Đồ án Thử nghiệm tạo thức uống Probiotic từ nước cam

Nội dung text: Đồ án Thử nghiệm tạo thức uống Probiotic từ nước cam

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM TẠO THỨC UỐNG PROBIOTIC TỪ NƯỚC CAM Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : PGS.TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG Sinh viên thực hiện : BÙI NHỰT TRƯỜNG MSSV: 107111193 Lớp: 07DSH4 TP. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2011
2. Ngày nay, ngành công nghiệp đồ uống đang có những bước phát triển lớn với nhiều dạng sản phẩm đa dạng hơn cho ra thị trường, nhằm đáp ứng nhu cầu của con người. Thị hiếu hiện nay đặt ra là sản phẩm thức uống không những giúp thỏa mãn nhu cầu giải khát đơn thuần, mà còn đáp ứng nhu cầu về dinh dưỡng, giá trị của thực phẩm chức năng như nâng cao sức đề kháng, chống oxi hóa, hỗ trợ tiêu hóa Sự lên men của vi khuẩn lactic trong thực phẩm góp phần làm tăng giá trị dinh dưỡng của thực phẩm, hầu hết các dạng sản phẩm này đều không chứa cồn, có vị chua ngọt nhẹ giàu dinh dưỡng và năng lượng. Một trong những thành tựu lớn nhất của công nghệ sinh học hiện nay có thể kể đến probiotic là chế phẩm chứa những “vi sinh vật thân thiện” có lợi cho sức khỏe của con người được sử dụng như một dạng thực phẩm từ rất lâu ví dụ như sữa chua men sống, Amazake truyền thống của người Nhật, Kunumzaki, hoặc sử dụng dưới dạng thương phẩm cốm vi sinh, viên nén Những “ vi sinh vật thân thiện này” sau khi thâm nhập vào cơ thể người, chúng cư ngụ trong hệ tiêu hóa và một số niêm mạc, chúng có vai trò làm hạn chế sự xâm nhập của các vi khuẩn có hại vào ruột, cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột đồng thời nâng cao khả năng chuyển hóa dinh dưỡng và đào thải bã tốt hơn, điều này giúp nâng cao khả năng đề kháng của cơ thể trước sự tấn công của những vi sinh vật cơ hội gây các bệnh tiêu chảy, nhiễm trùng tiết niệu, viêm ruột hay hội chứng ruột kích thích Ngoài ra chế phẩm probiotic an toàn và tự nhiên phần lớn không có hại gì cho sức khỏe [17]. Các sản phẩm có chứa probiotic đã được sử dụng tại rất nhiều nước trên toàn thế giới như Mỹ, Nhật, Châu Âu Probiotic được bổ sung vào rất nhiều sản phẩm như thực phẩm thông thường: sữa chua để ăn, sữa chua lỏng để uống, nước trái cây đến các thực phẩm bổ sung dành cho người bệnh và dưới dạng thuốc không cần kê toa như viên nén, hay dạng bột Đã có nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học về sản phẩm thức uống Probiotic lên men từ cà chua, nước ép bắp cải, gạo lức, malt, chanh dây gặt hái được những thành công bước đầu, góp phần làm đa dạng hóa các dạng thực phẩm lên men cho con người [8,9,10,11,12]. Cam là loại cây ăn quả được trồng phổ biến ở nước ta, cam cho quả quanh năm và được sử dụng làm thức uống từ rất lâu. Nghiên cứu cho thấy nước cam có nhiều 1
3. chất dinh dưỡng hơn các loại nước hoa quả khác như táo, dứa, nho và mận Nước cam chứa nhiều vitamin C, nhóm B6, kali, folate, thiamin giúp cơ thể điều hòa thân nhiệt, nâng cao đề kháng, tái sản xuất tế bào, chống oxi - hóa Trên thị trường hiện nay cũng có nhiều mặt hàng sản phẩm đồ uống được chế biến từ cam đã và đang khẳng định vị thế trên thị trường. Tuy nhiên dạng sản phẩm nước cam bổ sung probiotic vẫn còn khá xa lạ trên thị trường hiện nay [18]. Xuất phát từ những nhu cầu thực tế, việc tạo ra một dạng thức uống probiotic từ nước cam hứa hẹn sẽ mang lại một dạng thức uống có lợi cho sức khỏe, đáp ứng thị hiếu tiêu dùng và góp phần làm đa dạng hóa các sản phẩm probiotic thức uống. 1.1 Nội dung đề tài Chúng tôi tiến hành khảo sát nhằm tìm ra những điều kiện lên men tốt nhất cho Lactobacillus acidophilus trong môi trường nước ép cam có bổ sung đường và nước, tiến hành tối ưu hóa thực nghiệm tạo sản phẩm thức uống probiotic có giá trị dinh dưỡng và cảm quan thích hợp. Bước đầu xây dựng được quy trình sản xuất thức uống probiotic từ nước ép cam. 1.2 Giới hạn đề tài Đề tài chỉ thử nghiệm trong điều kiện quy mô nhỏ ở phòng thí nghiệm chưa thử nghiệm ở quy mô lớn. Do điều kiện trang thiết bị và thời gian thực hiện đề tài quá ngắn nên chưa thể tiến hành khảo sát, lập đường cong sinh trưởng của L.acidophilus trong môi trường trung gian nước cam ép pha loãng có bổ sung đường sucrose và cao nấm men. 2
4. 2.1 Giới thiệu chung về Probiotic Probitotic trong tiếng Hy Lạp cổ có nghĩa là “vì sức sống”. Kể từ lúc được phát hiện ra vào đầu thế kỷ 20 bởi nhà bác học đoạt giải nobel người Nga Elie Matchnikoff đến nay probiotic đã được coi như một loại “thần dược” tự nhiên. Khái niệm về probiotic phát triển theo nhiều thời gian. Lily và Stillwell (1965) đã trước tiên mô tả probiotic như một dạng hỗn hợp được tạo thành bởi một động vật nguyên sinh có tác động thúc đẩy sự phát triển của đối tượng khác. Sau đó, Parker (1974) đã áp dụng khái niệm này cho mảng chăn nuôi gia súc là “sự ảnh hưởng tốt đối với cơ thể vật chủ bằng việc góp phần vào cân bằng hệ vi sinh vật trong ruột của nó”. Khái niệm “probiotic” được ứng dụng để mô tả “cơ quan và chất” mà góp phần vào cân bằng hệ vi sinh vật ruột. Định nghĩa chung này sau đó được làm chính xác hơn bởi Fuller (1989), ông định nghĩa probiotic như “một chất bổ trợ thức ăn chứa vi sinh vật sống có lợi đến vật chủ bằng việc cải thiện cân bằng hệ vi sinh vật ruột của nó”. Khái niệm này sau đó được phát triển xa hơn nhờ Havenaar va Huis Int Veld (1992) “ probiotic là một hoặc nhiều sự kết hợp các vi sinh vật sống, ảnh hưởng có lợi đến vật chủ bằng việc hoàn thiện hệ vi sinh vật đường ruột”. Vi khuẩn Bifidobacterium và vi khuẩn Lactobacillus có trong hệ vi sinh đường ruột tiêu biểu cho probiotic. Hai loại vi khuẩn này từ lâu đã được Nhật bản và châu Âu sử dụng trong kỹ nghệ sản xuất sữa chua lên men. Tại Hoa Kỳ, trên 60% Yogurt có chứa Bifidobacterium và Lactobacillus. Trong kỹ nghệ Yogurt, các probiotic thường được thấy sử dụng: Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Lactobacillus acidophilus và Lactobacillus casei. Qua các nghiên cứu về probiotic thì Bifidobacteria và Lactobacilli là 2 chi được sử dụng rộng rãi nhất nhờ khả năng lên men sinh acid mạnh trên nhiều loại cơ chất khác nhau. Bên cạnh đó nấm men S.cerevisia , một vài vi khuẩn E.coli và Bacillus spp cũng là những dạng được sử dụng. Điều đáng quan tâm nữa là muốn đạt hiệu quả khi sử dụng các chế phẩm probiotic thì lượng vi sinh vật có lợi này phải tồn tại được trong hệ tiêu hóa ở một số lượng nhất định. Trở ngại thường gặp phải là acid của dịch vị tiêu hóa có thể hủy diệt 3
5. tới 90% probiotic đã được ăn vào do đó cần tiêu thụ một số lượng thật lớn probiotic để bù đắp số probiotic mất mát. Tiêu chí để đánh giá một chế phẩm probiotic được sử dụng hiệu quả cho cơ thể gồm: Có khả năng sống sót qua đường tiêu hóa nghĩa là chịu được acid và dịch tiêu hóa dạ dày. Có khả năng kết dính trên bề mặt biểu mô ruột và tồn tại lâu dài trong đường tiêu hóa người. Có hoạt tính đối kháng chống lại các vi sinh vật gây bệnh như Escherichia coli, Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Helicobacter pylori Kích thích miễn dịch nhưng không gây viêm. Kháng đột biến và kháng ung thư (Mattila et al, 2002). 2.2 Cơ chế hoạt động của probiotic 2.2.1 Bám kết trên biểu mô ruột Trước hết muốn đến được biểu mô ruột chúng phải vượt qua được dạ dày, tức là phải có khả năng chịu được pH thấp và các men tiêu hóa, sau đó là gắn vào các vị trí của biểu mô, vi khuẩn probiotic sẽ tạo thành một lớp “đệm” vi khuẩn nằm trên các biểu mô ruột, cạnh tranh thức ăn và vị trí dính bám đối với những vi sinh vật. 2.2.2 Sinh các chất kháng vi sinh vật Khả năng tổng hợp các chất kháng vi sinh vật như bacterioxin, acid lactic, H2O2 Quan trọng hơn cả là khả năng sinh bacteriocin của probiotic, bacteriocin là nhóm peptide hoặc protein được tổng hợp nhờ Ribosome và có hoạt tính kháng vi sinh vật rất cao (Cotter et al., 2005). Các loài vi sinh vật có hoạt tính Probiotic được trình bày ở bảng 2.1 4
6. Bảng 2.1 Các loài vi sinh vật có hoạt tính Probiotic Lactobacillus Bifidobacteri vi khuẩn lactic Không phải vi khuẩn lactic um khác L. acidophilus B.adolescenti Enterococcus Bacillus cereus var. Toyoi L. amylovorus s faecalis Escherichia coli Nissle 1917 L. casei B. animalis Enterococcus Propionibacterium L. cripatus B. bifidum faecium freudenreichii L. delbrueckii B. breve Lactococcus Saccharomyces cerevisiae subsp.Bulgaric B. infantis lactis Saccheromyces boulardii us B. lactis Leuconostoc L. gallinarum B. Longum mesenteroides L. gasseri Pediococcus L. johnsonii acidolactici L. paracasei Streptococcus L. plantarum thermophilus L. reuteri Sporolactobacil L. rhamnosus lus inulinus [20]. 2.2.3 Hoạt tính kích thích điều hòamiễn dịch và các hoạt tính khác Vi khuẩn probiotic có khả năng huy động tế bào miễn dịch, hoạt hóa các đáp ứng miễn dịch thích hợp nhờ một cơ chế phức tạp bắt đầu bằng sự tương tác giữa các tề bào probiotic và tế bào của hệ miễn dịch. Nhiều nghiên cứu gần đây còn cho rằng probiotic có tác dụng kháng đột biến và kháng ung thư nhờ sự tương tác của các tế bào này với các tác nhân gây đột biến và ung thư [20]. 2.3 Những ứng dụng và lợi ích của probiotic 2.3.1 Có khả năng kháng ung thư và chống các yếu tố đột biến Nhiều nghiên cứu đã cho thấy vi khuẩn probiotic có thể làm giảm nguy cơ ung thư ruột kết và ung thư bàng quang. Ngoài ra có tác dụng khử chất độc gây ung thư có trong cơ thể và làm chậm sự phát triển của các khối u bướu. Cơ chế này đã được nghiên cứu và kết luận rằng nhờ khả năng gắn kết và phân hủy được các chất gây ung thư. Sản xuất các hợp chất kháng ung thư : sinh ra những acid yếu có lợi cho đường ruột như acid butyric có vai trò giảm tạo ra những chất gây ung thư trong đường ruột và kích thích các tế bào niêm mạc ruột bị tổn thương mau lành và hồi phục chức năng. Điều hòa những enzyme gây tiền chất ung thư ruột như các enzyme phân 5
7. (nitroreductase, β-glucuronidase) có khả năng chuyển các chất tiền sinh ung thư thành chất gây ung thư trong trực tràng. Ức chế khối u bằng một cơ chế đáp ứng miễn dịch. Tuy nhiên, những vấn đề vẫn còn giới hạn trong mô hình in vitro, việc mở rộng ra trên người để dự phòng ung thư còn là vấn đề đang tranh cãi. Hình 2.1 Những tác động của probiotic [16 ]. 2.3.2 Kiềm hãm vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa Probiotic kìm hãm sự phát triển của mầm bệnh và cải thiện hệ thống miễn dịch của dạ dày và giảm nguy cơ nhiễm một số mầm bệnh phổ biến như Salmonella và Shigella. Để có thể tác động lên hệ sinh thái vi khuẩn đường ruột thì điều khá quan trọng đó là probiotic phải có khả năng chống lại các vi khuẩn gây bệnh bằng cách tiết ra các kháng khuẩn hay là những chất cạnh tranh. Tác động của probiotic đến hệ vi sinh vật đường ruột được mô tả như sau : Cạnh tranh dinh dưỡng cần thiết cho sự sống sót của mầm bệnh. Cạnh tranh với các nguồn bệnh để ngăn chặn sự bám dính của chúng vào đường ruột. Vị trí nào được các vi khuẩn probiotics gắn kết thì các độc tố đường ruột bị ngăn chặn. Vi khuẩn probiotic tạo ra các chất đa dạng ức chế cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương. Những hợp chất này có thể làm giảm không chỉ những vi 6
8. sinh vật mang mầm bệnh có thể sống được mà còn ảnh hưởng đến sự trao đổi chất của vi khuẩn và sự tạo ra các độc tố. Qua nghiên cứu cho thấy các kháng sinh và chất cạnh tranh thường thấy ở các chủng probiotic là: bacteriocin, hydrogen peroxide, acid hữu cơ (acid lactic, acid acetic), diacetyl. Điều này được thực hiện bằng cách giảm pH khoang ruột thông qua sự tạo ra các acid béo chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yếu là acetate, propionate, và butyrate, nhất là acid lactic. 2.3.3 Cải thiện việc sử dụng lactose ở những người không dung nạp được lactose: Sự không dung nạp đường lactose (có nhiều trong sữa) xảy ra khá phổ biến ở nhiều người, gây ra sự đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu thực phẩm có chứa đường lactose. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy một số chủng vi khuẩn lên men acid lactic trong sản phẩm sữa lên men có thể cải thiện các triệu chứng kháng đường lactose của cơ thể bằng cách cung cấp men lactase cho đường ruột và dạ dày. Sử dụng các thực phẩm có chứa các chủng vi khuẩn này giúp cải thiện rõ rệt khả năng tiêu hóa đường lactose. 2.3.4 Làm giảm cholesterol trong huyết thanh : Probiotic có tác dụng làm giảm nồng độ cholesterol trong huyết thanh, làm giảm huyết áp cao. Ngoài ra, giúp nhanh chóng bình phục sau khi mắc các bệnh tiêu chảy và sử dụng nhiều kháng sinh. 2.3.5 Kích thích hệ thống miễn dịch : Thực phẩm chức năng probiotic có thể góp phần cải thiện hệ thống miễn dịch của cơ thể, làm tăng hàm lượng globulin. Sự hấp thụ thực phẩm probiotic đối với người ốm và trẻ nhỏ cải thiện rõ rệt sức đề kháng của cơ thể. Tăng cường hiệu quả của một số vaccin như vaccin thương hàn. Những cải thiện hệ miễn dịch bởi probiotic gồm tăng cường hoạt động của đại thực bào, nâng cao khả năng thực bào của sinh vật hay nguồn carbon. Tăng khả năng sản xuất kháng thể thường là loại IgG và IgM và interferon (nhân tố kháng virus không đặc hiệu). Tăng cường khả năng định vị kháng thể trên bề mặt ruột thường là IgA. 7
9. 2.3.6 Các tác dụng khác : Probiotic còn có một số tác dụng khác như giảm tác dụng phụ của kháng sinh, giảm nhiễm trùng đường niệu ở người. Đối với việc sử dụng probiotic trong chăn nuôi còn mang lại hiệu quả cao nhờ có khả năng tăng trọng ở gia cầm, giảm tỉ lệ mắc các bệnh do nhiễm trùng và tiêu chảy ở động vật non. Bảng 2.2 : Tác dụng lâm sàng của một số chủng probiotic Chủng Tác dụng lâm sàn trên người Lactobacillus rhamrosus GG Giảm hoạt tính enzyme phân, giảm tiêu chảy do (ATCC 53103) kháng sinh ở trẻ em, điều trị và dự phòng rotavirus và tiêu chảy cấp ở trẻ em, điều trị tiêu chảy tái phát do Clostridium difficile, kích thích miễn dịch, giảm nhẹ triệu chứng viêm da không điển hình ở trẻ em. Lactobacillus johnsonii Cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, tăng cường (acidophilus) LJ-1 (La1) miễn dịch, hỗ trợ điều trị Helicobacter pylori. Bifidobacterium lactis Bb-12 Dự phòng tiêu chảy , điều trị tiêu chảy do virus, kể cả rotavirus, cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, cải thiện tình trạng táo bón, kích thích hệ miễn dịch, giảm nhẹ triệu chứng viêm da không điển hình ở trẻ em. Lactobacillus reuteri Rút ngắn thời gian bị tiêu chảy do rotavirus ở trẻ (BioGaia Biologics) em, điều trị tiêu chảy cấp ở trẻ em, an toàn và dung nạp tốt ở bệnh nhân trưởng thành HIV dương tính. Lactobacillus casei Shirota Cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, giảm hoạt tính enzyme phân, có tác động tích cực đối với ung thư mặt bàng quang và ung thư cổ tử cung, không ảnh hưởng tới hệ miễn dịch của người khỏe mạnh. Lactobacillus plantarum Cân bằng hệ vi sinh đường ruột, tăng hàm lượng DSM9843 (299v) acid béo mạch ngắn trong phân. Saccharomyces bourlardii Dự phòng tiêu chảy do kháng sinh, điều trị viêm ruột kết do Clostridium difficile, dự phòng tiêu chảy cho bệnh nhân sử dụng dinh dưỡng qua ống. 8
10. Chủng trong sữa chua Không có tác dụng trên tiêu chảy do rotavirus, (Streptococcus thermophilus hay không có hiệu ứng tăng cường miễn dịch khi bị L. Delbrueckii subsp bulgaricus) tiêu chảy do rotavirus, không có tác dụng lên hoạt tính enzyme phân. [19]. 2.4 Tổng quan về quá trình lên men lactic 2.4.1 Tổng quan về các vi khuẩn lên men lactic phổ biến Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn lên men lactic thuộc họ Lactobacterium, là vi khuẩn Gram (+). Đây là những trực khuẩn hoặc cầu khuẩn, đa số không sinh bào tử, thường không chuyển động và kị khí tùy tiện, vi hiếu khí, chúng không chứa cytochrom và enzyme catalase, chúng có khả năng sinh tổng hợp enzyme peroxydase rất mạnh, phân giải H2O2 để phát triển. Đa số chúng lên men được mono và disaccharide, một số không lên men được saccharose, đường maltose. Các vi khuẩn lactic không có khả năng lên men tinh bột và các polysaccharide khác (chỉ có loài L. delbruckii là đồng hóa được tinh bột). Vi khuẩn lactic thường có dạng hình cầu, hình oval và hình que, đường kính của dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5-1,5 μm, các tế bào hình cầu xếp thành từng cặp hoặc chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thước tế bào trực khuẩn lactic từ 1-8 μm, trực khuẩn thường đứng riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi. Các loài vi khuẩn lactic có khả năng rất khác nhau tạo thành acid trong môi trường và sức chịu đựng acid cũng khác nhau. Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành acid cao hơn (khoảng 2- 3,5 %), liên cầu khuẩn (khoảng 1%). Các trực khuẩn này có thể phát triển được ở pH = 3- 4, còn cầu khuẩn không thể phát triển được ở môi trường này. Hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn lactic ở vùng pH = 5,5 - 6. Đa số vi khuẩn lactic (đặc biệt là trực khuẩn đồng hình) rất kén chọn thành phần dinh dưỡng, chúng chỉ phát triển khi trên môi trường có tương đối đầy đủ các yếu tố dinh dưỡng cần thiết như acid amin, peptide, protein, vitamin (B1, B2, B6, PP) các acid pantotenic và acid folic Phân loại vi khuẩn lactic hiện nay chưa hoàn thiện và còn nhiều tranh cãi, chủ yếu phân loại dựa theo hình dáng tế bào. Thí dụ: cầu khuẩn xếp các giống 9
11. Streptococcus và Leuconostoc, còn trực khuẩn xếp thành một giống Lactobacillus 2.4.1.1 Lactobacillus Lactobacillus là vi khuẩn có tự nhiên trong miệng , đường ruột, và cả trong âm đạo của con người, đây là loại vi khuẩn có khả năng lên men tạo axit lactic rất mạnh và khả năng phát triển trong môi trường axit rất tốt. Vi khuẩn này có khả năng sản xuất các enzyme phá vỡ các thành phần trong các sản phẩm sữa rất tốt do sinh enzyme có hoạt lực protease cao. Lactobacillus là tên một giống vi khuẩn, giống này có nhiều loài như Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus sporogenes, Lactobacillus kefir Các vi khuẩn này có nhiệm vụ biến đổi chất xơ thực phẩm, thức ăn chưa tiêu hóa hết ở ruột non thành acid lactic, acetic, butyric, hàng loạt vitamin, acid amin, men, hormon và các chất dinh dưỡng quan trọng khác. Nó cũng sinh ra các khí như NH3, CO2, H2S Quá trình biến đổi đó gọi chung là quá trình lên men, mà nhờ nó thức ăn được tiêu hóa hoàn toàn. Lactobacillus bulgaricus: lên men đồng hình, là trực khuẩn tròn đôi khi ở dạng hạt, thường kết thành chuỗi dài, Gram (+), không có khả năng di động. Chúng có khả năng lên men được các loại đường glucose, lactose, galactose, không lên men được sacaroza, xylose, arabinose, sorbose, dulcitol, mannitol, dextrin, inulin. Chúng không có khả năng tạo ra nitrit từ nitrate. Đây là giống ưa nhiệt, nhiệt độ tối thích cho phát triển là 40 – 450C, tối thiểu là 15 – 200C, tạo thành acid mạnh. Hình 2.1 Vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus [22]. Lactobacillus casei: lên men lactic đồng hình, trực khuẩn nhỏ, Gram (+), thường gặp ở dạng chuỗi dài hoặc ngắn, tích tụ tới 1,5% acid. Chúng không có khả năng 10
12. chuyển động. Có khả năng lên men được các loại đường glucose, fructose, galactose, maltose, lactose, salicin. Trong quá trình lên men chúng tạo ra D – acid lactic. Nhiệt độ tối thích cho phát triển là 38 – 400C, nhờ có hoạt tính protease nên có thể phân huỷ protein trong sữa thành acid amin. Lactobacillus lycopersici: lên men lactic dị hình, là trực khuẩn Gram (+), sinh hơi, trong thiên nhiên chúng tồn tại thành từng đôi một, có khả năng tạo bào tử. Trong quá trình lên men đường, chúng tạo ra cồn, acid lactic, acid acetic và CO2. Ngày nay chúng được coi như các biến chủng của Lactobacillus brevis [3]. Hình 2.2 Vi khuẩn Lactobacillus casei [22]. Lactobacillus pasteurianus: là trực khuẩn Gram (+), có kích thước rộng: 0.5 – 1,0µm, dài: 7,0 – 35µm. Trong thiên nhiên chúng tồn tại riêng lẻ, không di động. Chúng có khả năng lên men được arabinose, glucose, fructose, galactose, maltose, saccharose, rafinose, trehalose, manitol, dextrin. Trong quá trình lên men chúng tạo ra một loạt sản phẩm như: CO2, alcohol, acid lactic, acid acetic, acid formic. Nhiệt độ thích hợp từ 29 – 330C. Lactobacillus bifidus: trực khuẩn rất nhỏ, thuộc loại Gram (+). Chúng không có khả năng di dộng, có khả năng lên men được các loại đường glucose, fructose, galactose, saccharose, inulin, dextrin. Nhiệt độ phát triển tốt nhất của vi khuẩn này là 370C. Lactobacillus causaciccus: trực khuẩn Gram (+) ngắn, không có khả năng chuyển động, có khả năng lên men các loại đường glucose, fructose, mannose, galactose, maltose, lactose, mannitol. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 48 – 500C. 11
13. Lactobacillus delbruckii: trực khuẩn dài Gram (+), có kích thước rộng: 0,5µm – 0,8µm, dài: 2,0 – 9,0µm, không di động. Chúng có khả năng lên men các loại đường glucose, maltose, fructose, galactose và dextrin, chúng không có khả năng lên men xylose, arabinose, rhamnose, lactose, raffinose, trehalose, inulin. Lactobacillus brevis: lên men lactic dị hình, là loại trực khuẩn Gram (+), không có khả năng di động, có kích thước rộng: 0,7 – 1,0µm, dài: 2,0 – 4,0µm, tìm thấy chủ yếu trong muối chua bắp cải, rau cải, dưa chuột, vì vậy nó còn được gọi là trực khuẩn bắp cải. Trong thiên nhiên chúng thường liên kết với nhau thành chuỗi. Trong quá trình phát triển chúng có thể sử dụng lactate canxi như nguồn cung cấp carbon. Chúng có khả năng lên men các loại đường arbinose, xylose, gluxose, fructose, galactose, maltose. Trong lên men ngoài acid lactic (1,2%), nó còn tạo thành acid acetic, rượu etylic (2,4%), CO2, nó còn tạo hương làm cho sản phẩm có hương vị dễ chịu. Nhiệt độ phát triển tối đa là 300C, vi khuẩn này có nhiều trong sữa, kefir, dưa chua Hình 2.3 Vi khuẩn Lactobacillus brevis [23]. Lactobacillus leichmannii: trực khuẩn Gram (+). Trong tự nhiên chúng có khả năng tạo thành chuỗi ngắn, kích thước tế bào từ 0,6 – 2,0µm. Chúng có khả năng lên men glucose, fructose, maltose, saccharose, trehalose và không có khả năng lên men lactose, galactose, raffinose, arabinose, rhamnose, dextrin, inulin. Trong quá trình lên men, chúng tạo ra L – acid lactic, không có khả năng tạo nitrit từ nitrat. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 360C. Lactobacillus helveticcus: trực khuẩn, có kích thước rộng: 0,7 – 0,9µm, dài: 2,0 – 6,0µm. Trong thiên nhiên chúng có thể tồn tại riêng lẻ từng tế bào, cũng có thể tạo 12
14. thành chuỗi tế bào. Chúng có khả năng lên men các loại đường glucose, fructose, galactose, mannose, maltose, lactose. Nhiệt độ phát triển từ 40 – 420C. Vi khuẩn này được sử dụng nhiều trong sản xuất sữa chua và pho mai cứng. Lactobacillus thermophilus: là trực khuẩn gram (+), kích thước tế bào 0,5 – 3,0µm, không có khả năng di động. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 300C, có thể chịu được nhiệt độ 65 – 750C. Vi khuẩn này được sử dụng nhiều trong sản xuất sữa chua và pho mai. Lactobacillus plantarum: trực khuẩn gram (+), kích thước tế bào rộng: 0,7 – 1µm, dài: 3 – 8µm. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 300C, có khả năng chịu được nồng độ NaCl 5,5%. Vi khuẩn này được dùng nhiều trong chế biến sữa. 2.4.1.2 Leuconostoc Leuconostoc gồm những liên cầu khuẩn lên men lactic đồng dạng, lên men đường sinh acid lactic và 1 lượng lớn acid acetic, cồn etylic và khí CO2. Khả năng của 2 loài Leuconostoc dextranicium và Leuconostoc citrovorum lên men acid citric của sữa với sự sản sinh chất có mùi thơm diacetyl và khả năng kích thích liên cầu khuẩn lactic làm cho chúng được đem dùng vào giai đoạn đầu của chế biến bơ và phomai. Một số đặc trưng của giống Leuconostoc cho nó vị trí quan trọng trong thực phẩm như: Sản sinh diacetyl, sự chịu đựng của những nồng độ muối cao làm cho Leuconostoc mesenteriodes được đem dùng ở giai đoạn đầu của sự lên men lactic. Sự chịu đựng được ở những nồng độ đường cao đến 55 – 60% (đối với Leuconostoc mesenteriodes) làm cho vi khuẩn có thể phát triển trong xiro bán lỏng và kem đá sản sinh ra nhiều thán khí từ đường làm hư hỏng 1 số loại phomai, xiro. 13
15. Hình 2.4: Vi sinh vật thuộc nhóm Leuconostoc [24]. 2.4.1.3 Streptococcus Streptococcus cremoris: là tế bào hình cầu và kết thành chuỗi dài, ưa ấm và tạo ít acid trong môi trường. Nhiệt độ thích hợp cho phát triển là 250C, tối thiểu là 100C, tối đa là 36 – 380C. Streptococcus thermophilus: có dạng hình cầu, kết thành chuỗi dài, phát triển tốt ở nhiệt độ 40 – 450C, tích tụ khoảng 1% acid. Streptococcus falcalis: là tế bào Gram (+), chúng thường tạo thành chuỗi tế bào hình cầu, có khả năng chịu được nồng độ NaCl 5%, có khả năng lên men đường glucose, maltose, lactose, trehalose, silicin, sorbitol [4]. Streptococcus diacetylactis còn được gọi là Pneumococci, là cầu khuẩn Gram (+), xếp từng đôi hay thành chuỗi, có vỏ bằng polysaccharide. Pneumococci dễ bị ly giải bởi những chất hoạt động bề mặt như muối mật. 2.4.1.4 Bifidobacterium Bifidobacteria là vi khuẩn gram dương, không di động, kị khí bắt buộc . Bifidobacterium không di động, không sinh bào tử, hình que với nhiều dạng khác nhau như dạng cong, dạng móc câu, hình gậy đánh gôn, dạng phân nhánh và cũng thường có dạng chữ Y. Các tế bào vi khuẩn Bifidobacteria thường đứng riêng lẻ, xếp thành cặp hoặc xếp thành chữ V. Kích thước tế bào khoảng 0,5 – 1,3mm. Bifidobacterium có dạng hình que chẻ đôi hoặc que phân nhiều nhánh và dưới điều kiện tăng trưởng khác nhau thì các tế bào sẽ có hình dạng khác nhau ( Tisser, 1990). Khi sử dụng N- Acetyl D – Glucosaminde, alamine, acid aspartic, acid 14
16. glutamic, serin, ca2+ trong môi trường nuôi cấy sẽ ảnh hưởng đến hình dạng của tế bào vi khuẩn Bifidobacteria. Tế bào Bifidobacteria không có vỏ bao và không có hệ thống tiêm mao bao quanh . Vách tế bào cấu tạo bởi 3 phần chính Peptidoglycan Polysaccharide Acid lipotechoic Peptidoglycan của vi khuẩn Bifidobacteria được cấu tạo từ acid N- acetylmuramic và N- acetylglucosamine. Các phân tử này kết hợp với nhau tạo thành chuỗi oligopeptide. Ngoài ra , vách tế bào vi khuẩn Bifidobacteria còn chứa nhiều polysaccharide gồm các phân tử đường glucose, galactose, rhamnose liên kết với nhau (Lauer và Kandler,1983). Bifidobacterium cư trú trong ruột của cơ thể người và động vật. chúng đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh pH ở ruột và kết tràng . Chúng được phát hiện trong phân của trẻ sơ sinh còn bú sữa mẹ. Tính ổn định của loài vi khuẩn này tỷ lệ nghịch với độ tuổi, tuổi càng lớn thì lượng vi khuẩn càng giảm. Lượng vi khuẩn Bifidobacteria trong cơ thể bị tác động bởi nhiều yếu tố như thức ăn, nước uống, tình trạng sức khỏe và việc sử dụng kháng sinh. Nhiệt độ tối ưu cho Bifidobacterium phát triển là 37 – 41oC. Tế bào không tăng trưởng ở nhiệt độ dưới 20oC và trên 46oC. Tuy nhiên Bifidobacterium Themacidophilum có khả năng phát triển ở nhiệt độ 49,5oC. Phần lớn các chủng có nguồn gốc từ động vật đều có khả năng phát triển ở 45oC. Riêng các chủng có nguồn gốc từ người thì không có khả năng phát triển ở nhiệt độ này. pH tối ưu cho sự phát triển nằm khoảng 6,5 – 7. Tế bào vi khuẩn Bifidobacteria không tăng trưởng ở pH thấp hơn 4,5 và pH trên 8,5. Ngoại trừ Bifidobacterium thermacidophilum có thể tăng trưởng ở pH 4. Bifidobacterium là loài chịu được acid nhưng không phải là loài ưa acid. 2.4.1.5 Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Lactobacillus acidophilus là trực khuẩn dài hình que, Gr+, không sinh bào tử, lên men lactic đồng hình. Trực khuẩn này được phân lập từ ruột trẻ em và bê mới đẻ. Một số chủng có khả năng tạo thành màng nhầy. Trong thiên nhiên chúng tồn tại 15
17. riêng lẻ, đôi khi chúng tạo thành những chuỗi ngắn, có khả năng chuyển động, có khả năng lên men 1 số loại đường glucose, fructose, galactose, mannose, maltose, lactose, saccharose để tạo ra acid lactic và hoàn toàn không có khả năng lên men xylose, arabinose, rahamnose, glycerol, sorbitol, dulcitol, inositol. Trong quá trình lên men chúng tạo ra cả 2 dạng đồng phân quang học của acid lactic. Trong sữa nó có thể tích tụ tới 2,2% acid [4]. Lactobacillus acidophilus thuộc: Giới: Bacteria Ngành: Fermicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillilales Họ: Lactobacillaceae Giống: Lactobacillus [4]. Lactobacillus acidophilus có thể phát triển ở nhiệt độ cao như 450C nhưng tối ưu là 35-400C. với pH tối ưu từ 5,5-6. Chúng có những yêu cầu phát triển phức tạp như yêu cầu áp lực oxygen thấp, có thể lên men carbohydrate, protein và các phần tử bị phá vỡ từ các chất này, một số vitamin và khoáng như B-complex, acid nucleic, Mg, Mn, Fe cần cho sự phát triển. Lactobacillus acidophilus phát triển ở pH < 3,5 và lên men trong điều kiện yếm khí. Lactobacillus acidophilus thiếu cytochrome, prophyrin, những enzyme hô hấp nó sẽ không thể thực hiện quá trình phosphoryl hóa hoặc hô hấp. Vì vậy, nó sử dụng đường như một cơ chất cho sự lên men và sống được ở môi trường phong phú đường. Mỗi phân tử glucose trải qua sự lên men của Lactobacillus acidophilus tạo ra năng lượng là 2ATP. Ngoài glucose, Lactobacillus acidophilus còn sử dụng aesculin, cellobiose, galactose, lactose, maltose, salicin, sucrose và trehalose cho sự lên men [4]. 16
18. Hình 2.5 Hình thái Lactobacillus acidophilus [24]. 2.4.2. Cơ sở sinh hóa của quá trình lên men lactic. Đầu tiên, đường sẽ được vi khuẩn lactic đưa vào bên trong tế bào nhờ cơ chế vận chuyển đặc trưng của màng tế bào. Nếu phân tử đường là đường đơn như glucose thì sẽ vào thẳng chu trình chuyển hóa, còn nếu phân tử đường là đường đôi hay các dạng đường khác thì sẽ bị thủy phân thành các monosaccharide sau đó mới vào chu trình chuyển hóa. Sau đó, phân tử đường này sẽ đi vào chu trình chuyển hóa khác nhau và cuối cùng cho sản phẩm là acid lactic, acid acetic, CO2, Dựa vào sản phẩm tạo thành của quá trình lên men, mà người ta chia chúng ra hai nhóm là vi khuẩn lactic lên men đồng hình hay vi khuẩn lactic lên men dị hình. Trường hợp lên men lactic đồng hình: quá trình lên men tạo acid lactic theo chu trình Embden-Meyerhorf (con đường EMP). Trong tế bào vi khuẩn lên men lactic đồng hình có đủ enzyme carboxylase, do vậy pyruvate không bị phân giải sâu hơn, mà thay vào đó nó nhận hydro được tách ra và chuyển tới pyruvate để tạo thành acid lactic. Lượng acid lactic tạo thành chiếm hơn 90% sản phẩm, chỉ một phần nhỏ pyruvate còn lại bị khử cacbon chuyển thành acid acetic, ethanol, CO2 và acetone, Các chủng vi sinh vật được sử dụng trong lên men đồng hình như: Lactobaterium casei, Lactobacterium cremoris, Lactobacterium bulgaricus, Lactobacterium delbruckii C6H12O6 → CH3-CO-COOH → CH3-CHOH-COOH + Năng lượng 2ATP (glucose) (acid lactic) Trường hợp lên men lactic dị hình: xảy ra khi vi khuẩn lactic không có đủ các enzyme cơ bản của chu trình EMP là andolase và trizaphosphattizomerase. Do không theo con đường EMP nên chúng chuyển hóa theo con đường Pentose- 17
19. Phosphate ở giai đoạn đầu, từ glucose-6-phosphate, 6-phosphoglucose và ribuloae-5- phosphate dưới tác dụng của enzyme epimerase chuyển thành xilulose-5-phosphate. Xilulose-5-phosphate sẽ đi theo hai con đường chuyển hóa khác nhau, Chỉ có khoảng 50% lượng đường tạo thành acid lactic, ngoài ra còn có các sản phẩm phụ khác nhau như acid acetic, ethanol, CO2, các sản phẩm phụ tương tác với nhau tạo thành ester có mùi thơm Xilulose-5-phosphate sẽ được chuyển hóa tiếp thành glyceraldehydes - 3-phosphate. Sau đó bị thủy phân tiếp theo con đường EMP để tạo thành acid lactic. Xilulose-5-phosphate bị thủy phân tiếp theo một con đường khác để tạo acetyl phosphate. Sau đó, dưới tác dụng của acetatkinase sẽ tạo thành acetate hoặc bị khử tiếp thành acetaldehyde rồi thành ethanol, acid acetic, CO2, C6H12O6 → CH3-CHOH-COOH + HOOC-CH2-CH2-COOH + CH3-COOH (glucose) (acid lactic) (acid sucxinic) (acid acetic) + CH3-CH2OH + CO2 +H2 (ethanol) Lượng sản phẩm phụ của quá trình lên men dị lactic như sau: acid lactic chiếm 40% (thấp hơn nhiều so với lên men lactic đồng hình), acid sucxinic chiếm 20%, ethanol chiếm 10%, acid acetic chiếm 10% và khoảng 20% còn lại là các loại khí [3]. 2. 5 Sơ lược về tình hình nghiên cứu thực phẩm probiotic trong và ngoài nước 2.5.1 Tình hình nghiên cứu trong nước Có nhiều công trình nghiên cứu về probiotic, tuy nhiên chưa có định hướng dưới dạng phát triển sản phẩm thực phẩm .Vì vậy các nghiên cứu về các chủng vi khuẩn probiotic trong thực phẩm còn nhiều hạn chế, các nghiên cứu gần đây có thể kể gồm: Nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Hà và cộng sự (2002) đã dử dụng 2 chủng vi khuẩn lactic là Bifidobacterium bifidum và Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm probiotic. Nhóm nghiên cứu của tác giả Trần Thanh Thủy (2003) xây dựng thành công quy 18
20. trình công nghiệp chế biến sắn thành đồ uống lên men lactic và có giá trị dinh dưỡng, cảm quan thích hợp. Sau khi xử lý sắn thành dịch đường tác giả bổ sung nấm men, sự tương tác giữa lượng đạm sinh khối nấm men với lượng đường trong dịch lên men ở áp suất cao tạo điều kiện cho phản ứng melanoid xảy ra nhờ đó màu sắc và hương vị của sản phẩm được cải thiện. Chủng vi sinh vật được sử dụng là pediococcus pentsaceus B và pediococcus pentosaceus KC4. Tuy nhiên sản phẩm này không bảo quản được lâu, chỉ trong 2 ngày ở nhiệt độ lạnh 4 - 6oC. Tác giả Lê Hà Vân Thư (2008), trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM đã thực hiện đề tài “ Nghiên cứu quy trình tạo thức uống lên men lactic từ gạo lức” kết quả đạt được là tạo được sản phẩm lên men từ gạo lức với chủng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, lượng tế bào vi khuẩn khoảng 107 - 108 cfu/ml, bảo quản tốt trong điều kiện 4- 6oC trong 4 tuần [10]. Tác giả Nguyễn Hoài Phương (2010) thực hiện đề tài “ Thử nghiệm tạo thức uống probiotic từ dịch malt” kết quả đạt được là tạo ra được dạng thức uống chua ngọt nhẹ, hàm lượng tế bào vi khuẩn Bifidobacterium bifidum khoảng 108 – 109 cfu/ml, sản phẩm bảo quản tốt trong 4 tuần ở nhiệt độ 4-6oC [8]. 2.5.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước Năm 2004 ,Yong D Hang và cộng sự đã thành công trong việc tạo ra thức uống Probiotic từ nước ép cà chua nhờ vi khuẩn lactic, nguyên liệu nước ép cà chua được lên men bởi bốn vi khuẩn lactic là Lactobacillus aciddophilus, Lactobacillus plantarum C3, Lactobacillus casei A4 và Lactobacillus D7 delbrueckii quá trình lên men ở nhiệt độ 30oC trong 24 giờ, những biến đổi về pH , lượng acid lactic sinh ra, hao hụt lượng đường luôn được kiểm soát liên tục bằng các thiết bị đo. Kết quả số tế bào đạt gần 1-9.109 cfu/ml trong thời gian lên men 72 giờ [13]. Đến 2005, Yong D. Hang và cộng sự tiếp tục thành công tạo ra sản phẩm lên men lactic từ nước ép bắp cải chủng Vi sinh vật sử dụng là Lactobacillus plantarum C3, Lactobacillus casei A4 , Lactobacillus delbrueckii D7 kết quả lên men sau 48 giờ ở 30oC đạt đến 10 x 108 cfu/ml. Sản phẩm bảo quản tốt ở 4oC trong 4 tuần [21]. Seung Hee Baek (2005) đã chọn L.acidophilus là chủng vi khuẩn thích hợp để lên men gạo lức ở 37oC trong vòng 60,4 giờ , cùng với 30,56% nước và 6,94% mật ong, chế phẩm này có tên gọi là “Fermented Brown Rice” được chứng minh là có khả 19
21. năng làm giảm cholesterol ở chuột. Sản phẩm này rất thích hợp cho người ăn kiêng[14]. Sumanagala Gokavi và cộng sự (2005) đã thành công trong việc tạo thức uống lên men từ yến mạch bởi chủng Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei ssp. và Lactobacillus acidophilus. Đầu tiên họ phân lập chủng probiotic gồm L.plantarum và L.paracasei, L.aciddophilus từ đồ uống truyền thống của người Bungari. Tiếp theo họ chứng minh được khả năng loại bỏ cholesterol khỏi môi trường sinh. Sau đó họ dùng chủng probiotic này lên men yến mạch và cho ra đời loại đồ uống có chất lượng về dinh dưỡng và cảm quan khá [15]. 2.6 Giá trị của các sản phẩm lên men lactic với sức khỏe con người Các sản phẩm lên men từ vi sinh vật có vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực như: thực phẩm, y học, mỹ phẩm Các sản phẩm lên men lactic chiếm một vị trí đặc biệt. Các thực phẩm tạo thành do quá trình lên men lactic rất phong phú như: thức uống lên men từ ngũ cốc, phomai, sữa chua, rau củ, xúc xích khô, chao tương Thức uống lên men từ ngũ cốc Boza được chứng minh là nguồn nguyên liệu dồi dào cung cấp cho việc sản xuất bacteriocin từ vi khuẩn lactic với hoạt tính chống vi trùng gây hư hỏng thực phẩm và vi khuẩn gây bệnh. Đồng thời với sự hiện diện của acid lactic sẽ giúp ích cho việc tiêu hóa của cơ thể được dễ dàng, làm đẹp da và làm chậm quá trình lão hóa [11]. Oat là thức uống được lên men từ yến mạch, sử dụng các giống vi sinh vật như Lactobacillus plantarum, L. paracasei, L. acidophilus, được coi như là thực phẩm chức năng cung cấp cùng lúc cả probiotic và prebiotic. Loại đồ uống yến mạch này không chứa sữa như vẫn có thể thay thế sữa và sữa đậu nành, nhất là rất phù hợp với sức khỏe của người theo chế độ ăn chay [15]. Những đồ uống lên men từ ngũ cốc có khả năng thế chỗ những vi khuẩn đường ruột có lợi bị kháng sinh phá huỷ. Hỗ trợ khả năng tiêu hoá và ngăn chặn các vi khuẩn gây bệnh, điều trị sự tăng trưởng quá nhanh của các sinh vật có hại trong ống tiêu hoá, làm giảm các triệu chứng rối loạn đường ruột kích ứng và có thể cả bệnh viêm đường ruột [19]. Sữa chua là sản phẩm thu được khi lên men lactic sữa động vật, có nhiều ích lợi đối với sức khoẻ mỗi người, là loại sản phẩm phổ biến được nhiều người ưa thích 20
22. vì có chứa các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của cơ thể con người. Sữa chua trở thành món ăn có dinh dưỡng cao, độ hấp thụ lớn, ngoài ra nhờ vi khuẩn lactic, nên sữa chua có tác dụng chữa bệnh đường ruột, bệnh dạ dày và các bệnh về tiêu hóa nói chung. Sữa chua đặc biệt thích hợp với người già, trẻ em, người mới ốm dậy, nhất là những người mắc bệnh về tiêu hóa. Nhờ quá trình lên men lactic, một phần protein trong sữa phân giải thành các acid amin, các chất đường bột chuyển hóa thành đường lactose dễ tiêu hóa và các chất thơm như acetoin, diacetin cùng nhiều vi lượng quý hiếm được tạo thành, kích thích sự đáp ứng miễn dịch và làm giảm cholesterol huyết thanh. Sữa chua còn có nhiều chất bổ dưỡng và dễ hấp thụ vào máu. Vì vậy mà cơ thể người có thể hấp thụ sữa chua nhiều hơn gấp 3 lần sữa tươi, tốt cho đối tượng người bệnh trong giai đoạn phục hồi sức khỏe, suy nhược, biếng ăn Sữa chua vẫn giữ được và làm giàu thêm lượng chất protein trong sữa, đặc biệt là casein, vitamin và các loại khoáng chất cần thiết, giúp cân bằng hệ vi khuẩn, tăng cường khả năng đề kháng của cơ thể. Protein trong sữa ngăn ngừa ung thư dạ dày, đường lactose làm tăng vi khuẩn Bifidobacteria trong ruột. Sữa lên men sẽ kích thích sự tiêu hóa, làm cân bằng môi trường đường ruột. Việc sử dụng sữa chua đều đặn sẽ phục hồi tính acid ở ruột non, đồng thời cũng làm giảm nguy cơ ung thư đường ruột. Calcium và sắt trong sữa chua giúp ngăn chặn bệnh thiếu máu hồng cầu, vitamin A giúp tăng cường thị giác, pepton và peptid có tác dụng kích thích chức năng gan. Bên cạnh đó, trong sữa chua có chất kháng sinh gọi là lactocidine, có khả năng chống lại các virus gây bệnh. Sữa chua còn được xem như một loại mỹ phẩm chăm sóc da hiệu quả. Acid lactic trong sữa chua với tác dụng ngăn ngừa sự xâm nhập và kiềm chế hoạt động của các loại vi khuẩn có hại tạo nên một màng chắn an toàn bảo vệ cho da. Sản phẩm Kefir chứa nhiều chất chống oxy hóa, kháng thể, các chất chuyển hóa và là nguồn thực phẩm giàu vitamin, chất khoáng có giá trị. Nhiều nghiên cứu cho thấy quá trình lên men sữa từ những hạt kefir sống sẽ làm tăng giá trị dinh dưỡng đáng kể như vitamin B, acid folic, vitamin tan trong chất béo như A, D, E, K. Kefir kích thích quá trình tiêu hóa và sự thèm ăn, làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu, tăng sức đề kháng của cơ thể đối với các yếu tố bất lợi của môi trường như chống cảm lạnh và các bệnh hay lây khác. 21
23. Lợi ích của rau cải muối chua: Nghiên cứu mới đây nhất chỉ ra rằng ăn các loại rau họ cải như cải bắp và dưa bắp cải có thể giúp giảm nguy cơ một số loại ung thư, trong đó có ung thư vú. Ăn bắp cải và món dưa bắp cải Đức khi còn trẻ sẽ giúp ngăn ngừa hữu hiệu bệnh ung thư vú. Ăn nhiều các thực phẩm chống ung thư như bắp cải và dưa bắp cải Sauerkraut cũng có tác dụng hỗ trợ ngừa ung thư ở những phụ nữ lớn tuổi [21]. Dưa chua có tác dụng kích thích tiêu hoá nhờ có men lactic, ăn ngon miệng hơn, tốt hơn cho cơ thể. Ngoài ra còn có phương pháp bảo quản cỏ tươi có bổ sung vi khuẩn lactic đã làm thay đổi khu hệ vi sinh vật theo chiều hướng có lợi, trong đó vi khuẩn lactic chiếm ưu thế, làm giảm đáng kể các loại vi sinh vật có hại cho quá trình bảo quản, do đó đã làm tăng giá trị dinh dưỡng của thức ăn lên. 2.7 Nguyên liệu cam 2.7.1. Tổng quan về cây cam Giới : plantae chi : citrus Họ : rutacae Bộ : sapindales Các loài phổ biến gồm Citrus aurantifolia - chanh ta Citrus maxima - bưởi Citrus reticulate - quýt Citrus sinensis - cam ngọt Citrus nobilis - cam sành [24]. Chi Cam chanh (danh pháp khoa học : Citrus) là một chi thuộc loại thực vật có hoa trong họ cửu lý hương (Rutaceae), có nguồn gốc từ khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới ở Đông Nam Á. Các loại cây trong chi này là các cây bụi lớn hay cây thân gỗ, cao từ 5-15 m (tùy loại), thân cây có gai và các lá thường xanh mọc so le có mép nhẵn. Hoa mọc đơn hay thành từng đóa nhỏ, mỗi hoa có đường kính 2-4 cm với 5 (ít khi 4) cánh hoa màu trắng và rất nhiều nhị hoa. Hoa thông thường có mùi thơm rất mạnh. Quả là loại quả có múi, một dạng quả mọng đặc biệt, hình cầu hay cầu thuôn dài, chiều dài 4-30 cm và đường kính 4-20 cm, bên trong quả khi bóc lớp vỏ và cùi sẽ 22
24. thấy lớp vỏ mỏng, dai, màu trắng bao quanh các múi bên trong chứa nhiều tép mọng nước. Chi này có giá trị lớn về mặt thương mại do nhiều loài (hoặc cây lai ghép) được trồng để lấy quả. Quả được ăn tươi hay vắt, ép lấy nước [24]. Quả của chi Citrus đáng chú ý vì mùi thơm, một phần là do các terpen chứa trong lớp vỏ, và trong quả chứa nhiều nước. Nước quả có hàm lượng acid citric cao, tạo ra hương vị đặc trưng. Chúng cũng là nguồn cung cấp vitamin C và các flavonoid đáng kể. Sự phân loại nội bộ trong chi này rất phức tạp và hiện nay người ta vẫn không biết chính xác số lượng loài có nguồn gốc tự nhiên, do nhiều loài được coi là có nguồn gốc lai ghép. Các loại cây trong chi Citrus được trồng có thể là con cháu của chỉ 4 loài tổ tiên. Hiện nay có hàng loạt các loại cây lai ghép tự nhiên hay do con người nuôi trồng, bao gồm nhiều loại quả có giá trị thương mại như cam ngọt, chanh tây, bưởi chùm ,quýt, bưởi Các nghiên cứu gần đây cho rằng các chi có quan hệ họ hàng gần như Fortunella , và có lẽ cả Poncitrus, Microcitrus, Eremocitrus, cần được gộp lại trong chi Citrus. Hình 2.7 Quả cam sành [24]. Cam sành là một giống cây ăn quả thuộc chi cam chanh được sử dụng nhiều trong sản xuất thức uống, có nguồn gốc từ Việt Nam. Quả cam sành rất dễ nhận ra nhờ lớp vỏ dầy, sần sùi giống bề mặt mảnh sành, và thường có màu lục nhạt (khi chín có sắc cam), các múi thịt có màu cam. Cam sành được gắn nhiều tên khoa học khác nhau như Citrus nobilis, Citrus reticulata, hay Citrus sinensis, trên thực tế nó là giống lai tự nhiên: C. reticulata x C. sinensis (tên tiếng Anh: king mandarin). Tên khoa học citrus nobilis, citrus reticulate hay citrus sinensis 23
25. Giới plantae Chi citrus Họ rutaceae Bộ sapindales Lớp eudicots Ngành angiospermae [24]. 2.7.2 Sơ lược về quy trình sản xuất và thiết bị sản xuất nước ép từ cam Nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất nước ép hiện nay trên thế giới là giống cam ngọt - citrus sinensis hoặc cam sành – citrus nobilis . Các dạng sản phẩm nước ép trên thị trường thường ở dạng nước cốt nguyên chất, nước ép đóng hộp Cam chín sau khi thu hoạch sẽ được tập trung về một nơi, và tiến hành phân loại, cam bị dập nát, không đủ chất lượng sẽ bị loại bỏ. Quả dùng để chế biến nước quả phải tươi tốt, không bầm dập, sâu thối, ở độ chín đúng mức. Nếu quả chưa đủ chín thì màng tế bào cứng, dịch bào ít, nên nhiều phế liệu, và do hàm lượng đường thấp, hàm lượng acid cao nên chua nhiều. Nhưng quả chín thì mô quả mềm và bở, khi ép thịt quả kết lại không cho dịch quả thoát ra, dịch quả có nhiều bọt và khó lắng, lọc. Những quả có vết rám ở ngoài vỏ không ảnh hưởng đến hương vị của dịch quả, vẫn dùng được. Kích thước và hình dáng của quả cũng không ảnh hưởng nhiều đến phẩm chất nước quả nên không hạn chế. 24
26. Cam Chọn lựa, phân loại, rửa ∆ Loại quả hư Ép ∆ loại bả ép Lọc ∆ loại bả lọc Sản phẩm Phối chế Bài khí Thanh Rót hộp Ghép trùng kín Sơ đồ 2.1 Quy trình sản xuất nước ép cam không tép [7] 25
27. Bảng 2.3 Chỉ tiêu nước sử dụng trong thực phẩm Chỉ tiêu Tiêu chuẩn Chỉ tiêu vật lý Không Mùi vị 100 Độ trong ( ống Dienert) 5 Màu sắc (thang màu coban) Chỉ tiêu hóa học 6 – 7.8 PH 50- 100 mg/l CaO 50 MgO 0.3 Fe2O3 0.2 MnO2 3- 1.2 -2.5 BO4 2- 0.5 SO4 + 0.1- 0.3 NH4 - Không NO2 - Không NO3 0.1 Pb 0.05 As 2 Cu 5 Zn 0.3 – 0.5 F Chỉ tiêu vi sinh Tổng số vi sinh vật hiếu khí < 100 cfu/ml Ecoli/ 1lit nước <20 Vi sinh vật gây bệnh khác không [7]. 26
28. 2.7.2.1 Phân loại Việc phân loại theo kích thước được tiến hành bằng các phương tiện : Sử dụng máy phân cỡ kiểu rây lắc, máy có nhiều tầng rây, có kích cỡ mắc lưới khác nhau, tầng trên cùng mắc lưới rộng nhất, tầng dưới cùng mắc lưới nhỏ nhất. Hệ thống rây chuyển động lắc nhờ bộ phận chấn động. Máy này dùng để phân loại nguyên liệu có kích thước nhỏ. Máy phân cỡ kiểu dây cáp: bộ phận phân loại là hệ thống dây cáp căng giữa 2 trục quay, chuyển động theo chiều dọc của dây. Khe hở ở giữa hai dây cáp to dần, quả đi giữa 2 giây cáp sẽ rơi dần theo thứ tự từ nhỏ đến lớn. Loại máy này được sử dụng phổ biến nhất trong phân loại cam. 2.8.2.2 Giai đoạn rửa Sau khi tuyển chọn, nguyên liệu được đưa qua khâu rửa. Mục đích là loại trừ những tạp chất, đất cát, và một lượng lớn vi sinh vật dính bám trên nguyên liệu. Yêu cầu nguyên liệu sau khi rửa phải sạch, không dập nát và lưu ý không nên rửa trong thời gian quá lâu. Tiêu chuẩn nước sử dụng trong công nghiệp nước rửa cũng như nước dùng trong chế biến phải trong và không có mùi. 2.8.2.3 Quá trình ép Do vỏ cam dày và chứa vỏ đắng, các thành phần này làm ảnh hưởng xấu đến sản phẩm vì vậy quá trình ép phải được sử dụng bằng những thiết bị ép chuyên dụng trong công nghiệp. Mục đích của quá trình ép là tách dịch bào ra khỏi nguyên liệu. Trong quá trình ép , hiệu suất ép rất quan trọng , hiệu suất ép phụ thuộc vào các yếu tố Bản chất nguyên liệu Phương pháp sơ chế Cấu tạo , chiều dài và độ chắc nguyên liệu Áp suất ép Hiệu suất ép tính theo công thức B = a ( µ1 + µ2) k .b Trong đó a: Hệ số tính đến sự tổn thất nước ép do bả và thấm ướt thiết bị b: hàm lượng dịch bào trong nguyên liệu 27
29. k: hệ số đặc trưng cho sự bảo toàn ống mao dẫn µ1: mức độ biến tính chất nguyên sinh khi sơ chế ( 0 – 1) µ2: mức độ phá vỡ màng chất nguyên sinh khi ép ( 0.1 – 0.2) tổng số ( µ1 + µ2) < 1 Các thiết bị sử dụng trong quá trình ép Máy ép giỏ trục vit hiệu suất chỉ đạt khoảng 40 – 50% Máy ép thủy lực hiệu suất khoảng 55 -60% Máy ép trục xoắn là dạng máy ép đem lại hiệu quả cao nhất . Hiệu suất đạt 83- 90% 2.8.2.4 Quá trình lọc Dùng phương pháp lọc mục đích là loại bỏ những phần tử lơ lửng và các cặn bả không cần thiết sau khi ép. Lọc có thể ở áp suất không đổi hay vận tốc không đổi. Tuy nhiên đối vói dịch ép từ cam nên lọc ở áp suất không đổi không nên lọc ở áp suất cao dễ gây tắc lỗ lọc. Tốc độ lọc phụ thuộc vào Áp suất của nước quả Bề dày và cơ cấu của lớp cặn Nhiệt độ và độ nhớt của nước ép Vật liệu lọc thường là giấy lọc , vải lọc, sợi amiant, betonit Thiết bị lọc : thường sử dụng máy lọc ép. 2.8.2.5 Làm trong dịch quả Dùng phương pháp lắng Nguyên lý : dựa vào quá trình rơi của các hạt huyền phù dưới tác dụng của trọng lực Tốc độ lắng của các hạt huyền phù trong môi trường lỏng sẽ không đổi khi trọng lượng của hạt cân bằng với sức cản của môi trường. Trên thực tế dùng phương pháp lắng để tách các hạt lớn hơn 10-4 cm. Phương pháp ly tâm Sử dụng các máy ly tâm để tách huyền phù trong dịch ép, dưới tác dụng của lực ly tâm các hạt huyền phù sẽ bị tách ra khỏi dịch ép. Phương pháp sinh học Sử dụng hỗn hợp enzyme pectinase, protease, hemicellulase để làm trong dịch 28
30. quả. Xử lý với hàm lượng khoảng 3-6g/l ở nhiệt độ 40 -45oC trong 2- 4 giờ. Chế phẩm pectinase có nguồn gốc từ Aspergillus Aculeatus hoạt động tốt ở pH 4,5. Chế phẩm này gồm nhiều nhóm enzyme như protease, nhóm pectolytic, celullase Tác dụng của nhóm enzyme pectolytic gồm có: . Pectinesterase phân cách nhóm methoxyl đứng cạnh nhóm COOH tự do, sản phẩm tạo thành là acid pectic và methanol. . Enzyme polygalacturonase cắt các liên kết 1,4 glycosid trong mạch pectin tạo thành sản phẩm acid galacturonic. 2.8.2.6 Phối chế Để tăng thêm hương vị của sản phẩm, cần có sự bổ sung các thành phần khác như đường, chất màu, hương tổng hợp, vitamin, Hàm lượng đường trong quá trình phối chế phải có hàm lượng nhất định nếu hàm lượng đường quá nhiều sẽ gây ra hiện tượng đông tụ đường và các hạt keo gây đục sản phẩm và nước quả sẽ quá ngọt vừa lãng phí vừa không có hiệu quả , nhưng ham,lượng đường quá ít cũng sẽ làm ảnh hưởng tới độ nhớt, độ ngọt, pH cũa sản phẩm. Riêng chất màu và chất mùi phải làm từ nguyên liệu tự nhiên, hạn chế chất màu chất mùi tổng hợp có khả năng gây ung thư cho người sử dụng, chất mùi chất màu khi sử dụng phải có sự thẩm định cũng như giấy phép lưu hành và dùng trong giới hạn cho phép. Chất ổn định độ nhớt, độ trong phải an toàn và phù hợp với quy trình công nghệ. Các phụ gia khác có thể được sử dụng trong quá trình phối chế gồm chất bảo quản phải đạt được những tiêu chuẩn như: Phải có tính kháng khuẩn , kháng nấm cao Không gây độc cho người Không làm thay đổi hoặc làm mất tính hóa lý , cảm quan của đồ uống Không tạo ra những phản ứng hóa học sinh những sản phẩm độc hại khác Sunfur dioxide, natribenzoat sử dụng với mục đích làm chất bảo quản với hàm lượng giới hạn cho phép là 0,06 %. Natribenzoat (C6H5COONa) là chất bền vững , không mùi, màu trắng có vị hơi ngọt và tan trong nước. Cơ chế hoạt động làm ức chế quá trình hô hấp tế bào, ức chế quá trình oxy hóa của đường glucose và pyruvate, làm 29
31. hạn chế khả năng sữ dụng cơ chất của tế bào. Hoạt tính chống khuẩn của benzoat Natri phụ thuộc rất nhiều vào PH thực phẩm, hoạt tính kháng khuẩn cao nhất khi ở PH thấp. Đệm EDTA, acid ascorbic, anpha cotopherol là những chất chống oxi hóa rất tốt. Các chất ngọt khác có thể sử dụng như si rô ngọt nhân tạo, si rô bắp , mật ong tùy thuộc vào mục đích mùi vị của sản phẩm sau này. 2.8.2.7 Rót hộp Yêu cầu của bao bì đồ hộp Không làm biến đổi màu sắc lẫn mùi vị thực phẩm, không gây độc trong quá trình bảo quản. Có độ bền khi tác dụng với thực phẩm. Chịu được nhiệt độ và áp suất cao. Truyền nhiệt tốt, dễ gia công và giá thành hợp lý. Kiểu dáng mẫu mã bắt mắt. Trước khi nước quả được rót vào bao bì , hộp (chai) đươc vệ sinh kĩ bằng nước kiềm loãng nhằm loại bỏ cặn bẩn và vi sinh vật bám trên bề mặt, thông thường hỗn hợp nước rửa hộp pha loãng với NaOH 3% , Na3PO4 1%, nếu dùng dung dịch để sát trùng bằng clo thì nồng độ clo phải đạt khoảng 100 ml/l . Sau đó hộp sẽ được rửa sạch bằng nước , sấy khô hoặc để ráo nước. Nước quả sẽ được rót vào hộp (chai) bằng hệ thống rót chuyên dụng. 2.8.2.8 Bài khí và ghép kín Trong các quá trình chế biến cơ học như lọc, ép và vận chuyển các bán chế phẩm như bơm chuyển từ thùng chứa này sang thùng chứa khác, khi cho thực phẩm vào trong bao bì, đều làm cho một số không khí xâm nhập, hòa lẫn vào các sản phẩm. Trong các gian bào của thực phẩm lúc đóng hộp cũng còn tồn tại các chất khí như hơi nước, khí carbonic Sản phẩm cho vào bao bì không hoàn toàn chiếm đầy cả dung tích của hộp mà còn lại một khoảng không gian trong hộp kín, chứa không khí và hơi nước. Trước khi ghép kín đồ hộp, cần đuổi bớt các chất khí tồn tại trong đồ hộp. Quá trình này gọi là bài khí 30
32. Mục đích Giảm áp suất bên trong đồ hộp khi thanh trùng. Nguyên nhân làm tăng áp suất bên trong đồ hộp khi thanh trùng, chủ yếu là do tồn tại lượng không khí trong đồ hộp đó sau khi ghép kín. Áp suất trong hộp khi thanh trùng bằng tổng áp suất riêng phần của không khí, áp suất riêng phần của hơi nước và áp suất do sản phẩm dãn nở. Khi áp suất tổng cộng ấy bằng 1,96 – 3,92.105N/m2 (2 – 4at) có thể làm hỏng hộp. Bài khí sẽ làm giảm áp suất trong hộp, nên hộp khi thanh trùng không bị biến dạng hay hư hỏng hộp. Hạn chế sự oxy hóa các chất dinh dưỡng của thực phẩm ,Oxy của không khí còn lại trong đồ hộp làm cho các quá trình oxy hóa xảy ra trong đồ hộp ,các quá trình oxy hóa xảy ra trong đồ hộp mạnh, làm cho các vitamin, nhất là vitamin C bị tổn thất, các chất hữu cơ bị oxy hóa làm thay đổi hương vị màu sắc của sản phẩm. Hạn chế sự phát triển của các vi khuẩn hiếu khí còn tồn tại trong đồ hộp Sau khi thanh trùng đồ hộp, trong số các loại vi sinh vật còn sống, tồn tại các vi sinh vật hiếu khí và nha bào của nó. Nếu trong môi trường còn nhiều Oxy, các vi sinh vật đó có điều kiện phát triển, gây hư hỏng sản phẩm. Khi bài khí, các vi sinh vật hiếu khí không có điều kiện phát triển, nên dù còn sống cũng không gây hư hỏng đồ hộp. Hạn chế hiện tượng ăn mòn hộp kim loại . Hộp kim loại, nếu trong môi trường acid yếu, các lỗ nhỏ không phủ thiếc trên bề mặt, sẽ tạo ra những cặp pin li ti, mà hai điện cực là sắt và thiếc. Khi dòng điện chạy từ cực dương sang cực âm, đẩy hydro thoát ra dung dịch đến bám vào cực âm, tạo thành một màng bảo vệ cực âm, hạn chế sự phân cực của pin và tiến tới làm ngừng quá trình ăn mòn. Nhưng nếu trong hộp còn oxy, oxy phản ứng ngay với hydro phá hủy màng bảo vệ, dòng điện tiếp tục chạy và diễn ra quá trình ăn mòn. Do đó, bài khí thì hiện tượng ăn mòn sẽ bị hạn chế Tạo độ chân không trong đồ hộp khi đã làm nguội, đồ hộp thực phẩm cần phải có một độ chân không nhất định, để khi vận chuyển, bảo quản trong các điều kiện khí hậu khác nhau. Đồ hộp không có các biểu hiện phồng đáy, nắp, để người sử dụng có thể phân biệt được đồ hộp tốt hay xấu do các vi 31
33. sinh vật tạo thành khí gây ra. Vì vậy độ chân không được coi là một chỉ số phẩm chất của đồ hộp. Độ chân không thường là 3,22 – 5,98.104N/m2. Ở Nhật Bản, áp suất trong hộp yêu cầu chỉ còn 1,06.104 N/m2 (hay 80 mmHg) Phương pháp bài khí Có nhiều phương pháp bài khí khác nhau, nhưng chủ yếu là dùng phương pháp bài khí bằng nhiệt và dùng thiết bị chân không. Bài khí bằng nhiệt Phương pháp đơn giản và thuận lợi nhất để bài khí bằng nhiệt là cho sản phẩm vào bao bì khi còn nóng. Cho sản phẩm vào bao bì khi đã đun nóng tới khoảng 850C rồi ghép kín ngay. Bài khí bằng thiết bị chân không người ta dùng bơm chân không để hút không khí ra khỏi hộp trong một phòng của máy ghép kín. Hiện nay biện pháp này được sử dụng phổ biến để tạo độ chân không có hiệu quả nhất trong đồ uống. Phương pháp bài khí khác ngoài các phương pháp trên, người ta còn tiến hành bài khí bằng phun hơi. Dùng hơi nước nóng phun vào khoảng không gian trong đồ hộp, trước khi ghép kín, hơi nước đẩy không khí ra ngoài. Sau khi ghép kín và làm nguội, hơi nước đó ngưng tụ và tạo độ chân không trong hộp. Phương pháp này chỉ áp dụng cho loại đồ hộp lỏng. Giới thiệu thiết bị bài khí Trong sản xuất nước quả, có thể dùng các thiết bị bài khí chân không : - Thiết bị bài khí ly tâm : Nước quả đưa vào phòng chân không có ngăn quay rồi theo rãnh vòng đi ra ngoài. - Thiết bị bài khí kiểu phun : nước quả được phun thành tia tạo thành các giọt rất nhỏ ở trong một thùng kín có hút chân không. - Thiết bị bài khí kiểu màng : dùng vòi phun mạnh nước quả vào thành một bình có bộ hút chân không để tạo thành màng chất lỏng rất mỏng trên thành bình. Các thiết bị này làm việc với độ chân không rất cao có thể tới 740 mmHg nên tác dụng bài khí rất mạnh. Ghép kín Quá trình ghép kín nắp vào hộp để ngăn cách hẳn sản phẩm thực phẩm với môi trường không khí và vi sinh vật ở bên ngoài, là một quá trình quan trọng, có ảnh 32
34. hưởng tới thời gian bảo quản lâu dài các thực phẩm đó. Nắp hộp phải được ghép thật kín, chắc chắn. 2.8.2.9 Thanh trùng Cơ sở của quá trình thanh trùng : Trong sản xuất thực phẩm, thanh trùng là một quá trình quan trọng, có tác dụng quyết định tới khả năng bảo quản và chất lượng của thực phẩm. Đây là biện pháp cất giữ thực phẩm theo nguyên lý tiêu diệt mầm móng gây hư hỏng thực phẩm (nguyên tắc đình chỉ sự sống) bằng nhiều phương pháp khác nhau: dùng dòng điện cao tần, tia ion hóa, siêu âm, lọc thanh trùng và tác dụng của nhiệt độ. Các loại vi sinh vật có khả năng tồn tại trong nước ép Loại hiếu khí Bacillus mesentericus : có nha bào, không độc, ở trong nước và trên bề mặt Quả Nha bào bị phá hủy ở 1100C trong 1 giờ. Loại này có trong tất cả các loại đồ uống đóng hộp phát triển nhanh ở nhiệt độ quanh 370C. Bacillus subtilis : có nha bào, không gây bệnh. Nha bào chịu 1000C trong 1giờ, 1150C trong 6 phút. Loại này có trong đồ hộp cá, rau, thịt. Không gây mùi vị lạ, phát triển rất mạnh ở 25 - 350C. Loại kỵ khí Clostridium sporogenes: cố định ở trạng thái tự nhiên của mọi môi trường. Nó phân hủy protid thành muối của NH3, rồi thải NH3,, sản sinh ra H2S, H2 và CO2. Nha bào của nó chịu đựng được trong nước sôi trên 1 giờ. Clostridium sporogenes có độc tố, song bị phá hủy nếu đun sôi lâu. Loại này có trong mọi đồ hộp, phát triển rất mạnh ở 27 - 580C. Nhiệt độ tối thích là 370C. Clostridium putrificum: là loại vi khuẩn đường ruột, có nha bào, không gây bệnh. Các loại nguyên liệu thực vật đề kháng mạnh với Clostridium putrificum vì có phitonxit. Loại này có trong mọi đồ hộp, nhiệt độ tối thích là 370C. Loại vừa hiếu khí vừa kỵ khí Bacillus thermophillus: có trong đất, phân gia súc, không gây bệnh, có nha bào. Tuy có rất ít trong đồ hộp nhưng khó loại trừ. Nhiệt độ tối thích là 60 - 70oC. Staphylococcus pyrogenes aureus : có trong bụi và nước, không có nha bào. Thỉnh thoảng gây bệnh vì sinh ra độc tố, dễ bị phá hủy ở 60 - 70oC. Phát triển nhanh 33
35. ở nhiệt độ thường. Loại gây bệnh, gây ra ngộ độc do nội độc tố Bacillus botulinus : còn có tên là Clostridium botulinum. Triệu chứng gây bại liệt rất đặc trưng : làm đục sự điều tiết của mắt, rồi làm liệt các cơ điều khiển bởi thần kinh sọ, sau đó toàn thân bị liệt. Người bị ngộ độc sau 4 - 8 ngày thì chết. Loại này chỉ bị nhiễm khi không tuân theo nguyên tắc vệ sinh và thanh trùng tối thiểu. Nha bào có khả năng đề kháng mạnh: ở 100oC là 330 phút, 115oC là 10 phút, 120oC là 4 phút. Độc tố bị phá hủy hoàn toàn khi đun nóng 80oC trong 30 phút. Salmonella: thuộc nhóm vi khuẩn gây bệnh, hiếu khí, ưa ẩm, không có nha bào nhưng có độc tố. Nấm men, nấm mốc Nấm men: chủ yếu là Saccharomyces ellipsoides, hiện diện rộng khắp trong thiên nhiên. Nấm men thường thấy trong đồ hộp có chứa đường. Bào tử của nấm men không có khả năng chịu đựng được nhiệt độ cao, chúng có thể chết nhanh ở nhiệt độ 60oC. Nấm mốc : ít thấy trong đồ hộp. Nói chung men, mốc dễ bị tiêu diệt ở nhiệt độ thấp và dễ loại trừ bằng cách thực hiện vệ sinh công nghiệp tốt [7]. 2.8.3 Thành phần dinh dưỡng và lợi ích của nước cam Trong nước ép từ cam chứa nhiều thành phần quan trọng như vitamin C, vitamin K, P, Fe, các loại đường chủ yếu là sucrose, các acid hữu cơ như citric, malic, tataric, các thành phần mùi vị như este, rượu, xeton. Nước cam tươi còn là nguồn cung cấp phong phú chất Thiamine và Folate. Thiamine hay vitamin B1 tham gia vào tiến trình sản xuất năng lượng. Folate có công dụng làm cho máu huyết trở nên "khỏe" hơn. Các nghiên cứu đã tìm ra được nước cam ép giúp tăng mức catechin lên gấp 5 lần. Hiệp hội Khoa học Australia đã nghiên cứu về công dụng của các loại nước ép trái cây và chỉ đích danh những loại đồ uống tốt cho sức khỏe đặc biệt là nước ép từ cam[18]. 34
36. Bảng 2.4 Thông tin dinh dưỡng trong 100ml nước cam nguyên chất Các thành phần dinh dưỡng Hàm lượng trong 100ml Protein 0.7g Chất béo 0.2g Carbohydrate 10.4g Đường 8.4g Can- xi 11mg Sắt 0.2mg Kali 200mg Sodium 1mg Kẽm 0.05mg Selen 0.1mcg Vitamin C 50mg [17] Vitamin C là một trong những chất chống oxy hóa quan trọng nhất và nó giúp hỗ trợ hệ thống miễn dịch khỏe mạnh Vitamin C có thể giúp trung hòa các gốc tự do có thể gây hại tế bào và mô và dẫn đến bệnh tật. Một ly nước cam 250ml cung cấp đến 150% nhu cầu vitamin C cho mỗi người dùng trong một ngày. Kali đóng vai trò quan trọng trong chức năng cơ bắp và có thể giúp giảm nguy cơ huyết áp cao và đột quỵ. Ly nước cam 250ml nguyên chất có thể cung cấp 14% kali giá trị hàng ngày . Folate (Folic Acid) rất cần thiết cho phân chia tế bào và giúp tế bào máu khỏe mạnh. Đầy đủ axit folic cho người phụ nữ trong suốt quá trình mang thai sẽ sinh con được mạnh khỏe làm giảm nguy cơ sinh con bị dị tật bẩm sinh não và tủy sống, Folate có thể giúp giảm mức độ homocysteine trong máu có thể góp phần vào tình trạng viêm đã được kết hợp với suy giảm nhận thức. Với 240ml nước ép cam nguyên chất cung cấp khoảng 11 % giá trị nhu cầu hàng ngày. Canxi là một vật liệu xây dựng cho xương khỏe mạnh chế độ ăn giàu canxi cũng có thể giúp điều hòa huyết áp ,hỗ trợ tuần hoàn tim mạch 35
37. Vitamin B6 hỗ trợ quá trình dị hóa sinh năng lượng từ những thực phẩm cho cơ thể hoạt động và cần thiết cho việc sản xuất các tế bào mới bao gồm các tế bào máu đỏ khỏe mạnh. 7% nhu cầu vitamin B6 hàng ngày. Thiamin được liên kết với hệ thống hoạt động của nhiều enzyme, chuyển đổi thức ăn thành năng lượng, chức năng sản xuất và sửa chữa DNA. Một ly 240ml nước ép cam nguyên chất cung cấp cung cấp 18 % nhu cầu thiamin hàng ngày. Flavanoid - chất hiện diện trong nước cam kết hợp với vitamin C giúp tăng cường hệ miễn dịch, làm chắc khỏe mao mạch, ngừa hiện tượng mạch máu dưới da mặt bị vỡ, khiến cho da mịn màng và sáng hơn [15,16,17]. 36
38. 3.1 Vật liệu 3.1.1 Nguyên liệu cam Chúng tôi sử dụng nguồn nguyên liệu cam sành được mua từ chợ Văn Thánh, nguyên liệu được mua tại cùng địa điểm, kích cỡ tương đương nhau, không dập nát và được bảo quản trong điều kiện mát. 3.1.2 Giống vi sinh vật Lactobacillus acidophilus có khả năng lên men đường sucrose và chịu được pH thấp trong môi trường nước ép cam nên chúng tôi quyết định chọn Lactobacillus acidophilus để tiến hành thí nghiệm tạo sản phẩm. Giống vi khuẩn Lactobacillus acidophilus được cung cấp từ phòng thí nghiệm trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM dưới dạng thạch nghiêng. Giống được nuôi cấy trên môi trường MRS lỏng và sau đó được chuyển sang môi trường trung gian là môi trường nước ép cam pha loãng, có bổ sung đường sucrose và cao nấm men. 3.2 Hóa chất, trang thiết bị, dụng cụ khác 3.2.1 Thiết bị Tủ ủ Nồi hấp khử trùng Máy đo quang 3.2.2 Dụng cụ Ống nghiệm Pipet Erlen Đĩa petri Becher Kính hiển vi Cân điện tử Que cấy 3.2.3 Hóa chất Môi trường MRS cải tiến Đường sucrose, thuốc nhuộm crytal violet, iodine, fuchsin, chất chỉ thị 37
39. phenolphtalein, NaOH 0,1N. 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Sơ đồ nghiên cứu Khảo sát Lactobacillus acidophilus Xử lý nguyên liệu cam Thời gian lên men Nhiệt độ Khảo sát điều kiện lên men pH Tỷ lệ pha loãng Tỷ lệ cấy giống Đánh giá chất Bảo quản Đường bổ sung lượng sản phẩm sản phẩm Sơ đồ 3.1 Sơ đồ bố trí nội dung nghiên cứu 3.3.2 Bố trí nội dung thí nghiệm 3.3.2.1 Xử lý giống Từ giống gốc trên ống thạch nghiêng, dùng que cấy vòng cấy giống vào môi trường thạch MRS- agar trên đĩa petri để tiến hành quan sát đại thể sau 24- 48h ủ ở 37oC. Quan sát vi thể và xác định Gram bằng phương pháp nhuộm Gram. Phương pháp nhuộm Gram do nhà vi khuẩn học Đan Mạch Hans Christan Gram (1853 – 1938) phát minh ra từ năm 1884. Nhờ phương pháp này người ta phân biệt ra 2 nhóm vi khuẩn đó là: Vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm. Nhuộm Gram không những giúp phân biệt được vi khuẩn nhờ các đặc điểm hình thái và sự sắp xếp của tế bào mà còn cung cấp thông tin về lớp vỏ tế bào. Khi nhuộm theo phương pháp này, tế bào vi khuẩn Gram (+) có lớp vỏ tế bào dày tạo bởi peptidoglycan sẽ có màu tím, còn 38
40. vi khuẩn Gram (-) có lớp vỏ tế bào mỏng hơn do có ít peptidoglycan hơn và được bao bọc bởi một màng mỏng sẽ có màu hồng [6]. Cho 1 ít giống vi sinh vật trên lame. Cho crytal violet lên, bổ sung thêm 1 giọt iodine giúp crytal violet bám chặt vào màng tế bào vi sinh vật trong khoảng 30 giây. Rửa nước → Rửa cồn → Rửa lại bằng nước → Cho thêm 1 giọt Basic Fuchsin → Rửa nước → Để khô tấm lame → Nhỏ 1 giọt dầu soi kính → Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100. Cấy giống vào môi trường MRS lỏng nuôi cấy ở 37oC sau 24 – 48 giờ tiếp tục chuyển giống sang môi trường nhân giống là dịch quả pha loãng (tỉ lệ 1 nước quả : 5 nước) có bổ sung đường sucrose và cao nấm men ủ ở nhiệt độ 37oC sau 24 – 48 giờ tiến hành đếm số lượng tế bào bằng phương pháp trãi đĩa nhằm kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn trước khi tiến hành lên men. 3.3.2.2 Khảo sát các điều kiện lên men và lên men tạo sản phẩm Dựa theo quy trình tạo sản phẩm thức uống lên men lactic từ malt, gạo lức, boza, yến mạch, cà chua Quy trình lên men lactic từ nước ép cam được thể hiện ở sơ đồ 3.2 39
41. Cam Ép Loại bả ép Dịch ép Loại hạt Phối trộn, chỉnh pH Đường , nước Thanh trùng 95oC/ 30 phút Theo dõi bảo quản Làm nguội phẩm Đánh giá chất lượng SP Cấy giống Vi khuẩn L.acidophilus Sản phẩm Lên men Sơ đồ 3.2 Quy trình sản xuất nước cam probiotic. 40
42. Chúng tôi tiến hành khảo sát các yếu tố Ảnh hưởng của lượng nước bổ sung vào nước ép Ảnh hưởng của lượng đường bổ sung Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống ban đầu Ảnh hưởng của thời gian lên men Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ lên men Khảo sát các điều kiện lên men bao gồm theo dõi quá trình lên men dựa trên các chỉ tiêu Hàm lượng acid lactic sinh ra (%) Khả năng sử dụng đường trong môi trường Mật độ tế bào vi khuẩn Thông số pH Chúng tôi tiến hành xác định chế độ và thành phần môi trường tối ưu theo phương thức chọn lọc thực nghiệm Các ảnh hưởng được khảo sát bằng cách cho 1 yếu tố thay đổi trong khoảng giới hạn còn các yếu tố khác giữ nguyên. Mặc dù tốn nhiều thời gian nhưng phương pháp này đáng tin cậy [3]. Các thí nghiệm được bố trí như sau 41
43.  Thí nghiệm 1- Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng nước bổ sung vào dịch ép Mục đích : tìm ra một tỷ lệ pha loãng nhất định giữa dịch ép cam và nước thích hợp cho vi sinh vật lên men đồng thời giúp sản phẩm tạo thành có vị ngọt, vị chua vừa và màu sắc đẹp tự nhiên Bảng 3.1 Bố trí thí thí nghiệm 1 Yếu tố cố định 17g đường/100ml 5% giống L. acidophilus Lên men 24 giờ ở 37oC pH 5 Yếu tố thay Tỷ lệ dịch ép quả: nước đổi 1: 0 1: 1 2: 1 Các chỉ tiêu Hàm lượng acid lactic sinh ra theo dõi Thông số pH Hàm lượng chất khô (brix) Mật độ tế bào Lactobacillus acidophilus Cảm quan sơ bộ sản phẩm 42
44.  Thí nghiệm 2 – Khảo sát hàm lượng đường bổ sung Đường là một cơ chất quan trọng trong quá trình lên men của vi khuẩn, lượng đường quá ít sẽ làm giảm khả năng lên men của vi sinh vật, cũng như ảnh hưởng đến mật độ tế bào vi sinh vật cho sản phẩm, mặt khác đường nhiều sẽ gây mất cân bằng áp suất thẩm thấu qua màng tế bào vi sinh vật, làm ức chế quá trình lên men đồng thời tốn nhiều nguyên liệu đường làm giá thành sản phẩm tăng lên. Do đó mục đích của thí nghiệm này nhằm tìm ra một tỷ lệ bổ sung đường hợp lý cho quá trình lên men cũng như tạo vị ngọt vừa cho sản phẩm. Bố trí thí nghiệm như sau: Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm 2 Yếu tố cố định Tỷ lệ dịch ép quả: nước thích hợp ở thí nghiệm 1 Tỷ lệ cấy giống 5% Lên men 24 giờ ở 37oC pH 5 Yếu tố thay đổi Hàm lượng đường 17g/100ml 19g/100ml 21g/100ml Chỉ tiêu theo dõi Tương quan giữa lượng acid lactic sinh ra với hàm lượng đường bổ sung Thông số pH Hàm lượng chất khô ( brix) Mật độ L.acidophilus Cảm quan sơ bộ 43
45.  Thí nghiệm 3 – Khảo sát tỷ lệ cấy giống ban đầu Tỷ lệ cấy giống ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men, khả năng sinh acid lactic và mật độ vi khuẩn có trong sản phẩm, lượng giống ít sẽ kéo dài thời gian lên men và khả năng bị nhiễm cao, mặt khác tỷ lệ giống lớn sẽ làm rút ngắn thời gian lên men, hàm lượng acid lactic sinh ra lớn, tuy nhiên việc bảo quản sản phẩm ở các tuần tiếp theo sẽ rất khó khăn. Do đó mục đích của thí nghiệm này nhằm tìm ra một tỷ lệ cấy giống vừa phải nhưng hiệu quả cho quá trình lên men. Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm 3 Yếu tố cố định Tỷ lệ dịch ép quả : nước thích hợp đã xác định từ thí nghiệm 1 Hàm lượng đường thích hợp ở thí nghiệm 2 Lên men 24 giờ ở 37oC Yếu tố thay đổi Tỷ lệ cấy giống 3% 5% 7% Chỉ tiêu theo dõi Tương quan giữa hàm lượng acid lactic sinh ra với tỷ lệ giống Thông số pH Hàm lượng chất khô (brix) Mật độ vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Cảm quan sơ bộ 44
46.  Thí nghiệm 4 -Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men Mục đích : chọn thời gian lên men cho sản phẩm có lượng acid lactic sinh ra vừa đủ làm cho sản phẩm có vị chua ngọt vừa. Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm 4 Yếu tố cố định Tỷ lệ dịch ép quả: nước thích hợp ở thí nghiệm 1 Hàm lượng đường bổ sung thích hợp ở thí nghiệm 2 Tỷ lệ cấy giống thích hợp xác định ở thí nghiệm 3 pH thích hợp ở thí nghiệm 4 Yếu tố thay đổi Thời gian lên men 12 giờ 24 giờ 36 giờ 48 giờ Chỉ tiêu theo dõi Hàm lượng acid lactic sinh ra Hàm lượng chất khô (brix) Mật độ L.acidophilus C ảm quan sơ bộ 45
47.  Thí nghiệm 5 – Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men Mục đích của thí nghiệm này nhằm chọn ra giá trị pH thích hợp cho quá trình lên men. Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm 5 Yếu tố cố định Tỷ lệ dịch ép quả: nước thích hợp ở thí nghiệm 1 Hàm lượng đường bổ sung thích hợp ở thí nghiệm 2 Tỷ lệ cấy giống thích hợp xác định ở thí nghiệm 3 Thời gian lên men 24 giờ o Nhiệt độ lên men 37 C Yếu tố thay đổi Giá trị pH Đối chứng 4.5 5 5.5 Chỉ tiêu theo dõi Biến động pH Hàm lượng lactic sinh ra Hàm lượng chất khô (brix) Mật độ L.acidophilus Cảm quan sơ bộ 46
48.  Thí nghiệm 6 – Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình lên men Mục đích của thí nghiệm này nhằm chọn ra nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men. Bảng 3.6 Bố trí thí nghiệm 6 Yếu tố cố định Tỷ lệ dịch ép quả: nước thích hợp ở thí nghiệm 1 Hàm lượng đường bổ sung thích hợp ở thí nghiệm 2 Tỷ lệ cấy giống thích hợp xác định ở thí nghiệm 3 pH lên men thích hợp ở thí nghiệm 4 Thời gian lên men thích hợp ở thí nghiệm 5 Yếu tố thay đổi Nhiệt độ lên men Nhiệt độ phòng 37 42 Chỉ tiêu theo dõi Hàm lượng acid lactic sinh ra Hàm lượng chất khô ( brix) Cảm quan sơ bộ 47
49. 3.3.3 Đánh giá chất lượng sản phẩm Đánh giá chất lượng sản phẩm qua các chỉ tiêu pH, độ brix, mật độ tế bào vi khuẩn lactic, cấu trúc sản phẩm và được so sánh tại các thời điểm bắt đầu bảo quản (thời điểm 0) và các tuần tiếp đó. Các chỉ tiêu theo dõi định ra trong từng thí nghiệm sẽ luôn được xác định trong suốt thời gian lên men. Sau đó tiến hành lên men với các điều kiện tối ưu đã khảo sát và xác định hoạt tính probiotic theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ 4-6oC, các thông số xác đinh hoạt tính này bao gồm các chỉ tiêu pH, mật độ tế bào. Đánh giá cảm quan cho phép giải quyết những bận tâm của nhà sản xuất trong quá trình kiểm tra nguyên liệu, quá trình sản xuất, đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ và kỹ thuật đến sản phẩm cuối cùng, xác định thời hạn của sản phẩm và cuối cùng là phát triển sản phẩm mới [ 2]. Chất lượng thực phẩm được cấu thành bởi những tính chất đặc trưng và thị hiếu của người tiêu dùng. Các phương pháp phân tích chất lượng cho phép tiếp cận hai khía cạnh của chất lượng thực phẩm thông qua việc phân tích các thuộc tính và đánh giá thị hiếu người sử dụng. Thực tế nghiên cứu thị hiếu người tiêu dùng cho thấy mức độ ưa thích chung của người tiêu dùng chỉ tỉ lệ thuận với một số tính chất của sản phẩm. Chúng tôi đánh giá chất lượng cảm quan sản phẩm qua phương pháp phép thử cho điểm chất lượng. Thang tính điểm dựa theo TCVN 3215-79, thống nhất 4 bậc 5 điểm. Điểm 0 ứng với sản phẩm bị hỏng, từ điểm 1 đến 5 ứng với mức khuyết tật giảm dầm, mức điểm 5 là cao nhất cũng đồng nghĩa với việc sản phẩm có chất lượng tốt không mắc lỗi và khuyết tật nào. Phép thử cho điểm thị hiếu đánh giá theo thang điểm 5, điểm 1 ứng với trạng thái rất “ghét”, từ điểm 2 đến điểm 5 ứng với mức độ ưa thích dần, điểm 5 ứng với trạng thái “rất thích”. Chỉ tiêu vi sinh là chỉ tiêu vô cùng quan trọng của sản phẩm trước khi đưa ra thị trường nhằm đảm bảo an toàn cho người sử dụng, ngoài ra chỉ tiêu vi sinh cũng rất quan trọng trong việc bảo quản sản phẩm, đối với các sản phẩm probiotic còn phải 48
50. đạt chỉ tiêu về vi khuẩn lactic theo thời gian bảo quản. 3.4 Các phương pháp phân tích Đo pH: Sử dụng máy đo pH Đo nồng độ chất khô: Dùng máy đo độ Brix (khúc xạ kế) có thang đo từ 0 – 32 Xác định hàm lượng acid lactic (%) Nguyên tắc: acid tổng được qui về acid lactic, xem như acid lactic là chủ yếu trong dịch lên men. Dùng dung dịch kiềm chuẩn NaOH để trung hòa lượng acid lactic có trong mẫu với phenolphtalein 1% làm chất chỉ thị. Tiến hành: Cho 10ml dịch lên men vào erlen, bổ sung thêm 20ml nước cất trung tính, cho thêm 2 – 3 giọt phenolphtalein. Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cho đến khi có màu hồng nhạt bền vững trong 30 giây, so sánh với mẫu đối chứng là dịch chưa lên men Cách tính: Hàm lượng acid tổng được tính theo công thức: (V – V0) x 0,1 x 90/10 = (V – V0) x 0,9 V: Thể tích dung dịch NaOH dùng để trung hòa 10ml dịch lên men (ml) V0: Thể tích dung dịch NaOH dùng để trung hòa 10ml mẫu đối chứng (ml) Xác định mật độ tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên thạch MRS agar sau 24 – 48 giờ ủ ở 37oC . Trải đĩa để xác định mật độ tế bào sử dụng dịch mẫu được pha loãng ở nồng độ thích hợp để làm thí nghiệm, mỗi độ pha loãng sẽ được làm trên 2 đĩa petri. Dùng pipetman (đầu vô trùng) hút 0.1 ml mẫu cho vào đĩa petri chứa môi trường MRS - agar đã vô trùng dùng que tran vô trùng trải đĩa cho đến khi khô bề mặt, ủ ở 37oC trong 24- 48 giờ. Cách tính số lượng tế bào/ml như sau: cfu N.D ml V Trong đó N : số khuẩn lạc trung bình trên những đĩa petri ở cùng độ pha loãng nhất định 49
51. V: thể tích mẫu trãi đĩa D: hệ số pha loãng 3.5 Phương pháp đánh giá cảm quan Nguyên tắc: phép thử được lựa chọn là phép thử cho điểm thị hiếu để đánh giá về các chỉ tiêu màu sắc, mùi vị, mức độ ưa thích chung và phép thử cho điểm chất lượng tổng hợp của sản phẩm. Người thử là sinh viên được lựa chọn ngẫu nhiên và không qua huấn luyện. Phương pháp: sản phẩm khảo sát trên 10 người, người thử sẽ cho điểm về màu sắc, cấu trúc, mùi vị. Sau đó người thử sẽ cho điểm độ ưa thích chung đối với sản phẩm. Điều kiện thử ở nhiệt độ phòng, mẫu ở trạng thái lạnh Xây dựng TCVN cho “ nước cam probiotic”. Bảng 3.7 Đánh giá cảm quan “nước cam probiotic” Tên chỉ tiêu Hệ số quan trọng % Trên 4 1. Màu sắc 25 1 2. Trạng thái 20 0.8 3. Mùi 25 1 4. Vị 30 1.2 Tên chỉ tiêu Hệ số Điểm Yêu cầu quan trọng 5 Sản phẩm có màu vàng tự nhiên của nước ép cam Màu sắc 1 4 Sản phẩm có màu vàng vừa phải 3 Màu sản phẩm vàng nhạt, ít đặc trưng của màu nước cam 2 Sản phẩm có màu phớt vàng, không giống màu nước cam chín vàng 1 Sản phẩm có màu rất nhạt 50
52. 0 Sản phẩm có màu lạ, màu của sản phẩm hư hỏng 5 Sản phẩm có thể lỏng vừa phải, có độ sánh mịn, đồng nhất Trạng thái 0.8 4 Sản phẩm có độ thể lỏng vừa phải, độ mịn và đồng nhất 3 Sản phẩm có thể lỏng, ít đồng nhất 2 Sản phẩm có thể lỏng và tách lớp 1 Sản phẩm lỏng loãng, tách lớp nhiều 0 Sản phẩm có trạng thái hư hỏng 5 Sản phẩm có mùi thơm đặc trưng của nước ép cam, không có mùi lạ Mùi 1 4 Sản phẩm có mùi đặc trưng của cam 3 Sản phẩm ít có mùi đặc trưng của dịch cam 2 Sản phẩm không có mùi đặc trưng của dịch cam 1 Sản phẩm có mùi lạ 0 Sản phẩm có mùi bị hư hỏng 5 Sản phẩm có vị đặc trưng của sản phẩm lên Vị 1.2 men lactic, chua ngọt hài hòa tự nhiên 4 Sản phẩm có vị chua ngọt ít hài hòa 3 Sản phẩm có vị chua ngọt kém hài hòa, vị chua nhiều hơn ngọt 2 Sản phẩm chua ngọt không rõ ràng 1 Sản phẩm có vị đắng nhẹ 0 Sản phẩm rất đắng 51
53. 4.1 Một số kết quả khảo sát Lactobacillus acidophilus Giống vi khuẩn Lactobacillus acidophilus được cung cấp từ phòng thí nghiệm trường Đại học Bách Khoa TP.HCM, giống vi khuẩn ở dạng thạch nghiêng được cấy sang môi trường thạch MRS để kiểm tra độ thuần của giống, quan sát đại thể, tiến hành quan sát vi thể và nhuộm Gram. 4.1.1 Kết quả quan sát đại thể, vi thể Chúng tôi tiến hành trải đĩa giống L.acidophilus trên môi trường thạch MRS, ủ ở 37oC trong 48 giờ, khuẩn lạc L.acidophilus trên môi trường thạch MRS có hình tròn, bề mặt lồi màu trắng đục.( hình 4.1) Hình 4.1 Kết quả quan sát đại thể Lactobacillus acidophilus trên môi trường MRS Một tế bào có thể phân chia theo cấp số nhân cho đến khi hình thành một khuẩn lạc có thể trông thấy được. Đây là cơ sở của việc định lượng tế bào trên thạch đĩa, bởi vì số lượng khuẩn lạc sinh ra từ một thể tích giống vi sinh vật nhất định tương đương với số lượng tế bào sống ban đầu có trong thể tích giống đó. Hình 4.2 Nhuộm Gram quan sát vi thể L.acidophilus ở vật kính 100 52
54. Lactobacillus acidophilus bắt màu tím do có lớp peptidoglycan dày chứng tỏ Lactobacillus acidophilus là vi khuẩn Gram (+). Đây là trực khuẩn, có kích thước rộng: 0,6 – 0.9µm, dài: 1,5 – 6,0µm, chúng thường tồn tại riêng lẻ, đôi khi tạo thành chuỗi ngắn và có khả năng chuyển động. 4.1.2 Tăng sinh giống trên môi trường MRS lỏng và môi trường trung gian nước ép cam pha loãng Sau 24 giờ nuôi cấy trong môi trường MRS lỏng số lượng tế bào đạt 2,1x 1010 cfu/ml, tiếp tục cấy chuyền sang môi trường nước cam pha loãng tỉ lệ (dịch ép: nước cất) 1:5 có bổ sung 5% đường sucrose và 2% cao nấm men mục đích cho vi khuẩn Lactobacillus acidophilus thích nghi dần với môi trường nước quả, môi trường trung gian sau khi được cấy giống sẽ được ủ ở 37oC thời gian 24 giờ. Sinh khối sau 24 giờ nuôi cấy đạt 1,11x 109 cfu/ml. Với lượng sinh khối này cho phép tiến hành lên men tạo sản phẩm, đây là lượng sinh khối có thể chấp nhận được nếu chúng ta so sánh với số lượng giống khởi đầu của một số sản phẩm lên men từ ngũ cốc như “ tương tự Amazake” làm từ gạo nấu chín có lượng Lactobacillus amylovorus là 5– 7 x 106 cfu/ml, sản phẩm FB (fermented Brown rice) có hàm lượng Lactobacillus acidophilus là 1,8 x 107 cfu/ml, sản phẩm yogurt làm từ gạo có hàm lượng Lactobacillus acidophilus và Lactobacillus casei là 108 – 109 cfu/ml. Mật độ giống luôn được theo dõi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. 4.2 Xử lý nguyên liệu cam Cam sau khi được rửa sạch vỏ, tiến hành ép lấy dịch quả, loại hạt, dịch ép sau khi xử lý có màu vàng đẹp tự nhiên, mùi thơm đặc trưng, pH dao động từ 3,4- 3,8, hàm lượng chất khô tự nhiên khoảng 4-6 độ brix. Cam → rửa → ép → loại hạt → dịch ép. 53
55. Hình 4.3 Lactobacillus acidophilus trong môi trường tăng sinh MRS Hình 4.4 Lactobacillus acidophilus trong môi trường trung gian sau 48 giờ ủ 4.3 Khảo sát quá trình lên men Quá trình lên men lactic là một quá trình phức tạp với sự chuyển hóa đường thành acid lactic dưới tác dụng của hệ vi khuẩn lactic. Lên men lactic là một trong những lên men rất dễ bị sinh vật tạp nhiễm khác lẫn vào quá trình lên men. Vì vậy, tất cả các công việc cấy giống cũng như lên men cần phải thực hiện trong điều kiện vô trùng tuyệt đối. 4.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng 54
56. Cam Ép Thu dịch Loại hạt Pha loãng 1:1 1:0 2:1 Bổ sung đường (17g/100ml) Thanh trùng (95oC/30 phút) Cấy giống Lên men Sơ đồ 4.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát tỷ lệ pha loãng. Sau khi xử lý cơ học nguyên liệu bao gồm ép thu dịch quả, lắng, loại hạt thu dịch ép, chúng tôi tiến hành pha loãng nước ép với nước cất tỷ lệ lần lượt 1:0; 2:1 và 1:1, đường sucrose được bổ sung ngay sau đó với tỷ lệ 17g đường/100 ml. Thanh trùng 95oC trong 30 phút trước khi cấy giống. Tỷ lệ cấy giống 5%. Tỷ lệ pha loãng dịch ép: nước sẽ ảnh hưởng đến màu sắc và hương vị của sản phẩm, đồng thời làm giảm chi phí nguyên liệu, sản phẩm sẽ có giá thành tốt hơn để tiếp cận người tiêu dùng. 55
57. Hình 4.5 Màu sắc của sản phẩm ở các tỷ lệ pha loãng Kết quả thí nghiệm cho thấy màu sắc của sản phẩm thay đổi theo tỷ lệ pha loãng, màu sắc nhạt dần theo thứ tự 1:0 ; 2:1 ; 1:1. Mùi vị sản phẩm ở độ pha loãng 2:1 là thích hợp nhất với hương cam nhẹ, màu vàng của nước ép cam tự nhiên. Mặt khác, nhìn vào biểu đồ 4.1 và bảng 4.1 cho thấy khả năng sử dụng đường, % acid lactic sinh ra và nồng độ tế bào L.acidophilus sau lên men cho thấy không có sự khác biệt đáng kể giữa các nghiệm thức. Tuy nhiên về mặt cảm quan: màu sắc cũng như mùi vị sản phẩm chúng tôi chọn tỷ lệ pha loãng 2:1 cho các thí nghiệm kế tiếp. Bảng 4.1 Kết quả thí nghiệm khảo sát tỷ lệ pha loãng Tỷlệ Chất pH Chất khô % Nồng độ tế bào Cảm quan sơ bộ pha khô sau sau lên acid L.acidophilus(cfu/ml) loãng (brix) lên men lactic nước men (brix) sinh ép:nước ra 1:0 20.5 3,95 18 3% 2,1 x 108 Màu vàng tự nhiên, mùi hăng nồng 1:1 20 3,93 17.5 3% 2,35 x 108 Màu vàng nhạt, hương cam nhẹ 2:1 20 3,95 18 2.8% 2,3 x 108 Hương cam nhẹ, 56
58. màu đẹp 20 18 17.5 18 15 brix 10 8.32 8.37 8.36 % acid lactic log cfu/ml 5 3 3 2.8 0 1:00 1:01 2:01 ty le pha loang Biểu đồ 4.1 Hàm lượng acid lactic sinh ra, nồng độ chất khô và mật độ tế bào sau lên men ở các tỷ lệ pha loãng 4.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của lượng đường bổ sung Đường sucrose có vị ngọt ổn định, thường được sử dụng tạo vị ngọt cho thức uống, L.acidophilus có khả năng lên men tốt đường sucrose nên chúng tôi chọn dạng đường này để tiến hành lên men. Mục đích của thí nghiệm này nhằm tìm ra lượng đường thích hợp, sản phẩm có vị ngọt vừa, nhắm đến thị hiếu người tiêu dùng đồng thời tránh sử dụng hàm lượng đường quá cao làm ức chế vi khuẩn L.acidophilus, tăng giá thành sản phẩm Cam Ép Thu dịch Loại hạt Pha loãng Thêm đường 17% 19% 21% Thanh trùng (95oC/30 phút) Cấy giống Lên men Sơ đồ 4.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát lượng đường bổ sung 57
59. Qua biểu đồ 4.2 cho thấy ở hàm lượng đường 17g/100ml chất khô biến động từ 20 về 18 ( độ brix), acid lactic sinh ra 3% thể tích, sinh khối đạt 2,2x 108 cfu/ml. Hàm lượng đường 19g/100ml chất khô biến động 20,5 về 17,5, lượng acid lactic sinh ra 3,3%, sinh khối đạt 2,19 x 108 cfu/ml. Ở 21g/100ml chất khô biến động từ 21 về 20 cùng với 1,8 % acid lactic sinh ra, sinh khối đạt 1,1 x 107 cfu/ml. Qua đó có thể thấy rằng ở hàm lượng 17 và 19g đường/100ml là lượng đường vừa đủ để L.acidophilus lên men. Mặt khác, 21g đường/100ml là hàm lượng đường cao làm mất cân bằng thẩm thấu của màng tế bào, do đó ức chế vi khuẩn làm giảm khả năng sử dụng đường và khả năng sinh acid, mật độ tế bào L.acidophilus trong sản phẩm cũng thấp hơn. Về mặt cảm quan sản phẩm ở hàm lượng 19g đường/100ml sản phẩm có vị chua ngọt hài hòa, màu sắc đẹp phù hợp với tiêu chí tiếp cận thị hiếu người sử dụng. Do đó chúng tôi chọn hàm lượng 19g đường/100 ml để tiến hành các thí nghiệm kế tiếp. Theo Nguyễn Lân Dũng (1980), ngoài đường lactose, vi khuẩn Lactobacillus acidophilus còn có khả năng lên men các loại đường glucose, saccharose, maltose [2]. Ở một số sản phẩm lên men lactic từ ngũ cốc như Sobia, Boza, lượng đường cũng được bổ sung với hàm lượng trong khoảng 10 – 20% [24, 25]. Bảng 4.2 Kết quả thí nghiệm khảo sát lượng đường bổ sung Hàm Chất pH sau Chất %Acid Nồng độ Cảm quan sơ bộ lượng khô ( lên khô lactic tế bào đường brix) men sau sinh ra L.acidoph (g/100ml) lên (%) ilus(cfu/m men l) (brix) 17 20 3,9 18 3 2,2 x 108 Vị ngọt nhẹ, màu đẹp, hương cam nhẹ 19 20.5 3,82 17.5 3.3 2,19x 108 Vị ngọt vừa, màu vàng đẹp, hương cam nhẹ 21 21 3,98 20 1.8 1,1 x 107 Vị ngọt gắt, mùi đường nồng, 58
60. màu đẹp 25 20 20 18 17.5 15 brix % acid lactic 8.34 8.34 10 7.04 log cfu/ml 5 3 3.3 1.8 0 17 19 21 ham luong duong/100ml Biểu đồ 4.2 Hàm lượng acid lactic sinh ra, chất khô và mật độ tế bào L.acidophilus sau lên men ở các nồng độ đường 4.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống Cam Ép Thu dịch Loại hạt Pha loãng Thêm đường Thanh trùng(90oC/ 30 phút) Cấy giống 3% 5% 7% Lên men Sơ đồ 4.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát tỷ lệ cấy giống Tỷ lệ cấy giống ban đầu ảnh hưởng đến thời gian lên men, tỷ lệ giống cấy giống ban đầu cao sẽ rút ngắn thời gian lên men và giảm thiểu khả năng tạp nhiễm, tuy nhiên tỷ lệ cấy giống cao còn có khuyết điểm là làm ngắn thời gian bảo quản, lưu hành của sản phẩm trên thị trường. Do đó mục đích của thí nghiệm này nhằm tìm ra 59
61. một tỷ lệ cấy giống hợp lý, đảm bảo cho quá trình lên men diễn ra tốt, tránh khả năng tạp nhiễm trong quá trình lên men nhưng vẫn có khả năng kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm ngoài thị trường. Nhìn vào biểu đồ 4.3 ta thấy được hàm lượng acid lactic sinh ra, biến động chất khô và nồng độ tế bào vi khuẩn trong sản phẩm tỷ lệ thuận với tỷ lệ cấy giống ban đầu. Ở tỷ lệ cấy giống 3% , chất khô ban đầu biến động từ 20 về 19,5 acid lactic sinh ra sau 24 giờ lên men là 1%, sinh khối trong sản phẩm đạt 2x 107 cfu/ml. Tỷ lệ cấy giống 5% chất khô dao động từ 20,5 về 18, acid lactic sinh ra 3% thể tích, sinh khối đạt 1,1x 108 cfu/ml. Còn tỷ lệ cấy 7%, sau quá trình lên men chất khô dao động từ 20,5 về 16,5, acid lactic sinh ra 4,5%, sinh khối đạt 109 cfu/ml. Qua đây có thể kết luận rằng tỷ lệ cấy giống 7% sẽ làm cho quá trình lên men diễn ra mạnh nhất, điển hình là khả năng tạo acid lactic sau quá trình lên men là 4,5% và mức độ sử dụng đường mạnh nhất. Tuy nhiên xét về mặt cảm quan màu sắc và mùi vị của sản phẩm thì tỷ lệ cấy giống 7% cho màu sậm làm giảm đi màu vàng tự nhiên của nước cam, mùi chua nặng lấn áp đi hương cam tự nhiên. Xét thấy ở tỷ lệ cấy giống ban đầu là 5% cho màu vàng đẹp tự nhiên, hương acid lactic nhẹ và vị chua vừa phải, chúng tôi quyết định chọn tỷ lệ cấy giống 5% cho các thí nghiệm kế tiếp. Bảng 4.3 Kết quả thí nghiệm khảo sát tỷ lệ cấy giống ban đầu Tỷ lệ Chất khô Chất khô pH acid Nồngđộ Cảm quan sơ bộ cấy ban sau lên sau lactic L.acidophilus giống đầu(brix) men(brix) lên sinh ra (cfu/ml) (%) men (%) 3 20,5 19 3,98 1 2x 107 Vị chua nhẹ, Màu đẹp 5 20,5 18 3,88 3 1,1x 108 Vị chua hài hòa, Màu đẹp 7 20,5 16,5 3,5 4,5 1 x 109 Vị chua nhiều Màu sậm 60
62. 19 20 18 16.5 15 brix 9 10 8.04 % acid lactic 7.3 log cfu/ml 4.5 5 3 1 0 3% 5% 7% ty le cay giong Biểu đồ 4.3 Hàm lượng acid lactic sinh ra ,chất khô và mật độ L.acidophilus sau quá trình lên men ở các tỷ lệ cấy giống 4.3.4 Thí nghiệm khảo sát thời gian lên men Thời gian lên men là yếu tố rất quan trọng ảnh hưởng đến giá trị cảm quan của sản phẩm, thời gian lên men quá lâu sẽ sinh ra vị chua nhiều, ảnh hưởng đến màu sắc, cấu trúc sản phẩm. Do đó mục đích của thí nghiệm này nhằm chọn ra thời gian vừa đủ để vi sinh vật lên men với lượng acid lactic sinh ra vừa phải đảm bảo mùi vị sản phẩm không quá chua khi cho ra thị trường. Chúng tôi tiến hành khảo sát ở các mốc thời gian 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, và 48 giờ. 61
63. Cam Ép Thu dịch Loại hạt Pha loãng Thêm đường Chỉnh pH Thanh trùng Cấy giống Lên men 12 giờ 24 giờ 36 giờ 48 giờ Sơ đồ 4.4 sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian lên men Bảng 4.4 % acid lactic sinh ra qua các thời gian Thời gian 12 24 36 48 (giờ) Acid lactic 1 3,3 4,5 5,8 (%) Kết quả khảo sát cho thấy lượng acid lactic sinh ra tỷ lệ thuận với thời gian lên men trong 48 giờ lên men lượng acid sinh ra 5,8% . trong 12 giờ đầu tiên sau khi cấy giống L.acidophilus đang dần thích nghi với môi trường, 12 giờ kế tiếp quá trình lên men diễn ra mạnh acid lactic sinh ra nhiều hơn, tuy nhiên acid lactic sinh ra quá cao sẽ làm sản phẩm bị chua nhiều cho nên xét về mặt cảm quan mùi vị cũng như màu sắc của sản phẩm, ở 24 giờ lên men sản phẩm có màu vàng đẹp tự nhiên, vị chua ngọt hài hòa lưu giữ được hương cam. Vì vậy chúng tôi quyết định chọn mốc thời gian 24 giờ để lên men tạo sản phẩm. 62
64. % acid lactic 7 5.8 6 5 4.5 4 3.3 % acid lactic 3 2 1 1 0 12 24 36 48 thoi gian len men Biểu đồ 4.4 Tương quan acid lactic sinh ra với các thời gian lên men 4.3.5 Thí nghiệm khảo sát nhiệt độ lên men Đa số các loài vi khuẩn lên men lactic là vi sinh vật ưa ấm, chúng phát triển tốt trong môi trường có nhiệt độ 37 – 42 oC. Thí nghiệm này chúng tôi khảo sát ở các mốc nhiệt độ : nhiệt độ phòng; 37oC; 42oC. Cam Ép Thu dịch Loại hạt Pha loãng Thêm đường Thanh trùng Cấy giống Lên men Nhiệt độ phòng 37oC 42oC Sơ đồ 4.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ lên men Kết quả thí nghiệm ở bảng 4.5 và biểu đồ 4.5 cho thấy ở nhiệt độ 42oC vi khuẩn L.acidophilus sử dụng đường mạnh nhất , sau 24 giờ lên men chất khô biến động từ 20,5 về 16, lượng acid lactic sinh ra đạt 4,5%, sinh khối 5x108 cfu/ml. Tuy 63
65. nhiên, ở nhiệt độ 37oC lượng sinh khối đạt 1,1x108 lượng acid lactic sinh ra 3,5 %, nhiệt độ 37oC gần giống với thân nhiệt của cơ thể người, ở nhiệt độ này vi khuẩn L.acidophilus dễ thích nghi hơn khi đưa vào cơ thể người nên chúng tôi chọn nhiệt độ 37oC để tiến hành lên men. Bảng 4.5 Kết quả thí nghiệm khảo sát nhiệt độ Nhiệt độ Chất khô Chất khô sau Acid lactic Mật độ Cảm quan sơ ban đầu lên men (brix) sinh ra (%) L.acidophi bộ (brix) lus (cfu/ml) Nhiệt độ 20,5 18,5 2 2 x 107 Màu vàng tự phòng nhiên, vị ngọt chua 37 20,5 17,5 3,5 1,1 x 108 Màu vàng tự nhiên, vị chua ngọt 42 20,5 16 4,5 5,1 x 108 Màu vàng tự nhiên, vị chua ngot 18.5 20 17.5 16 15 brix 10 8.04 8.71 % acid lactic 7.3 log cfu/ml 4.5 5 3.5 2 0 nhiet do phong 37 42 nhiet do len men Biểu đồ 4.5 Hàm lượng acid latic sinh ra, nồng độ chất khô, mật độ L.acidophilus sau lên men ở các nhiệt độ 64
66. 4.3.6 Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến quá trình lên men Lactobacillus acidophilus có khả năng lên men đường trong môi trường acid, tuy nhiên pH tối ưu cho quá trình lên men thường dao động trong khoảng 4 – 6. Môi trường dịch ép cam sau khi ép loại hạt có pH dao động trong khoảng 3,4 – 3,8, môi trường pH thấp với nộng độ ion H+ cao sẽ ức chế quá trình lên men của L.acidophilus Do đó chúng tôi tiến hành thí nghiệm này nhằm mục đích chọn điểm pH tốt nhất cho L.acidophilus lên men đường sucrose. pH được hiệu chỉnh bằng NaOH 1N.Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức : pH đối chứng (pH tự nhiên của nước ép), pH 4.5, pH5 và pH5.5. Sơ đồ thí nghiệm khảo sát thông số pH như sau: Cam Ép Thu dịch Loại hạt Pha loãng Thêm đường Chỉnh pH pH đối chứng pH4.5 pH5 pH 5.5 Thanh trùng Cấy giống Lên men Sơ đồ 4.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát pH Qua bảng 4.6 và biểu đồ 4.6 cho thấy biến động chất khô và hàm lượng acid lactic sinh ra ở mẫu pH đối chứng là thấp nhất, trong nước ép cam chứa nhiều acid đặc biệt là acid citric, nồng độ ion H+ quá cao làm ức chế quá trình lên men do đó quá trình lên men diễn ra kém ở pH 3,6. Hàm lượng chất khô biến động mạnh nhất ở pH 4,5; 5 và 5,5 lần lượt tương ứng với 3,5% ; 3,8% ; 3,9 % acid lactic được sinh ra. 65
67. Dựa vào chỉ tiêu cảm quan mùi vị màu sắc và nồng độ tế bào trong sản phẩm chúng tôi chọn khoảng pH 4,5- 5,5 cho các thí nghiệm kế tiếp Bảng 4.6 Kết quả thí nghiệm khảo sát pH Giá trị Chất pH Chất Acid Nồng độ Cảm quan sơ bộ pH khô sau khô sau lactic tế bào ban đầu lên lên sinh L.acidoph (brix) men men ra ilus (brix) (%) (cfu/ml) 3.6 20,5 3,55 19,5 0,9 2,33 x 107 Màu vàng đẹp, mùi hương cam (đối nhẹ, vị chua ít chứng ) 4.5 20,5 3,8 18,5 3,5 2 x 108 Màu vàng đẹp , mùi hương cam nhẹ, vị chua ngọt vừa 5 20,5 3,8 17,5 3,8 4 x 108 Màu vàng đẹp , mùi hương cam nhẹ, vị chua ngọt vừa 5.5 20,5 3,7 17 3,9 4,10 x 108 Màu vàng đẹp ,mùi hương cam nhẹ, vị chua ngọt vừa 25 19.5 18.5 20 17.5 17 15 brix % acid lactic 8.3 8.6 8.61 10 7.36 log cfu/ml 3.8 3.9 5 3.5 0.9 0 dc 4.5 5 5.5 pH Biểu đồ 4.6 Hàm lượng acid lactic sinh ra, chất khô, nồng độ tế bào sau lên men với các giá trị pH 66
68. Như vậy sau thí nghiệm khảo sát các điều kiên lên men, kết quả của chúng tôi như sau: Tỷ lệ pha loãng dịch ép : nước là 2:1 Hàm lượng đường sucrose bổ sung 19g/100ml Tỷ lệ cấy giống ban đầu 5% pH 4,5 – 5,5 Thời gian lên men 24 giờ , nhiệt độ lên men 37oC 4.4 Đánh giá cảm quan Sau khi chọn ra được các điều kiện lên men tối ưu chúng tôi tiến hành lên men sản phẩm để đánh giá cảm quan chất lượng sản phẩm. Nhận xét : dựa vào điểm trung bình có trọng lượng và bảng chỉ tiêu xây dựng TCVN tạm xây dựng cho “ thức uống cam probiotic” cho thấy: Màu sắc : mẫu đạt số điểm trung bình là 4,3/5 , tương ứng với mô tả “sản phẩm giữ được màu vàng vừa phải của nước ép cam” Cấu trúc: mẫu đạt điểm trung bình 3,8/5 tương ứng với mô tả “Sản phẩm có độ thể lỏng vừa phải, độ mịn và đồng nhất” Mùi : mẫu có điểm trung bình 3,6 ứng với mô tả “ sản phẩm có mùi đặc trung của nước ép cam” Vị: mẫu đạt trung bình 4,5/5 ứng với mô tả “ vị chua ngọt ít hài hòa” Bảng 4.7 đánh giá chất lượng cảm quan sản phẩm bằng phương pháp thử cho điểm chất lượng Chỉ tiêu Điểm trung bình chưa có Hệ số trọng lượng Trung bình có trọng lượng trọng lượng Màu sắc 4,3 1 4,3 Cấu trúc 3,8 0,8 3,04 Mùi 3,6 1 3,6 Vị 4,5 1,2 5,4 ĐTB 16.34 Kết quả đánh giá cảm quan : khá 67
69. 4.5 Khảo sát hoạt tính probiotic theo thời gian bảo quản Hoạt tính probiotic được theo dõi trong 2 tuần bảo quản sản phẩm trong điều kiện lạnh và không sử dụng một loại hóa chất bảo quản nào các chỉ tiêu theo dõi gồm pH, mật độ L.acidophilus, cảm quan sản phẩm. Trong thời gian bảo quản tiêu chí số lượng probiotic rất quan trọng, vì vậy ức chế probiotic trong sản phẩm bằng điều kiện bảo quản là rất cần thiết Sản phẩm tại thời điểm 0 có pH4, hàm lượng acid lactic là 3.5%, mật độ L.acidophilus là 2.7 x 108 cfu/ml Bảng 4.8 bảng theo dõi sản phẩm trong điều kiện bảo quản 4oC Tuần pH Mật độ Cấu trúc L.acidophilus(cfu/ml) 1 3.98 1.8 x 108 Cấu trúc ổn 2 3.88 8 x 107 định Hình 4.6 Sản phẩm sau 2 tuần bảo quản Trong 2 tuần bảo quản ở nhiệt độ 4oC pH sản phẩm dao động nhẹ từ 4 xuống 3,88, lượng sinh khối tế bào hao hụt 2,7 x 108 cfu/ml xuống còn 8 x 107 cfu/ml cấu trúc sản phẩm ổn định. Sản phẩm giữ được màu vàng như ban đầu và không có mùi lạ. Sau 2 tuần bảo quản lượng sinh khối trên hoàn toàn có thể chấp nhận được nếu so sánh với các sản phẩm thức uống lên men lactic khác như sản phẩm đồ uống cộng sinh từ yến mạch với số lượng Lactobacillus acidophilus là 6,77 x 107 cfu/ml, 68
70. Lactobacillus plantarum là 1,77 x 106 cfu/ml, số lượng vi khuẩn lactic còn lại là 7,39 x 107 cfu/ml, sản phẩm Boza với số lượng vi khuẩn lactic là 4,6 x 108 cfu/ml, sản phẩm Kunun – zaki có số lượng Lactobacillus plantarum là 7,3 x 107 cfu/ml. Sản phẩm Oats – based symbiotic beverage, nghiên cứu sự tồn tại của Lactobacillus acidophilus trong thời gian bảo quản 4 tuần kết quả là sinh khối giảm từ 6,77 x 107 cfu/ml (trước bảo quản) đến tuần thứ 4 là 5,55 x 105 cfu/ml. Tuy nhiên do đề tài hạn hẹp về thời gian nên chúng tôi chưa tiến hành khảo sát sản phẩm “nước cam probiotic” trong thời gian bảo quản đến tuần thứ 4. Như vậy sản phẩm “ nước cam probiotic” vẫn đảm bảo được hoạt tính probiotic trong 2 tuần bảo quản ở 4oC. 69
71. 5.1 Kết luận Trên cơ sở quy trình sản xuất nước ép trái cây kết hợp với quy trình tạo các dạng đồ uống lên men lactic, quy trình tạo thức uống “ nước cam probiotic” được xây dựng như sau Cam Ép Loại bả ép Thu dịch ép Loại hạt Pha loãng nước ép: nước tỷ lệ 2:1 Phối trộn Chỉnh pH 5.5 Đường “ nước cam 19g/100m Probiotic” l Thanh trùng 95oC/ 30 phút Cấy Lên men giống 5% 37oC/ 24 giờ 70
72.  Tỷ lệ pha loãng dịch ép cam : nước là 2:1  Hàm lượng đường bổ sung 19g/100ml  Tỷ lệ cấy giống ban đầu 5 ml/100ml  Thời gian lên men 24 giờ  Nhiệt độ lên men 37oC  pH lên men vùng 4,5 – 5,5  Đánh giá chất lượng cảm quan đạt khá. Với quy trình tạo sản phẩm như trên, thức uống “ nước cam probiotic” có thể bảo quản tốt trong 2 tuần ở 4-6oC, hoạt tính probiotic của sản phẩm vẫn ổn định. Mật độ tế bào L.acidophilus trong sản phẩm đạt 2,7 x 108 cfu/ml. Sản phẩm đánh giá cảm quan đạt loại khá. Đây là dạng thức uống probiotic quy trình sản xuất đơn giản, nguyên liệu dễ tìm và có khả năng thực hiện ở quy mô gia đình. Hy vọng những kết quả bước đầu của quá trình khảo sát sẽ là tiền đề để có những nghiên cứu sâu hơn để hoàn thiện sản phẩm. 5.2 Kiến nghị . Lập đường cong sinh trưởng của L.acidophilus trong môi trường nước ép cam pha loãng có bổ sung đường và cao nấm men, tìm ra thời điểm để thu sinh khối lớn hơn trước khi tiến hành lên men tạo sản phẩm . Do thời gian thực hiện đề tài ngắn sản phẩm nên chưa tiến hành đánh giá các chỉ tiêu vi sinh ( TPC, E.coli, Samonella, Staphylococcus ) . Khảo sát hoạt tính probiotic và cảm quan sản phẩm ở các tuần lễ tiếp theo . Thử nghiệm bổ sung các thành phần dinh dưỡng vào sản phẩm như DHA, mật ong, Vitamin D, can xi . Khảo sát sự thất thoát của vitamin C sau quá trình lên men . Nghiên cứu so sánh khả năng lên men của L.acidophilus với chủng vi khuẩn lactic khác hoặc tìm ra tỷ lệ phối trộn các chủng vi khuẩn lactic khác nhau để nâng cao chất lượng sản phẩm . Nghiên cứu phát triển sản phẩm ở quy mô công nghiệp. 71
73. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Đức Lượng và cộng sự, “Thí nghiệm vi sinh vật học”, NXB ĐHQG TPHCM, 2006 2. Hà Duyên Tư, “Kỹ thuật phân tích cảm quan”, NXB TC – TC – ĐL – CL, 2006 3. Lê Ngọc Tú và cộng sự, “Hóa sinh công nghiệp”, NXB KH- KT, 1997 4. Lương Đức Phẩm, “Vi sinh vật học và an toàn vệ sinh thực phẩm”, NXB Nông nghiệp Hà Nội, 2000 5. Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương, “Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm”, chương 2, 4, NXB ĐHQG TPHCM, 2006 6. Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, “Vi sinh vật học”, tập 2, chương 9, NXBGD 2002 7. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Lệ Hà , “ nguyên lý sản xuất đồ hộp thực phẩm”, NXB KHKT 8. Nguyễn Hoài Phương, “thử nghiệm tạo thức uống probiotic từ dịch malt”, luận văn thạc sĩ, trường Đại Học Bách Khoa TPHCM, 2010 9. Hồ thị Bích Phượng , “nước cà chua bổ sung Probiotic”, luận văn tốt nghiệp , trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM, 2011 10. Lê Hà Vân Thư , “thử nghiệm tạo thức uống lên men lactic từ gạo lức”, luận văn thạc sĩ trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM, 2008 11. Kimet Guven và Nuray Benlikaya, “Acid pH produced by lactic acid bacteria prevent the growth of bacillus cereusin “Boza”, a traditional fermented Turkish beverage”., tạp chí Journal of food Safety, số 25, trang 98 – 108, 2005 12. Yuji ODA và cộng sự, “Utilization of Lactobacillus amylovorus as an alternative microorganism for saccharifying boiled rice”, Tạp chí Food Sci. Technol. Res., số 8, trang 166 – 168, 2002 13. Kyung Young Yoon, Edward E.Woodams and Young D Hang ,“probiotication of tomato juice by lactic acid bacteria”, The Journal of applied Microbody, vol 32. No.4,p.315- 318, December 2004 72
74. 14. Seung Hee Beak và cộng sự, “Hypocholesterolemic action of fermented brown rice supplement in Cholesterol – Fed Rats: Cholesterol – lowing action of fermented brown rice”, tạp chí Journal of Food Science, Vol 70, số 8, trang 527 – 537, 2005. 15. Sumangala Gokavi và cộng sự, “Oat – based symbiotic beverage fermented by Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei ssp.casei, and Lactobacillus acidophilus”, tạp chí Journal of Food Science, Vol.70, trang 216 – 223, 2005 16. www.khoahoc.net 17. www. nutrition-resource.blogspot.com 18. www.orangejuicenutrition.com 19. www.nccam.nih.gov/health/probiotics/introduction.htm 20. www.probioticnutrition.com 21. ww.asianfood.info 21. www.jgi.doe.gov 22.www. suckhoecongdong.vn 23. www. genome.ig-pst.org 24.www.wikipedia.org 73
75. PHỤ LỤC 1 Thành phần môi trường MRS cải tiến dùng để nuôi cấy, khảo sát và giữ giống Giá 400 g Nước cất 1000ml Đường sucrose 20 g Cao nấm men 2g pH 6 Thành phần môi trường trung gian Nước ép cam 50ml Nước cất 250ml Cao nấm men 6g Đường sucrose 15 g pH 6 74
76. PHỤ LỤC 2 Kiểm tra mật độ giống L.acidophilus trong môi trường trung gian ở các lần thí nghiệm Lần Mật độ giống ( cfu/ml) 1 1.1 x 109 2 2 x 109 3 109 4 5 x 108 5 4.2 x 108 6 4 x108 75
77. PHỤ LỤC 3 Phương pháp đánh giá cảm quan : các chỉ tiêu đánh giá cảm quan được đánh giá theo tiêu chuẩn TCVN 3215 – 94. Phép thử cho điểm Nguyên tắc Được sử dụng để đánh giá tổng quát mức chất lượng của một sản phẩm so với tính chất trên tất cả các chỉ tiêu cảm quan về màu sắc, mùi vị, và trạng thái. Tình trạng chất lượng của mỗi chỉ tiêu được đánh giá bằng điểm. Giá trị điểm tăng theo mức tăng chất lượng sản phẩm. Do các chỉ tiêu có vai trò lớn đối với chất lượng chung của sản phẩm ở mức khác nhau nên các giá trị cho được đối với mỗi chỉ tiêu được nhân lên đối với một giá trị tương ứng gọi là hệ số trọng lượng. Các chỉ tiêu có vai trò lớn hơn thì hệ số trọng lượng lớn hơn. Tổng điểm của các chỉ tiêu là điểm chất lượng của sản phẩm. Điểm này quyết định mức chất lượng của sản phẩm được đánh giá. Khi đánh giá cảm quan bằng phương pháp cho điểm theo tiêu chuẩn Việt Nam thì tất cả các chỉ tiêu cảm quan hay từng chỉ tiêu riêng biệtcủa sản phẩm ta dùng hệ điểm 20 để xây dựng trên một thang thống nhất 6 bậc 5 điểm từ 0 -5. Điểm 0 ứng với sản phẩm bị hỏng, 1-5 ứng với khuyết tật giảm dần. Tổng hệ số có trọng lượng của tất cả các chỉ tiêu được đánh giá cho 1 sản phẩm là 4. Phương pháp thực hiện: tiến hành cho cảm quan sản phẩm Số người cảm quan 10 -15 người Kỹ thuất thao tác cảm quan : Xác định màu sắc sản phẩm : quan sát màu sắc sản phẩm bên ngoài bao bì thủy tinh. Sau đó mở nắp để quan sát bế mặt bên trong, độ đồng đều màu sắc sau đó ghi nhận và cho điểm. Xác định cấu trúc sản phẩm : quan sát bế mặt, trạng thái độ đồng nhất của sản phẩm. Ghi nhận và cho điểm. 76