Đồ án Thử nghiệm các phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. đối với một số nấm mốc sinh độc tố aflatoxin

141 trang thiennha21 12/04/2022 5150

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Thử nghiệm các phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. đối với một số nấm mốc sinh độc tố aflatoxin", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_thu_nghiem_cac_phuong_phap_danh_gia_kha_nang_doi_khang.pdf

Nội dung text: Đồ án Thử nghiệm các phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. đối với một số nấm mốc sinh độc tố aflatoxin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SPP. VÀ LACTOBACILLUS SPP. ĐỐI VỚI MỘT SỐ NẤM MỐC SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực hiện : LÊ NGÔ VŨ PHƯỢNG MSSV: 1515100007 Lớp: 15HSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2016.
Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Hoài Hương khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường của trường Đại Học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh. Những kết quả trong đồ án này hoàn toàn không sao chép từ đồ án tốt nghiệp của người khác với bất kì hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án tốt nghiệp hoàn toàn trung thực. Tôi xin chịu toàn bộ trách nhiệm về đồ án của mình. TP.HCM, ngày 12 tháng 8 năm 2016 Sinh viên thực hiện Lê Ngô Vũ Phượng. i
Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn đến cha mẹ, người đã nuôi nấng dạy dỗ khuyến khích và tạo mọi điều kiện cho con học tập để con có được thành quả như ngày hôm nay. Trong suốt khoảng thời gian học tại trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM, em đã được các thây, cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ em trong quá trình học tập tại trường cũng như trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn đến quý Thầy, Cô nhờ có thầy, cô đã trang bị cho chúng em kiến thức cần thiết để tự tin bước vào đời. Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Hoài Hương, đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt khoảng thời gian xây dựng đề cương và thực hiện, hoàn thành đồ án này. Em cũng xin cám ơn các Thầy, Cô trong phòng thí nghiệm và bạn bè đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thành đồ án tốt nghiệp này. Cuối cùng, em xin cảm ơn các Thầy, Cô trong Hội Đồng Phản Biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án này. Em xin gửi đến quý Thầy, Cô lời chúc sức khỏe. TP. HCM, ngày 12 tháng 8 năm 2016 Sinh viên thực hiện Lê Ngô Vũ Phượng ii
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC TRANG DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ix MỞ ĐẦU 2 CHƢƠNG I: TÔNG QUAN 4 1.1. Tổng quan về nấm: 4 1.1.1. Giới thiệu chung 4 1.1.2. Độc tố do nấm tiết ra 4 1.1.3. Tác hại của nấm 5 1.1.3.1. Tác hại của nấm gây cho người và động vật 5 1.1.3.2. Tác hại của nấm gây cho thực vật 6 1.1.4. Một số chủng nấm gây hại trên thực phẩm 6 1.2. Tổng quan về hợp chất kháng nấm: 7 1.2.1. Hợp chất kháng nấm hóa học 10 1.2.2. Tác hại của hợp chất kháng nấm hóa học 10 1.2.3. Hợp chất kháng nấm trong sinh học 13 1.2.3.1. Hợp chất kháng nấm từ thực vật: 13 1.2.3.2. Hợp chất kháng nấm từ vi khuẩn: 17 a. Khả năng kháng nấm mốc của Bacillus spp. 17 b. Khả năng kháng nấm mốc của Lactobacillus spp 19 1.3. Các phương pháp sàng lọc các chủngVSV kháng nấm mốc: 21 1.3.1. Phương pháp đối kháng trực tiếp (cấy 2 đường vi khuẩn) 21 1.3.2. Phương pháp đối kháng trực tiếp (đặt thạch khuếch tán) 23 1.3.3. Phương pháp đối kháng che phủ (đổ dĩa 2 lớp): 25 iii
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1. Địa điểm nghiên cứu: 26 2.2. Thời gian nghiên cứu: 26 2.3. Vật liệu nghiên cứu: 26 2.3.1. Giống vi sinh vật: 26 2.3.1. Hóa chất và môi trường sử dụng 26 2.3.1.1. Hóa chất: 26 2.3.1.2. Môi trường nuôi cấy: 26 2.4. Thiết bị và dụng cụ: 27 2.4.1. Thiết bị: 27 2.4.2. Dụng cụ: 28 2.5. Phương pháp luận: 28 2.6. Phương pháp nghiên cứu: 29 2.6.1. Sơ đồ nghiên cứu 29 2.6.2. Khảo sát sự tăng trường của nấm mốc: 30 2.6.3. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp ria 2 đường vi khuẩn của 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với nấm mốc: 30 2.6.4. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp đặt thạch khuếch tán của 2 chủng VK Bacillus spp.và Lactobacillus spp.với nấm mốc: 35 2.6.5. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng che phủ theo phương pháp đỗ dĩa 2 lớp của 2 chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với nấm mốc: . 39 2.6.6. Một số phương pháp khảo sát hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của một số chủng vi khuẩn 43 2.6.6.1. Nhuộm gram 43 2.6.6.2. Nhuộm bào tử 44 2.6.6.3. Một số thử nghiệm sinh hóa: 44 iv
Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 45 3.1. Định danh sơ bộ khảo sát sinh lý - sinh hóa của một số chủng vi khuẩn 45 3.1.1. Nhuộm Gram: 45 3.1.2. Nhuộm bào tử: 46 3.1.3. Một số thử nghiệm sinh hóa: 47 3.2. Khảo sát sự tăng trưởng của nấm mốc: 48 3.3. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp ria 2 đường vi khuẩn của 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với các chủng nấm mốc: 50 3.4. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp đặt thạch khuếch tán của 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với các chủng nấm mốc: 66 3.5. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng che phủ thep phương pháp đỗ dĩa 2 lớp 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với các chủng nấm mốc 81 3.6. So sánh khả năng đối kháng nấm mốc của 20 chủng vi khuẩn thông qua cách chấm điểm LSD (Sai số khác biệt nhỏ nhất) 90 KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO 96 PHỤ LỤC v
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT LAB Lactobacillus spp NA Nutrient Agar NB Nutrient Broth MT Môi trường PDA Potato dextrose agar VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật vi
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1.Một số hợp chất kháng nấm hóa học được sử dụng để bảo quản hạt giống 9 Bảng 1.2.Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men (Corsetti và cộng sự, 1998) 18 Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của các chủng Bacillus spp. 45 Bảng 3.2. Một số phản ứng sinh hóa của các chủng Bacillus spp. 47 Bảng 3.3. Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế các chủng nấm mốc của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn 53 Bảng 3.4. So sánh sô liệu tỉ lệ ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn Bacillus spp. mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn 54 Bảng 3.5. Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế của các chủng nấm mốc của các vi khuẩn Lactobacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn 62 Bảng 3.6. So sánh số liệu tỉ lệ ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn Lactobacillus spp. mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn 63 Bảng 3.7. Thống kê số liệu vòng ức chế các chủng nấm mốccủa các chủng vi khuẩn Bacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp đặt thạch khuếch tán 68 Bảng 3.8. So sánh sô liệu vòng ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn Bacillus spp. mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp đặt thạch khuếch tán 69 Bảng 3.9. Thống kê số liệu vòng ức chế của các chủng nấm mốc của các vi khuẩn Lactobacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp đặt thạch khuếch tán 76 vii
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.10.So sánh số liệu vòng ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn Lactobacillus spp. mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp đặt thạch khuếch tán 77 Bảng 3.11. Thống kê số liệu trung bình ức chế các chủng nấm mốc của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp đỗ dĩa 2 lớp 84 Bảng 3.12. Sắp xếp sô liệu trung bình ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn Bacillus spp. trong các nhóm theo phương pháp đõ dĩa 2 lớp 85 Bảng 3.13. Sắp xếp số liệu trung bình ức chế của các chủng nấm mốc của các vi khuẩn Lactobacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp đỗ dĩa 2 lớp 89 Bảng 3.14. Sắp xếp sô liệu trung bình ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn Lactobacillus spp. trong các nhóm theo phương pháp đỗ dĩa 2 lớp 90 Bảng 3.15. Thống kê điểm các chủng vi khuẩn Bacillus spp. theo từng phương pháp dựa theo xếp hạng LSD 91 Bảng 3.16 Thống kê điểm các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. theo từng phương pháp dựa theo xếp hạng LSD 92 viii
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của Metalaxyl 10 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của Manocozeb 11 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của Hexacoconazole 11 Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của Pyrones 14 Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của Viridines 15 Hình 1.6. Phương pháp cấy ria 2 đường thể hiện sự đối kháng của vi khuẩn LAB đối với nấm mốc (trích từ Nora Laref, 2013) 20 Hình 1.7. Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng của vi khuẩn có lợi theo phương pháp ria 2 đường vi khuẩn 21 Hình 1.8. Phương pháp đặt thạch khuếch tán thể hiện sự đối kháng giữa vi khuẩn Bacillus spp với Calbicans (trích dẫn Mounyr Balouiri, 2015) 22 Hình 1.9. Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng của vi khuẩn có lợi theo phương pháp đặt thạch khuếch tán 23 Hình 1.10. Phương pháp đối kháng che phủ của Bacillus spp. với các loại nấm (trích từ Kumar và các cộng sự,2009). 24 Hình 1.11. Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng của vi khuẩn có lợi theo phương pháp đỗ dĩa 25 Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát nghiên cứu khả năng dối kháng của các chủng vi khuẩn có lợi đối với nấm mốc 29 Hình 2.2. Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp cấy ria 2 đường 31 ix
Đồ án tốt nghiệp Hình 2.3. Mô tả cách đo đường kính vòng ức chế theo phương pháp ria 2 đường vi khuẩn 35 Hình 2.4. Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp đặt thạch khuếch tán 36 HÌnh 2.5. Cách đặt thạch vi khuẩn trong phương pháp đặt thạch khuếch tán . 37 Hình 2.6. Mô tả cách đo vòng ức chế của vi khuẩn theo phương pháp đặt thạch khuếch tán 38 Hìn h 2.7.Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp đỗ dĩa 2 lớp thạch 40 Hình 3.1. HÌnh thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn Bacillus spp 45 HÌnh 3.2. Nhuộm Gram các chủng vi khuẩn 46 Hình 3.3. Nhuộm bào tử các chủng vi khuẩn 47 Hình 3.4. Sự phát triển của nấm mốc sau 3 ngày trên MT PDA 48 Hình 3.5. Sự phát triển của nấm mốc sau 3 ngày trên MT MRS Cải tiến 49 Hình 3.8. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus spp phân lập tử phụ phế phẩm 55 Hình 3.9. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốccủa nhóm Bacillus spp phân lập tử phụ đất 56 Hình 3.10 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus spp phân lập tử nước thải 57 Hình 3.13. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốccủa nhóm Lactobacillus sp phân lập tử nem 63 x
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.14. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốc của nhóm Lactobacillus sp phân lập tử cơm mẻ 64 Hình 3.18. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus spp phân lập tử phụ phế phẩm 70 Hình 3.19. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus 66spp phân lập tử đất 71 Hình 3.20. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấmmốccủa nhóm Bacillus spp phân lập tử nước thải 72 Hình 3.24. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Lactobacillus sp phân lập tử nem 78 Hình 3.25. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Lactobacillus sp phân lập tử cơm mẻ 79 xi
MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề: Hiện nay, trên thế giới và nước ta đang nghiên cứu về các phương pháp đối kháng lại các loại nấm mốc khác nhau như đối kháng giữa nấm có lợi với nấm mốc hay đối kháng giữa các vi sinh vật có lợi với nấm mốc. Độc tố của các loại vi nấm có nhiều loại như aflatoxin, ocharatoxin, tricothecenes, zearalenone . Các loại độc tố này rất nguy hiểm, thường gây nhiễm trên nông sản, gây độc cho con người và gia súc như là gây tổn thương gan (ung thư gan ), gây quái thai, gây đột biến và nếu bị nhiễm ở hàm lượng cao sẽ gây chết người. Trong khi đó, thuốc trừ nấm mốc hóa học lại gây nhiều tác dụng phụ ảnh hường đến đời sống của con người và động vật. Vì vậy, ở nước ta đã có khá nhiều công trình nghiên cứu về khả năng đối kháng lại nấm mốc gây hại trên nông sản và thực phẩm bằng các loại nấm có lợi khác như Trichoderma spp và sử dụng các thuốc bảo vệ thực vật hóa học. Nhưng việc sử dụng vi sinh vật có lợi để đối kháng lại các loại nấm mốc gây hại vẫn còn khá mới và chưa được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm. Từ những vấn đề trên, để phân lập được các chủng vi sinh vật có khả năng kháng nấm mốc trong in vitro đã có nhiều đề tài và các phương pháp kháng nấm mốc khác nhau nhưng chưa có sự so sánh giữa các phương pháp đó với nhau. Từ đó, em đã thực hiện nhiều phương pháp kháng nấm mốc khác nhau và so sánh chúng và sau đó, tìm ra phương pháp thích hợp và hiệu quả nhất với phòng thí nghiệm của trường .Chính vì vậy, em xin thực đề tài “Thử nghiệm các phƣơng pháp đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. đối với một số nấm mốc Aspergillus spp. sinh aflatoxin”. 1
2. Tình hình nghiên cứu: Có rất nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật để kháng nấm mốc gây hại trong nông sản và thực phẩm theo nhiều phương pháp khác nhau. Trong nước đã có nhiều công trình nghiên cứu dùng vi sinh vật để kháng lại nấm mốc theo phương pháp đối kháng trực tiếp (Magaldi,2004) như: “ Phân lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp. ứng dụng trong bảo quản nông sản” (Văn Hương, 2015), đồ án tốt nghiệp “Khảo sát khả năng kháng nấm nhiễm thực phẩm Aspergillus Niger và Mucor sp. Của vi khuẩn Lactobacillus L5”(Phan Nguyễn Hương Thảo, 2015) . Ngoài nước có công trình nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi khuẩn lactic được phân lập từ Kim Chi để kháng lại Aspergillus fumigatus Jeong- 75, Hàn Quốc theo phương pháp đối kháng che phủ (Magnusson và Schnurer,2001) . 3. Mục đích nghiên cứu: Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm mốc cao và hiệu quả nhất từ bộ sưu tập các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. của phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường của trường. 4. Mục tiêu nghiên cứu: Tìm ra phương pháp đánh giá khả năng đối kháng vi nấm hiệu quả nhất và dễ thực hiện áp dụng trên bộ sưu tập các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. của phòng thí nghiệm khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường. 5. Nhiệm vụ nghiên cứu: Xác định tỉ lệ đối kháng của 10 chủng Bacillus spp. và 10 chủng Lactobacillus spp. đối với 5 chủng nấm mốc Aspergillus spp. tiềm năng sinh aflatoxin được phân lập từ hạt đậu phông, đậu nành và cà phê bằng phương pháp đối kháng trực tiếp (Dual Culture Two Line Culture Method). Xác định tỉ lệ đối kháng nấm theo phương pháp đặt thạch khuếch tán.(Agar Plug Diffusion Method). 2
Đánh giá khả năng đối kháng nấm theo phương pháp đối kháng che phủ .(Overlay Method). Đánh giá tương quan giữa các phương pháp, từ đó đề nghị phương pháp thích hợp nhất cho phòng thí nghiệm. 6. Phƣơng pháp nghiên cứu: a. Phƣơng pháp luận: Dựa trên các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. đã được phân lập trong phòng thí nghiệm để thử nghiệm các phương pháp đối kháng nấm đã được mô tả trong tài liệu.Từ đó, đưa ra phương pháp thích hợp nhất trong phòng thí nghiệm để đối kháng lại các loại nấm mốc gây hại trên thực phẩm và hạt giống cây trồng. b. Phƣơng pháp xử lí số liệu: Sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị. Sử dụng phần mềm SAS 9.1 để xử lí số liệu. 7. Kết quả đạt đƣợc từ đề tài: Tuyển chọn được chủng vi khuẩn Bacillusspp.và vi khuẩn Lactobacillus spp. có hoạt tính kháng nấm tốt nhất trong bộ sưu tập của phòng thí nghiệm. Đánh giá tỉ lệ ức chế các loại vi nấm của 2 chủng vi khuẩn thông qua phương pháp kháng nấm trực tiếp theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn. (Dual Culture Two Line Culture Method). Xác định đường kính ức chế các loại nấm mốc của 2 chủng vi khuẩn qua phương pháp đối kháng trực tiếp theo cách đặt thạch khuếch tán (Agar Plug Diffusion Method). Đánh giá khả năng ức chế các loại nấm mốc của 2 chủng vi khuẩn qua phương pháp đối kháng che phủ (Overlay Method). Đã chọn được phương pháp cho kết quả ổn định nhất trong phòng thí nghiệm. 3
8. Kết cấu đồ án: Mở đầu Chương 1: Tổng quan tài liệu- Nội dung chương đề cập đến các nội dung liên quan đến tài liệu nghiên cứu. Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – Nội dung chương đề cập đến các dụng cụ, thiết bị và phương pháp nghiên cứu trong đồ án. Chương 3: Kết quả và thảo luận – Nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biện chứng kết quả thu được Kết luận và kiến nghị- Nội dung tóm lại những kết quả mà đề tài đã đạt được và kiến nghị cho những hướng cần cải tiến thêm trong đề tài. 4
Chƣơng I: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về nấm: 1.1.1. Giới thiệu chung về nấm: Nấm học (Mycology) được nhà khoa học người Ý là Pier Antonio Micheli (1729) nghiên cứu ra qua tài liệu “Giống cây lạ” (Nova Plantarum Genera) nhưng theo giáo sư Ekriksson Gunnan (1978) thì người có công nghiên cứu sâu về nấm mốc lại là Elias Fries (1794- 1874).Những đại diện tiêu biểu của nấm là nấm mốc, nấm men và nấm lớn (nấm quả thể). Phần lớn các loài nấm này không quan sát được bằng mắt thường. Đa phần chúng sống trong đất, chất mùn, xác của vi sinh vật, cộng sinh hay kí sinh trên cơ thể của động vật, thực vật hay nấm khác. Vi nấm có vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân hủy các chất hữu cơ và không thể thiếu trong quá trình chuyển hóa và trao đổi chất Nấm mốc (hay còn gọi là vi nấm) là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản, là tế bào không có diệp lục tố, thường sinh sản thông qua bào tử hoặc sống dị dưỡng (hoại sinh, kí sinh, cộng sinh),quá trình sinh sản có thể là vô tính nhay hữu tính.Vách tế bào chủ yếu là chitin, có hoặc không có cenllulose và một số thành phần khác có hàm lượng thấp. Nấm mốc thường thường phát triển dưới dạng sợi đa bào gọi là sợi nấm (hyphae) tạo hệ sợi (mycelium). Có 2 loại sợi: Sợi nấm dinh dưỡng: nằm trong lớp môi trường, làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng cho toàn bộ hệ nấm. Sợi nấm khí sinh: thường nhô ra môi trường, giữ vai trò sinh sản (tạo bào tử). 1.1.2. Độc tố do nấm tiết ra: Theo Nguyễn Duy Tường (2009), độc tố của nấm mốc (mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo 5
ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc đối với động vật có vú, gia cầm và con người. Hiện nay, có khoảng 300 loài độc tố được phát hiện và nghiên cứu. Tuy nhiên, chỉ có khoảng 20 loài độc tố gây hại lên thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng và liên quan đến an toàn thực phẩm. Được tạo ra từ 5 chi nấm: Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria, Clavicep, chúng bao gồm: Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, M1, M2 và G1, G2), Ochratoxin A, Stermatocystin, Axit Cyclopianxoic. Các độc tố của Penicillium: Pautulin, Ochratoxin A, Citrinin, Penitrem A, Fumonisin, Moniliformin . Các độc tố của Fusarium: Deoxynivalenon, Nivalenon, Zearalenon, T-2 toxin. Các độc tố của Alternaria: Axit Tenuazoic, Alternarion, Methyl Ether Alternarion. Các độc tố của Clavicep: các alkaloid của nấm cựa gà. Trong đó, nấm gây độc chủ yếu và nguy hại nhất là Aflatoxin. Chúng là độc tố vi nấm do nấm mốc Aspergillus flavus, A.parasiticus sản sinh ra, thường gây độc tố ô nhiễm lên các loại đậu (như đậu phộng). Phản ứng gây độc chủ yếu của chúng là trong gan. Nếu mức độ gây nhiễm thấp sẽ tích lũy dần trong gan và làm giảm khả năng sinh sản của động vật về lâu dài sẽ gây ra bệnh ung thư. Ngoài ra, còn có 1 số độc tố của các vi nấm thường gặp như Ochratoxin Penicillium và Aspergillus tiết ra. Độc tố Zearalenon và Tricothecenes chủ yếu do nấm Fusarium tiết ra, độc tố Patulin lại do nấm Penicillium và Fumonisin tiết ra. 6
1.1.3. Tác hại của nấm mốc: 1.1.3.1. Tác hại của nấm gây ra cho con người và động vật: Dị ứng hoặc ngộ độc do ăn hay tiếp xúc với nấm: Có khoảng 70 loài nấm sinh bào tử là những tác nhân gây dị ứng. Chúng có thể là nấm mốc trong nhà hay ngoài trời, đa phần là nấm sợi thuộc các chi Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Helminthosporium, Epicoccum, Penicillium, Fusarium , chỉ có vài loài nấm đơn bào như Candida, Rhodotorula, có một số loài là nấm lớn như Agaricus, Coprinus, Fomer, Ganoderma Bào tử nấm có thể gây ra những chứng như hen suyễn, viêm mũi dị ứng, các bệnh nấm dị ứng phế quản phổi và viêm phổi quá mẫn. Ngộ độc do ăn phải nấm độc, có thể làm rối loạn tiêu hóa, ảo giác, bào mòn ống tiêu hóa, làm giảm khả năng đề kháng tiêu hóa các chât dinh dưỡng trong thức ăn, nghiêm trọng hơn có thể dẫn tử vong. Nấm kí sinh trên cơ thể người gây bệnh trực tiếp: Những loài có thể gây bệnh cho người thuộc các chi như: Aspergillus, Candida, Cryptococcus, Histoplasma và Pneumocystic. Chúng có thể gây ra các bệnh ngoài da ở người như nấm chân, nấm móng, nấm tóc, hắc lào, lang ben, cho đến những bệnh nguy hiểm có thể gây chết người như viêm màng não (nấm Cryptococcus), hay Viêm phổi do nấm Pneumocystic carinii. 1.1.3.2. Tác hại của nấm gây ra cho thực vật: Những loài nấm gây bệnh trên cây trồng có thể gây thiệt hại lớn cho ngành nông nghiệp và lâm nghiệp. Ví dụ như nấm đạo ôn (Magnaporthe oryzae) gây bệnh cho lúa. Những loài gây bệnh cho cây thuộc các chi Fusarium, Ustilago, Alternaría và Cochliobolus. Chúng làm thối rễ, tổn thương các bộ phận của cây trồng, hoa, quả, làm giảm năng suất hoặc chất lượng sản phẩm nông nghiệp do bị ẩm mốc, 1.1.4. Một số chủng nấm gây hại trên thực phẩm: Trong hệ vi khuẩn, nấm mốc thiên nhiên (Fungal flora) có 3 chủng giống nấm mốc chiếm ưu thế đã và đang gây độc cho thực phẩm là Aspergillus, 7
Fusarium và Penicillium thường tiết độc tố vi nấm vào thực phẩm vào thời gian trước, trong và sau khi thu hoạch ngũ cốc, hạt có dầu, đậu đỗ, Có 4 tác động gây độc của độc tố vi nấm là: độc cấp tính, mãn tính, gây đột biến và quái thai. Phổ biến nhất là độc cấp tính, làm hư gan và rối loạn chức năng hoạt động của thận, có thể gây chết đối với trường hợp nặng. Các độc tố vi nấm tác động lên hệ thần kinh, ở nồng độ thấp gây tê liệt động vật và ở nồng độ cao có thể gây tổn thương não và chết. Nhiều công trình thử nghiệm đã xác định độc tố vi nấm có thể gây ung thư, đặc biệt là ở gan. Qua thử nghiệm trên động vật nuôi trong nhà đã xác định có một số độc tố vi nấm gây rối loạn tới sự sao chép ADN và gây hậu quả là đột biến hoặc quái thai. 1.2. Tổng quan về các hợp chất kháng nấm: Hợp chất kháng nấm là các chất ức chế sự tăng trưởng của nấm có tầm quan trọng trong việc kiểm soát các tác nhân gây bệnh của nấm đối với con người và động vật và trong việc phòng chống nấm mốc trong thực phẩm và các vật liệu khác. 1.2.1. Hợp chất kháng nấm hóa học: Các hợp chất kháng nấm hóa học đa số đều có mặt trong các loại thuốc trừ nấm mốc gây hại cho nông sản như Carbendazim, Metalaxyl, Anvil, . 8
Bảng 1.1: Một số hợp chất kháng nấm hóa học thƣờng gặp trong thuốc bảo quản hạt giống. (Mathre và các cộng sự,2011). Các hoạt chất kháng nấm hóa học phổ biến như metalaxyl, mancozeb và hexaconazole chúng đều thông qua tế bào mô thực vật tiêu diệt các nấm gây bệnh phát triển trong đó. Metalaxyl có tên hóa học là methyl N-(methoxyacetyl)-N-(2,6-xylyl)-DL- alaninate là hoạt chất trừ nấm thuộc nhóm Alanine, đặc biệt hiêu quả với nhóm nấm Oomycetes mà hai đại diện điển hình là Phytophthora và Pythium gây nên các bệnh nghiêm trọng cho cây trồng. Hoạt chất Metalaxyl có tác dụng nội hấp và lưu dẫn mạnh, thuốc được hấp thụ qua lá, thân, rễ của cây trồng sau đó vẫn chuyển, lưu dẫn trong cây, ức chế sự tổng hợp protein, can thiệp vào quá trình tổng hợp ARN ribosome của tế bào nấm. Phòng trừ hiệu quả các loại nấm phát sinh từ đất và các loại nấm phát tán bào tử trong không khí. (trích Chi cục trồng trọt và bảo vệ thực vật tỉnh Lâm Đồng,2015). 9
Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của Metalaxyl Manocozeb có tên hóa học là Manganese Ethylene bisdithiocarbamate phức hợp với kẽm, là hoạt chất thuộc nhóm thuốc diệt nấm Dithiocarbamate. Manocozeb là phức hợp của kẽm và muối mangan, dạng bột màu vàng hung, không tan trong nước và các dung môi hữu cơ khác, bền trong môi trường khô nhưng thủy phân trong môi trường nóng, ẩm và acid. Hoạt chất này không diệt nấm trực tiếp chỉ khi tiếp xúc với nước, manocozeb mới bị hoạt hóa, giải phóng ethylene bisthiocyanate sunfua (EBIS). Dưới tác động của tia cực tím, EBIS chuyển hóa thành ethylene bisthiocyanate (EBI). EBIS và EBI tác động tới các enzyme có chứa nhóm sulphydryl gây ức chế hoạt động của sáu quá trình sinh hóa khác nhau trong tế bào chất và ty thể, phá vỡ sự nảy nầm của bào tử nấm mốc.( trích dẫn từ Chi cục trồng trọt và bảo vệ thực vật tỉnh Lâm Đồng, 2014). Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của Manocozeb 10
Hexaconazole có công thức hóa học là C19H17Cl2N3O3 là hoạt chất có chứa trong thuốc kháng nấm hóa học Anvil 5SC. Là hoạt chất trừ nấm phổ rộng, tiêu diệt nấm mốc thông qua cơ chế ngăn cản sinh tổng hợp Ergosterol (chất cấu tạo nên màng nấm mốc), nấm sẽ bị cô lập và ngừng phát triển do chúng không hình thành được tế bào mới. Chất này được mô cây hấp thu rất nhanh, chuyển vị và lưu dẫn mạnh nên kiểm soát nấm mốc nhanh chóng và hiệu quả và kéo dài cơ chế vừa phòng vừa trị bệnh. Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của Hexaconazole. 1.2.2. Tác hại của hợp chất kháng nấm hóa học: Bên cạnh các lợi ích trong việc kháng nấm thì các hợp chất hóa học gây ảnh hưởng mạnh đến môi trường và sức khỏe của con người và động vật. Theo điều tra của cục Y tế dự phòng và môi trường Việt Nam, hằng năm có trên 5000 trường hợp nhiễm độc hợp chất hóa học phải cấp cứu tại bệnh viện và có trên 300 trường hợp tử vong (do ngộ độc cấp tính) vì lượng chất hóa học còn tồn đọng quá cao trong thực phẩm. Nếu liều lượng ít, được đưa gián tiếp vào cơ thể thông qua thực phẩm, về lâu dài từ 3-5 năm sẽ phát bệnh (tim mạch, ung thư ) Đối với con người: cơ thể con người nhiễm độc các hợp chất hóa học biểu hiện ở nhiều mức độ như là giảm sức khỏe, gây rối loạn hoạt động ở hệ thần kinh, tim mạch, tiêu hóa hô hấp, bài tiết, gây các tổn thương bệnh lý ở các cơ quan từ mức độ nhẹ đến nặng thậm chí tàn phế và tử vong. Ví 11
dụ: hoạt chất Mancozeb gây bệnh da đối với người tiếp xúc, hoạt chất Metalaxyl gây độc cấp tính thấp nhưng gây kích ứng ở mắt ở mức trung bình và nhóm độc II về tác động kích thích mắt. Đối với môi trường xung quanh: các hợp chất hóa học sẽ diệt hết tất cả các loài côn trùng, sâu bệnh và nấm gây bệnh có thể làm mất đi sự cân bằng tự nhiên trong của hệ sinh thái gây ô nhiễm môi trường, đất, nước và không khí. Các chất tồn dư, không phân hủy ở trong đất và nước có thể làm cho động vật, cây trồng sống ở đó bị nhiễm các chất đó lâu dài, con người khi ăn các sản phẩm trồng trọt và chăn nuôi bị nhiễm chất hóa học hằng ngày một cách gián tiếp, lâu ngày sẽ rất có hại đến sức khỏe. Đối với các loại thực vật, chúng sẽ hình thành sự kháng thuốc và có khả năng sẽ tạo ra các loại vi sinh vật hay nấm gây bệnh mới, mạnh hơn các loài vi sinh vật và nấm gây bệnh cũ. Chẳng hạn như: hoạt chất Metalaxyl khi sử dụng liên tục dễ hình thành tính kháng thuốc của vi sinh vật gây hại; còn hoạt chất Manocozeb chỉ có tác dụng phong bệnh tiếp xúc, sau khi phun thuốc lên thực vật thi chỉ ngăn ngừa sự hình thành mầm bệnh, không xâm nhập được vào bên trong mô thực vật, do đó chúng không có tác dụng khi nấm mốc hình thành và xâm nhiễm bên trong cây trồng. 1.2.3. Hợp chất kháng nấm sinh học: 1.2.3.1. Hợp chất kháng nấm từ thực vật: Các vi khuẩn có lợi thường tạo ra các chất có hoạt tính sinh học nhằmức chế được các tác nhân gây bệnh, trong đó có 1 số chất như là chất có thể chuyển hóa thành hợp chất thứ cấp hoặc chất có tính kháng sinh. Các chất đó giúp cho vi khuẩn có thể ức chế hay tiêu diệt các loại vi sinh vật cạnh tranh với chúng trong cùng điều kiện sống thích hợp. Thật vậy, ta có thể tìm thấy một số hợp chất thứ cấp từ các vi khuẩn có lợi khác nhau đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sinh học trong quá trình phát hiện bệnh trong cây trồng, chúng đã và đang được mọi người trên toàn thế giới sử dụng để làm thuốc bảo vệ cây trồng hay phân bón sinh 12
học. Ngoài ra, các hợp chất thứ cấp khôn những giúp cho thực vật chống lại các tác nhân gây bệnh từ nấm mốc mà còn giúp chúng tăng trưởng và phát triển tốt hơn. Điển hình là hợp chất thứ cấp được tiết ra từ nấm Trichoderma, chúng chống lại được phytopathogens và một số chất khác ảnh hương đến sự trao đổi chất của thực vật. Chất gây hại chủ yếu trong các bệnh của cây trồng chủ yếu là phytopathogenic, các hợp chất thứ cấp trong sinh học có thể kháng lại chúng mà không gây ô nhiễm môi trường, không gây hại đến con người và động vật, ít tốn kém, quan trọng hơn hết là không làm cho các chất hây hại có khả năng kháng thuốc nhanh như các chất hóa học. Các hợp chất thứ cấp (SM) là sự chuyển hóa hóa học các hợp chất khác nhau có trọng lượng phân tử tương đối thấp (<3kDa) và được sản xuất dựa bởi các vi sinh vật và thực vật có liên quan đến các chi, loài hay chủng. Các hợp chất thứ cấp này được chuyển hóa bằng con đường sinh tổng hợp từ các chất chuyên biệt (như polypeptide hhay con đường bắt nguồn từ Acetyl Co-enzyme A hoặc các amino aicd). Các hợp chất này còn có một số tác nhân sinh học ảnh hưởng đến sự sống, các chức năng của cơ thể hay cạnh tranh với các vi sinh vật khác. Đối với nấm, việc sản xuất các hợp chất thứ cấp thường tương quan đến các giai đoạn như sự khác biệt về cấu trúc, hình thái và giai đoạn tăng trường. SM còn biểu hiện một số chức năng sinh học và đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh sự tương tác giữa các vi sinh vật. Ví dụ: phytotoxins là hợp chất thứ cấp của nấm mốc tiết ra để gây hại cho cây trồng, độc tố nấm là hợp chât thứ cấp được sản xuất ra để gây hại cho cây trồng và có khả năng gây hại cho con người và động vật, kháng sinh là các chất trong tự nhiên có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt đối thủ cạnh tranh của vi sinh vật. Ngoài ra, các hợp chất thứ cấp từ nấm có thể thay đổi sự tăng trưởng và trao đổi chất cho cây nhằm mục đích kéo dài sự 13
hình thành bào tử và sơi nấm. Chính vì vậy, người ta tập trung nghiên cứu các hợp chất thứ cấp từ nấm có lợi và vai trò của nó để chống lại các vi sinh vật và nấm gây bệnh khác. Trong các nghiên cứu cho thấy,sự phân lập nấm Trichoderma tiết ra hợp chất thứ cấp quan trọng có hoạt tính kháng nấm và gây độc chống lại phytopathogenic. Trong nấm Trichoderma có chứa các chất kháng nấm như là pyrones, viridins, butenolides và Hydroxy-lacton . Pyrones hay còn có tên gọi là 6-pentyl-2H-pyran-2-one (6PP): là chất được chuyển hóa từ các loại nấm Trichoderma spp khác nhau( T.viride, T.atroviride, T.harzianum, T.koningii). Hợp chất này đã thể hiện được khả năng kháng lại một số nấm gây bệnh trong cả in vitro và in vivo. Ngoài ra, còn có cytosporone S thuộc nhóm hợp chất pyrones được phân lập từ Trichoderma có hoạt tính kháng sinh đối với 1 số loài vi sinh vật và nấm gây bệnh. Hình 1.4: Cấu trúc hóa học của Pyrones. 14
Viridins là hợp chất steroid được chuyển hóa từ sự phân lập các loài nấm Trichoderma spp, hợp chất này ngăn chặn sự tăng trưởng từ các loài nấm gây bệnh như: Aspergillus Niger, Fusarium caeruleum, Penicillium expansum . Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của Viridins. Butenolides và Hydroxy-Lactones cũng là các hợp chât thứ cấp được phân lập từ các chủng Trichoderma spp khác nhau và thông qua các nghiên cứu trong in vitro thấy được khả năng kháng nấm gây bệnh của chúng, đặc biệt là chống lại được phytopathogenic. 1.2.3.2. Hợp chất kháng nấm từ vi khuẩn: Một số loài vi sinh vật khác nhau sẽ thích hợp ở điều kiện và môi trường khác nhau, sinh ra các khuẩn lạc khác nhau. Thay đổi môi trường hoặc các yếu tố môi trường bất lợi là thay đổi điều kiện sống sẽ hạn chế hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Trong thực tế, trong môi trường nuôi cấy nấm gây bệnh sẽ có sự hiện diện của rất nhiều loài vi sinh vật khác tranh dành chất dinh dưỡng, không gian sống giữa vi khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế (Theo Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Nhuận,1976, trích dẫn Lý Kim Hữu, 2005). 15
a. Khả năng kháng nấm của vi khuẩn Bacillus spp.: Trước tiên, vi khuẩn Bacillus spp. tạo thành khối xung quanh các nấm gây bệnh ngăn chặn và không cho chúng bám lên vật chủ để gây bệnh. Sau đó, Bacillus spp. sẽ tiết ra hỗn hợp gồm nhiều chất lipopeptid (hay còn gọi là serenade) làm thủng vách tế bào và màng tế bào của các loại nấm gây bệnh đó, vì vậy ngăn chặn sự phát triển của chúng. Serenda có thể được bảo quản và được sử dụng như một loại thuốc trừ sâu hóa học tổng hợp, đã được kiểm tra và chứng minh trong phòng thí nghiệm không gây ngộ độc tới các loài động vật như cá hồi, ong mật, chim cút sâu đất . Serenda gồm có 3 nhóm lipopetid có tên là surfactin, agrastatin và iturin. Ba nhóm chất này kết hợp lại với nhau sẽ làm tăng hoạt tính diệt các mầm bệnh gây hại như nấm mốc và các bào tử gây bệnh của chúng. Surfactin là nhóm chất có hoạt tính sinh học, bản chất là lipopeptid. Bản thân của chất này không gây độc cho nấm nhưng khi kết hợp với inturin thì sẽ trở thành hợp chất diệt nấm. Sufactin có khả năng làm thủng vách tế bào của nấm gây bệnh và bảo tử của chúng hỗ trợ cho agrastatin và iturin phát huy tác dụng. Agrastatin vừa mới được phát hiện, cũng có khả năng diệt nấm giống như sufactin và iturin. Iturin là nhóm chất chiếm vai trò quan trọng nhất trong quá trình diệt nấm mốc, bản chất của chúng là lipopeptide được chiết từ môi trường nuôi cấy Bacillus spp. Iturin diệt nấm bằng cách tác dụng lên màng tế bào chất, làm tan màng, tạo thành nhiều lỗ thủng làm mất đi tính thẩm thấu và chọn lọc của màng Các nghiên cứu trong và ngoài nước về tác dụng đối kháng của Aspergillus spp. và Bacillus spp.: Trong nước: Nguyễn Đình Đào (1993) đã kiểm tra đối kháng của Bacillus subtilis AO1 với Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus và kết quả là 16
ức chế nấm mốc Aspergillus (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Ngọc Trân, 1995). Nguyễn Hữu Phúc và cộng sự năm 1993 đã tiến hành sử dụng Bacillus subtilis để ức chế sự sinh trưởng và sản xuất aflatoxin của Aspergillus flavusvà Aspergillus parasiticus trên đậu phộng (trích Lâm Thanh Thúy, 1995). Ngoài nước: Một số thí nghiệm về khả năng ức chế sinh tổng hợp aflatoxin của một số chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Norio Kimura (1990) đã sử dụng Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus trên đậu phộng và bắp. Các chủng Bacillus subtilis NK330 và NK-C-3 ức chế mạnh mẽ sự phát triển của nấm mốc và tổng hợp aflatoxin. (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Ngọc Trân, 1995). b. Khả năng kháng nấm của vi khuẩn Lactic: Khả năng ức chế của các vi khuẩn Lactic liên quan đến sự ức chế các vi sinh vật khác, được gây ra bởi sự cạnh tranh các chất dinh dưỡng và sự sản xuất ra các chất kháng sinh (Holzapfel, 1995). Khả năng kháng nấm và các thành phần ức chế đã tìm thấy và được công nhận qua các nghiên cứu. Các vi khuẩn Lactic có thể sản xuất ra các chất kháng sinh như acid lactic và reuterin, ngoài ra còn có các acid hữu cơ, peroxit hydro, bacteriocin kháng khuẩn và các loại peptide kháng nấm. Các vi khuẩn Lactic đã được biết đến trong nhiều năm và có vai trò quan trọng trong việc sản xuất các sản phẩm lên men phục vụ vho đời sống con người. Lợi ích của chúng mang lại là ảnh hưởng quan trọng đến đường tiêu hóa của con người (Cogan và cộng sự,1995; Hafidh và cộng sự, 2010). Giống Lactobacillus đã được báo cáo có hoạt tính kháng nấm đánh giá bằng thử nghiệm thạch lớp phủ chống lại loạt các nấm hư hỏng. Hoạt chất kháng nấm của 17
L.coryniformis subsp ổn định khi bị nung nóng ở nhiệt độ cao và độ pH 3- 4.5 (Magnusson và Schnurer, 2001). Hầu hết các nghiên cứu kháng nấm của vi khuẩn Lactic là do việc sản xuất một loại protein kháng nấm hoặc hoạt chất proteinaceous và một số các vi khuẩn Lactic L.Plantarum và L.Sanfrancisco đặc biệt sản xuất acid hữu cơ và đặc tính kháng nấm (Corsetti và cộng sự năm 1998; Lavermicocca và cộng sự, 2003). Hiện nay, hợp chất bảo quản sinh học duy nhất là Nisin có thể thêm được vào thực phẩm sản phẩm của vi khuẩn Lactic (Gardiner và cộng sự,2003; Corcoran và cộng sự,2004). Nghiên cứu về tiềm năng kháng nấm của vi khuẩn Lactic đã xác định được một số hợp chất có tác dụng ức chế lại nấm mốc và các loại nấm men khác nhau (Corsetti và cộng sự, 1998, (Bảng 1.1).; Lavermicocca và cộng sự, 2000;.Niku-Paavola và cộng sự, 1999; Magnusson, 2003; Sjogren và cộng sự, 2003.Sjogren, 2005). Bảng 1.2:Một số hợp chất đƣợc xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men (Corsetti và cộng sự, 1998) Hợp chất đƣợc xác định Nguồn sản xuất giống 4-hydroxy-phenyllacticacid 3- Lactobacillusplantar 21B phenyllacticacid 3 -hydroxydecanoicacid 3 - Lactobacillusplantarum MILAB14 hydroxydodecanoicacid 3 - hydroxytetradecanoicacid 3- hydroxy-5-cis –dodecenoicacid cyclo(Gly-Leu) methylhydantoin Lactobacillusplantarum VTTE- mevalonolactone 78076 Caproic-, propionic-, buturic-, Lactibacillus sanfranciscensis CB1 acetic-, formic- and n-valeric acid. 18
Roy và cộng sự báo cáo đã phân lập được 2100 khuẩn lạc lactic từ phô mai cũ và sữa trâu sống, đã cho thấy hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI và phân lập nhiều nhất vi khuẩn Lactococcus subsp CHD-28.3 có hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI, A.flavus NCIM 555, A.parasiticus NCIM 898 và Fusarium sp Nấm Aspergillus IARI được xem là chất cảm ứng cho chủng lactic này (Roy và cộng sự, 1996). Vi khuẩn Lactic có khả năng sản xuất một lượng lớn các sản phẩm có tính acid và các tổ hợp khác với hoạt tính kháng nấm mạnh. Đa số các chất kháng nấm được xác định đều có trọng lượng phân tử thấp bao gồm acid hữu cơ, H2O2, hợp chất proteinaceous, acid béo hydroxyl Ngoài sự ức chế tăng trưởng thực tế của nấm, các vi khuẩn Lactic cũng có thể ức chế sản phẩm đặc biệt của độc tố nấm mốc (Gourama và Bullerman, 1997) hoặc làm bất động độc tố thông qua liên kết với bề mặt của chúng (El- Nezami và cộng sự, 2004). 1.3. Các phƣơng pháp sàng lọc các chủng VSV kháng nấm mốc: Từ cuối những năm 50 và đầu các thập niên 60, các nhà khoa học đã nghiên cứu hoạt tính kháng nấm mốc của các vi khuẩn có lợi thông qua nhiều phương pháp khác nhau để từ đó, các nhà khoa học có thể khẳng định được sự kháng nấm của các vi khuẩn có lợi sẽ ức chế được sự tăng trưởng và phát triển của các bào tử và sợi nấm của các chủng nấm gây hại, đặc biệt là chủng nấm Aspergillus spp. Dựa trên tiêu chí đó, để lựa chọn ra được chủng vi khuẩn có lợi từ bộ sưu tập của phòng thí nghiệm có khả năng kháng nấm mốc hiệu quả thích hợp nhất, em đã thực hiện theo 3 phương pháp khác nhau: phương pháp đối kháng trực tiếp, phương pháp đặt thạch khuếch tán và phương pháp đối kháng che phủ. Từ đó, dựa trên sự đường kính của sợi nấm đánh giá được mức độ đối kháng của vi khuẩn có lợi nào mạnh nhất và cũng như phương pháp nào tối ưu nhất. 19
1.3.1. Phƣơng pháp đối kháng trực tiếp (phƣơng pháp ria 2 đƣờng vi khuẩn): Để xác định khả năng đối kháng nấm của các vi khuẩn có lợi thì ta sẽ sử dụng phương pháp đối kháng trực tiếp (Dual Culture Two Line Culture Method) trên môi trường rắn theo mô tả của Brunner và cộng sự (2005): Đầu tiên, ta cấy khoanh thạch của nấm chỉ thị (đường kính 7mm) và đặt vào tâm dĩa petri có môi trường thạch đã chuẩn bị, sau đó ủ 24h cho nấm phát triển. Tiếp theo, ta tiến hành cấy 2 vạch vi khuẩn chỉ thị vào dĩa và đặt cách ngoài mép dĩa 1,5cm (2 vạch chủng vi khuẩn phải nằm đối diện nhau qua tâm dĩa trên cùng một đường kính). Cuối cùng, ủ các dĩa thạch trong 72h, nhiệt độ phòng. Hoạt động ức chế sẽ dựa trên đường kính của sợi nấm. Hình 1.6: Phƣơng pháp cấy ria 2 đƣờng vi khuẩn thể hiện sự đối kháng của vi khuẩn LAB với nấm mốc (trích từ Brunner và cộng sự (2005). 20
Hình 1.7: Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng của các vi khuẩn có lợi theo phƣơng pháp ria 2 đƣờng vi khuân. 21
1.3.2. Phƣơng pháp đối kháng trực tiếp (đảt thạch khuếch tán): Phương pháp khuếch tán(Agar Plug Diffusion Method) này được phát triển vào năm 1940, là phương pháp thông dụng được sử dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm vi sinh lâm sàng để thử nghiệm nhạy cảm kháng sinh thông thường. Hiện nay, nhiều tiêu chuẩn đã chấp nhận và phê duyệt được công bố bởi CLSI cho vi khuẩn và nấm mốc thử nghiệm, mặc dù không phải hầu hết các vi khuẩn đều thể hiện khả năng đối kháng trên phương pháp này nhưng cũng đã thành công trên một số vi khuẩn và thể hiện rõ sự ức chế của chống đối với nấm mốc. Phương pháp này được mô tả như sau: Đầu tiên, ta trang huyền phù của nấm với mật độ 105/ml nấm trên dĩa thạch PDA cho khô. Tiếp theo, sử dụng cây khoanh thạch đục lỗ vi khuẩn chỉ thị đặt vào 3 điểm đã xác định trên dĩa petri có chứa nấm. Cuối cùng, ủ trong 72h ở nhiệt độ phòng.Hoạt động ức chế sẽ dựa trên sụ phát triển của đường kính nấm. Hình 1.8: Phƣơng pháp đặt thạch khuếch tán thể hiện sự đối kháng giữa vi khuẩn Bacillus spp với C.albicans (trích dẫn Mounyr Balouiri, 2011). 22
Hình 1.9: Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng nấm của các vi khuẩn có lợi theo phƣơng pháp khuếch tán. 23
1.3.3. Phƣơng pháp đối kháng che phủ: (phƣơng pháp đỗ dĩa) Phương pháp che phủ (Overlay Method) này như mô tả của Kumar và các cộng sự, 2009 .Sử dụng dịch tăng sinh của vi khuẩn chỉ thị được cấy trang lên môi trường đặc thù của chúng, sau đó ủ 24h trong nhiệt độ phòng. Tiếp theo, chúng được phủ lên bằng 10ml chiết xuất malt thạch mềm có chứa 105/ml nấm ủ hiếu khí trong vòng 72h. Sau 72h nuôi cấy, vùng ức chế sẽ hiện ra.Hoạt động ức chế dựa trên độ bao phủ của nấm thể hiện trên dĩa. Hình 1.10: Phƣơng pháp đối kháng che phủ của vi khuẩn Bacillus spp. với nấm mốc - Nấm Trichorphyton sp. (a) - Nấm Microsporum fulvum (b). (trích dẫn Kumar và các cộng sự, 2009). 24
Hình 1.11: Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng nấm với các vi khuẩn có lợi theo phƣơng pháp đõ dĩa. 25
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm nghiên cứu: Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường của Trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM. 2.2. Thời gian thực hiện: Đề tài được thực hiện từ 20/3/2016 đến 30/7/2016 2.3. Vật liệu nghiên cứu: 2.3.1. Giống vi sinh vật: Các giống vi khuẩn Bacillus spp.: Nhóm phân lập từ phụ phế phẩm: CS1a, CS1+, CS1b,VK4. Nhóm phân lập từ đất: D9, Paenibacillus Nhóm phân lập từ nước thải: Sb NT 1.4, Sb NT 1.3, Sb NT 2.3, Sb NT 3.3. Các giống vi khuẩn lên men lactic Lactobacillus spp.: Nhóm phân lập từ nem: L5, L6, LN2-5(L3), LN2-7 (L4), LN3-5, LN3-7. Nhóm phân lập từ cơm mẻ: LC6-5, LC7-7, LC1-1(C1), LC3(LC3-3). Các loại nấm thuộc nhóm Aspergillus spp.: Nhóm nấm phân lập từ đậu nành: ĐN3, ĐN2. Nhóm phân lập từ đậu phộng: CĐP1, CĐP2. Nhóm phân lập từ hạt cà phê: HCP2. Do phòng thí nghiệm vi sinh thuộc khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường của Trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM cung cấp. Nystatin từ nhà sản xuất F.T.Pharma 500000IU/viên, 1mg chứa 4855IU và 1IU tương đương 0,0002059 mg chế phẩm tương đương chứa 0,9996445mg Nystatin. 26
2.3.2. Hóa chất và môi trƣờng sử dụng: 2.3.2.1. Hóa chất: Các hóa chất dùng để pha môi trường NA, NB, PDA, MRS cải tiến và MRS- broth. Các hóa chất dùng để làm huyền phù nấm. Các hóa chất để pha các loại thuốc nhuộm: Tím kết tinh (Crystal Violet), Iod ethanol 95%, Aceton, thuốc nhuộm Fushin, xanh methylen. 2.3.2.2. Môi trường nuôi cấy: Môi trường NA- NB Môi trường PDA Môi trường MRS-broth và MRS agar 2.4. Thiết bị và dụng cụ: 2.4.1. Thiết bị: Tủ cấy vi sinh (Brlad France) Tủ ủ (Memmert Germany) Tủ lạnh Toshiba Autoclave (Memmert- Đức) Cân phân tích (Orbital Germany) Bếp từ (Billy- England) Máy nước cất (Branstead USA) Máy lắc Kính hiển vi quang học Bể điều nhiệt 27
2.4.2. Dụng cụ: Ống nghiệm, đĩa petri, erlen, cốc thủy tinh, bình định mức, đũa thủy tinh, ống đong. Pipet thủy tinh 10ml, 20ml, pipetman 100-1000µl Que cấy, que trang, kẹp gấp thạch,que đục lỗ thạch, dao phẫu thuật, đèn cồn. Bông thấm nước, bông không thấm nước, lame, lamell, giá đỡ ống nghiệm, rổ nhựa. 2.5. Phƣơng pháp luận: Mục tiêu: Khảo sát các phương pháp đối kháng của 2 chủng vi khuẩn Bacillus spp.và Lactobacillus spp.đối kháng lại 1 số loại nấm mốc gây hại trên các loại hạt nông sản. Nội dung: Khảo sát sự tăng trưởng của nấm mốc Aspergillus spp. Khảo sát hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hóa của 1 số chủng vi khuẩn. Đánh giá khả năng đối kháng trực tiếp thông qua phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn của 2 chủng vi khuẩn Bacillus spp.và Lactobacillus spp. với nấm mốc Aspergillus spp. Xác định khả năng đối kháng trực tiếp thông qua phương pháp khuếch tán của 2 chủng vi khuẩn Bacillus spp.và Lactobacillus spp. với nấm mốc Aspergillus spp. Khảo sát khả năng đối kháng thông qua phương pháp che phủ của 2 chủng vi khuẩn Bacillus spp.và Lactobacillus spp.với nấm mốc Aspergillus spp. So sánh kết quả để lựa chọn ra phương pháp đối kháng mạnh nhất của 2 chủng vi khuẩn Bacillus spp.và Lactobacillus spp. 2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu: 2.6.1. Sơ đồ nghiên cứu: 28
Hình 2.1: Sơ đồ tổng quát nghiên cứu khả năng đối kháng của các chủng VK có lợi với nấm mốc. 29
2.6.2. Khảo sát sự tăng trƣởng của nấm mốc: Mục đích: Khảo sát sự phát triển của nấm mốc và chứng tỏ rằng đây là các giống nấm mốc Aspergillus spp. khỏe mạnh Tiến hành: Từ dĩa giống nấm của phòng thí nghiệm, ta đục một khoanh thạch nấm cấy và đặt vào môi trường PDA đã hấp khử trùng ở 1210C trong 30 phút. Sau đó, ủ trong 72h trong nhiệt độ phòng và quan sát, 2.6.3. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phƣơng pháp ria 2 đƣờng vi khuẩn của 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với nấm mốc Aspergillus spp. : Quy trình thí nghiệm: 30
Hình 2.2: Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phƣơng pháp cấy 2 đƣờng vi khuẩn. 31
Thuyết minh quy trình: Mục đích: Khảo sát khả năng kháng các chủng nấm mốc của 20 chủng vi khuẩn theo phương pháp vạch 2 đường vi khuẩn. Tiến hành: Chuẩn bị môi trường vi khuẩn: Hoạt hóa 20 chủng vi khuẩn có sẵn trong phòng thí nghiệm:  Đối với vi khuẩn Bacillus spp., hoạt hóa trong môi trường NB đã hấp khử trùng ở 370C và lắc trong 24h. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong môi trường NB ở 370C trong 24h.  Đối với vi khuẩn Lactobacillus spp., hoạt hóa giống trong môi trường MRS broth ở 370C trong 24h. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong môi trường MRS broth ở 370C trong 24h Cấy truyền dịch tăng sinh:  Đối với vi khuẩn Bacillus spp., cấy ria vào môi trường NA đã hấp khử trùng 1210C trong vòng 30 phút. Sau đó, ủ 24h ở 370C.  Đối với vi khuẩn Lactobacillus spp., cấy ria vào môi trường MRS agar đã hấp khử trùng ở 1210C trong vòng 30 phút. Sau đó, ủ 24h ở 370C Chuẩn bị môi trường khảo sát đối kháng: Môi trường sử dụng là môi trường PDA và MRS cải tiến đều được hấp khử trùng ở 1210C trong 30 phút. Sau đó, phối vào dĩa petri đã được hấp khử trùng, mỗi dĩa 15ml. Khi thạch đã đông, ta tiến hành cấy nấm mốc vào tâm các dĩa. Mỗi dĩa lặp lại 3 lần. Sau đó, ủ 24h ở nhiệt độ phòng. Sau 24h, ta tiến hành cấy 2 vạch vi khuẩn cách ngoài mép dĩa 1,5cm (2 vạch chủng vi khuẩn phải nằm đối diện nhau qua tâm dĩa trên cùng một đường kính)cần thử đối kháng vào.Mẫu đối chứng là chỉ cấy nấm vào tâm dĩa, không cấy 2 vạch vi khuẩn lên. Tiếp tục ủ 72h ở nhiệt độ phòng. Quan sát, đọc kết quả đối kháng dựa vào sự phát triển của nấm sau 3 ngày. 32
Ta tiến hành đo tỉ lệ ức chế theo hình và công thức phần trăm: 1.5 D Dđc cm tn Hình 2.3: Mô tả cách đo đƣờng kính vòng ức chế của phƣơng pháp vạch 2 đƣờng vi khuẩn Trong đó: Dđc: đường kính (cm) đĩa nấm đối chứng Dtn: đường kính (cm) đĩa thí nghiệm Số liệu được xử lí bằng phần mền SAS 9.1 33
2.6.4. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phƣơng pháp đặt thạch khuếch tán của 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với nấm mốc Aspergillus spp. : Quy trình thí nghiệm: 34
Hình 2.4 : Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng kháng nấm của 20 chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phƣơng pháp đục thạch khuếch tán. 35
Thuyết minh quy trình : Mục đích: Khảo sát khả năng kháng các chủng nấm mốc của 20 chủng vi khuẩn theo phương pháp khuếch tán. Tiến hành: Chuẩn bị môi trường vi khuẩn: Hoạt hóa 20 chủng vi khuẩn có sẵn trong phòng thí nghiệm:  Đối với vi khuẩn Bacillus spp., hoạt hóa trong môi trường NB đã hấp khử trùng ở 370C và lắc trong 24h. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong môi trường NB ở 370C trong 24h.  Đối với vi khuẩn Lactobacillus spp., hoạt hóa giống trong môi trường MRS broth ở 370C trong 24h. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong môi trường MRS broth ở 370C trong 24h Cấy truyền dịch tăng sinh:  Đối với vi khuẩn Bacillus spp., hút 0.1ml dịch tăng sinh và trang vi khuẩn vào môi trường NA đã hấp khử trùng 1210C trong vòng 30 phút. Sau đó, ủ 24h ở 370C.  Đối với vi khuẩn Lactobacillus spp., hút 0.1ml dịch tăng sinh và trang vi khuẩn vào môi trường MRS agar đã hấp khử trùng ở 1210C trong vòng 30 phút. Sau đó, ủ 24h ở 370C. Chuẩn bị huyền phù nấm: Cấy truyền giống nấm vào dĩa có chứa môi trường PDA đã hấp khử trùng ở 1210C trong 30 phút. Sau đó, ủ trong 72h ở nhiệt độ phòng. Sau 72h, ta dùng muỗng đã hấp khử trùng cào hết phần bào tử nấm đã mọc tròn dĩa và pha loãng với nước muối sinh lí có Tween 80 đã hấp khử trùng để nấm đạt đến mật độ 105/ml nấm. Chuẩn bị môi trường để khảo sát sự đối kháng: 36
Môi trường sử dụng là môi trường PDA và MRS cải tiến đều được hấp khử trùng ở 1210C trong 30 phút. Sau đó, phối vào dĩa petri đã được hấp khử trùng, mỗi dĩa 15ml. Khi thạch đã đông, ta tiến hành hút 0.1ml dịch huyền phù nấm đã pha loãng và trang đều cho khô. Sau đó, đặt khoanh thạch vi khuẩn vào các điểm đã được chấm trước trên dĩa.Mỗi dĩa được lặp lại 3 lần. Đối với dĩa đối chứng, ta chỉ hút dịch huyền phù nấm và trang khô, không đặt thạch vi khuẩn. Cuối cùng, ủ 72h ở nhiệt độ phòng. (A) (B) Hình 2.5:Cách đặt thạch vi khuẩn theo phƣơng pháp đặt thạch khuếch tán- Đĩa petri có chứa huyền phù nấm để đặt thạch chứa vi khuẩn lên (A) – Đĩa petri chứa vi khuẩn (B) Quan sát và đọc kết quả đối kháng dựa trên sự phát triển của vòng ức chế nấm của vi khuẩn. 37
Ta tiến hành đo và tính toán kết quả dựa theo hình vẽ và công thức: D d Hình 2.6: Cách đo đƣờng kính vòng ức chế của vi khuẩn đối với nấm mốc theo phƣơng pháp đặt thạch khuếch tán Trong đó: Dtn1: đường kính vòng ức chế (D) của vi khuẩn trong nghiệm thức 1 chưa trừ ra đường kính lỗ thạch (d). Dtn2: đường kính vòng ức chế (D) của vi khuẩn trong nghiệm thức 2 chưa trừ ra đường kính lỗ thạch (d). Dtn3: đường kính vòng ức chế (D) của vi khuẩn trong nghiệm thức 3 chưa trừ ra đường kính lỗ thạch (d). 38
2.6.5. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng che phủ theo phƣơng pháp đỗ dĩa 2 lớp của 2 chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với nấm mốc Aspergillus spp.: Thuyết minh quy trình: 39
Hình 2.7: Sơ đồ khảo sát khả năng đối kháng che phủ của 20 chủng vi khuẩn với các nấm mốc theo phƣơng pháp đỗ dĩa. 40
Thuyết minh quy trình: Mục đích: Khảo sát khả năng kháng các chủng nấm mốc của 20 chủng vi khuẩn theo phương pháp đỗ dĩa. Tiến hành: Chuẩn bị môi trường vi khuẩn: Hoạt hóa 20 chủng vi khuẩn có sẵn trong phòng thí nghiệm:  Đối với vi khuẩn Bacillus spp. hoạt hóa trong môi trường NB đã hấp khử trùng ở 370C và lắc trong 24h. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong môi trường NB ở 370C trong 24h.  Đối với vi khuẩn Lactobacillus spp. hoạt hóa giống trong môi trường MRS broth ở 370C trong 24h. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong môi trường MRS broth ở 370C trong 24h Pha loãng dịch tăng sinh:  Hút 1ml dịch tăng sinh của các chủng vi khuẩn pha loãng với nước muối sinh lí 85% cho đến 1 nồng độ nhất định. Chuẩn bị huyền phù nấm: Cấy truyền giống nấm vào dĩa có chứa môi trường PDA đã hấp khử trùng ở 1210C trong 30 phút. Sau đó, ủ trong 72h ở nhiệt độ phòng. Sau 72h, ta dùng muỗng đã hấp khử trùng cào hết phần bào tử nấm đã mọc tròn dĩa và pha loãng với nước muối sinh lí có Tween 80 đã hấp khử trùng để nấm đạt đến mật độ 105/ml nấm. Chuẩn bị môi trường để khảo sát sự đối kháng: Môi trường sử dụng là môi trường PDA và MRS agar đều được hấp khử trùng ở 1210C trong 30 phút. Sau đó, phối vào dĩa petri đã được hấp khử trùng, mỗi dĩa 15ml. Khi môi trường đã đông, hút 0.1ml dịch vi khuẩn đã pha loãng và trang đều cho khô. Sau đó, ủ trong 24h ở nhiệt độ phòng. 41
Cho dịch nấm đã pha loãng vào môi trường PDA đã hấp khử trùng đùng theo tỉ lệ nồng độ. Sau đó, đổ 1 lớp PDA có chứa nấm lên dĩa môi trường có chứa khuẩn lạc vi khuẩn đã ủ trong 24h và lắc đều. Mỗi dĩa được lặp lai 3 lần. Đối với dĩa đối chứng chỉ đổ lớp môi trường PDA có chứa dịch nấm không trang vi khuẩn. Cuối cùng, đem ủ 72h ở nhiệt độ phòng. Quan sát và đọc kết quả dựa trên sự phát triển của nấm sau 3 ngày. Dựa theo hình ảnh quan sát, ta chia tỉ lệ ức chế nấm mốc của vi khuẩn theo 3 phân đoạn khác nhau:  Không ức chế hay ức chế yếu từ 0 đến 30%  Ức chế trung bình từ 35 đến 60%  Ức chế mạnh từ 65-100%. 42
2.6.6. Một số phƣơng pháp khảo sát hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hóa của một số chủng vi khuẩn: 2.6.6.1. Nhuộm Gram: Mục đích: Dựa vào cấu trúc vách tế bào giúp ta xác định nhóm của vi khuẩn là vi khuẩn Gram dương (Gram – positive) hay vi khuẩn Gram âm (Gram – negative). Ngoài ra nhuộm Gram cho phép ta quan sát rõ hình thái tế bào hơn so với soi vi khuẩn sống. Tiến hành: Sử dụng phương pháp Hucker cải tiến. Vi khuẩn đem nhuộm gram phải là vi khuẩn mới cấy truyền sau 24 giờ. Ngược lại vi khuẩn già cho kết quả sai lệch. Kết quả: vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, vi khuẩn Gram (-) bắt màu hồng. 2.6.6.2. Nhuộm bào tử: Mục đích: Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử: dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipid. Trước hết xử lý để tế bào chất dễ bắt màu bằng nhiệt và acid. Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh. Tẩy màu tế bào chất của tế bào và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm khác bổ sung. Nhờ đó tế bào chất của bào tử và tế bào chất bắt màu phân biệt. Theo sơ đồ Bergey thì chủng Bacillus spp. sinh bào tử. Do đó việc xác định này nhằm loại bỏ các vi khuẩn sinh bào tử như Lactobacillus spp. Tiến hành: Dùng phương pháp Schaefera – Fulton. Kết quả: Bào tử có màu xanh lục, tế bào có màu đỏ hồng. 2.6.6.3. Các thí nghiệm sinh hóa: Thử khả năng lên men đường: Mục đích : Kiểm tra vi sinh vật có khả năng lên men các loại đường nào. 43
Tiến hành : Môi trường NB với lượng đường glucose lần lượt thay thế bằng các loại đường cần kiểm tra. Phân môi trường vào các ống nghiệm, mỗi ống 10ml. Đặt vào mỗi ống nghiệm 1 ống nhỏ (ống Durham) lộn ngược đầu để hứng khí CO2 sinh ra nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường. Khử trùng trong 15 phút ở 1210C. Cấy vi khuẩn mới hoạt hóa vào các ống nghiệm, đặt ở 370C, theo dõi hiện tượng sinh acid sau 1-3 ngày. Có trường hợp cần dùng paraffin để bịt kín nút bông và theo dõi trong 14-30 ngày. Kết quả: Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường (sinh acid) chất chỉ thị Phenol Red sẽ chuyển sang màu vàng. Thửnghiệm Catalase: Mục đích: Để phát hiện được enzyme catalase trong vi khuẩn. Phản ứng catalase rất cần thiết để phân biệt vi khuẩn kị khí và hiếu khí bắt buộc, vi khuẩn kị khí sẽ không có enzyme này như Lactobacillus spp.còn vi khuẩn hiếu khí bắt buộc sẽ có enzyme này như Bacillus spp. Tiến hành: Dùng que cấy vòng lấy sinh khối từ khuẩn lạc thuần cho lên phiến kính sạch, nhỏ 1 giọt H2O2 lên sinh khối vi sinh vật trên phiến kính. Kết quả: Nếu là vi khuẩn hiếu khí sẽ sủi bọt khi nhỏ H2O2 lên còn kị khí thì không sủi bọt. Thử khả năng di động: Mục đích: Xác định khả năng di động của vi sinh vật. Tiến hành: Sử dụng môi trường NA 0,5% agar. Hấp khử trùng 121oC/ 15 phút. Để cho môi trường đông lại, dùng que cấy thẳng thu lấy sinh khối từ khuẩn lạc của chủng thuần, cấy điểm vào giữa đĩa môi trường thạch bán rắn. Ủ ở 370C. Đọc kết quả sau 24giờ. Kết quả: Vi khuẩn Bacillus spp. có khả năng di động. 44
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Định danh sơ bộ khảo sát sinh lý- sinh hóa của một số chủng vi khuẩn: Các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. và Bacillus spp.được dùng trong thí nghiệm đã được một số nghiên cứu trước định danh sơ bộ bằng khảo sát sinh lí và sinh hóa. Tuy nhiên, vẫn còn ba vi khuẩn VK4, CS1a, CS1+ chưa được khảo sát sơ bộ bằng khảo sát sinh lí và sinh hóa nên chúng ta khảo sát sinh lý và sinh hóa chúng lại để khẳng định chúng có một số đặc điểm tiêu biểu của Bacillus spp. hay không. Vi khuẩn Bacillus spp.cần phải đáp ứng các điều kiện: vi khuẩn gram dương, hình cầu hoặc hình que, sinh bào tử, có khả năng di động Các phản ứng sinh ly-sinh hóa sau sẽ chứng minh vi khuẩn Bacillus spp.đạt được các yêu cầu đó. Hình thái khuẩn lạc của các chủng Bacillus spp.thể hiện qua bảng 3.1: Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng Bacillus spp. Tên chủng Hình thái khuẩn lạc CS1a Khuẩn lạc tròn, bờ răng cưa, nhẵn, ướt, màu trắng đục, có tâm CS1+ Khuẩn lạc tròn đều, ướt, nhẵn, có tâm, màu trắng đục VK4 Khuản lạc tròn đều, nhẵn, không có tâm, màu trắng đục Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc của các chủng Bacillus spp. CS1a (a) – CS1+ (b) – VK4 (c). 45
3.1.1. Nhuộm Gram: Vi khuẩn Bacillus spp. là vi khuẩn gram dương, hình que hoặc hình cầu nên ta tiến hành nhuộm Gram với các tế bào tăng sinh ở 24h trong môi trường NB, vì khi tế bào già sẽ bắt màu giống như vi khuẩn gram âm. Kết quả thu được vi khuẩn Bacillus spp.: VK4 là vi khuẩn gram dương Hình 3.2: Nhuộm Gram vi khuẩn VK4 3.1.2. Nhuộm bào tử: Theo sơ đồ định danh của Bergey thì Bacillus spp.sinh bào tử nên nhuộm bào tử giúp loại bỏ các vi khuẩn gram dương không sinh bảo tử như Lactobacillus spp. và đây là cách nhận dạng của chúng. Kết quả sau khi nhuộm bào tử và được đối chiếu với vi khuẩn Lactobacillus spp.gram dương. Kết quả cho thấy 3 chủng vi khuẩn Bacillus spp.CS1a,CS1+ và VK4 đều bắt màu xanh lục sau khi nhuộm thuốc thử Malachite Green còn Lactobacillus spp. L5 chỉ bắt màu đỏ hồng. 46
a b Hình 3.3: Nhuộm bào tử các chủng vi khuẩn- Nhuộm bào tử của vi khuẩn VK4 (a) - Nhuộm bào tử của vi khuẩn Lactobacillus sp L5. (b) 3.1.3. Các thử nghiệm sinh hóa: Một số thử nghiệm sinh hóa được thể hiện qua bảng: Bảng 3.2: Một số phản ứng sinh hóa của chủng vi khuẩn Bacillus spp. Phƣơng pháp Chủng CS1a CS1+ VK4 Catalase + + + Khả năng di động + + + Glucose + + + Khả năng lên men đường Saccarose + + + Xylose + - - Lactose + + + 47
Chú thích: “-“ là kết quả âm tính; “+” là kết quả dương tính. Qua các định danh sơ bộ theo phương pháp cổ điển, người thực hiện đề tài khẳng định được các chủng Bacillus spp. VK4, CS1a, CS1+ đều là vi khuẩn Bacillus và đều thuẩn khiết. 3.2. Khảo sát sự tăng trƣởng của các chủng nấm mốc Aspergillus spp.: Để xác định được các chủng nấm trong phòng thí nghiệm là các chủng nấm khỏe mạnh và thuần khiết, ta cấy bằng cách đặt thạch nấm và đo đường kính phát triển của chúng sau 3 ngày. Vì ở đây ta thực hiện sự đối kháng của nấm với 2 chủng vi khuẩn là Bacillus spp và Lactobacillus spp. nên ta sẽ đặt thạch nấm lên 2 môi trường đặt trưng của 2 vi khuẩn đó và đo đường kính phát triển của chúng sau 3 ngày. Đối với Bacillus spp.ta dùng môi trường PDA để khảo sát: Hình 3.4: Sự phát triển của nấm mốc sau 3 ngày quan sát trên môi trƣờng PDA – Nấm CĐP1 (a) – Nấm CĐP2 (b) – Nấm ĐN2 (c) – Nấm ĐN3 (d) – Nấm HCP2 (e). 48
Đối với Lactobacillus spp. ta dùng MRS cải tiến (bỏ citrate amon) để khảo sát: Hình 3.5: Sự phát triển của nấm mốc sau 3 ngày quan sát trên môi trƣờng MRS cải tiến – Nấm CĐP1 (a) – Nấm CĐP2 (b) – Nấm ĐN2 (c) – Nấm ĐN3 (d) – Nấm HCP2 (e). 49
3.3. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phƣơng pháp ria 2 đƣờng vi khuẩn của 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với nấm mốc Aspergillus spp.: Ta có 20 chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp.nên ở mỗi ta sẽ sắp xếp chúng theo từng nhóm có nguồn phân lập giống nhau: Đối với vi khuẩn Bacillus spp. ta phân làm 3 nhóm: Nhóm phân lập từ phụ phế phẩm: CS1a, CS1b, CS1+, VK4. Nhóm phân lập từ đất: D9, Paenibacillus. Nhóm phân lập từ nước thải: Sb NT 1.4, Sb NT 1.3, Sb NT 2.3, Sb NT 3.3. Đối với vi khuẩn Lacobacillus spp. ta phân thành 2 nhóm: Nhóm phân lập từ nem: L5, L6, LN3-5, LN3-7, LN2-7, LN 2-5. Nhóm phân lập từ cơm mẻ: LC6-5, LC7-7, LC1-1,LC3-3. Thử nghiệm đối kháng nấm mốc ta sử dụng 5 chủng nấm mốc Aspergillus spp. chỉ thị với mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Trong đó, ta sử dụng đối chứng (+) là thuốc Nystatin vì Nystatin là hợp chất hóa học tác động lên màng tế bào của nấm mốc của Steptomyces nourse. Nhằm mục đích để so sánh sự đối kháng của chủng vi khuẩn thí nghiệm với hợp chất hóa học có sự khác biệt hay không. 50
Đối với vi khuẩn Bacillus spp.: Hình 3.6: Đối chứng CĐP2 (a)- Nystatin-CĐP2 (b)-Paenibacillus-CĐP2 (c) - CS1b-CĐP2 (d)- NT 1.4-CĐP2(e). 51
Hình 3.7: Đối chứng ĐN3 (a) – Nystatin-ĐN3 (b) –Paenibacillus-ĐN3 (c) – CS1b-ĐN3 (d) – NT 1.4-ĐN3 (e). 52
Bảng 3.3: Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế của các nhóm vi khuẩn Bacillus spp. với nấm mốc theo từng nhóm theo phƣơng pháp cây 2 đƣờng vi khuẩn. VI KHUẨN ĐN3 ĐN2 CĐP2 CĐP1 HCP2 ĐC(+) 32.80a±4.71 39.39b±1.78 43.80ab±2.66 38.95b±1.51 27.99b±4.66 NHÓM VK4 37.58c±4.81 35.28b±3.08 5.24d±4.26 34.73b±4.62 8.59c±3.73 VK CS1a 2.54a±1.91 30.60c±2.57 37.85bc±4.39 60.61a±4.78 28.92b±4.44 PHÂN LẬP TỪ CS1+ 16.71b±3.59 16.79d±4.71 32.00c±2.66 54.79a±4.12 10.27c±2.52 PHỤ CS1b 40.76a±2.53 52.74a±1.78 51.39a±1.41 52.90a±4.86 47.39a±1.12 PHẾ PHẨM ĐC(+) 32.80b±4.71 39.39b±1.78 43.80a±2.66 38.95b±1.51 27.99b±4.66 NHÓM D9 44.58a±2.53 40.76a±4.75 44.16a±4.55 47.67b±3.80 27.99b±0.65 VK Paenibacillus 38.85ab±3.45 32.20c±1.78 44.00a±3.24 50.29a±3.80 38.44a±4.48 PHÂN LẬP TỪ ĐẤT ĐC(+) 32.80a±4.71 39.39a±1.78 43.80b±2.66 38.95a±1.51 27.99b±4.66 NHÓM Sb NT 1.3 21.33b±3.86 29.26b±4.37 31.08a±3.73 46.65c±4.78 34.15b±4.27 VK Sb NT 2.3 29.93a±1.46 27.40b±4.15 45.54ab±3.73 40.40b±3.52 15.12c±4.20 PHÂN LẬP TỪ Sb NT 3.3 31.21a±5.06 25.01b±4.48 35.39ab±2.77 41.86b±4.80 32.47b±4.13. NƢỚC Sb NT 1.4 36.30a±0.55 22.27b±2.14 37.23a±4.62 44.76ab±3.06 53.73a±2.58 THẢI 53
Bảng 3.4: So sánh tỉ lệ ức chế nấm mốc của 3 vi khuẩn Bacillus spp. mạnh nhất trong từ nhóm với nhau theo phƣơng pháp cấy 2 đƣờng vi khuẩn.(dựa theo độ tin cậy 95% của phần mền SAS 9.1. VI KHUẨN ĐN3 ĐN2 CĐP2 CĐP1 HCP2 ĐC(+) 32.80c±4.71 39.39b±1.78 43.80bc±2.66 38.95b±1.51 27.99c±4.66 CS1b (NHÓM VK PHÂN 40.76ab±2.53 52.74a±1.78 51.39a±1.41 52.90a±4.86 47.39a±1.12 LẬP TỪ PHỤ PHẾ PHẨM) D9 a b b a c (NHÓM VK PHÂN 44.58 ±2.53 40.76 ±4.75 44.16 ±4.55 47.67 ±3.80 27.99 ±0.65 LẬP TỪ ĐẤT) Sb NT 1.4 bc c c a b (NHÓM VK PHÂN 36.30 ±0.55 22.27 ±2.14 37.23 ±4.62 44.76 ±3.06 53.73 ±2.58 LẬP TỪ NƢỚC THẢI) 54
Hình 3.8: Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế trung bình của nhóm vi khuẩn Bacillus spp.đƣợc phân lập từ phụ phế phẩm. 55
Hình 3.9: Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế trung bình của nhóm vi khuẩn Bacillus spp. đƣợc phân lập từ đất. 56
Hình 3.10: Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế trung bình của nhóm vi khuẩn Bacillus spp .đƣợc phân lập từ nƣớc thải. 57
Sau khi xử lí số liệu bằng phần mền ANOVA (phân tích phương sai) với mức độ tin cậy là 95% thì ta có: Phần trăm tỉ lệ ức chế của vi khuẩn CS1b là mạnh nhất với các chủng vi khuẩn Bacillus spp. còn lại nằm trong khoảng 40.76-52.74% thể hiện trong bảng 3.4 và hình 3.7 Thông qua bảng 3.3, cho thấy được vi khuẩn thể hiện tỉ lệ ức chế yếu nhất là vi khuẩn VK4, tỉ lệ ức chế chỉ nằm trong khoảng 5.24-37.58% trong bảng 3.3. Trong từng nhóm phân lập, các vi khuẩn Bacillus spp. thể hiện tỉ lệ đối kháng thông qua biểu đồ: Ở biểu đồ 3.8, tỉ lệ đối kháng của vi khuẩn CS1b thể hiện qua sự bao phủ hết các vi khuẩn khác trong nhóm vi khuẩn phân lập từ phụ phế phẩm. Trong nhóm phân lập từ đất, tỉ lệ đối kháng của vi khuẩn D9 thể hiện mạnh và rõ ràng thông qua sự bao phủ của D9 trong biểu đồ 3.9. Nhóm vi khuẩn phân lập từ nước thải, Sb. NT 1.4 thể hiện sự đối kháng thông qua biểu đồ 3.10 cho thấy tỉ lệ đối kháng khá mạnh đối với chủng nấm HCP2. So với thí nghiệm của Nystatin với các chủng nấm mốc thì vi khuẩn CS1b có khả năng kháng nấm mốc cao hơn rất nhiêu chiếm khoảng từ 40.00-50.00% còn Nystatin chỉ khoảng 25.00-40.00%. (đồ thị hình 3.8). 58
Đối với vi khuẩn Latobacillus spp.: Hình 3.11: Đối chứng CĐP2 (a) – Nystatin-CĐP2 (b) – LN2-5-CĐP2 (c) – LC1-1-CĐP2 (d) 59
Hình 3.12: Đối chứng ĐN3 (a) – Nystatin-ĐN3 (b) – LN2-5-ĐN3 (c) – LC1-1-ĐN3 (d). 60
Bảng 3.5: Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế của các nhóm vi khuẩn Lactobacillus spp. với nấm mốc theo từng nhóm theo phƣơng pháp cấy 2 đƣờng vi khuẩn. VI KHUẨN ĐN3 ĐN2 CĐP2 CĐP1 HCP2 ĐC(+) 63.49ab±1.37 9.12d±4.34 35.75c±4.18 43.15c±0.00 16.35e±1.09 L5 64.48ab±3.78 28.08ab±4.29 51.06ab±2.58 63.11a±1.21 47.01ab±3.14 NHÓM L6 52.38c±3.14 20.03bc±4.26 43.36bc±4.20 59.78ab±4.45 39.94c±3.03 VK PHÂN LN3-5 60.12b±3.90 9.75d±1.24 22.46c±0.00 48.59c±1.05 25.63d±4.82 LẬP TỪ NEM LN3-7 60.91b±1.37 15.38cd±4.87 38.41c±4.75 55.24b±0.00 21.23de±2.45 LN2-7 64.29ab±1.57 24.86b±3.87 52.05ab±4.87 59.48ab±3.68 43.40bc±1.89 LN2-5 68.75a±1.26 35.95a±2.28 55.07a±4.10 60.49ab±3.42 52.83a±2.67 ĐC(+) 63.49ab±1.37 9.12b±4.34 35.75b±4.18 43.15b±0.00 16.35c±1.09 LC7-7 60.71b±2.73 3.03b±2.17 39.37b±2.41 36.49b±2.77 16.51c±4.03 NHÓM LC6-5 63.29ab±1.24 26.65a±4.34 35.27b±4.32 61.29a±1.60 39.31a±3.57 VK PHÂN LC1-1 64.29ab±0.00 9.47a±2.23 36.47a±4.18 62.10a±4.12 24.06a±4.19 LẬP TỪ CƠM LC3-3 61.31a±2.73 31.84b±4.68 50.60b±4.20 65.32a±0.00 34.91b±4.55 MẺ 61
Bảng 3.6: So sánh tỉ lệ ức chế nấm mốc của 2 vi khuẩn Lactobacillus spp. mạnh nhất trong từ nhóm với nhau theo phƣơng pháp cấy 2 đƣờng vi khuẩn. (dựa theo độ tin cậy 95% của phần mền SAS 9.1) VI KHUẨN ĐN3 ĐN2 CĐP2 CĐP1 HCP2 ĐC(+) 63.49b±1.37 9.12b±4.34 35.75b±4.18 43.15b±0.00 16.35c±1.09 LN2-5 (NHÓM VK PHÂN 68.75a±1.26 35.95a±2.28 55.07a±4.10 60.49a±3.42 52.83a±2.67 LẬP TỪ NEM) LC1-1 b a a a b (NHÓM VK PHÂN 64.29 ±0.00 9.47 ±2.23 36.47 ±4.18 62.10 ±4.12 24.06 ±4.19 LẬP TỪ CƠM MẺ) 62
Hình 3.13: Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế trung bình của nhóm vi khuẩn Lactobacillus spp. đƣợc phân lập từ nem. 63
Hình 3.14: Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế trung bình của nhóm vi khuẩn Lactobacillus spp. đƣợc phân lập từ cơm mẻ. 64
Theo số liệu trên phàn mền ANOVA (phân tích phương sai) cho thấy tỉ lệ ngày thứ 3 là cho tỉ lệ ức chế tốt nhất nhóm nấm mốc Aspergillus spp.thể hiện qua các hình 3.11 và 3.12 với độ tin cậy 95%. Trong đó, vi khuẩn LN2-5 (L3) thuộc nhóm vi khuẩn Lactobacillus spp.phân lập từ nem là có khả năng kháng nấm mốc mạnh nhất và tỉ lệ ức chế nấm cũng đồng đều hơn so với vi khuẩn Lactobacillus spp.khác trong 10 chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. của phòng thí nghiệm thể hiện qua bảng 3.6. Tỉ lệ ức chế của LN2-5 (L3) với các nấm mốc dao động từ khoảng 36.0-67.0%, đối với nấm ĐN3 68.75%, nấm ĐN2 là 35.95%, nấm CĐP1 là 60.49%, nấm CĐP2 là 55.07%, nấm HCP2 là 52.83% được thể hiện rõ qua bảng thống kê số liệu 3.5. Trong từng nhóm phân lập của các chủng Lactobacillus spp.: Nhóm phân lập từ nem, LN2-5 thể hiện sự đối kháng mạnh đối với các chủng nấm mốc thông qua sự bao phủ được biểu hiện qua biểu đồ 3.13. Trong biểu đồ 3.14, vi khuẩn LC1-1 thể hiện tỉ lệ kháng nấm mốc khá cao qua sự bao phủ của nó so với các chủng vi khuẩn khác. Thí nghiệm của Nystatin với các chủng nấm mốc thì vi khuẩn LN2-5 có khả năng kháng nấm mốc cao hơn rất nhiêu chiếm khoảng từ 40.00-75.00% còn Nystatin chỉ khoảng 25.00-40.00%. (đồ thị hình 3.13). Ƣu điểm và nhƣợc điểm của phƣơng pháp đối kháng nấm trực tiếp theo cách cấy 2 đƣờng vi khuẩn: Ưu điểm: Đơn giản, dễ quan sát. Nhược điểm: Khi đặt thạch nấm vào dĩa môi trường phải nhanh nên không bào tử nấm sẽ bay ảnh hưởng đến kết quả Sai số giữa các lần lặp lại trong cùng một nghiệm thức khá cao. 65
3.4. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phƣơng pháp đặt thạch khuếch tán của 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với nấmmốc Aspergillus spp.: Ta có 20 chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. nên ở mỗi ta sẽ sắp xếp chúng theo từng nhóm có nguồn phân lập giống nhau: Đối với vi khuẩn Bacillus spp. ta phân làm 3 nhóm: Nhóm phân lập từ phụ phế phẩm: CS1a, CS1b, CS1+, VK4. Nhóm phân lập từ đất: D9, Paenibacillus. Nhóm phân lập từ nước thải: Sb NT 1.4, Sb NT 1.3, Sb NT 2.3, Sb NT 3.3. Đối với vi khuẩn Lacobacillus spp. ta phân thành 2 nhóm: Nhóm phân lập từ nem: L5, L6, LN3-5, LN3-7, LN2-7, LN 2-5. Nhóm phân lập từ cơm mẻ: LC6-5, LC7-7, LC1-1,LC3-3. Thử nghiệm đối kháng nấm mốc với 2 chủng vi khuẩn ta sử dụng 5 chủng nấm mốc Aspergillus spp. chỉ thị với mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Đối với vi khuẩn Bacillus spp.: Hình 3.15 : Đối chứng ĐN3 (a)- Sb NT 1.4- ĐN3 (b)- Sb NT 3.3- ĐN3 (c). 66
Hình 3.16 : Đối chứng ĐN2 (a)- Sb NT 1.4- ĐN2 (b)- D9- ĐN2 (c). So sánh vòng ức chế nấm mốc giữa các vi khuẩn Bacillus spp.mạnh nhất ở các nhóm với nhau : Hình 3.17: So sánh vòng ức chế giữa các nhóm VK mạnh nhất với nhau Sb NT3.3-HCP2(a)-CS1b-HCP2(b)-D9-HCP2(c). 67
Bảng 3.7 : Thống kê số liệu vòng ức chế của vi khuẩn Bacillus spp. theo từng nhóm đối với nấm mốc trong phƣơng pháp đặt thạch khuếch tán.(dựa theo độ tin cậy 95% của phần mền SAS 9.1) VI KHUẨN ĐN3 ĐN2 CĐP1 CĐP2 HCP2 NHÓM VK4 10.44b±0.77 11.00b±1.73 10.00b±0.00 11.11a±1.08 10.00b±0.00 VK CS1a 13.17ab±1.17 10.91b±0.86 11.50ab±0.60 10.67a±1.15 10.00b±0.00 PHÂN LẬP CS1b 16.61a±3.95 16.67a±2.31 12.83a±1.32 12.94a±1.60 15.44a±2.59 TỪ PHỤ CS1+ 9.56b±2.21 16.06a±3.33 13.06a±1.35 11.11a±1.92 11.67b±1.86 PHẾ PHẨM NHÓM D9 21.33a±2.89 17.83a±0.58 14.11a±1.11 19.11a±4.33 19.72a±2.42 VK PHÂN LẬP Paenibacillus 11.94b±2.31 16.33a±2.74 14.44a±1.17 16.11a±2.81 10.61b±0.54 TỪ ĐẤT NHÓM Sb NT 1.3 14.83b±2.33 14.78a±0.10 12.78a±0.59 12.33a±1.17 12.28a±0.54 VK Sb NT 2.3 10.39b±0.42 10.39c±0.67 11.56ab±1.02 12.06a±0.67 10.00b±0.00 PHÂN LẬP Sb NT 3.3 21.83a±6.64 15.78a±1.35 13.17a±1.45 12.00a±0.93 13.22a±1.86 TỪ b b b a ab NƢỚC Sb NT 1.4 11.06 ±1.08 12.72 ±0.67 10.28 ±0.48 10.83 ±1.44 11.22 ±1.58 THẢI 68
Bảng 3.8 : So sánh vòng ức chế trung bình giữa các vi khuẩn Bacillus spp. mạnh giƣa các nhóm với nhau đối với nấm mốc theo phƣơng pháp đặt thạch khuếch tán.(dựa theo độ tin cậy 95% của phần mền SAS 9.1) VI KHUẨN ĐN3 ĐN2 CĐP1 CĐP2 HCP2 CS1b (NHÓM VK PHÂN a a a b ab LẬP TỪ PHỤ PHẾ 16.61 ±3.95 16.67 ±2.31 12.83 ±1.32 12.94 ±1.60 15.44 ±2.59 PHẨM) D9 a a a a a (NHÓM VK PHÂN 21.33 ±2.89 17.83 ±0.58 14.11 ±1.11 19.11 ±4.33 19.72 ±2.42 LẬP TỪ ĐẤT) Sb NT 3.3 a a a b b (NHÓM VK PHÂN 21.83 ±6.64 15.78 ±1.35 13.17 ±1.45 12.00 ±0.93 13.22 ±1.86 LẬP TỪ NƢỚC THẢI) 69
Hình 3.18: Biểu đồ thể hiện vòng ức chế trung bình nấm mốc của vi khuẩn Bacillus spp. trong nhóm phân lập từ phụ phế phẩm. 70
Hình 3.19 : Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốccủa vi khuẩn Bacillus spp. trong nhóm phân lập từ đất. 71
Hình 3.20 : Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của vi khuẩn Bacillus spp.trong nhóm phân lập từ đất. 72
Phân tích ANOVA (phân tích phương sai) cho thấy vòng ức chế nấm mốc Aspergillus spp. của nhóm vi khuẩn Bacillus spp.thể hiện rõ nhất là vào ngày thứ 3 với độ tin cậy 95%.(xem hình 3.17). Trong số 10 chủng Bacillus spp. do phòng thí nghiệm cung cấp thì D9 thể hiện rõ nhất đường kính vòng ức chế nấm mốc Aspergillus spp.như hình 3.16 và cũng có đường kính vòng ức chế trung bình tương đối đồng đều đối với tất cả các loại nấm mốc như biểu đồ hình 3.19. Số đo đường kính vòng ức chế trung bình của D9 dao động từ khoảng 14,11- 21,33 (mm) như bảng 3.8 đây là số đo vòng ức chế cao nhất trong nhóm vi khuẩn Bacillus spp.phân lập từ đất và cao so với các nhóm vi khuẩn Bacillus spp.còn lại (nhóm vi phân lập từ phụ phế phẩm và nước thải). Trong từng nhóm phân lập Bacillus spp.: Nhóm phân lập từ phụ phế phẩm: CS1b có khả năng kháng nấm mốc cao nhất vì thông qua biểu đô 3.18 cho thấy sự bao phủ của nó so với các vi khuẩn còn lại rộng hơn. Thông qua biểu đồ 3.19, sự bao phủ của vi khuẩn D9 đối với các chủng nấm mốc rộng hơn chủng vi khuẩn Paenibacillus trong nhóm phân lập từ đất. Biểu đồ 3.20 sự bao phủ vòng ức chế đối kháng của vi khuẩn Sb.NT 3.3 khá rộng so với các chủng vi khuẩn còn lại. Số đo vòng ức chế trung bình (mm) của D9 đối với các nhóm nấm mốc Aspergillus spp.như sau (bảng 3.8) : nấm ĐN3 là 21,33 mm, nấm ĐN2 là 17,83mm,nấm CĐP1 là 14.11mm, nấm CĐP2 là 19.11mm và nấm HCP2 là 19.72mm. 73
Đối với vi khuẩn Lactobacillus spp.: Hình 3.21: Đối chứng ĐN3 (a) - LC7-7- ĐN3 (b) - LC1-1- ĐN3 (c). Hình 3.22: Đối chứng CĐP1 (a)- LC7-7- CĐP1 (b)- L5-CĐP1 (c). 74
So sánh vòng ức chế nấm mốc của các vi khuẩn Lactobacillus spp.mạnh nhất ở các nhóm với nhau: Hình 3.23: So sánh vòng ức chế nấm mốcgiữa các nhómvi khuẩn Lactobacillus spp.với nhau LC7-7-HCP2(a)-LC1-1-HCP2(b)-L5-HCP2(c). 75
Bảng 3.9: Thống kê số liệu vòng ức chế nấm mốc của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp.theo từng nhóm trong phƣơng pháp đặt thạch khuếch tán.(dựa theo độ tin cậy 95% của phần mền SAS 9.1) VI KHUẨN ĐN3 ĐN2 CĐP1 CĐP2 HCP2 L5 20.72a±6.01 14.06a±3.70 23.17a±3.33 17.28a±9.89 16.61a±4.32 NHÓM L6 12.00b±0.76 10.78b±0.69 12.78b±1.07 11.39a±0.10 11.67b±1.44 VK PHÂN b b b a ab LN3-5 11.78 ±0.63 12.11 ±0.25 11.78 ±0.42 11.89 ±0.54 13.11 ±1.23 LẬP TỪ LN3-7 12.11b±0.25 11.39b±1.21 14.50b±1.69 12.94a±0.92 11.39b±1.23 NEM LN2-5 14.17b±0.76 13.56ab±0.59 11.89b±0.77 14.50a±0.87 13.44ab±0.51 LN2-7 14.33b±4.19 10.94b±2.06 12.22b±1.84 12.72a±1.06 13.61ab±0.77 LC7-7 12.11ab±0.63 11.78b±0.98 11.61b±0.54 11.22b±0.25 11.67bc±1.44 NHÓM LC6-5 10.17b±0.29 10.44b±0.77 10.00b±0.00 10.00b±0.00 10.11c±0.19 VK PHÂN ab a a a a LC1-1 11.44 ±0.35 18.39 ±6.83 15.94 ±3.38 17.22 ±3.96 16.78 ±3.42 LẬP TỪ LC3-3 12.72a±1.99 11.06ab±0.25 12.83ab±0.44 11.61b±1.46 14.22ab±0.77 CƠM MẺ 76
Bảng 3.10: So sánh số liệu vòng ức chế nấm mốc của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. mạnh nhất trong từng nhóm trong phƣơng pháp đặt thạch khuếch tán. (dựa theo độ tin cậy 95% của phần mền SAS 9.1) VI KHUẨN ĐN3 ĐN2 CĐP1 CĐP2 HCP2 L5 a a a a a (NHÓM VK PHÂN 20.72 ±6.01 14.06 ±3.70 23.17 ±3.33 17.28 ±9.89 16.61 ±4.32 LẬP TỪ NEM) LC1-1 b a a a a (NHÓM VK PHÂN 11.44 ±0.35 18.39 ±6.83 15.94 ±3.38 17.22 ±3.96 16.78 ±3.42 LẬP TỪ CƠM MẺ) 77
Hình 3.24: Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm vi khuẩn Lactobacillus spp. từ nem. 78
Hình 3.25: Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm vi khuẩn Lactobacillus spp. từ cơm mẻ. 79
Xử lí số liệu ANOVA (phân tích phương sai) với độ tin cậy 95% thì kết quả cho thấy đường kính vòng ức chế nấm mốc Aspergillus spp.của nhóm vi khuẩn Lactobacillus spp. thể hiện rõ nhất là vào ngày thứ 3. Trong số 10 chủng Lactobacillus spp.do phòng thí nghiệm cung cấp thì L5 thể hiện rõ nhất đường kính vòng ức chế nấm mốc Aspergillus spp.như hình 3.22 và cũng có vòng ức chế trung bình tương đối đồng đều ở tất cả các loại nấm mốc thể hiện qua độ bao phủ nó đối với các vi khuản khác như biểu đồ hình 3.24. Số đo đường kính vòng ức chế trung bình của L5 dao động từ khoảng 14,06- 20.72 (mm) như bảng 3.10 đây là số đo vòng ức chế cao nhất trong nhóm vi khuẩn phân lập từ nem và cao so với nhóm vi khuẩn lactic còn lại (nhóm vi phân lập từ cơm mẻ ). Số đo vòng ức chế trung bình (mm) của L5 đối với các nhóm nấm mốc Aspergillus spp. như sau (bảng 3.10) : nấm ĐN3 là 20.72 mm, nấm ĐN2 là 14,08mm, nấm CĐP1 là 23.17mm, nấm CĐP2 là 17,28mm và nấm HCP2 là 16,61mm Ƣu điểm và nhƣợc điểm của phƣơng pháp đối kháng trực tiếp theo cách đặt thạch khuếch tán : Ưu điểm : Phương pháp này thấy rõ được vòng ức chế nấm mốc của vi khuẩn. Sai số trong các lần lặp lại của một nghiệm thức tương đối thấp, vì hệ số CV (hệ số biến thiên) trong ANOVA chỉ dao động từ 3-10%. Nấm mốc sau khi tạo huyền phù không bị bay bào tử làm ảnh hưởng kết quả. Nhược điểm : Phức tạp ở bước tạo huyền phù các chủng nấm mốc Aspergillus spp. 80
3.5. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng che phủ theo phƣơng pháp đỗ dĩa của 2 chủng vi khuẩn Bacillus spp.và Lactobacillus spp.với các chủng nấm mốc Aspergillus spp.: Ta có 20 chủng vi khuẩn Bacillus spp.và Lactobacillus spp.nên ở mỗi ta sẽ sắp xếp chúng theo từng nhóm có nguồn phân lập giống nhau: Đối với vi khuẩn Bacillus spp. ta phân làm 3 nhóm: Nhóm phân lập từ phụ phế phẩm: CS1a, CS1b, CS1+, VK4. Nhóm phân lập từ đất: D9, Paenibacillus. Nhóm phân lập từ nước thải: Sb NT 1.4, Sb NT 1.3, Sb NT 2.3, Sb NT 3.3. Đối với vi khuẩn Lacobacillus spp. ta phân thành 2 nhóm: Nhóm phân lập từ nem: L5, L6, LN3-5, LN3-7, LN2-7, LN 2-5. Nhóm phân lập từ cơm mẻ: LC6-5, LC7-7, LC1-1,LC3-3. Thử nghiệm đối kháng nấm mốc với 2 chủng vi khuẩn ta sử dụng 5 chủng nấm mốc Aspergillus spp. chỉ thị với mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. 81
Đối với vi khuẩn Bacillus spp.: Hình 3.26 : Đối chứng HCP2(a) – D9-HCP2(b) – CS1b-HCP2(c) – Sb. NT 3.3-HCP2(d). 82
Hình 3.27 : Đối chứng ĐN3(a) – D9- ĐN3 (b) – CS1b- ĐN3 (c) - Sb. NT 3.3-ĐN3 (d). 83
Bảng 3.11: Thống kê số liệu trung bình ức chế nấm mốc của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. theo từng nhóm trong phƣơng pháp đối kháng che phủ bằng cách đổ dĩa. VI KHUẨN ĐN3 ĐN2 CĐP1 CĐP2 HCP2 NHÓM VK4 40-60.00% 0-30.00% 40-60.00% 0-30.00% 0-30.00% VK CS1a 40-60.00% 0-30.00% 40-60.00% 0-30.00% 40-60.00% PHÂN LẬP TỪ CS1b 40-60.00% 40-60.00% 40-60.00% 70- 70- PHỤ 100.00% 100.00% PHẾ PHẨM CS1+ 40-60.00% 40-60.00% 0-30.00% 40-60.00% 40-60.00% NHÓM D9 40-60.00% 70- 70- 40-60.00% 40-60.00% VK 100.00% 100.00% PHÂN LẬP TỪ Paenibacillus 40-60.00% 40-60.00% 40-60.00% 40-60.00% 0-30.00% ĐẤT NHÓM Sb NT 1.3 40-60.00% 0-30.00% 0-30.00% 40-60.00% 0-30.00% VK Sb NT 2.3 40-60.00% 40-60.00% 0-30.00% 40-60.00% 40-60.00% PHÂN LẬP TỪ Sb NT 3.3 40-60.00% 40-60.00% 40-60.00% 40-60.00% 0-30.00% NƢỚC THẢI Sb NT 1.4 40-60.00% 40-60.00% 40-60.00% 40-60.00% 40-60.00% 84
Bảng 3.12 : Sắp xếp trung bình ức chế giữa các vi khuẩn Bacillus spp. giữa các nhóm với nhau đối với nấm mốc theo phƣơng pháp đối kháng che phủ theo đỗ dĩa. NHÓM VI KHUẨN KHÔNG HOẶC ĐỐI KHÁNG YẾU VK4, CS1a, Sb.NT 3.3, Sb NT 1.3 ĐỐI KHÁNG TRUNG BÌNH Sb NT 1.4, CS1+, Paenibacillus ĐỐI KHÁNG MẠNH CS1b, D9, Sb NT 3.3 Sau khi sắp xếp lại bằng bảng ta thấy được trung bình ức chế thể hiện rõ nhất là ở ngày quan sát kết quả thứ 3, khi đó nấm ở các dĩa đối chứng đã phát triển mạnh nhất đồng thời thể hiện rõ được sự đối kháng của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. Trong đó, vi khuẩn CS1b, D9, Sb N.T 3.3 là các vi khuẩn có sự đối kháng thể hiện rõ nhất và cho thấy được khuẩn lạc rời rạc rõ ràng nhất (hình 3.26 và 3.27). Ngoài ra, CS1b còn thể hiện được sự đối kháng đồng đều ở các chủng nấm mốc Aspergillus spp. khác nhau.( bảng 3.12). 85
Đối với Lactobacillus spp. : Hình 3.31 : Đối chứng CĐP2 (a) – LC1-CĐP2 (b) – L5-CĐP2 (c) – LN2-5- CĐP2 (d). 86
Hình 3.32 : Đối chứng ĐN3 (a) – LC1-ĐN3 (b) – L5-ĐN3 (c) - LN2-5- ĐN3 (d). 87
Bảng 3.13: Thống kê số liệu trung bình ức chế nấm mốc của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. theo từng nhóm trong phƣơng pháp đối kháng che phủ bằng cách đổ dĩa. VI KHUẨN ĐN3 ĐN2 CĐP1 CĐP2 HCP2 L5 0-30.00% 40-60.00% 40-60.00% 40-60.00% 0-30.00% NHÓM L6 0-30.00% 0-30.00% 0-30.00% 0-30.00% 0-30.00% VK PHÂN LN3-5 40-60.00% 40-60.00% 0-30.00% 40-60.00% 40-60.00% LẬP TỪ NEM LN3-7 0-30.00% 40-60.00% 0-30.00% 0-30.00% 0-30.00% LN2-5 70- 70- 70- 40- 70-100.00% 100.00% 100.00% 100.00% 60.00% LN2-7 0-30.00% 40-60.00% 0-30.00% 0-30.00% 0-30.00% LC7-7 0-30.00% 0-30.00% 0-30.00% 0-30.00% 0-30.00% NHÓM LC6-5 0-30.00% 40-60.00% 0-30.00% 0-30.00% 0-30.00% VK PHÂN LC1-1 0-30.00% 40-60.00% 40-60.00% 40- 40-60.00% LẬP TỪ 60.00% CƠM LC3-3 0-30.00% 0-30.00% 0-30.00% 0-30.00% 40-60.00% MẺ 88
Bảng 3.14: Sắp xếp trung bình ức chế giữa các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. trong các nhóm phân lập khác nhau theo phƣơng pháp đối kháng che phủ NHÓM VI KHUẨN L6, LN3-7, LC7-7, LC6-5, KHÔNG HOẶC ĐỐI KHÁNG YẾU LN2-7 ĐỐI KHÁNG TRUNG BÌNH L5, LN3-5, LC1-1, LC3-3 ĐỐI KHÁNG MẠNH LN2-5 Sau khi sắp xêp theo nhóm đối kháng, ta thấy được trung bình ức chế thể hiện rõ nhất là ở ngày quan sát kết quả thứ 3, khi đó nấm ở các dĩa đối chứng đã phát triển mạnh nhất đồng thời thể hiện rõ được sự đối kháng của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp Trong đó, vi khuẩn LN2-5 (L3) là vi khuẩn có sự đối kháng thể hiện rõ nhất và cho thấy được khuẩn lạc rời rạc rõ ràng nhất (hình 3.31 và 3.32). Ngoài ra, vi khuẩn LN2-5 còn thể hiện sự đối kháng mạnh ở chỗ nó đã tăng trưởng lên lớp thạch PDA có chứa nấm, ức chế nấm mốc để chúng không mọc được. Ƣu điểm và nhƣợc điểm của phƣơng pháp đối kháng che phủ theo cách đặt đổ dĩa : Ưu điểm : Có thể nuôi cấy vi sinh vật đặc trưng trên 2 lớp môi trường khác nhau. Vi khuẩn Bacillus spp. trên môi trường NA và vi khuẩn Lactobacillus spp. trên môi trường MRS và sau đó thêm một lớp PDA phía trên. Nhược điểm : 89
Phức tạp ở bước tạo huyền phù các chủng nấm mốc Aspergillus spp. Không thấy rõ được vòng ức chế nấm mốc của vi khuẩn. Khó theo dõi được độ đông của môi trường. 3.6. So sánh các phƣơng pháp đối kháng lại các chủng nấm mốc của 20 chủng vi khuẩn thí nghiệm thông qua cách chấm điểm LSD (sai số khác biệt nhỏ nhất) : Dựa theo xử lí số liệu của ANOVA (phần mềm phân tích phương sai) , ta có thể chấm điểm của các chủng vi khuẩn thí nghiệm theo từng phương pháp đối kháng khác nhau để từ đó tìm ra sự tương đồng của các phương pháp với nhau. Ở đây, ta có 20 chủng vi khuẩn thí nghiệm của 2 nhóm vi khuẩn có lợi là Bacillus spp. và Lactobacillus spp , mỗi chủng có 10 vi khuẩn. Ta có thể chia theo thang điểm 10 tương đương với các thứ hạng (a,b,c ) trong xử lí SAS 9.1. Đối với Bacillus spp. ta có bảng sau : 90
Bảng 3.15 : Thống kê điểm của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. theo từng phƣơng pháp dựa theo xếp hạng LSD. VI KHUẨN TỔNG XẾP ĐN3 ĐN2 CĐP1 CĐP2 HCP2 ĐIỂM HẠNG Nystatin 8.0 8.0 3.0 9.0 8.0 36.0 6 PHƢƠNG VK4 9.0 7.0 4.0 4.0 6.0 30.0 10 CS1a 6.0 6.0 10.0 8.0 8.0 38.0 4 PHÁP ĐỐI CS1b 10.0 10.0 9.0 10.0 10.0 49.0 1 KHÁNG CS1+ 7.0 4.0 10.0 7.0 7.0 35.0 7 TRỰC TIẾP D9 10.0 9.0 7.0 9.0 8.0 43.0 2 (CẤY 2 Paenibacillus 10.0 6.0 7.0 9.0 9.0 41.0 3 Sb NT 1.4 8.0 5.0 6.0 8.0 10.0 37.0 5 ĐƢỜNG VI Sb NT 1.3 7.0 5.0 6.0 5.0 9.0 32.0 9 KHUẨN) Sb NT 2.3 7.0 5.0 5.0 6.0 7.0 30.0 10 Sb NT 3.3 7.0 5.0 6.0 7.0 9.0 34.0 8 VK4 7.0 6.0 8.0 8.0 5.0 34.0 7 PHƢƠNG CS1a 8.0 7.0 8.0 8.0 5.0 36.0 5 CS1b 9.0 8.0 9.0 9.0 9.0 44.0 2 PHÁP ĐỐI CS1+ 8.0 9.0 9.0 8.0 6.0 40.0 4 KHÁNG D9 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 50.0 1 TRỰC TIẾP Paenibacillus 8.0 10.0 10.0 9.0 6.0 43.0 3 (ĐẶT THẠCH Sb NT 1.4 7.0 7.0 8.0 8.0 6.0 36.0 5 Sb NT 1.3 8.0 8.0 9.0 8.0 7.0 40.0 4 KHUẾCH Sb NT 2.3 7.0 7.0 8.0 8.0 5.0 35.0 6 TÁN) Sb NT 3.3 10.0 9.0 9.0 8.0 8.0 44.0 2 VK4 2 1 2 1 1 7.0 5 CS1a 2 1 2 1 2 8.0 4 PHƢƠNG CS1b 2 2 2 3 3 12.0 1 PHÁP ĐỐI CS1+ 2 2 1 2 2 9.0 3 KHÁNG CHE D9 2 3 3 2 2 12.0 1 Paenibacillus 2 2 2 2 2 10.0 2 PHỦ (ĐỖ Sb NT 1.4 2 2 2 2 2 10.0 2 DĨA) Sb NT 1.3 2 1 1 2 1 7.0 5 Sb NT 2.3 2 2 1 2 2 9.0 3 Sb NT 3.3 2 2 2 2 2 10.0 2 91
Đối với Lactobacillus sp ta có bảng sau : Bảng 3.15 : Thống kê điểm của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. theo từng phƣơng pháp dựa theo xếp hạng LSD. VI TỔNG XẾP KHUẨN ĐN3 ĐN2 CĐP1 CĐP2 HCP2 ĐIỂM HẠNG Nystatin 9.0 4.0 6.0 7.0 5.0 31.0 9 PHƢƠNG L5 9.0 9.0 10.0 10.0 9.0 47.0 2 L6 8.0 7.0 9.0 9.0 8.0 41.0 5 PHÁP ĐỐI LC7-7 9.0 5.0 5.0 8.0 5.0 32.0 10 KHÁNG LC6-5 9.0 9.0 10.0 8.0 8.0 44.0 4 TRỰC TIẾP LN3-5 9.0 5.0 7.0 8.0 6.0 35.0 8 LN3-7 9.0 6.0 8.0 8.0 6.0 37.0 7 (CẤY 2 LN2-7 9.0 8.0 9.0 10.0 9.0 45.0 4 ĐƢỜNG VI LN2-5 10.0 10.0 9.0 10.0 10.0 49.0 1 KHUẨN) LC1-1 9.0 10.0 10.0 10.0 7.0 46.0 3 LC3-3 9.0 5.0 10.0 8.0 6.0 38.0 6 L5 10.0 10.0 10.0 10.0 10.0 50.0 1 PHƢƠNG L6 9.0 9.0 8.0 7.0 10.0 43.0 6 LC7-7 9.0 9.0 8.0 8.0 9.0 43.0 6 PHÁP ĐỐI LC6-5 8.0 9.0 7.0 7.0 9.0 40.0 7 KHÁNG LN3-5 9.0 9.0 8.0 8.0 10.0 44.0 5 TRỰC TIẾP LN3-7 9.0 9.0 8.0 9.0 10.0 45.0 4 LN2-7 9.0 9.0 9.0 8.0 10.0 45.0 4 (ĐẶT THẠCH LN2-5 9.0 10.0 9.0 7.0 10.0 45.0 4 KHUẾCH LC1-1 9.0 10.0 10.0 9.0 10.0 48.0 2 TÁN) LC3-3 9.0 10.0 9.0 8.0 10.0 46.0 3 L5 2 2 2 2 2 10.0 2 L6 1 1 1 1 1 5.0 4 PHƢƠNG LC7-7 1 1 1 1 1 5.0 4 PHÁP ĐỐI LC6-5 1 2 1 1 1 6.0 3 LN3-5 2 2 2 2 2 10.0 2 KHÁNG CHE LN3-7 1 2 1 1 1 6.0 3 PHỦ (ĐỖ LN2-7 1 2 1 1 1 6.0 3 DĨA) LN2-5 3 3 3 2 3 14.0 1 LC1-1 2 2 2 2 2 10.0 2 LC3-3 1 1 1 1 2 6.0 3 92
Sau khi xếp hạng theo các phương pháp, ta dùng cách chấm điểm dựa theo sai số khác biệt nhỏ nhất (LSD) trong xử lí số liệu thống kê có độ tin cậy là 95% thì có được thứ hạng của các chủng vi khuẩn : Theo các phương pháp đối kháng trực tiếp cấy 2 đường vi khuẩn thì các vi khuẩn Bacillus spp. có CS1b xếp hạng 1, D9 xếp hạng 2, Paenibacillus xếp hạng 3. Các vi khuẩn Lactobacillus spp. có LN2-5 xếp hạng 1, L5 xếp hạng 2 và LC1-1 xếp hạng 3. Trong phương pháp đối kháng trực tiếp đặt thạch khuếch tán thì các vi khuẩn Bacillus spp. có D9 xếp hạng 1, CS1b và Sb NT 3.3 xếp hạng 2 và Paenibacillus xếp hạng 3. Các vi khuẩn Lactobacillus spp. có L5 xếp hạng 1, LC1-1 hạng 2 và LC 3-3 xếp hạng 3. Trong phương pháp đối kháng che phủ thì các vi khuẩn Bacillus spp. D9 xếp hạng 1, Sb.NT 3.3 xếp hạng 2 và Paenibacillus, Sb NT 1.4 và Sb.NT 2.3 xếp hạng 3.Các vi khuẩn Lactobacillus spp. có LN2-5 xếp hạng 1, LN3-5, L5 và LC1-1 xếp hạng 2 Từ đó, ta thấy được điểm tương đồng giữa các phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn và đặt thạch khuếch tán có sự xếp hạng giữa các vi khuẩn đối kháng nấm mốc. Nhưng trong phương pháp đặt thạch khuếch tán, nó thể hiện đường kính vòng ức chế rõ ràng hơn và có độ sai số không quá khác biệt nên phương pháp đặt thạch khuếch tán là khả quan nhất và thích hợp trong điều kiện phòng thí nghiệm của trường. 93
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận : Hoạt hóa lại các chủng vi khuẩn và các chủng nấm mốc có sẵn trong phòng thí nghiệm. Trong đó, có 3 chủng vi khuẩn CS1a, CS1+, VK4 chưa được định danh sơ bộ trước đó. Và đã được định danh sơ bộ lại bằng sinh lý và sinh hóa để khẳng định lại là chủng Bacillus spp. Trong phƣơng pháp đối kháng trực tiếp bằng cách cấy 2 đƣờng vi khuẩn : Vi khuẩn Bacillus spp. CS1b thể hiện khả năng đối kháng với tất cả các chủng nấm mốc Aspergillus spp. cho tỉ lệ ức chế khá cao từ khoảng 40.00- 53.00% tương ứng với tỉ lệ ức chế các chủng nấm mốc Aspergillus spp. của LN2-5 của các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. là khoảng 36.00-68.00%. Trong phƣơng pháp đối kháng trực tiếp bằng cách đặt thạch khuếch tán: Vi khuẩn Bacillus spp. D9 thể hiện rõ đường kính vòng ức chế đối kháng với các chủng nấm mốc Aspergillus spp. khoảng 14.00-21.00(mm)và cho kết quả rất đồng đều ở các lần lặp lại. Tương tự, đối với các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. L5 đối kháng với các chủng nấm mốc Aspergillus spp. khoảng 15.00-20.00(mm) cũng đạt kết quả vòng ức chế cao và đồng đều. Trong phƣơng pháp đối kháng che phủ bằng cách đỗ dĩa, không thể định lượng chính xác khả năng ức chế, nhưng kết quả không mâu thuẫn với hai phương pháp trên. Theo bảng chấm điểm trên, ta thấy có được nhiều điểm tương đồng của giữa 2 phương pháp đối kháng trực tiếp theo cách cấy 2 đường vi khuẩn (cho thấy tỉ lệ ức chế) và đặt thạch khuếch tán (cho thấy được đường kính vòng ức chế). Còn phương pháp đối kháng che phủ không thể hiện được điểm tương đồng và không định lượng rõ ràng sự ức chế như 2 phương pháp trên. Vì vậy, 2 phương pháp đối kháng trực tiếp là cấy 2 đường vi khuẩn và đặt thạch khuếch tán cho nên được áp dụng trong việc đối kháng nấm mốc trong phòng thí nghiệm của trường. 94
Chủng vi khuẩn CS1b, D9 và LN2-5, LC1-1 cho thấy được khả năng kháng nấm cao có thể ứng dụng thực tế trong việc bảo quản các hạt nông sản như : Sử dụng CS1b để bảo quản hạt đậu phộng, D9 để bảo quản hạt hạt cà phê Sử dụng LN2-5 và LC1-1 để bảo quản hạt đậu phộng. 2. Đề nghị : Kiểm chứng các lại rõ hơn các phương pháp đối kháng được nêu trên bằng cách tăng số lượng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. nhiều hơn và phân lập thêm các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm mốc cao. Bổ sung phương pháp khảo sát khả năng ức chế in vivo va so sánh sự tương quan với các thí nghiệm in vitro . 95
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt: 1.Phan Thị Ngọc Ái (2014) “Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm của vi khuẩn Lactic”. Trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM. 2.Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn (2000). Vi nấm- Dùng trong công nghệ sinh học. NXB Khoa học và Kỹ Thuật Hà Nội, trang 184-188. 3.Văn Hương (2015) “ Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp ứng dụng bảo quả nông sản”. Trường Đại học Công Nghệ TP. HCM. 4.Nguyễn Thị Thúy Hằng “ Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn phân giải lân và kích thích tăng trưởng cây trồng”. Trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM. 5.Nguyễn Đức Lượng (2002). Công nghệ vi sinh vật tập 2 Vi sinh vật học công nghiệp. NXB Đại học Quốc Gia Tp.HCM, trang 33 – 34. 6.Phan Huỳnh Mai Nhi (2015) “Phân lập một số chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng phân hủy protein trong nước thải chế biến thủy sản”. Trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM. 7.Phan Nguyễn Hương Thảo (2015) “Khảo sát khả năng kháng nấm nhiễm thực phẩm Aspergillus Niger và Mucor sp của vi khuẩn Lactobacillus sp L5”. Trường Đâị Học Công Nghệ TP.HCM. Tài liệu Tiếng Anh: 8.Mounyr Balouiri, Moulay Sadiki, Saad Koraichi Ibnsouda .2011. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis: 71-79. 96
9 Nora Laref, Bettache Guessas. 2013. Antifungal activity of newly isolates of lactic acid bacteria. Department of Biology, Faculty of Sciences, Laboratory of Applied microbiology, University of ES- Senia of Oran, Box 16, Es- Senia 31100, Oran, Algeria: 80-88. 10.Ajay Kumar, Pragati Saini, J N Shrivastava. 2009. Prodution of peptide antifungal antibiotic and biocontrol activity of Bacillus subtilis.Indian Jouranal of Experimental Biology: 57-62. 11. K.K .Sharma, U.S. Singh, Pankaj Sharma, Ashish Kummar and Lalan Sharma. 2008. Seed treatments for sustainable agriculture- A review: 521-539. 12.Rositsa Tropcheva, Dilyana Nikolova, Yana Evstatieva, Svetla Danova. 2014. Antifunal activity and indentification of Lactobacilli, inolated from traditional dairy product “katak”.Anaerobe: 78-84. 13.Francesco Vinale, Krishnapillai Sivasithamparam, Emilio L. Ghisalberti, Sheridan L.Woo. 2014. Trichoderma secondary Metabolites Active on Plant and Fungal Pathogens.The Open Mycology Journal (Suppl-1,M5): 127-139. Tài liệu Internet: 13. doc-to-nam-moc-54187/ 14. textbook/fungi-24/characteristics-of-fungi-149/fungi-cell-structure-and-function- 590-11809/ 15. khao-sat-kha-nang-uc-che-san-sinh-aflatoxin-cua-cac-chung-phan-lap-duoc-2475/ 97
16. doi-khang-vi-sinh-vat-gay-benh-cho-cay-trong-cua-cac-chung-nam-soi-phan-lap- 42864/ 17. khang-vi-sinh-vat-gay-benh-cho-cay-trong-cua-cac-chung-nam-soi-phan-lap-tu- rung-42467/ 18. thuc-pham-24205/ 19. nam-gay-benh-cay-va-nam-sinh-doc-to-afelatoxin-cua-san-pham-chiet-xuat-tu- xoan-chiu-han-20334/ 20. 21. hoat-chat-metalaxyl-trong-phong-tru-benh-hai-cay-trong.html 22. nhom-thuoc-tru-benh.aspx 23. cua-hoat-chat-mancozeb-trong-phong-tru-dich-hai-cay-trong.html 98
PHỤ LỤC THÀNH PHẨN MÔI TRƢỜNG Thành phần môi trường PDA: (Potato Dextrose Agar): Khoai tấy 200g D-Glucose 20g Agar 1% Nước cất 1000ml Thành phần môi trường NA: Pepton 5g Cao thịt 3g NaCl 5g Agar 20g Nước cất 1000ml Thành phần môi trường NB: Pepton 5g Cao thịt 3g NaCl 5g Nước cất 1000ml Thành phần môi trường MRS agar: Tween 80 1ml Cao thịt 10g Pepton 5g Yest Extract 5g D-glucose 10g Diamonium Citrate 2g MgSO4.7H2O 0.2g MgSO4.4H2O 0.2g K2PO4 2g Nước cất 1000ml 1
Agar 2% Thành phần môi trường MRS Broth: Tween 80 1ml Cao thịt 10g Pepton 5g Yest Extract 5g D-glucose 10g Diamonium Citrate 2g MgSO4.7H2O 0.2g MgSO4.4H2O 0.2g K2PO4 2g Nước cất 1000ml Thành phần môi trường MRS Cải tiến: Tween 80 1ml Cao thịt 10g Pepton 5g Yest Extract 5g D-glucose 10g MgSO4.7H2O 0.2g MgSO4.4H2O 0.2g K2PO4 2g Nước cất 1000ml Agar 2% Thành phần nước muối sinh lí 85%: NaCl 8.5g Tween 80 1ml Nước cất 1000ml 2
PHỤ LỤC A Đặc điểm sinh lý- sinh hóa của vi sinh vật CÁC CHỦNG LACTOBACILLUS SP: Trích từ đồ án “ Phân lập vi khuẩn Lactic có nguồn gốc từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng nấm”- Lưu Đại Kim Phượng (2016). Kí hiệu Quan sát Quan sát Thử nghiệm Thử nghiệm lên men chủng khuẩn lạc nhuộm Gram di động đƣờng phân lập LN2-5 LN2-7 LN3-5 3
LC1-1 LC3-3 LC7-7 LC6-5 4
LN3-7 Kí hiệu Quan sát nhuộm Thử Thử nghiệm lên men đƣờng chủng phân Gram nghiệm di lập động L5 L6 (Trích từ đồ án” Khảo sát khả năng kháng nấm nhiễm thực phẩm Aspergillus Niger và Mucor sp của vi khuẩn Lactobacillus sp L5”) 5
CÁC CHỦNG BACILLUS SPP.: Kí hiệu chủng Quan sát nhuộm Quan sát nhuộm Thử Thử nghiệm phân lập Gram bào tử nghiệm Catalase di động D9(Trích từ đồ án: “Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn phân giải lân và khhh thích tăng trưởng cây trồng”- Nguyễn Thị Thúy Hằng) Paenibacillus (Trích từ đồ án:” Nghiên + + cứu sản xuất phân bón vi sinh cố định đạm”-Phạm Ngọc Yến Trinh) -2015 Sb. NT 1.3(Trích từ đồ án: “Phân + + lập một số chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng phân hủy protein trong nước thải chế biến thủy sản”- Nguyễn Huỳnh Mai Nhi)-2015 6
Sb. NT 1.4(Trích + + Nguyễn Huỳnh Mai Nhi)-2015 Sb. NT 2.3(Trích + + Nguyễn Huỳnh Mai Nhi)-2015 Sb. NT 3.3(Trích + + Nguyễn Huỳnh Mai Nhi)-2015 CS1b (Trích từ đề tài: “Phân lập tuyển chọn vi + + khuẩn Bacillus spp. ứng dụng trong bảo quản nông sản)- Eureka Văn Hương) 7
CS1+ + + CS1a + + VK4 + + 8
PHỤ LỤC B Hình ảnh các phƣơng pháp đối kháng nấm mốc Aspergillus sp. của các chủng vi khuẩn PHƢƠNG PHÁP ĐỐI KHÁNG TRỰC TIẾP (CẤY RIA 2 ĐƢỜNG VI KHUẨN): Từ trái sang phải: Đối chứng CĐP1 (a)-Nystatin- CĐP1 (b)-Paenibacillus- CĐP1(c). Đối chứng CĐP2(a)- Nystatin-CĐP2 (b)-CS1b-CĐP2(c). Từ trái sang phải:Đối chứng ĐN3(a)- Nystatin- ĐN3(b)-CS1b-ĐN3(c). Đối chứng ĐN2 (a)- Nystatin- ĐN2(b)-Sb NT 1.4-ĐN2(cHình: Đối chứng HCP2(a)-Nystatin- HCP2(b)-CS1b-HCP2(c). 9
Hình từ trái sang phải: Đối chứng CĐP1(a)- Nystatin-CĐP1(b) -LN2-5- CĐP1(c).Đối chứng CĐP2(a)- Nystatin-CĐP2(b) –LC1-1-CĐP2(c). Từ trái sang phải: Đối chứng ĐN3(a)-Nystatin-ĐN3(b)- LN2-5-ĐN3 (c). Đối chứng ĐN2 (a)- Nystatin ĐN2 (b) –LC1-1-ĐN2(c).Đối chứng HCP2 (a)- Nystatin- HCP2(b) -LN2-5-HCP2(c). 10
PHƢƠNG PHÁP ĐỐI KHÁNG TRỰC TIẾP (ĐẶT THẠCH KHUẾCH TÁN): Từ trái sang phải: Đối chứng ĐN3 (a)- Sb NT 1.4- ĐN3 (b)- Sb NT 3.3- ĐN3 (c). Đối chứng ĐN2 (a)- Sb NT 1.4- ĐN2 (b)- D9- ĐN2 (c). Từ trái sang phải: Đối chứng CĐP1 (a)- Sb NT 1.4- CĐP1 (b)- D9- CĐP1 (c). Đối chứng CĐP2 (a)- Sb NT 1.4- CĐP2 (b)- CS1b- CĐP2 (c). Từ trai sang phải: Đối chứng ĐN3 (a)- LC7-7- ĐN3 (b)- L5- ĐN3 (c)- Đối chứng CĐP1 (a)- LC7-7- CĐP1 (b)- L5-CĐP1 (c). 11
Từ trái sang phải: Đối chứng CĐP2 (a)- LC7-7- CĐP2 (b)- L5- CĐP2 (c)- Đối chứng HCP2 (a)- LC7-7-HCP2 (b)- L5-HCP2 (c). PHƢƠNG PHÁP ĐỐI KHÁNG CHE PHỦ (ĐỖ DĨA): Từ trái sang: Đối chứng CĐP1 (a)- CS1b-CĐP1(b)-D9-CĐP1 (c)-Sb NT3.3-CS1b (d)- Đối chứng ĐN2 (a)-CS1b-ĐN2 (b)- D9-ĐN2 (c)-Sb.NT3.3-ĐN2 (d). 12
Từ trái sang phải: Đối chứng ĐN2(a)-C1-ĐN2(b)-L5-ĐN2(c)-LN2-5-ĐN2(d)- Đối chứng CĐP1(a)- C1-CĐP1(b)-L5-CĐP1(c)-LN2-5-CĐP1(d). 13
PHỤ LỤC C Xử lí số liệu thông qua phần mềm SAS 9.1 PHƢƠNG PHÁP ĐỐI KHÁNG TRỰC TIẾP (CẤY 2 ĐƢỜNG VI KHUẨN): KẾT QUẢ 3 NGÀY DN3: TI LE UC CHE NAM DN3 21:09 Thursday, July 23, 2016 10 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values DN3 11 1 10 2 3 4 5 6 7 8 9 DCNYSTAT Number of Observations Read 33 Number of Observations Used 33 TI LE UC CHE NAM DN3 21:09 Thursday, July 23, 2016 11 The ANOVA Procedure Dependent Variable: TILEKHANG Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 10 4725.825764 472.582576 27.65 F DN3 10 4725.825764 472.582576 27.65 <.0001 TI LE UC CHE NAM DN3 21:09 Thursday, July 23, 2016 12 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for TILEKHANG 14
NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 22 Error Mean Square 17.09133 Critical Value of t 2.07387 Least Significant Difference 7.0004 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N DN3 A 44.583 3 5 (D9) A B A 40.760 3 4 (CS1b) B A B A 40.757 3 8 (Paenibacillus) B A B A C 38.910 3 1 (VK4) B C B D C 36.300 3 7 (NT 1.4) D C D C 32.797 3 DCNYSTAT D D 31.207 3 6 (NT 3.3) D D 29.933 3 9 (NT 2.3) E 21.330 3 10 (NT 1.3) E E 16.710 3 3 (CS1+) F 2.540 3 2 (CS1a 15
DN2: TI LE UC CHE NAM DN2 21:09 Thursday, July 23, 2016 13 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values DN2 11 1 10 2 3 4 5 6 7 8 9 DCNYSTAT Number of Observations Read 33 Number of Observations Used 33 TI LE UC CHE NAM DN2 21:09 Thursday, July 23, 2016 14 The ANOVA Procedure Dependent Variable: TILEKHANG Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 10 2954.889655 295.488965 29.16 F DN2 10 2954.889655 295.488965 29.16 <.0001 TI LE UC CHE NAM DN2 21:09 Thursday, July 23, 2016 15 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for TILEKHANG NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate. Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 22 16