.5 1,5 1 1 1 1 1 1 1.5 1,5 1 1 (µl)/ 20 µl Nồng độ xúc tác 3,125 1.875 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 1,875 1,875 1,25 1,25 (mM) 3.2.3. Khảo sát nồng độ Taq DNA polymerase Dựa trên kết quả nhiệt độ bắt cặp tối ưu đã được xác định ở bảng 3.1 (Bảng nhiệt độ bắt cặp của các mồi sau khảo sát nhiệt độ tối ưu) và kết quả nồng độ MgCl2 tối ưu đã được xác định ở bảng 3.2 (Bảng kết quả tối ưu nồng độ MgCl2 của 12 cặp mồi), tiếp tục tối ưu hóa nồng độ Taq DNA polymerase để nồng độ xúc tác tốt nhất cho phản ứng PCR. Tiến hành phản ứng tối ưu hóa nồng độ Taq DNA polymerase theo các nồng độ dựa vào bảng 2.10 (Bảng nồng độ Taq DNA polymerase khảo sát) được kết quả minh họa ở hình 3.26. Hình 3.26. Kết quả điện di thay đổi nồng độ Taq DNA polymerase trên gel Agarose 2,5 %. Ở nồng độ Taq 1,25 U (giếng 1) cho tín hiệu khuếch đại rất yếu, có những lần không cho kểt quả. Lượng enzyme cần thiết phụ thuộc vào hàm lượng bản mẫu 57
Đồ án tốt nghiệp DNA và kích thước vạch sản phẩm PCR. Trên thực tế thành phần này rất ít khi hiệu chỉnh. Nhưng vì ở đây sử dụng nồng độ thấp nhất (1,25 U) của nhà sản xuất mà không cho kết quả như mong muốn nên băt buộc phải tăng nồng độ enzyme lên. Khi tăng nồng độ Taq DNA polymerase lên 1,5 U (giếng 2) thì sản phẩm khếch đại rất tốt. Tiếp tục tăng lên 1,75 U (giếng 3) hay 2 U (giếng 4) thì sản phẩm khếch đại vẫn không thay đổi so với 1,5 U (giếng 2). Đê tiết kiệm hóa chất mà vẫn đạt được hiệu suất phản ứng PCR cao thì nồng độ 1,5 U Taq DNA polymerase được cho là tối ưu. Theo một số nghiên cứu như nghiên cứu của Kainz (2000) cho rằng khi số phần tử DNA tổng số vượt gấp 30 lần số phần tư DNA polymerase là thời điểm xảy ra sự bảo hòa sản phẩm khếch đại của phản ứng PCR. Vì vậy khuyến cáo không nên tăng nồng độ enzyme DNA polymerase quá cao vì các chất trong dung dịch bảo quản enzyme có thể gây ức chế phản ứng PCR hoặc là sẽ tạo ra lượng lớn sản phẩm không đặc hiệu khác nhau. Tuy nhiên cũng tùy thuộc vào đặc tính enzyme của hãng sản xuất. Cụ thể đối với nhà sản xuất Bioline với hướng dẫn đi kèm hóa chất, lượng enzyme được khuyến cáo có thể tăng giảm nồng độ Taq DNA polymerase từ 1,25 U đến 2 U mà không ảnh hưởng đến phán ứng PCR. 3.3. Khảo sát tính hoạt động của các cặp mồi microsatellite Sau khi có kết quả nhiệt độ bắt cặp, nồng độ MgCl2 và nồng độ Taq tối ưu cho mỗi cặp mồi microsatellite, thực hiện phản ứng PCR với các mẫu DNA tách chiết từ mẫu vây cá Tra được lựa chọn ngẫu nhiên. Mục đích của việc thực hiện phản ứng PCR này nhằm tiếp tục kiểm tra độ hoạt động của từng cặp mồi microsatellite, đồng thời kiểm tra tính ổn định của phản ứng sau khi đã tối ưu hóa để làm nền tảng cho khảo sát các tham số di truyền trên các quần thể cá tra thu thập tích hợp cho chương trình chọn giống. Sau khi thực hiện các phản ứng kiểm tra độ hoạt động của từng cặp mồi microsatellite và kiểm tra tính ổn định của phản ứng sau khi đã tối ưu hóa chọn được 6 cặp mồi có độ hoạt động tốt nhất từ 12 cặp mồi đã tối ưu: CB13, CB14, CB15, CB19, Pg–13 và Ph–7. Hình 3.27, 3.28 là các hình ảnh đại diện minh họa 58
Đồ án tốt nghiệp cho kết quả phản ứng PCR kiểm tra tính ổn định và đa hình của 4 mẫu cá tra đại diện của các cặp mồi. Hình 3.27. Sản phẩm khuếch đại của mồi CB19 trên 12 mẫu cá tra. Hình 3.28. Hình kiểm tra đa hình sản phẩm khuếch đại của các mồi CB13, CB14, CB18, CB19, Pg-13, Ph-7 trên 4 mẫu cá tra. Tất cả các cặp mồi microsatellite đều hoạt động tốt trên hầu hết các mẫu cá tra phân tích (Hình 3.28). Quá trình tối ưu hóa phản ứng PCR đạt kết quả cao, lượng sản phẩm PCR lớn, các vạch sản phẩm rõ nét và không tạo smear nhiều. Đa số các vạch DNA giữa các các mồi có sự đa hình,và nội bộ các vạch DNA trong cùng một mồi cũng có sự đa hình. Nghĩa là các mồi này có tính đa hình phù hợp ứng dụng cho nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền vật liệu cá tra trong các nghiên cứu tiếp theo. 59
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Quá trình tách chiết DNA của cá Tra với quy trình tham khảo đạt hiệu quả cao. Lượng DNA mẫu thu được khá nhiều, ít bị đứt gãy và không lẫn nhiều tạp chất. Kết quả tối ưu hóa đạt hiệu quả cao, các phản ứng PCR với những yếu tố đã tối ưu hóa tạo ra lượng sản phẩm PCR nhiều hơn hẳn quy trình chuẩn. Vạch sản phẩm PCR rõ nét và không có nhiều sản phẩm tạp. Chọn được 12 cặp mồi microsatellite được chọn ra từ 16 cặp mồi đều hoạt động tốt trên số lượng mẫu lớn. Sản phẩm PCR tạo ra nhiều và ít sản phẩm không đặc hiệu. Chọn được 6 cặp mồi microsatellite có tính đa hình cao cho các nghiên cứu tiếp theo. 4.2. Đề nghị Microsatellite (SSR) là chỉ thị phân tử triển vọng để phân tích đa dạng di truyền. Tuy nhiên, trong phạm vi của đề tài sử dụng số lượng các cặp mồi microsatellite còn hạn chế. Do đó cần tiếp tục nghiên cứu, phát triển thêm nhiều cặp mồi microsatellite hơn nữa để đánh giá đa dạng di truyền với độ tin cậy cao hơn, phục vụ cho công tác chọn giống. Cần tiến hành thí nghiệm trên một số lượng mẫu lớn, khảo sát và kết hợp thêm một số cặp mồi microsatellite để có kết quả chính xác về mức độ đa dạng di truyền của cá Tra thu thập trong chương trình chọn giống. Kết quả phân tích của các bước sau cần được thực hiện trên hệ thống điện di mao quản để tăng hiệu quả phân tách các phân đoạn DNA microsatellite. 60
Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (1999). Di truyền phân tử - Những nguyên tắc căn bản trong chọn giống cây trồng. Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. 2. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2005). Sinh học phân tử: Giới thiệu phương pháp và ứng dụng. Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. 3. Bùi Thị Liên Hà (2004). Bước đầu thăm dò ứng dụng một số chỉ thị DNA phân tích đa dạng di truyền cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). Đề tài tập sự, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II. 4. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003). Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Giáo Dục, TP. Hồ Chí Minh. 5. Huỳnh Quốc Khanh (2009). Thực nghiệm ương cá Tra giống (Pangasianodon Hypophthalmus) tại trung tâm giống thủy sản tỉnh An Giang. Trường Đại Học Thủy Sản Cần Thơ. 6. Nguyễn Thị Lang (2002). Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. 7. Nguyễn Văn Hảo, Nguyễn Văn Sáng, Phạm Đình Khôi, Đinh Hùng, Vũ Hải Định (2005). Chọn giống cá tra nhằm nâng cao tỷ lệ philê: Các thông số di truyền. Tuyển tập báo cáo hội thảo toàn quốc về nghiên cứu và ứng dụng khoa học công nghệ vào nuôi trồng thủy sản, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II: 359 – 368. 8. Nguyễn Văn Thường (2008). Tổng quan dẫn liệu về định loài cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) phân bố ở vùng hạ lưu sông Mê Kong, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ(1): 84 – 89. 9. Phạm Thành Hổ (2005). Di truyền học. Nhà xuất bản Giáo Dục, TP. Hồ Chí Minh. 10. Phạm Thành Hổ (2005). Nhập môn Công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Giáo Dục, TP. Hồ Chí Minh. 61
Đồ án tốt nghiệp 11. Trịnh Đình Đạt (2006). Công nghệ sinh học tập 4: “Công nghệ Di truyền”. Nhà xuất bản Giáo dục, TP. Hồ Chí Minh. 12. Trương Thủ Khoa, Trần Thị Thu Hương (1993). Định loại cá nước ngọt vùng đồng bằng sông Cửu Long. Khoa thủy sản trường đại học Cần Thơ. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 13. Ferraris C.J. (2007). Checklist of Catfishes, recent and fossil (Osteichthyes, Siluriformes), andcatalogue of siluriform primary types. Zootaxa 1418 © 2007 Magnolis Press. 14. Hayden M.J., Sharp P.J. (2001). Targeted development of informative microsatellite (SSR) marker, Nucleic Acid Research, 29: e44. 15. Hung L.T., Lazard J., Mariojoul C., Moreau Y. (2003). Comparison of starch utilization in fingerlings of two Asian catfishes from the Mekong River (Pangasius bocourti) Sauvage, 1980,( Pangasius hypophthalmus) Sauvage, 1878. Aquaculture Nutrition 9: 215 – 222. 16. Kashi Y., Hallerman E. M., Soller M. (1990). Marker-assisted selection of candidate bulls for progeny testing programs. Animal Production 51: 63 – 74. 17. Kottelat M., Vidthayanon C. (1993). Boraras micros, a new genus and species of minute freshwater fish from Thailand (Teleostei: Cyprinidae). Ichthyological Exploration Freshwater 4 (2): 161 – 176. 18. Murray P.R., Jones R.N., Allen S.D. (1993). Multilaboratoey evaluation of the in vitro activity of 13 beta-lactam antibioties against 1471 clinical isolatoes of aerobic and anaerobic bacteria. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 16: 191 – 203. 19. Poulsen A.F., Hortle K. G., Valbo-Jorgensen, Chan J.S., Chhuon C.K., Viravong S., Bouakhamvongsa K., Suntornratana U., Yoorong N., Nguyen T.T., Tran B.Q. (2004). Distribution and ecology of some important riverine fish species of the Mekong River Basin. MRC Technical Paper No. 10. 62
Đồ án tốt nghiệp 20. Powell W., Morgante M., Andre C., Hanafey M., Vogel J., Tingey S., Rafalski A. (2004). The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (Microsatellite) markers for germplasm analysis. Genetics and Molecular Biology 27 (4): 579 – 588. 21. Rainboth W.J. (1996). Fishes of the Cambodian Mekong. FAO species identification sheets for fishery purposes. Food and Agriculture Organization, Rome. 265p. 22. Roberts T.R., Vidthayanon C. (1991). Systematic revision of the asian catfish family Pangasiidae with biological observations and descriptions of three new species. Proceedings of the Academy of Natural Sciences of Philadelphia 143: 97 – 144. 23. Tautz D. (1984). Hypervariability of simple sequences as a general source of polymorphic DNA markers. Nucleic Acids Research 12: 4127 – 4138. 24. Vidthayanon C. (1993). Taxonomic revision of the Catfish family Pangasiidae. The sis sumitted to Tokyo University of Fisheries, Laboratory Aquactic Biology, Department of Aquatic Biosciences, Tokyo University of Fisheries. THAM KHẢO TỪ INTERNET 25. Trí Quang, Vực dậy chất lượng cá tra giống, 7/2015 11276.tsvn 26. Lạc Long VCCI Cần Thơ, Phát triển cá Tra phải đầu tư từ giống, 7/2015 tu-giong/ 27. Thành Công, Cần nhiều ñ lực để nâng cao chất lượng cá tra giống, 7/2015 su-kien/Can- nhieu-no-luc-de-nang-cao-chat-luong-ca-tra-giong.aspx 28. Tình hình sản xuất, tiêu thụ thủy sản tháng 1 năm 2015, 7/2015 63
Đồ án tốt nghiệp 1/tinh-hinh-san-xuat-tieu-thu-thuy-san-thang-1-nam-2015/ 29. Phạm Tiến Thành, Bước đầu đánh giá đa dạng di truyền quần đàn cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) có nguồn gốc tự nhiên, từ các trại giống và từ chương trình chọn giống ở Việt Nam, 7/2015 pangasianodon-hypophth 30. Nguyễn Văn Sáng, Viện nghiên cưu nuôi trồng thủy sản II, Đánh giá hiệu quả chọn giống cá tra, 7/2015 giong/Danh-gia-hieu-qua-chon-giong-ca-tra-28/ 31. 64