Đồ án Sản xuất phân bón lá từ phụ phế phẩm nông nghiệp

Nội dung text: Đồ án Sản xuất phân bón lá từ phụ phế phẩm nông nghiệp

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP SẢN XUẤT PHÂN BÓN LÁ TỪ PHỤ PHẾ PHẨM NÔNG NGHIỆP Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn :TS.NGUYỄN THỊ HAI Sinh viên thực hiện :ĐỖ THÀNH KỲ MSSV: 1311100375 Lớp: 13DSH06 TP. Hồ Chí Minh, 2017
2. LỜI CAM ĐOAN Nhóm sinh viên xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của mình. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nhóm sinh viên xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Đồ án này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Đồ án đã được chỉ rõ nguồn gốc. Sinh viên thực hiện Đồ án i
3. LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên của Đồ án tốt nghiệp này em xin trân trọng gửi đến quý Thầy Cô lời cảm ơn chân thành nhất! Trong suốt thời gian học tập tại trường, dưới sự dìu đắt tận tình của các thầy cô khoa Công nghệ sinh học thực phẩm và môi trường các khoa khác của trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM đã truyền đạt cho em những kiến thức, những kinh nghiệm quý báu trong chuyên môn cũng như trong nhiều lĩnh vực khác. Sự tận tụy, say mê, lòng nhân ái nhiệt thành của quý thầy cô là động lực giúp em cố gắng trau dồi thêm kiến thức và vượt qua những khó khăn trong học tập. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô TS.Nguyễn Thị Hai đã tận tình hướng dẫn, gúp đỡ em hoàn thành Đồ án tốt nghiệp này. Sau cùng em xin cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện thuận lợi và là chỗ dựa cho em trong suốt những năm dài học tập. Đồng thời cũng xin cảm ơn đến tất cả bạn bè đã gắn bó cùng nhau học tập và giúp đỡ nhau trong suốt thời gian qua, cũng như trong suốt quá trình thực hiện Đồ án này. ii
4. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài 2. Tình hình nghiên cứu 2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước về sử dụng enzyme bromelin trong thủy phân protein 2.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước về sử dụng enzym bromelin trong thủy phân protein 2.3. Một số nghiên cứu về sử dụng phân bón trên cây trồng 3. Mục đích nghiên cứu 4. Phương pháp nghiên cứu 4.1. Phương pháp tổng hợp tài liệu 4.2. Phương pháp thu thập và xử lí số liệu 5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 6. Kết quả đạt được 7. Ý nghĩa đề tài 8. Kết cấu đồ án CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÁ TRA 1.1.1. Đặc điểm sinh học cá tra 1.1.2. Thành phần hóa học của cá tra 1.1.3. Tình hình nuôi cá trong nước 1.2. Giới thiệu về cây dứa i
5. 1.3. Giới thiệu enzym Bromelin 1.4. Nghiên cứu ngoài nước về sử dụng enzym trong thủy phân protein 1.5. Nghiên cứu trong nước về sử dụng enzym trong thủy phân protein 1.5.1. Quá trình thủy phân cá 1.5.2. Các hệ enzym tham gia phân giải 1.5.3. Sự tham gia của vi sinh vật trong quá trình phân giải 1.5.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân cá 1.6. Tình hình xuât khẩu rau quả ở Việt Nam 1.6.1. Giới thiệu về cây cải xanh 1.6.2. Một số nghiên cứu về sử dụng phân bón trên cây trồng CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Dụng cụ và thiết bị 2.1.2. Hóa chất 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Xác định đạm tổng số bằng phương pháp kjeldahl 2.2.1.1. Vô cơ hóa 2.2.1.2. Phương pháp kjeldahl 2.2.2. Xác định đạm formol bằng phương pháp sorensen 2.2.3. Xác định hoạt tính enzym bromelin bằng phương pháp anson cải tiến 2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.3.1. Khảo sát quá trình thủy phân phụ phế phẩm cá tra bằng enzym bromelin trong dứa. 2.3.2. Xác định hoạt tính enzym bromelin có trong các thành phần của cây dứa ii
6. 2.3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dứa đến quá trình thủy phân phụ phế phẩm cá tra. 2.3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu (dứa,cá) và nước đến quá trình thủy phân. 2.3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân phụ phế phẩm cá tra 2.3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân phụ phế phẩm cá tra bằng enzym bromelin trong phế phẩm dứa 2.3.2.5. Ổn định dung dịch thủy phân bằng rỉ đường 2.3.3. Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá cho cây cải xanh trồng ngoài dồng . CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PHỤ PHẾ PHẨM CÁ TRA BẰNG ENZYM BROMELIN TRONG DỨA 3.1.1. Xác định hoạt tính enzym bromelin có trong các thành phần của quả dứa 3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dứa đến quá trình thủy phân phụ phế phẩm cá tra 3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu (dứa,cá) và nước đến quá trình thủy phân iii
7. 3.1.4. KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA pH ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PHỤ PHẾ PHẨM CÁ TRA. 3.1.5. KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN THỦY PHÂN PHỤ PHẾ PHẨM CÁ TRA BẰNG ENZYM BROMELIN TRONG PHẾ PHẨM DỨA . . 3.1.6. ỔN ĐỊNH DUNG DỊCH THỦY PHÂN BẰNG RỈ ĐƯỜNG 3.2. KHẢO NGHIỆM CHẾ PHẨM PHÂN BÓN LÁ TỪ PHỤ PHẨM CÁ TRA CHO RAU CẢI NGOÀI ĐỒNG RUỘNG. 3.2.1. Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá cho cải xanh trồng ngoài đồng . 3.2.1.1. Cải ươm 3.2.1.2. Cải trồng ngày 6 3.2.1.3. Cải trồng ngày 10 3.2.1.4. Cải trồng ngày 17 3.2.1.5. Cải thu hoạch ngày 30 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận 4.2. Đề nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv
8. DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT NT Nghiệm thức ĐC Đối chứng TN Thí nghiệm DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên Trang 1.1 Thành phần dinh dưỡng trên 100g thành phẩm ăn được 12 1.2 Tình hình xuất khẩu rau quả của Việt Nam 24 3.1 Kết quả phân tích nguyên liệu đầu vào (%) 43 3.2 Hoạt tính enzym bromelin có trong các thành phần của quả 43 dứa 3.3 Kết quả N tổng số (g/l), N formol (g/l) qua 3,5 và 7 ngày ủ 44 3.4 Kết quả tỷ lệ (%) N formol trên N tổng số sau 3,5 và 7 ngày ủ 46 3.5 Kết quả N tổng số và N formol trên số gam phế phẩm cá 3.6 Tỷ lệ N formol/ N tổng số (g/l) qua 3,6 và 9 ngày 3.7 Hàm lượng N tổng số và N formol của tỷ lệ mẫu và nước sau 5 và 9 ngày ủ 3.8 Tỷ lệ N formol/ N tổng số (g/l) qua 5 và 9 ngày 3.9 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân protein cá Tra 3.10 ác định liều lượng rỉ đường bổ sung vào dịch thủy phân. 3.11 Ảnh hưởng của phân bón lá đến chiều cao của cây cải 3.12 Ảnh hưởng của phân bón lá đến số lá rau cải 3.13 Ảnh hưởng của chế phẩm phân bón lá đến năng suất v
9. DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ Tên Trang 3.1 Lượng N formol (g/l) qua 3,5 và 7 ngày ủ 3.2 Tỷ lệ lượng N formol trên N tổng số sau 3,5 va 7 ngày ủ 3.3 Kết quả N formol trên số gam phế phẩm cá 3.4 Tỷ lệ N formol/N tổng số (g/l) qua 3,6 và 9 ngày 3.5 Hàm lượng N formol của tỷ lệ mẫu và nước sau 5 và 9 ngày ủ 3.6 Tỷ lệ N formol/N tổng số (g/l) qua 5 và 9 ngày 3.7 Lượng N formol và N tổng số (g/l) qua 3,6,9,12 và 15 ngày 3.8 Tỷ lệ N formol trên N tổng số (%) qua 3,6,9,12 và 15 ngày 3.9 Kết quả liều lượng rỉ đường bổ sung vào dịch thủy phân 3.10 Biểu hiện ảnh hưởng đến chiều cao của cây cải trong quá trình phun xịt 3.11 Biểu hiện ảnh hưởng đến số lá của cây cải trong quá trình phun xịt 3.12 Biểu hiện khối lượng trung bình của cây cải sau thu hoạch 3.13 Biểu hiện trọng lượng của cải trong 1m2 3.14 Hình 3.14: Cây cải được 10 ngày tuổi (A: phun nước; B: phun dịch chiết thô 2%; C: phun chế phẩm 2%; D: phun phân bón Sen Trắng 2%) 3.15 nh 3.15: Cây cải được 17 ngày tuổi (A: phun nước; B: phun dịch chiết thô 2%; C: phun chế phẩm 2%; D: phun phân bón Sen Trắng 2%) 3.16 Hình 3.16: Cây cải được 30 ngày tuổi (A: phun nước; B: phun dịch chiết thô 2%; C: phun chế phẩm 2%; D: phun phân bón Sen Trắng 2%) vi
10. MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Trong những năm gần đây ngành thủy sản ở nước ta ngày càng phát triển mạnh mẽ. Năm 2016 diện tích nuôi cá tra thương phẩm đạt 4.552 ha, sản lượng đạt 1,047 triệu tấn (tăng 9% so với 2015). So với cùng kỳ 2015, mặc dù số lượng giống thả nuôi giảm -11,1%, diện tích thả nuôi tăng 3,1%, nhưng sản lượng tăng 8,9% so với cùng kỳ năm 2015. Ước tổng giá trị xuất khẩu năm 2016 đạt 1,67 tỷ USD, tăng 6,6% so với năm 2015. Vùng nuôi cá tra tập trung ở các tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Vĩnh Long, Bến Tre, Sóc Trăng, Tiền Giang, Hậu Giang và Trà Vinh. Theo ước tính, phần phụ phẩm của cá Tra trong chế biến philê chiếm đến từ 65 - 70% tổng khối lượng cá. Điều này đồng nghĩa với việc phát sinh một lượng phụ phẩm rất lớn khoảng 700.000 - 800.000 tấn gồm đầu, xương, ruột, vi cá Đây là nguồn chất thải có nguy cơ gây ô nhiễm môi trường rất lớn nếu không có biện pháp xử lý thích hợp. Nếu biết cách xử lý với công nghệ phù hợp thì chúng ta có thể thu được một lượng lớn nguồn đạm dễ hấp thu có giá trị nhằm sản xuất phân bón lá phục vụ trong sản xuất nông nghiệp. Hiện nay thì phương pháp xử lý nguồn phụ phẩm cá bằng các biện pháp sinh học đang rất được quan tâm, đặc biệt là sử dụng enzym thủy phân để tạo ra những sản phẩm có nhiều công dụng như làm phân bón lá (Phạm Đình Dũng và Trần Văn Lâm, 2013). Việc sử dụng các enzym protease để thủy phân protein phụ phẩm cá đã được ứng dụng rất phổ biến trên thế giới do những ưu điểm là rút ngắn được thời gian thủy phân và tận dụng được các nguồn phụ phẩm của cá. Dứa là một trong những cây ăn trái quan trọng trên thế giới đứng thứ ba sau chuối và cây có múi, dứa tiêu thụ chủ yếu qua chế biến và ăn tươi. Ở Việt Nam, dứa được trồng ở khắp nơi, Chỉ tính riêng ở huyện Tiên Phước, tỉnh Tiền Giang diện tích dứa với hơn 15.000 ha, sản lượng khoảng 250 ngàn tấn/năm (Trung tâm xúc tiến thương mại tỉnh Tiền Giang). Còn ở miền Bắc, vùng dứa Đồng Dao và vùng dứa Lào Cai với tổng 1
11. diện tích khoảng 5000 ha với sản lượng 70 ngàn tấn/ năm được coi là đáng kể để cung cấp nguyên liệu cho các nhà máy chế biến. Huyện Đồng Giáo, tỉnh Ninh Bình, dứa cũng được trồng khá phổ biến với sản lượng ước tính 47.000 tấn/námThế nhưng, 50% sản lượng của 2 vùng dứa này được ghi nhận chỉ có thể đáp ứng khoảng 50% nhu cầu cho chế biến xuất khẩu, số còn lại phục vụ tiêu thụ tươi trong nước. Như vậy, sản lượng dứa của Việt Nam hàng năm > 300.000 tấn, chủ yếu phục vụ ăn tươi và chế biến xuất khẩu. Lượng phế phẩm của dứa chiếm hơn 30% sản lượng dứa. Khảo sát 2 giống dứa trồng phổ biến ở Việt Nam là giống Queen và gióng Cayenne, Nguyễn Thị Cẩm Vi (2011), cho biết, enzyme bromelain một loại enzyme protease có mặt ở hầu hết các bộ phận của trái dứa như: vỏ, lá, chồi, cuống, lõi và thịt quả. Như vậy, khi sử dụng trái dứa để chế biến và ăn tươi, chúng ta đã bỏ phí một lượng rất lớn enzyme bromelain nếu sử dụng lượng enzyme này để thuỷ phân phụ phế phẩm từ ngành chế biến cá tra không những giúp làm giảm ô nhiễm môi trường mà còn tạo ra được một lượng phân hữu cơ quý giá phục vụ cho nền sản xuất nông nghiệp sạch của nước nhà. Đó là lý do để nhóm sinh viên thực hiện đề tài “Sản xuất phân bón lá từ phụ phế phẩm chế biến cá tra và dứa đóng hộp”. 2. Tình hình nghiên cứu 2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước về sử dụng enzyme bromelin trong thủy phân protein Theo Nguyễn Thị Nếp (2005), tỷ lệ enzym protease từ Bacillus subtilis S5 sử dụng để thủy phân với cơ chất là phụ phẩm đầu xương cá tra đạt hiệu quả cao là 2,5 ÷ 3 %, nhiệt độ thủy phân thích hợp là 50 0C, pH = 8,0 và trong thời gian là 10 giờ, hiệu suất thủy phân cao nhất là 25,68 %. Theo Đặng Thị Mộng Quyên (2006) và Trần Thị Xô (2006), để thủy phân cá phèn, cá ngân dạng cá phế liệu thu được sau công đoạn fillet bằng phương pháp thủy phân kết hợp, thủy phân bằng enzym trước, thủy phân bằng acid sau. 2
12. Trong đó, sử dụng chế phẩm enzym protease từ vi khuẩn B. subtilis C10. Kết quả với điều kiện thủy phân bằng enzym: tỷ lệ muối 3%, tỷ lệ dịch chiết enzym 20 % (dạng lỏng), tỷ lệ nước 30 %, nhiệt độ 50 0C, điều kiện thủy phân bằng acid: tỷ lệ muối 3 %, nhiệt độ thủy phân 90 0C, thể tích HCl 7N là 20 %, trung hòa bằng Na2CO3 20 % cho hiệu quả thủy phân cao. Dịch đạm thu được có hàm lượng đạm tổng số 39 g/l, đạm formol 21,6 g/l, đạm amoniac 3,95 g/l. Dương Thị Hương Giang (2006), sử dụng enzym papain thô ly trích trực tiếp từ mủ đu đủ để thủy phân bánh dầu đậu nành tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao ứng dụng trong chăn nuôi. Kết quả thí nghiệm cho thấy điều kiện tối ưu cho enzym papain trên cơ chất bánh dầu đậu nành là nhiệt độ 55oC và pH 7,0. Với tỉ lệ enzym:cơ chất là 0,75:100 (w:w), hoạt tính đặc hiệu của enzim là 91,12 TU/mg, thời gian thủy phân là 24 giờ cho hiệu suất thủy phân cao nhất 11,8%. Lê Công Toàn (2007), phối trộn phế phẩm cá và mùn cưa theo các tỷ lệ 4 cá : 1 mùn cưa; 3 cá : 1 mùn cưa và 9 cá : 4 mùn cưa sau đó phun chế phẩm PMET vào các mẫu đã phối trộn với liều lượng 1 lít/m3 và đem ủ kị khí. Trong quá trình ủ có đảo trộn và phun PMET định kỳ. Kết quả cho thấy các mẫu phân phối rộng theo tỷ lệ 3 : 1 và 9 : 4 đều đạt tiêu chuẩn quy định trong sản xuất phân bón về hàm lượng chất hữu cơ và axit humic. Tuy nhiên cũng có một vài chất không đạt như hàm lượng kali vì vậy các tác giả khuyến cáo cần bổ sung thêm chất này trong quá trình ủ phân. Võ Thị Hạnh đã nghiên cứu chế phẩm sinh học từ trùn quế để làm thức ăn cho gia súc, gia cầm, làm phân bón cho cây Một ưu điểm nổi trội của các chế phẩm này là vẫn giữ nguyên mùi trùn tươi, các chất dinh dưỡng không bị mất đi hoặc biến chất theo thời gian. Chế phẩm BIO-BL, đã được dùng để bón cho cây trà ô long và một số cây hoa màu, cây kiểng Kết quả sau khi sử dụng cho thấy búp trà tươi, màu sắc đẹp hơn, mùi hương của trà cũng thơm hơn. BIO-BL được tạo thành từ trùn quế tươi phối trộn với hỗn hợp vi sinh vật hữu ích và enzym 3
13. dùng trong trồng trọt, lên men tạo sản phẩm có mùi trùn, giàu đạm protein và amin cao, enzym tiêu hóa có hoạt lực cao, vi khuẩn có lợi. Nhóm tác giả cho biết ưu điểm của phương pháp chế biến trùn quế bằng công nghệ vi sinh là không cần dùng thiết bị đông lạnh hay thiết bị sấy nên không tốn chi phí điện, năng lượng, đem lại hiệu quả kinh tế cao. Với công nghệ đơn giản, các hộ nông dân ở các vùng xa xôi có thể áp dụng dễ dàng. Việc có thêm các chế phẩm sinh học mới có giá thành rẻ góp phần làm cho ngành chăn nuôi, nuôi trồng thủy sản và trồng trọt phát triển tốt hơn. Hiện nay, để xử lý các loại phế phẩm nông nghiệp, rác thải sinh hoạt thì có các chế phẩm như BIMA (Trichoderma), Active cleaner (xạ khuẩn Streptomyces sp., nấm Trichoderma sp., vi khuẩn Bacillus sp.) được sử dụng để ủ phân gia súc, chất thải hũu cơ như rơm, rạ, rác thải sinh hoạt hữu cơ (đã tách riêng rác vô cơ). Việc sử dụng chế phẩm có thể giúp rút ngắn thời gian ủ hoai phân chuồng, phân xanh, rác từ 2 - 3 lần so với cách ủ thông thường. Trung tâm công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh đã tạo 4 loại phân bón: Bio trùn quế 01; Bio trùn quế 02; Bio trùn quế 03 và Bio trùn quế 04 có thành phần chủ yếu là dịch chiết từ trùn quế tươi với hàm lượng axit amin cao (Aspartic acid – 2.000 ppm; Leucine – 1.200 ppm; Alanine – 1.000 ppm; Glutamic acid – 1.000 ppm; Valine – 800 ppm). Ngoài ra còn chứa một số nguyên tố đa lượng và vi lượng cần thiết. Đa lượng: N – 5.0 %; P – 1.0 %; K – 3.0 %. Vi lượng: B – 200 ppm; Zn – 200 ppm; Mg – 120 ppm; Ca – 120 ppm; Fe – 100 ppm. Chúng có tác dụng kích thích tăng trưởng, ra hoa và tăng tỷ lệ đậu trái. 2.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước về sử dụng enzym bromelin trong thủy phân protein Trong những năm gần đây, có nhiều nghiên cứu để thủy phân phụ, phế phẩm từ ngành thủy sản tạo ra sản phẩm hữu ích. Trong đó có hai nhóm phương 4
14. pháp chính là phương pháp hóa học và phương pháp sinh học. Phương pháp sinh học chủ yếu là dùng các enzym protease để thủy phân. Nguồn protease có thể từ động vật, thực vật và vi sinh vật. Bromelin là tên gọi chung cho nhóm enzym thực vật chứa nhóm sulfhydryl, có khả năng phân giải protein được thu nhận từ họ Bromeliaceae đặc biệt là ở cây dứa (Ananas comusus L.). Bromelin chiếm 50% protein trong quả dứa, có khả năng thủy phân mạnh và hoạt động tốt ở pH từ 5 – 8. Bromelin có trọng lượng phân tử 33kdalton, có tâm hoạt động chứa cystein với cầu nối S-S giữa 2 sợi peptid với nhau. Bromelin hoạt động ở nhiệt độ từ 45 – 650C và mất hoạt tính ở 700 C, biên độ pH từ 3 –9 tùy thuộc vào loại cơ chất. Các chất có tác dụng hoạt hóa bromelin gồm cystein, muối bisulfite, NaCN, H2S, Na2S và benzoate. Bromelin trong quả xanh có hoạt tính phân giải casein cao nhất, kế đến là trong quả chín và cuối cùng là bromelin trong thân. Đây là enzym được sử dụng nhiều trong ngành công nghiệp chế biến thực phẩm như giúp làm mềm thịt, làm rượu bia, thủy phân các nguồn protein khác nhau để thu hồi sản phẩm hòa tan là các axit amin có giá trị dinh dưỡng cao. Giống như các cấu trúc sinh học khác, bromelin chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố như: cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzym, nhiệt độ, pH Trên những loại cơ chất khá nhau thì bromelin có hoạt tính khác nhau. Đối với cơ chất tổng hợp như BAA (Benzoyl-L-Arginine amide), BAEE (Benzoyl-L-Arginine ethyl ester) thì khả năng thủy phân của bromelin yếu hơn papain. 2.3. Một số nghiên cứu về sử dụng phân bón trên cây trồng Theo Neri (2002), phun phân bón lá có các thành phần hữu cơ hoặc axit humic giúp duy trì khả năng phát triển của cây ở giai đoạn cuối của quá trình sinh trưởng. Axit humic thể hiện vai trò quan trọng trong việc kích thích sự hình thành và tích lũy các sắc tố trong lá, tích lũy lượng diệp lục tố cao hơn và làm lá xanh hơn (Hancock, 1999). Nghiên cứu sử dụng phân bón lá chiết xuất từ rong biển 5
15. (seaweed) của nhiều tác giả cho thấy: phun seaweed làm tăng năng suất thực thu của đậu đỗ lên trung bình khoảng 24% (Temple, 1989), cho thời gian thu trái sớm hơn ở dưa leo trồng trong nhà kính (Passam và ctv, 1995), tăng tổng khối lượng tươi của trái cà chua trồng trong nhà kính lên 17% (Crouch và Van Staden, 1992). Nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả Chen và Aviad, 1990; Fagbenro và Agboole, 1993 đều cho thấy phun các chế phẩm chứa axit humic giúp cây tăng khả năng hấp thu các nguyên tố đa và vi lượng. Theo Gopi (2005), việc xử lý Triazole đã làm tăng sự phát triển của bộ rễ ở dưa leo và từ đó làm tăng lượng Cytokinin nội sinh. Lượng Cytokinin nội sinh tăng đã dẫn đến làm tăng quá trình phân chia tế bào từ đó làm tăng khối lượng chất khô. Theo Cồ Khắc Sơn việc bổ sung phân bón lá hữu cơ sinh học (K-humate và Fish emulsion) có chiều hướng làm tăng trọng lượng trái, năng suất trái thương phẩm đối với một số loại rau. Sử dụng phối hợp giữa các loại phân hữu cơ sinh học bón gốc (Biorganic, Fish fertilizer) và phân bón lá (Fish emulsion và K- Humate) có tác dụng làm tăng năng suất trái từ 11,2 đến 11,3% đối với cây cà tím; 15 đến 18,7 % với dưa leo; 15,5 đến 15,9% với khổ qua và 14,3 đến 14,9% đối với đậu đũa. Công ty Hưng Trung đã sản xuất và đưa ra thị trường chế phẩm phân bón lá chiết xuất từ Trùn quế (HT5). Chế phẩm HT5 hiệu quả cao trên nhiều loại cây trồng, phù hợp với sản xuất nông nghiệp an toàn. Ngoài ra công ty còn sản xuất ra nhiều sản phẩm khác như phân hữu cơ vi sinh, hữu cơ khoáng Sở khoa học và công nghệ Đăklăk đã nghiên cứu và sản xuất phân bón lá từ trùn quế và than bùn. Sản xuất phân bón lá theo các công thức phối trộn N, P, K vi lượng, kích thích sinh trưởng cho cây lúa (5:10:5), cây ngô (8:3:3; 3:5:7) và rau (7:1:1). Phân bón lá BM05 do công ty Ban Mai sản xuất được chiết xuất từ phế thải chế biến thực phẩm động vật, có hàm lượng NPK: 4:4:3 ; Mg : 0,5%; Cu: 6
16. 0,07; Zn: 0,05; Mn; 0,02; B: 0,05 và axit amin 1500 ppm. Công ty Ni Việt có nhiều sản phẩm phân bón lá cho rau, cây ăn quả và cây công nghiệp như: Gugo- L: 3 – 0 – 10 + 10% hữu cơ và một số vi lượng B: 100ppm; Mn: 330 ppm; Cu: 1 ppm. GRO: 30 – 10 – 10; B 100ppm; Mn: 330ppm; Zn: 200ppm; Cu: 1ppm; Mo: 12 ppm và Fe: 500ppm. TC- MOBI: 18 – 2 – 20; B 250ppm; Mn 250 ppm; Zn 28 ppm; Cu 12 ppm; Fe 120ppm. Trần Thanh Dũng đã nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi khuẩn Bacillus subtilis thủy phân phụ phẩm cá da trơn tạo ra dịch đạm cao làm phân bón sinh học phục vụ sản xuất rau sạch và an toàn. Sử dụng dịch đạm thủy phân làm phân bón lá và phân bón viên bón cho cây hẹ, đánh giá năng suất và hàm lượng nitrat so với kiểu bón phân của nông dân và một số phân bón khác. Kết quả tỷ lệ tối ưu giữa các thành phần bổ sung chế phẩm vi khuẩn Bacillus subtilis là 1,4%, muối 7% và pH = 5,2 cho thấy mật số vi khuẩn thủy phân protein cao và hàm lượng lượng đạm formol đạt cao nhất (49,88 g/kg chất khô), đạm amoniac thấp nhất (5,0 g/kg chất khô) vào ngày thủy phân thứ 10. Dịch đạm thủy phân này phù hợp để làm phân bón. Khi sử dụng phân bón này cho cây hẹ đã cho năng suất cao (2,61 kg/m2 ) và hàm lượng nitrat thấp (281,95mg/kg rau tươi) ở nghiệm thức phân bón lá của dịch đạm thủy phân, (2,54 kg rau tươi/m2 ) và hàm lượng nitrat (268,36 mg/kg rau tươi) ở nghiệm thức phân bón viên của dịch đạm thủy phân, đạt tiêu chuẩn rau an toàn. 3. Mục đích nghiên cứu Mục tiêu của Đồ Án bao gồm: - Xác định hiệu quả thủy phân phụ phế phẩm cá Tra của enzym bromelin có trong xác bã cây dứa. - Tạo chế phẩm phân bón lá từ phụ phế phẩm cá Tra và enzym bromelin có trong xác bã cây dứa. 7
17. - Xác định hiệu quả của chế phẩm phân bón lá từ dịch thủy phân cá Tra trên cây rau cải. 4. Phương pháp nghiên cứu 4.1. Phương pháp tổng hợp tài liệu Nghiên cứu thu thập tài liệu tham khảo, tài liệu internet liên quan đến đề tài. Tổng hợp lựa chọn các đề tài liên quan đến mục tiêu đề tài 4.2. Phương pháp thu thập và xử lí số liệu - Ghi nhận số liệu trực tiếp từ các thí nghiệm bố trí khảo sát. - Xử lý số liệu bằng phần mềm Statistical Analysis System 9.4 (SAS 9.4). 5. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng: - Phụ phẩm cá tra là sản phẩm sau khi chế biến phile tại công ty khi lấy về từ nhà máy phụ phẩm được xử lý ngay bằng cách phân loại mỡ, xay nhuyễn và tiến hành thí nghiệm. - Phế phẩm dứa lá sản phẩm chế biến đóng hộp tại các công ty, khi lấy về thì phụ phẩm dứa được đem xay nhuyễn và tiến hành thí nghiệm Phạm vi nghiên cứu - Phụ phế phẩm cá tra và phế phẩm dứa thu từ các nhà máy chế biến. - Sử dụng enzym có trong phế phẩm dứa để thủy phân phụ phế phẩm cá tra tối ưu trong điều kiên pH, khoảngthời gian và tỷ lệ dứa và cá Tra trong nhiệt độ phòng thí nghiệm. Bảo quản dich thủy phẩn bằng cách bổ sung rỉ đường. - Khảo nghiệm dịch sau khi thủy phân phụ phế phẩm cá Tra tạo thành chế phẩm sau đó tiến hành khảo nghiệm trên cải xanh và so sánh với nước, dịch chiết và phân bón lá đang sử dụng trên thị trường. 8
18. 6. Kết quả đạt được - Kết quả nghiên cứu của đề tài cho thấy: Sử dụng enzym có trong phế phẩm dứa để thủy phân cá Tra tối ưu trong điều kiên pH = 6, nhiệt độ bình thường phòng thí nghiệm khoảng 370C, thời gian là 12 ngày và tỷ lệ dứa và cá Tra là 0,75 : 1. - Dịch sau khi thủy phân phụ phế phẩm cá Tra tạo thành chế phẩm với nồng độ 2% sau đó tiến hành khảo nghiệm trên cải xanh. - Khi khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá trồng ngoài đồng ruộng thì chế phẩm với nồng độ 2% (20ml/lít) cho hiệu quả cao nhất trên rau cải xanh so với nước, dịch chiết 2% và phấn bón lá Sen Trắng trên thị trường. 7. Ý nghĩa đề tài - Ý nghĩa khoa học: Kết quả nghiên cứu của đề tài cho thấy: Sử dụng enzym có trong phế phẩm dứa để thủy phân phụ phế phẩm cá tra tối ưu trong điều kiên pH = 6, nhiệt độ bình thường phòng thí nghiệm, khoảng thời gian là 12 ngày và tỷ lệ dứa và cá Tra là 0,75 : 1. - Ý nghĩa thực tiễn: Việc sử dụng phụ phế phẩm cá tra và phế phẩm dứa để tạo chế phẩm phân bón lá sẽ giảm ô nhiễm môi trường, cung cấp phân bón sạch cho nền nông nghiệp hữu cơ, giảm tiêu tốn ngoại tệ cho việc nhập phân bón từ nước ngoài. 9
19. 8. Kết cấu đồ án Phần mở đầu Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung chương đề cập đến các nội dung liên quan đến tài liệu nghiên cứu. Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến các dụng cụ , thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án. Chương 3: Kết quả và thảo luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận biện chứng cho kết quả thu được. Chương 4: Phần kết luận và đề nghị: nội dung tóm tắt lại những kết quả mà đề tai đạt được và đề nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài 10
20. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÁ TRA - Tên tiếng Anh: Pangasius - Tên khoa học: pangasius hypophthalmus - Tên thương mại: Pangasius 1.1.1. Đặc điểm sinh học cá tra Cá tra là cá da trơn (không vẩy), thân dài, lưng xám đen, bụng hơi bạc, miệng rộng, có hai đôi râu dài. Cá Tra sống chủ yếu trong nước ngọt, có thể sống được ở vùng nước hơi lợ (nồng độ muối 7-10), có thể chịu được nước phèn với pH > 5, dễ chết ở nhiệt độ thấp dưới 150C, nhưng chịu nóng tới 390C. Cá Tra phân bố tự nhiên ở vùng hạ lưu sông Mekong bao gồm các nước: Cambodia, Lào, Thái Lan, Việt Nam và chúng cũng được phát hiện ở sông Chao Praya – Thái Lan. Cá Tra có tình ăn rộng, ăn đáy và ăn tạp thiên về động vật nhưng dễ chuyển đổi loại thức ăn. Trong điều kiện thiếu thức ăn, cá có thể sử dụng các loại thức ăn bắt buộc khác như mùn bã hữu cơ, thức ăn có nguồn gốc động vật. Cá tra có tốc độ tăng trưởng tương đối nhanh. Cá tra trong tự nhiên có thể sống trên 20 năm, cỡ cá trong tự nhiên 18kg hoặc có mẫu cá dài tới 1,8m. 1.1.2. Thành phần hóa học của cá tra Thành phần hóa học của cơ thịt cá gồm có nước, protein, lipid, glucid, muối vô cơ, vitamin, enzym, hormone. Với thành phần hóa học của da cá: nước 60 ÷ 70 %, một ít chất vô cơ còn chủ yếu là protein và chất béo. Protein của da cá chủ yếu là collagen, elastin, keratin, rutin, globulin và albulmin. Công dụng của da cá chủ yếu là nấu keo, loại da dày như cá voi, cá nhám dùng trong công nghiệp thuộc da. Thành phần hóa học của vây cá: tương tự như xương sụn, protein trong vây cá chủ yếu là chondromucoid, collagen, chondroalbumin, đối với vây cá sau khi chế biến 11
21. các chất tan phân ly thành arginin, histidin và lysine chiếm 1/3 tổng lượng acid amin. Thường lấy vây đuôi, bụng, ngực của một số loài cá nhám để đem chế biến thành sản phẩm vây cá. Thành phần hóa học của xương cá: xương cá được chia làm hai nhóm, đó là xương cứng và xương sụn. Xương sụn: thành phần chủ yếu là protein phức tạp, keo và albumin; chất vô cơ nhiều nhất là Na, Ca, K, Mg, Fe Các acid amin cấu tạo thành protein trong xương sụn chủ yếu là acid amin tính bazơ như arginin, histidin, lysin Xương cứng: lượng chất hữu cơ và vô cơ tương đương, muối vô cơ chủ yếu là Ca3(PO4)2 ngoài ra còn có CaCO3, Ca(OH)2, Thành phần hóa học của bong bóng cá: chủ yếu là collagen, dùng để nấu keo hoặc phơi khô làm dược phẩm (Viện Cisdoma, 2005). Bảng 1.1 : Thành phần dinh dưỡng trên 100g thành phẩm ăn được Tổng năng Chất Tổng lượng Chất béo Cholesterol Natri lượng cung cấp đạm chất béo chưa bão hòa (%) (mg) (calori) (g) (g) (có DHA, EPA) (g) 124,52 23,42 3,42 1,78 0,025 70,6 1.1.3. Tình hình nuôi cá trong nước Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, tháng 11 năm 2016 diện tích nuôi cá Tra thương phẩm của nước ta ước đạt 4,552 ha, sản lượng đạt 1,047 triệu tấn. Ước tính, diện tích nuôi cá Tra trong cả năm có thể đạt gần 5,000 ha với sản lượng khoảng 1,20 triệu tấn (tăng 9% so với 2015). Tổng giá trị xuất khẩu năm 2016 ước đạt 1,67 tỷ USD, tăng 6,6% so với năm 2015. Hiện nay Việt Nam xuất khẩu cá tra sang 140 thị trường trên thế giới, tăng 4 thị trường so với năm 2015, đạt kim ngạch 1,466 tỷ USD. Các thị trường xuất khẩu chính của Việt Nam gồm có: Mỹ, Liên minh châu âu (EU), Trung Quốc, ASEAN, Mexico, 12
22. Brazil, Colombia Vùng nuôi cá Tra tập trung ở các tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Vĩnh Long, Bến Tre, Sóc Trăng, Tiền Giang, Hậu Giang và Trà Vinh. Theo ước tính, phần phụ phế phẩm của cá Tra trong chế biến philê chiếm đến 65 – 70% tổng khối lượng cá. Cá Tra: Trong thị trường xuất khẩu giảm, việc tiêu thụ khó khăn, giá cá tra nguyên liệu giảm, thấp hơn giá thành sản xuất là các khó khăn mà người nuôi cá tra đang phải đối mặt. Giá cá tra thịt trắng (loại 0,7 – 0,8 kg/con) hiện dao động ở mức từ 18.000 – 19.200 đồng/kg, thấp hơn so với cùng kỳ năm 2015 là 800 – 1.000 đồng/ kg và thấp hơn so với những tháng đầu năm 2016 từ 5.000 – 1.000 đồng/kg. Diện tích cá tra 9 tháng đầu năm của các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long ước đạt 5.146 ha, giảm 2,3% so với cùng kỳ. Sản lượng thu hoạch ước đạt 860.911 tấn, tăng 2,5% so với cùng kỳ do sản lượng của một số tỉnh tăng khá lớn như Đồng Tháp 285.554 tấn (+6,8%), Cần Thơ 118.035 tấn (+27,2%). Thị trường cá tra nguyên liệu tại các tỉnh ĐBSCL trong tháng 9/2016 có dấu hiệu khởi sắc do các doanh nghiệp đẩy mạnh mua vào phục vụ cho các đơn hàng ký mới phục vụ nhu cầu cuối năm. 1.2. Giới thiệu về cây dứa Hiện nay, trên thế giới, dứa là một loại cây trồng phổ biến. Mặt hàng dứa tươi chiếm vị trí đầu trong cơ cấu sản phẩm quả tươi trên thị trường (trên 50%, theo số liệu của FAO 2004), trong đó phần lớn là dứa Cayenne. Ở Việt Nam, giống dứa được trồng chủ yếu là dứa Queen, dứa Cayenne mới được du nhập và trồng ở nước ta trong khoảng 10 năm trở lại đây. Sản lượng dứa hàng năm ở nước ta đạt khoảng 300 nghìn tấn. Cả nước cũng có đến 15 nhà máy chuyên về sản xuất các sản phẩm từ dứa Cayenne như dứa cắt khoanh đóng hộp, nước ép từ quả dứa đóng hộp, nước ép dứa cô đặc Thực tế cho thấy lượng phế phẩm (lõi và vỏ dứa) luôn là một vấn đề đối với các nhà máy chế biến bởi cho đến nay 13
23. chúng ta vẫn chưa có hướng xử lý thích hợp đối với lượng phế phẩm chiếm đến 2/3 tổng khối lượng nguyên liệu đầu vào này. Quả dứa có các thành phần sau đây: nước 75,7%, protid 0,68%, lipid 0,06%, glucid 18,4% (saccharose 12,43%, glucose 3,21%), chất chiết xuất 4,35%, cellulose 0,57%, tro 1,24%. Còn có acid citric, acid malic và các vitamin A, B, C. Đặc biệt là bromelin có thể thuỷ phân vài phút một lượng protein bằng 1000 lần trọng lượng của nó và so sánh được với pepsin và papain. Ngoài ra còn có iod, magnesium, mangan, kalium, calcium, phosphor, sắt, lưu huỳnh. 1.3. Giới thiệu enzym Bromelin  Đặc điểm enzym Bromelin Bromelin là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chưa nhóm sulfhydryl, có khả năng phân giải protein được thu nhận từ họ Bromeliaceae, đặc biệt là ở cây dứa. Bromelin chiếm 50% protein trong quả dứa. Nó có khả năng thủy phân khá mạnh và hoạt động tốt ở pH từ 6 – 8. Bromelin có hoạt tính xúc tác sự phân giải protein tương tự như papain trong mủ đu đủ hay ficin trong cây họ Sung.  Tính chất enzym Bromelin Thành phần chủ yếu của bromelin có chứa nhóm sulfhydryl thủy phân protein. Trong dịch chiết bromelin còn có chứa một ít peroxidase, axit phosphatase và chất cản protease. Cấu trúc không gian của Bromelin Bromelin là một protease trong tâm hoạt động có chứa cysreine và hai sợi polypeptide lien kết với nhau bằng cầu nối –S – S-. Phân tử có dạng hình cầu do có cách sắp xếp phức tạp. Hoạt tính phân giải của Bromelin Bromelin có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase và esterase. Bromelin thân có nhiều cơ chất tự nhiên và có thể thủy phân cả cơ chất tự 14
24. nhiên lẫn cơ chất tổng hợp. Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của Bromelin thân cao hơn Bromelin quả xanh và Bromelin quả chín. Việc sử dụng các enzym protease để thủy phân protein phụ phẩm cá đã được ứng dụng rất phổ biến trên thế giới do những ưu điểm là rút ngắn được thời gian cho quá trình sản xuất, tăng lượng protein không hòa tan chuyển thành protein hòa tan và tận dụng được các nguồn phụ phế phẩm của cá. Trong điều kiện thủy phân thích hợp, các mô cá được biến đổi nhanh chóng thành chất lỏng. Phản ứng thủy phân thường bao gồm 2 bước: bước đầu là những phân tử enzym kết hợp với protein của cơ chất và bước 2 là sự thủy phân xảy ra dẫn tới sự phóng thích các polypeptid và axit amin tự do. Nhiều loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Protease phân bố chủ yếu ở vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn Bao gồm nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số loại nấm men. Các enzym này có thể ở trong tế bào (Protein nội bào) hoặc được tiết vào trong môi trường nuôi cấy (Protease ngoại bào). Cho đến nay các protease ngoại bào được nghiên cứu kỹ hơn các protease nội bào. Một số protease ngoại bào đã sản xuất trong quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kỹ nghệ khác nhau trong nông nghiệp và trong y học. Có thể thu nhận protease từ nhiều loài vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc. Hiện nay trên thế giới sản xuất khoảng trên 600 tấn protease tinh khiết từ vi sinh vật, trong đó có 500 tấn từ vi khuẩn và 100 tấn từ nấm mốc. Nhịp độ sản xuất enzym vi sinh vật ở qui mô công nghiệp ở các nước phát triển tăng trung bình hàng năm từ 5% - 15% và doanh thu sản xuất hàng năm ở các nước này khoảng 1,5 tỉ USD. Những nước có công nghệ sản xuất và ứng dụng protease tiên tiến nhất trên thế giới hiện nay là: Nhật Bản, Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan, Trung quốc, 15
25. Đan Mạch, Đức, Áo Các nước này đầu tư thích đáng cho công tác nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng các chế phẩm protease của vi sinh vật. Nguồn nguyên liệu rất dồi dào để sản xuất enzym nói chung và protease nói riêng. Người ta sử dụng protease để sản xuất các dịch đạm thủy phân từ các phế liệu giàu protein như thịt vụn, đầu cá, da . Dùng protease để thủy phân protein thường ít bị hao hụt acidamin như khi dùng phương pháp hóa học. Thủy phân protein bằng acid thường mất 10-25% các acidamin như tryptophan, tyrosin, cystein, arginin, histidin, serin, treonin. Vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại enzym endopeptidase và exopeptidase, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein. Các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus thermorpoteoliticus và một số loài thuộc Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất. Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu. Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5 - 8) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm như các chủng Aspergillus oryzae, A. terricola, A. fumigatus, A. satoi, Penicillium chysogenum Các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc có bào tử đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5 - 3. 16
26. Theo Diniz (1998), khi sử dụng enzym endopeptidase từ vi khuẩn để thủy phân mô thịt cá mập (Squalus acanthias) trong 2 giờ thì lượng nitơ thu được 76,2%. Ðiều kiện ðể thủy phân tốt nhất là nhiệt độ 550C, pH = 8 với tỷ lệ enzym là 40 mg/ g cơ chất và hiệu suất thủy phân 18,6%. Dong (2005), khi sử dụng enzym papain ðể thủy phân cá mối dài thì sản phẩm thủy phân chứa 84,7% protein thô, 7,1% tro và 3,5% mỡ. Sản phẩm thủy phân chứa 20 loại axit amin, trong đó tỷ lệ của 8 loại axit amin thiết yếu chứa 41,5% lýợng axit amin. Theo Min-Tian Gao (2005), thủy phân phụ phẩm cá gồm đầu và xương cá đã được xử lí sơ bộ với nước ở 121 0C trong 20 phút bằng dung dịch acid được pha loãng và pH dịch thủy phân được điều chỉnh về 1,0. Bằng cách này, thu được nguồn đạm dùng cho lên men sản xuất acid lactic với giá thành thấp và làm tăng hiệu suất sản xuất acid lactic gần 22 % so với việc dùng dịch chiết nấm men. 1.4. Nghiên cứu ngoài nước về sử dụng enzym trong thủy phân protein Trong những năm gần đây, có nhiều nghiên cứu để thủy phân phụ, phế phẩm từ ngành thủy sản tạo ra sản phẩm hữu ích. Trong đó có hai nhóm phương pháp chính là phương pháp hóa học và phương pháp sinh học. Phương pháp sinh học chủ yếu là dùng các enzym protease để thủy phân. Nguồn protease có thể từ động vật, thực vật và vi sinh vật. Bromelin là tên gọi chung cho nhóm enzym thực vật chứa nhóm sulfhydryl, có khả năng phân giải protein được thu nhận từ họ Bromeliaceae đặc biệt là ở cây dứa (Ananas comusus L.). Bromelin chiếm 50% protein trong quả dứa, có khả năng thủy phân mạnh và hoạt động tốt ở pH từ 5 – 8. Bromelin có trọng lượng phân tử 33kdalton, có tâm hoạt động chứa cystein với cầu nối S-S giữa 2 sợi peptid với nhau. Bromelin hoạt động ở nhiệt độ từ 45 – 650C và mất hoạt tính ở 700 C, biên độ pH từ 3 –9 tùy thuộc vào loại cơ chất. Các chất có tác dụng hoạt hóa bromelin gồm cystein, muối 17
27. bisulfite, NaCN, H2S, Na2S và benzoate. Bromelin trong quả xanh có hoạt tính phân giải casein cao nhất, kế đến là trong quả chín và cuối cùng là bromelin trong thân. Đây là enzym được sử dụng nhiều trong ngành công nghiệp chế biến thực phẩm như giúp làm mềm thịt, làm rượu bia, thủy phân các nguồn protein khác nhau để thu hồi sản phẩm hòa tan là các axit amin có giá trị dinh dưỡng cao. Giống như các cấu trúc sinh học khác, bromelin chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố như: cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzym, nhiệt độ, pH Trên những loại cơ chất khá nhau thì bromelin có hoạt tính khác nhau. Đối với cơ chất tổng hợp như BAA (Benzoyl-L-Arginine amide), BAEE (Benzoyl-L-Arginine ethyl ester) thì khả năng thủy phân của bromelin yếu hơn papain. 1.5. Nghiên cứu trong nước về sử dụng enzym trong thủy phân protein Theo Nguyễn Thị Nếp (2005), tỷ lệ enzym protease từ B. subtilis S5 sử dụng để thủy phân với cơ chất là phụ phẩm đầu xương cá tra đạt hiệu quả cao là 2,5 ÷ 3 %, nhiệt độ thủy phân thích hợp là 50 0C, pH = 8,0 và trong thời gian là 10 giờ, hiệu suất thủy phân cao nhất là 25,68 %. Theo Đặng Thị Mộng Quyên (2006) và Trần Thị Xô (2006), để thủy phân cá phèn, cá ngân dạng cá phế liệu thu được sau công đoạn fillet bằng phương pháp thủy phân kết hợp, thủy phân bằng enzym trước, thủy phân bằng acid sau. Trong đó, sử dụng chế phẩm enzym protease từ vi khuẩn B. subtilis C10. Kết quả với điều kiện thủy phân bằng enzym: tỷ lệ muối 3%, tỷ lệ dịch chiết enzym 20 % (dạng lỏng), tỷ lệ nước 30 %, nhiệt độ 50 0C, điều kiện thủy phân bằng acid: tỷ lệ muối 3 %, nhiệt độ thủy phân 90 0C, thể tích HCl 7N là 20 %, trung hòa bằng Na2CO3 20 % cho hiệu quả thủy phân cao. Dịch đạm thu được có hàm lượng đạm tổng số 39 g/l, đạm formol 21,6 g/l, đạm amoniac 3,95 g/l. Dương Thị Hương Giang (2006), sử dụng enzym papain thô ly trích trực tiếp từ mủ đu đủ để thủy phân bánh dầu đậu nành tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao ứng dụng trong chăn nuôi. Kết quả thí nghiệm cho thấy điều kiện tối ưu cho enzym papain trên cơ chất bánh dầu đậu nành là nhiệt độ 55oC và pH 7,0. Với tỉ lệ enzym:cơ chất là 18
28. 0,75:100 (w:w), hoạt tính đặc hiệu của enzim là 91,12 TU/mg, thời gian thủy phân là 24 giờ cho hiệu suất thủy phân cao nhất 11,8%. Lê Công Toàn (2007), phối trộn phế phẩm cá và mùn cưa theo các tỷ lệ 4 cá : 1 mùn cưa; 3 cá : 1 mùn cưa và 9 cá : 4 mùn cưa sau đó phun chế phẩm PMET vào các mẫu đã phối trộn với liều lượng 1 lít/m3 và đem ủ kị khí. Trong quá trình ủ có đảo trộn và phun PMET định kỳ. Kết quả cho thấy các mẫu phân phối rộng theo tỷ lệ 3 : 1 và 9 : 4 đều đạt tiêu chuẩn quy định trong sản xuất phân bón về hàm lượng chất hữu cơ và axit humic. Tuy nhiên cũng có một vài chất không đạt như hàm lượng kali vì vậy các tác giả khuyến cáo cần bổ sung thêm chất này trong quá trình ủ phân. Võ Thị Hạnh đã nghiên cứu chế phẩm sinh học từ trùn quế để làm thức ăn cho gia súc, gia cầm, làm phân bón cho cây Một ưu điểm nổi trội của các chế phẩm này là vẫn giữ nguyên mùi trùn tươi, các chất dinh dưỡng không bị mất đi hoặc biến chất theo thời gian. Chế phẩm BIO-BL, đã được dùng để bón cho cây trà ô long và một số cây hoa màu, cây kiểng Kết quả sau khi sử dụng cho thấy búp trà tươi, màu sắc đẹp hơn, mùi hương của trà cũng thơm hơn. BIO-BL được tạo thành từ trùn quế tươi phối trộn với hỗn hợp vi sinh vật hữu ích và enzym dùng trong trồng trọt, lên men tạo sản phẩm có mùi trùn, giàu đạm protein và amin cao, enzym tiêu hóa có hoạt lực cao, vi khuẩn có lợi. Nhóm tác giả cho biết ưu điểm của phương pháp chế biến trùn quế bằng công nghệ vi sinh là không cần dùng thiết bị đông lạnh hay thiết bị sấy nên không tốn chi phí điện, năng lượng, đem lại hiệu quả kinh tế cao. Với công nghệ đơn giản, các hộ nông dân ở các vùng xa xôi có thể áp dụng dễ dàng. Việc có thêm các chế phẩm sinh học mới có giá thành rẻ góp phần làm cho ngành chăn nuôi, nuôi trồng thủy sản và trồng trọt phát triển tốt hơn. Hiện nay, để xử lý các loại phế phẩm nông nghiệp, rác thải sinh hoạt thì có các chế phẩm như BIMA (Trichoderma), Active cleaner (xạ khuẩn Streptomyces sp., nấm Trichoderma sp., vi khuẩn Bacillus sp.) được sử dụng để ủ phân gia súc, chất thải hũu 19
29. cơ như rơm, rạ, rác thải sinh hoạt hữu cơ (đã tách riêng rác vô cơ). Việc sử dụng chế phẩm có thể giúp rút ngắn thời gian ủ hoai phân chuồng, phân xanh, rác từ 2 - 3 lần so với cách ủ thông thường. Trung tâm công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh đã tạo 4 loại phân bón: Bio trùn quế 01; Bio trùn quế 02; Bio trùn quế 03 và Bio trùn quế 04 có thành phần chủ yếu là dịch chiết từ trùn quế tươi với hàm lượng axit amin cao (Aspartic acid – 2.000 ppm; Leucine – 1.200 ppm; Alanine – 1.000 ppm; Glutamic acid – 1.000 ppm; Valine – 800 ppm). Ngoài ra còn chứa một số nguyên tố đa lượng và vi lượng cần thiết. Đa lượng: N – 5.0 %; P – 1.0 %; K – 3.0 %. Vi lượng: B – 200 ppm; Zn – 200 ppm; Mg – 120 ppm; Ca – 120 ppm; Fe – 100 ppm. Chúng có tác dụng kích thích tăng trưởng, ra hoa và tăng tỷ lệ đậu trái. 1.6. Quá trình thủy phân cá Là quá trình tác dụng của hệ enzym protease trong bản thân cá hoặc bên ngoài tác động vào thủy phân thịt cá từ dạng protein qua các dạng trung gian như pepton, polypeptid, peptid và cuối cùng là acid amin. Enzym Enzym Protein polypeptid axit amin Bên cạnh quá trình thủy phân protein là chủ yếu còn có sự thủy phân của đường và chất béo thành các acid hữu cơ, rượu Quá trình thủy phân protein trong thịt cá chủ yếu là do enzym tác dụng nhưng cũng có thể có sự tham gia của vi sinh vật. Những vi sinh vật hữu ích tiết ra protease thúc đẩy cho quá trình thủy phân nhưng các vi sinh vật gây thối thì có tác dụng làm rữa nát thịt cá có khi ở ngay giai đoạn đầu hay trong quá trình chế biến. Quá trình thủy phân tiếp tục là quá trình thối rữa do vi sinh vật gây thối thủy phân acid amin thành các chất cấp thấp như: indol, phenol và các loại acid có đạm và acid béo thủy phân thành H2S, NH3, CO2, (Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng,1990). 20
30. 1.6.1. Các hệ enzym tham gia phân giải Hệ enzym Metalo-protease còn gọi là aminopeptidase hay apase tồn tại nhiều trong nội tạng cá, chịu được nồng độ muối cao nên ngay từ đầu đã hoạt động rất mạnh, sau tháng thứ hai thì giảm dần cho tới tháng thứ ba, sau đó tác dụng kém dần đến cuối quá trình. Apase có hoạt tính khá mạnh, có khả năng thủy phân rộng rãi đối với các loại peptid, loại này đại diện cho nhóm enzym thủy phân trung tính, môi trường tối thích khoảng pH = 5,0 ÷ 7,0. Hệ enzym Serin – protease điển hình là trypsin tồn tại nhiều trong nội tạng cá, nhất là trong tụy. Môi trường hoạt động của Serin – protease trong khoảng pH = 5,0 ÷ 10. Hệ enzym axit protease được tìm thấy nhiều trong thịt cá và nội tạng cá, đại diện cho hệ này là Cathepsin D. Hệ enzym này tồn tại ngắn trong giai đoạn đầu thời kỳ thủy phân, khoảng 24 giờ sau thì hoạt tính của chúng mất dần vì không chịu nổi nồng độ muối cao. Hệ enzym này thủy phân protein rất mạnh nhưng bị ức chế bởi nồng độ muối cao, chỉ 5 % muối sau 12 giờ là có thể mất hoạt lực (Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng, 1990). 1.6.2. Sự tham gia của vi sinh vật trong quá trình phân giải Vi sinh vật có mặt ngay từ đầu quá trình chế biến do nguyên liệu, dụng cụ mang theo từ ngoài môi trường nhiễm vào, nhưng do nồng độ muối quá cao nên chúng không hoạt động được. Ngay trong giai đoạn ngắn đầu tiên khi muối chưa kịp tác dụng có một số vi sinh vật gây thối hoạt động. Khi độ mặn tăng dần lên đạt từ 12 % trở lên thì các vi khuẩn gây thối hầu như ngừng hoạt động và các vi khuẩn khác bị ức chế cao độ (Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng, 1990). 21
31. 1.6.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân cá  Ảnh hưởng của pH Các giá trị pH cần cho sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật tương ứng với các giá trị pH cần cho hoạt động của nhiều enzym. Giới hạn pH hoạt động của vi sinh vật nằm trong khoảng 4,0 ÷ 10pH của môi trường còn tác động sâu sắc lên các quá trình trao đổi chất. Màng tế bào chất của vi sinh vật tương đối ít thấm đối với các ion H+ và OH- , vì vậy dù pH của môi trường ngoài dao động trong giới hạn rộng, nồng độ của chúng trong tế bào chất vẫn ổn định. Ảnh hưởng của pH môi trường lên hoạt động của vi sinh vật phần lớn là do tác động qua lại giữa ion H+ và các enzym chứa trong màng tế bào chất và tế bào (Bộ thủy sản, 2004). pH ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của vi khuẩn, do nó liên quan đến tương tác giữa enzym và cơ chất. Vi khuẩn rất nhạy cảm với sự thay đổi pH của môi trường. Mỗi vi sinh vật chỉ có thể hoạt động được trong môi trường có pH giới hạn bởi pH thấp nhất và pH cao nhất. Đồng thời vi sinh vật hoạt động mạnh nhất trong môi trường có pH tối hảo. Phần lớn môi trường bên ngoài thiên nhiên có pH = 2,5 ÷ 9,0, và phần lớn vi sinh vật có pH tối hảo trong khoảng này. Có rất ít vi sinh vật có thể sống trong môi trường có pH nhỏ hơn 2,0 hoặc lớn hơn 10 (Nguyễn Hữu Thanh và Nguyễn Thị Thanh Xuân, 2003 trích bởi Phan Thiên Tùng, 2006).  Ảnh hưởng của thời gian thủy phân Theo một số nghiên cứu thì mức độ thủy phân tăng vọt trong thời gian đầu của phản ứng, sau đó tốc độ phản ứng chậm lại. Thời gian dài hơn và sử dụng lượng vi khuẩn lớn hơn thì mức độ thủy phân cao hơn (Phan Thiên Tùng, 2006 trích trong Nguyễn Thị Xuân Dung, 2005).  Ảnh hưởng của bản thân nguyên liệu Thủy phân hai loại cá gồm cá béo và cá không béo có nhiều mỡ và không mỡ bằng enzym thủy phân là papain được bổ sung 5% so với lượng cá. Kết quả 22
32. là các loại cá không hoặc ít béo đã cho hàm lượng protein trong nước bổi cao hơn so với cá có mỡ và khi chế biến thì mỡ thường nổi lên trên nên làm cho sản phẩm có mùi ôi khét (Nguyễn Đình Khôi, 2003 trích trong Mackie, 1982). 1.7. Tình hình xuât khẩu rau quả ở Việt Nam Rau là một trong những cây thực phẩm quan trọng, là loại thức ăn cần thiết không thể thiếu được trong bữa ăn hàng ngày. Theo nhận định của Bộ Công Thương, kim ngạch xuất khẩu rau hoa quả năm 2015 đạt 1 tỷ USD/năm. Nguyên nhân là trong một thời gian khá dài, từ cuối thập niên 1990, đầu thập niên 2000, việc xuất khẩu mặt hàng rau quả tăng trưởng rất chậm. Từ năm 2007 trở lại đây, việc xuất khẩu mặt hàng này bắt đầu khởi sắc khi tốc độ tăng trưởng nhanh hơn bình quân 20- 25%/năm. Nếu như năm 2007 kim ngạch xuất khẩu rau quả chỉ đạt 305 triệu USD, thì đến năm 2012 tăng lên 770 triệu USD. Những tháng đầu năm 2013 kim ngạch xuất khẩu đạt 187 triệu USD, tăng 10% so với cùng kỳ năm 2012.Như vậy, có thể thấy vị trí quan trọng của cây rau trong đời sống và đối với nền kinh tế. Tuy nhiên, năng suất rau của nước ta còn thấp, chỉ bằng 87% so với trung bình của thế giới. Chất lượng rau chưa đảm bảo tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm đang là vấn đề bức xúc của xã hội. Sản xuất rau an toàn hiện nay đang là vấn đề được hầu hết các địa phương quan tâm. Các tỉnh đều đã xây dựng chương trình sản xuất rau an toàn. Tuy nhiên, tình hình ngộ độc thức ăn do rau gây ra vẫn thường xuyên xảy ra và là mối lo ngại cho người tiêu dùng. 23
33. Bảng 1.2. Tình hình xuất khẩu rau quả của Việt Nam Số liệu thống kê sơ bộ của TCHQ về xuất khẩu rau quả 8 tháng đầu năm 2016 ĐVT: USD +/-(%) 8T/2016 so Thị trường T8/2016 8T/2016 với cùng kỳ 2015 Tổng kim ngạch 220.417.427 1.571.390.247 +21,8 Trung Quốc 159.521.690 1.099.739.160 +27,9 Hàn Quốc 6.516.043 59.440.075 +20,0 Hoa Kỳ 5.457.288 54.767.658 +35,3 Nhật Bản 6.982.076 49.184.689 -0,5 Hà Lan 6.157.914 39.374.533 +30,6 Malaysia 4.221.346 32.167.204 +23,3 Thái Lan 3.501.872 27.227.191 +22,0 Đài Loan 3.901.894 25.139.745 +4,2 Singapore 2.436.292 18.443.347 +9,8 Nga 2.425.962 14.919.770 -14,9 Australia 2.168.453 13.879.638 +16,4 Canada 1.804.389 11.471.611 +7,5 Indonesia 744.402 7.795.976 +12,6 Pháp 702.079 7.698.805 +20,0 Đức 1.092.381 7.680.820 -14,3 Anh 454.397 6.750.304 +39,0 Lào 594.387 3.922.881 -27,8 Italy 547.479 3.258.525 +35,2 Campuchia 52.383 1.675.590 -193,7 24
34. 1.7.1. Giới thiệu về cây cải xanh Cải bẹ xanh Brassica juncea (L.) Cây thảo hằng năm, cao 40 - 60cm hay hơn, rễ trụ ít phân nhánh. Lá mọc từ gốc, hình trái xoan, tù, có cuống lá có cánh với 1 - 2 cặp tai lá; có răng không đều; các lá ở thân tiêu giảm hơn; các lá phía trên hình dải. Hoa vàng nhạt, khá lớn, cao 1,5cm, xếp thành chùm dạng ngủ. Quả cải 35mm, tận cùng bởi một mũi nhọn, dài 4 - 5mm, mở thành các van lồi, có đường gân giữa rõ. Hạt hình cầu, có mạng màu đen đen, dài 2mm. Loài của miền nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á, có nhiều ở vùng Trung Á. Ở nước ta, cải xanh được trồng phổ biến khắp cả nước. Theo Đông y cải bẹ xanh có vị cay, tính ôn, có tác dụng giải cảm hàn, thong đàm, lợi khí Thành phần dinh dưỡng trong cải bẹ xanh gồm có: vitamin A, B, C, K, axit nicotic, catoten, abumin Cải bẹ xanh được các chuyên gia dinh dưỡng khuyên dùng vì có nhiều lợi ích đối với sức khỏe cũng như có tác dụng phòng chống bệnh tật. Theo Trần Thị Ba, cải xanh trồng được trên nhiều loại đất. Tuy nhiên đất nhiều cát, trồng mùa mưa nên dùng giống chịu mưa và nếu có thể được, nên dùng rơm phủ hoặc lưới nylon che để hạn chế đất cát bắn lên lá và hạn chế sâu bệnh cỏ dại. Chuẩn bị đất kỹ tơi xốp, nhặt sạch cỏ dại tàn dư cây trồng vụ trước, phơi khô khoảng một tuần và đảo lớp mặt xuống dưới để thoáng khí cho cây trồng sinh trưởng tốt đồng thời hạn chế các sâu bệnh cư trú trong đất. Khoảng 5-6 tháng một lần nên xử lý đất chống sâu bệnh bằng cách bón 50-60 kg vôi/1.000m2 đất. Lên líp cao 20-30cm trong mùa mưa để chống rễ không bị úng. Mùa khô lên líp cạn để giữ ẩm cho cây. Tổng lượng phân bón cho 1.000 m2 ruộng trồng: 500-1.000 kg phân chuồng , 10 kg Urea, 10 kg super lân, 5 kg KCl, 10 kg hỗn hợp 16-16-8 và 10 kg DAP.  Bón lót: Vườn ươm: lót 2-3 kg phân chuồng hoai mục + 15g phân lân/1m2. Ruộng trồng: Toàn bộ phân chuồng + super lân + 2 kg KCl. Rãi trên mặt liếp và xới trộn đều. 25
35.  Bón thúc: Vườn ươm: Không cần thiết cung cấp phân, nếu cây con phát triển hơi kém có thể tưới thúc nhẹ 1 lần khỏang 10-15 ngày sau khi gieo bằng nước phân hỗn hợp NPK 16-16-8 pha loãng (20-30g/10 lít nước). Cây con 18-20 ngày tuổi có thể cấy, cấy từng đợt riêng cây tốt và xấu để tiện chăm sóc. Trồng ngoài đồng ruộng: Bón phân dựa theo sự sinh trưởng của cây, do Cải Xanh rất ngắn ngày nên chia phân ra nhiều lần tưới sẽ có hiệu quả hơn. Có thể dung phân cá ủ pha loãng tưới thêm trong thời gian gần thu họach. 1.7.2. Một số nghiên cứu về sử dụng phân bón trên cây trồng Theo Neri (2002), phun phân bón lá có các thành phần hữu cơ hoặc axit humic giúp duy trì khả năng phát triển của cây ở giai đoạn cuối của quá trình sinh trưởng. Axit humic thể hiện vai trò quan trọng trong việc kích thích sự hình thành và tích lũy các sắc tố trong lá, tích lũy lượng diệp lục tố cao hơn và làm lá xanh hơn (Hancock, 1999). Nghiên cứu sử dụng phân bón lá chiết xuất từ rong biển (seaweed) của nhiều tác giả cho thấy: phun seaweed làm tăng năng suất thực thu của đậu đỗ lên trung bình khoảng 24% (Temple, 1989), cho thời gian thu trái sớm hơn ở dưa leo trồng trong nhà kính (Passam và ctv, 1995), tăng tổng khối lượng tươi của trái cà chua trồng trong nhà kính lên 17% (Crouch và Van Staden, 1992). Nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả Chen và Aviad, 1990; Fagbenro và Agboole, 1993 đều cho thấy phun các chế phẩm chứa axit humic giúp cây tăng khả năng hấp thu các nguyên tố đa và vi lượng. Theo Gopi (2005), việc xử lý Triazole đã làm tăng sự phát triển của bộ rễ ở dưa leo và từ đó làm tăng lượng Cytokinin nội sinh. Lượng Cytokinin nội sinh tăng đã dẫn đến làm tăng quá trình phân chia tế bào từ đó làm tăng khối lượng chất khô. 26
36. Theo Cồ Khắc Sơn việc bổ sung phân bón lá hữu cơ sinh học (K-humate và Fish emulsion) có chiều hướng làm tăng trọng lượng trái, năng suất trái thương phẩm đối với một số loại rau. Sử dụng phối hợp giữa các loại phân hữu cơ sinh học bón gốc (Biorganic, Fish fertilizer) và phân bón lá (Fish emulsion và K-Humate) có tác dụng làm tăng năng suất trái từ 11,2 đến 11,3% đối với cây cà tím; 15 đến 18,7 % với dưa leo; 15,5 đến 15,9% với khổ qua và 14,3 đến 14,9% đối với đậu đũa. Công ty Hưng Trung đã sản xuất và đưa ra thị trường chế phẩm phân bón lá chiết xuất từ Trùn quế (HT5). Chế phẩm HT5 hiệu quả cao trên nhiều loại cây trồng, phù hợp với sản xuất nông nghiệp an toàn. Ngoài ra công ty còn sản xuất ra nhiều sản phẩm khác như phân hữu cơ vi sinh, hữu cơ khoáng Sở khoa học và công nghệ Đăklăk đã nghiên cứu và sản xuất phân bón lá từ trùn quế và than bùn. Sản xuất phân bón lá theo các công thức phối trộn N, P, K vi lượng, kích thích sinh trưởng cho cây lúa (5:10:5), cây ngô (8:3:3; 3:5:7) và rau (7:1:1). Phân bón lá BM05 do công ty Ban Mai sản xuất được chiết xuất từ phế thải chế biến thực phẩm động vật, có hàm lượng NPK: 4:4:3 ; Mg : 0,5%; Cu: 0,07; Zn: 0,05; Mn; 0,02; B: 0,05 và axit amin 1500 ppm. Công ty Ni Việt có nhiều sản phẩm phân bón lá cho rau, cây ăn quả và cây công nghiệp như: Gugo-L: 3 – 0 – 10 + 10% hữu cơ và một số vi lượng B: 100ppm; Mn: 330 ppm; Cu: 1 ppm. GRO: 30 – 10 – 10; B 100ppm; Mn: 330ppm; Zn: 200ppm; Cu: 1ppm; Mo: 12 ppm và Fe: 500ppm. TC- MOBI: 18 – 2 – 20; B 250ppm; Mn 250 ppm; Zn 28 ppm; Cu 12 ppm; Fe 120ppm. Trần Thanh Dũng đã nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi khuẩn Bacillus subtilis thủy phân phụ phẩm cá da trơn tạo ra dịch đạm cao làm phân bón sinh học phục vụ sản xuất rau sạch và an toàn. Sử dụng dịch đạm thủy phân làm phân bón lá và phân bón viên bón cho cây hẹ, đánh giá năng suất và hàm lượng nitrat so với kiểu bón phân của nông dân và một số phân bón khác. Kết quả tỷ lệ 27
37. tối ưu giữa các thành phần bổ sung chế phẩm vi khuẩn Bacillus subtilis là 1,4%, muối 7% và pH = 5,2 cho thấy mật số vi khuẩn thủy phân protein cao và hàm lượng lượng đạm formol đạt cao nhất (49,88 g/kg chất khô), đạm amoniac thấp nhất (5,0 g/kg chất khô) vào ngày thủy phân thứ 10. Dịch đạm thủy phân này phù hợp để làm phân bón. Khi sử dụng phân bón này cho cây hẹ đã cho năng suất cao (2,61 kg/m2 ) và hàm lượng nitrat thấp (281,95mg/kg rau tươi) ở nghiệm thức phân bón lá của dịch đạm thủy phân, (2,54 kg rau tươi/m2 ) và hàm lượng nitrat (268,36 mg/kg rau tươi) ở nghiệm thức phân bón viên của dịch đạm thủy phân, đạt tiêu chuẩn rau an toàn. 28
38. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Dụng cụ và thiết bị Các thiết bị thông dụng dùng trong phòng thí nghiệm bao gồm: - Cân kĩ thuật và phân tích - Máy đo quang phổ UV-Vis - Máy phá mẫu - Máy chưng cất đạm - Erlen , bình định mức - ống đong , phiễu , giấy quỳ - Ống nghiệm - Pipet 1ml, 2ml, 3ml, 5ml, 10ml - Becher 50ml, 250ml, 500ml - Bình tia 2.1.2. Hóa chất - H2SO4 đậm đặc - Chất xúc tác (K2SO4 và CuSO4) - NaOH 45%, NaOH 0,1N , NaOH 0,05N - Dung dịch H2SO4 0,1N - Phenoltalein 3% - Dung dịch Casein 1% - Dung dịch TCA 5% - Dung dịch NaOH 0,5N - Thuốc thử Tashiro , thuốc thử Folin - Dung dịch HCl 0,2N , HCL 1N 29
39. - Dung dịch Tyrosin chuẩn 1 mM/ trong dung dịch HCl 0,2N 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Xác định đạm tổng số bằng phương pháp kjeldahl 2.2.1.1. Vô cơ hóa Nguyên tắc: Sự vô cơ hóa chất đạm là sự biến đổi tất cả các chất đạm dù nằm dưới dạng nào (hữu cơ, vô cơ, protein) thành hợp chất vô cơ là amonium sulfat (NH4)2SO4 bằng cách đun sôi với H2SO4 đậm đặc và chất xúc tác. Cách tiến hành: Hút chính xác 2ml nếu là nguyên liệu lỏng hay cân chính xác 2g nếu là nguyên liệu khô đã nghiền nhuyễn để cho đồng nhất, cho vào một bình cổ cao có dung tích từ 60ml đến 100ml (bình kjeldahl). Thêm vào đó 5ml H2SO4 đậm đặc và khoảng 0,5g chất xúc tác. Đun sôi hỗn hợp trong tủ hút khí độc từ 2 đến 3 giờ cho đến khi dung dịch trở thành trong suốt và có màu xanh do trời nhạt. Để nguội và pha loãng với 300ml với nước cất. Chất xúc tác dùng ở đây là hỗn hợp đã xay nhuyễn của: K2SO4 và CuSO4 có tỷ lệ theo trọng lượng là 9: 1 2.2.1.2. Phương pháp kjeldahl Nguyên tắc: Chất đạm đã được vô cơ hóa nằm dưới dạng Amonium sulfat đem cho tác dụng với chất kiềm mạnh như NaOH sẽ phóng thích ra amoniac (NH4)2SO4 + 2NaOH 2NH4OH + Na2SO4 Sau đó lượng amoniac được hơi nước dẫn đến một bình tam giác có chứa một lượng thừa H2SO4. Từ đây cho phép chúng ta xác định được lượng amoniac phóng thích ra, có nghĩa là xác định được lượng đạm có trong mẫu nguyên liệu. Cách tiến hành: Sau khi mẫu vô cơ hóa để nguội và pha loãng với 300ml nước cất ta cho vào bình cổ cao (bình Kjeldahl). Thêm vào 3 giọt thuốc thử tashiro có 30
40. màu xanh sau đó chuẩn bằng NaOH 40% cho đến khi dung dịch trong bình đổi màu. Sau đó đem đun dung dịch trong bình bằng máy Kjeldahl. Lượng đạm được hơi nước dẫn đến bình tam giác có chứa một lượng thừa H2SO4. Ta dùng quỳ tím thử cho đến khi hết đạm ta đem bình tam giác đi chuẩn độ bằng NaOH 0,1N Cách tính kết quả: Ntổng = [1,42/1000*(V1- V2)*100/m]*n Trong đó : V1 số ml H2SO4 cho vào trong bình. V2 số ml NaOH 0,1N đã chuẩn độ. m số gam mẫu hay ml khi chuẩn độ lại. n hệ số pha loãng mẫu khi vô cơ hóa mẫu, để đưa vào chưng cất. 2.2.2. Xác định đạm formol bằng phương pháp sorensen Nguyên tắc: - Các amino acide có thể phản ứng với formol trung tính để tạo thành dẫn xuất metylenic . Kết quả là nhóm amin mất tính chất cơ bản của nó , ngược lại nhóm cacboxyl trong amino acide tồn tại dạng metylen tự do có thể chuẩn độ với NaOH - Phương pháp được ứng dụng trong trường hợp nhóm cacboxyl và nhóm amin tự do bằng nhau. Nguyên liệu và hóa chất: Dung dịch formol ½ (pha formol : nước cất tỉ lệ 1:1 và chuẩn bị trước khi dung). Nước cất. Dung dịch NaOH 0,1N Thuốc thử Phenolphtalein 3% Cách tiến hành: Lấy 2 bình nón và đánh dấu bình 1 và bình 2 31
41. Bình 1 : Dùng làm bình kiểm tra. Cho vào 50ml dd formol ½ và thêm vào đó 3 giọt phenolphthalein 3% . Sau đó dùng dd NaOH 0,1N để hiệu chỉnh màu trong bình cho đến khi chỉ còn màu hồng nhạt. Ta được formol ½ trung hòa Bình 2 : Dùng làm bình thí nghiệm . Cho vào 10ml dịch mẫu ( đã được pha loãng từ 5 đến 20 lần ), thêm 10ml dd formol ½ đã trung hòa và 3 giọt phenolphthalein 3% , lắc đều cho phản ứng xảy ra hoàn toàn . Sau đó chuẩn độ bằng dd NaOH 0,1N cho đến khi dd trong bình 2 có màu hồng (đậm hơn bình 1)  Lượng đạm formol có trong 1L nguyên liệu: Cách tính : Trong đó : M(g/l)=1,4(V2- V1)/a V1 là thể tích NaOH 0,1N đối chứng V2 là thể tích NaOH 0,1N thí nghiệm a là lượng mẫu (ml) ứng với 10ml dịch mẫu pha loãng x lần (a=1ml=0,001L). 2.2.3. Xác định hoạt tính enzym bromelin bằng phương pháp anson cải tiến Nguyên tắc Phương pháp này dựa trên sự thủy phân protein casein bằng enzym Bromelin có trong dịch nghiên cứu, tiếp đó làm vô hoạt enzym và kết tủa protein chưa bị thủy phân bằng dung dịch acid trichloracetic. Định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng thủy phân bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn của Tyrosin để tính lượng sản phẩm do enzym xúc tác tạo nên. 32
42. Chuẩn bị đường chuẩn tyrosin Các bước dựng đường chuẩn Tyrosin Dung dịch hóa chất Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 Dung dịch Tyrosin chuẩn (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Lượng Tyrosin tương ứng (µM) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Dung dịch HCl 0,2N (ml) 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 10 10 10 10 10 10 Thuốc thử Folin (ml) 3 3 3 3 3 3 Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660nm Ống số 1 là ống thử không (TK), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN). Vẽ đường chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (µM) và ΔOD (ΔOD = ODTN – ODTK). Phương pháp tiến hành Lấy 6 ống nghiệm sạch, khô, tiến hành làm 3 ống thử thật, 3 ống thử không Các bước chuẩn bị mẫu enzym để đo hoạt tính Ống nghiệm Dung dịch hóa chất Thử thật Thử không Dung dịch Casein 1% (ml) 5 5 Dung dịch TCA 5% (ml) 0 10 Dung dịch enzym mẫu (ml) 1 1 Lắc đều và giữ ở 35,5oC trong 20 phút Dung dịch TCA 5% (ml) 10 0 Để yên 30 phút, lọc lấy dịch trong Lấy 2 ống nghiệm mới khác, cho vào ống thứ nhất 5ml dịch lọc của ống thử thật và cho vào ống thứ hai 5ml dịch lọc cùa ống thử không. 33
43. Tiếp tục thêm vào mỗi ống 10ml NaOH 0,5N và 3ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660nm. Tính ΔOD = ODTT – ODTK, sau đó dựa vào đồ thị chuẩn suy ra được số µM Tyrosin. Tính kết quả: Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzym tối thiểu trong điều kiện thí nghiệm (35,50C: pH 7,6 ) thủy phân Casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước sóng 660nm tương ứng với 1µM Tyrosin trong đường chuẩn. M Tyro sin* V * L Hđ Protease = (UI ) t * m * v Với: Hđ Protease : hoạt độ enzym protease (UI/g) V : tổng thể tích hỗn hợp trong ống thử thật hoặc ống thử không (ml) v : thể tích dịch lọc đem phân tích (ml) t : thời gian thủy phân (phút) m : khối lượng mẫu enzym đem đi xác định hoạt tính (g) L: độ pha loãng enzym µM Tyrosin: lượng µM Tyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn 34
44. 2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.3.1. Khảo sát quá trình thủy phân phụ phế phẩm cá tra bằng enzym bromelin trong dứa.  Phụ phẩm cá Tra là sản phẩm sau khi chế biến phile tại các công ty chế biến. Khi lấy về từ nhà máy chế biến phụ phế phẩm cá được xử lý ngay bằng cách loại mỡ rồi xay nhuyễn và tiến hành thí nghiệm.  Dứa được thu nhận từ các công ty, nhà máy chế biến dứa đóng hộp. Khi lấy về từ các công ty, nhà máy chế biến dứa đóng hộp thì phụ phế phẩm dứa được rửa sạch và đem xay nhuyễn và tiến hành thí nghiệm.  Phân tích nguyên liệu đầu vào - Xác định N tổng bằng phương pháp Kjeldhal - Xác định hoạt tính của enzyme bằng phương pháp Anson 2.3.1.1. Xác định hoạt tính enzym bromelin có trong các thành phần của cây dứa.  Mục tiêu: Xác định hoạt tính enzym Bromelin có trong các thành phần của cây dứa.  Vật liệu: Vỏ, chồi ngọn, lõi, thịt dứa  Phương pháp thực hiện: Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức lập lại 3 lần. Số liệu thu thập được xử lý thống kê bằng phần mềm SAS 9.4.  Các nghiệm thức Nghiệm thức Thành phần cây dứa NT1 Chồi ngọn NT2 Võ NT3 Thịt NT4 Lõi 35
45.  Chỉ tiêu theo dõi: Xác định hoạt tính enzym bằng phương pháp Anson cải tiến.  Cách tiến hành: Lấy các thành phần của quả dứa xay nhuyễn lọc thu dich chiết và tiến hành thí nghiệm để xác định hoạt tính enzym. 2.3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dứa đến quá trình thủy phân phụ phế phẩm cá tra.  Mục tiêu:Xác định tỷ lệ dứa cho vào tối ưu nhất.  Vật liệu: Phế phẩm dứa và phụ phế phẩm cá Tra  Phương pháp thực hiện: Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức và 3 lần lập lại. Số liệu thu thập được xử lý thống kê bằng phần mềm SAS 9.4.  Các nghiệm thức: Nghiệm thức Tỷ lệ (dứa/ cá) NT1 0,5:1 NT2 0,75:1 NT3 1:1 NT4 1,25:1  Cách tiến hành: Cân vào bình 20gam phụ phế phẩm cá tra, cho thêm 20 ml nước cất, cho phế phẩm dứa xay nhuyễn vào với khối lượng lần lượt là: 10g; 15g; 20g; 25g. Tiến hành ủ trong 3, 5 và 7 ngày ở điều kiện bình thường phòng thí nghiệm. Sau thời gian ủ mẫu được lọc bỏ bã và hút dịch lỏng để phân tích các chỉ tiêu. 36
46.  Chỉ tiêu theo dõi: - Hàm lượng N tổng số bằng phương pháp Kjeldhal - Hàm lượng Formol bằng phương pháp Sorensen 2.3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu (dứa,cá) và nước đến quá trình thủy phân.  Mục tiêu : Xác định được tỷ lệ mẫu (dứa, cá) và nước tối ưu nhất  Vật liệu: Phế phẩm dứa, phụ phế phẩm cá tra và nước.  Phương pháp thực hiện: Thí nghiệm được bố trí kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD với 3 nghiệm thức và lập lại 3 lần. Số liệu thu thập được xử lý thống kê bằng phần mềm SAS 9.4.  Các nghiệm thức: Nghiệm thức Tỷ lệ mẫu/ nước NT1 1 : 0,5 NT2 1 : 1 NT3 1 : 1,5  Cách tiến hành: Cân vào bình tỷ lệ mẫu (dứa, cá) lần lượt là 20gam phụ phế phẩm cá Tra xay nhuyễn và 15gam phế phẩm dứa xay nhuyễn, cho chạy lượng nước lần lượt là 17,5ml ; 35ml ; 52,5ml. Tiến hành ủ mẫu trong 3,6 và 9 ngày ở điều kiện bình thường phòng thí nghiệm. Sau thời gian ủ mẫu được lọc bỏ bã rồi hút dịch lỏng để phân tích các chỉ tiêu.  Chỉ tiêu theo dõi - Xác định N tổng bằng phương pháp Kjeldhal - Xác định N formol bằng phương pháp Sorensen 37
47. 2.3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân phụ phế phẩm cá tra.  Mục tiêu: Xác đinh pH tối ưu cho quá trình thủy phân phụ phế phẩm cá Tra  Vật liệu: Phế phẩm dứa, phụ phế phẩm cá tra và chất điều chỉnh pH ( NaOH 1N, HCl 1N)  Phương pháp thực hiện: Thí nghiệm được bố trí kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD với 4 nghiệm thức và lập lại 3 lần. Số liệu thu thập được xử lý thống kê bằng phần mềm SAS 9.4  Các nghiệm thức: Nghiệm thức PH NT1 5 NT2 6 NT3 7 NT4 8  Cách tiến hành : Cân vào bình 20gam phụ phế phẩm cá xay nhuyễn, 15gam phế phẩm dứa xay nhuyễn và 35ml nước cất. Điều chỉnh pH bằng hóa chất HCl 1N và NaOH 1N để được pH lần lượt là 5, 6, 7, 8. Tiến hành ủ trong 5 và 9 ngày ở điều kiện bình thường phòng thí nghiệm. Sau thời gian ủ mẫu được lọc bỏ bã và hút dịch lỏng để phân tích các chỉ tiêu.  Chỉ tiêu theo dõi - Xác định N tổng bằng phương pháp Kjeldhal - Xác định N formol bằng phương pháp Sorensen 38
48. 2.3.1.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân phụ phế phẩm cá tra bằng enzym bromelin trong phế phẩm dứa  Mục tiêu: Xác định thời gian thủy phân phụ phế phẩm cá tra bằng enzym bromelin trong phế phẩm dứa tối ưu nhất.  Vật liệu: Phế phẩm dứa và phụ phế phẩm cá Tra  Phương pháp thực hiện: Thí nghiệm được bố trí kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD với 5 nghiệm thức và lập lại 3 lần. Số liệu thu thập được xử lý thống kê bằng phần mềm SAS 9.4  Các nghiệm thức: Nghiệm thức Thời gian (ngày) NT1 3 NT2 6 NT3 9 NT4 12 NT5 15  Cách tiến hành: Cân vào bình 20gam phụ phế phẩm cá tra xay nhuyễn, 15gam phế phẩm dứa xay nhuyễn và 35ml nước, điều chỉnh pH = 6. Tiến hành ủ trong 3, 6, 9, 12 và 15 ngày ở điều kiện bình thường trong phòng thí nghiệm. Sau thời gian ủ mẫu được lọc bỏ bã và hút dịch lỏng để phân tích các chỉ tiêu.  Chỉ tiêu theo dõi: - Xác định N tổng bằng phương pháp Kjeldhal - Xác định N formol bằng phương pháp Sorensen 39
49. 2.3.1.6. Ổn định dung dịch thủy phân bằng rỉ đường  Mục tiêu: Hạn chế sự hao hụt của đạm trong dịch thủy phân.  Phương pháp tiến hành: Thí nghiệm được bố trí kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD với 3 nghiệm thức và lập lại 3 lần. Số liệu thu thập được xử lý thống kê bằng phần mềm SAS 9.4.  Các nghiệm thức: Nghiệm thức Rỉ đường (%) NT1( đối chứng) 0 NT2 5 NT3 10  Cách tiến hành: Dung dịch sau thủy phân hoàn toàn được phối trộn với rỉ đường có tỉ lệ lần lượt là 5% và 10%. Sau 1 tháng tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu.  Chỉ tiêu theo dõi : - Xác định N tổng bằng phương pháp Kjeldhal 2.3.2. Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá cho cây cải xanh trồng ngoài dồng. Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá cho cải xanh trồng ngoài.  Mục tiêu: Đánh giá hiệu quả của chế phẩm phân bón lá trên đối tượng cải xanh trồng ngoài đồng.  Vật liệu nghiên cứu: Dịch thủy phân và chế phẩm phân bón lá từ phụ phế phẩm cá tra và phế phẩm dứa, giống cải xanh, phân bón lá Sen trắng đang sử dụng trên thị trường.  Phương pháp nghiên cứu: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) , gồm 4 nghiệm thức, mõi nghiệm thức lập lại 3 lần. diện tích mõi ô là 2m2. Số liệu thu thập được xử lý thống kê bằng phần mềm SAS 9.4 40
50.  Các nghiệm thức: Nghiệm thức Loại phân NT1 Phun nước lã NT2 Dịch thủy phân 2% NT3 Chế phẩm 2% NT4 Phân bón lá SEN TRẮNG  Các tiến hành: Tiến hành trồng cải xanh trong các luống đất. Thời gian phun: 2 lần phun (sáng và chiều) ở các thời điểm 7, 11, 15, 19, 23 ngày sau khi trồng. lượng phân sử dụng 0,1 lít trong một lần phun trên 1m2 cải.  Chỉ tiêu theo dõi - Chiều cao cây: (cm) - Số lá: ( lá/cây) - Trọng lượng trung bình cây: ( g/cây) - Năng suất : (kg/m2.) 41
51. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PHỤ PHẾ PHẨM CÁ TRA BẰNG ENZYM BROMELIN TRONG DỨA Bảng 3.1: Kết quả phân tích nguyên liệu đầu vào (%) Nguyên liệu đầu vào (%) N tổng số 2,342 Protein thô 14,6375 Phụ phẩm cá Tra được phân loại mỡ, rồi xay nhuyễn sau đó phân tích các chỉ tiêu. Thành phần các chất trong phụ phẩm cá Tra: N = 2,342% và protein thô là 14,6375%. Như vậy, nguyên liệu đầu vào là phế phẩm cá tra có hàm lượng đạm tổng số khá cao. Đây là nguồn nguyên liệu quý để sản xuất phân bón cho cây trồng. 3.1.1. Xác định hoạt tính enzym bromelin có trong các thành phần của quả dứa Bảng 3.2: Hoạt tính enzym bromelin có trong các thành phần của quả dứa NT Bộ phận trên Tỷ lệ khối Hoạt tính Hoạt tính quả dứa lượng (%) dịch chiết riêng (U/g) (U/ml) NT1 Chồi 15,31 38,4 2,56 NT2 Vỏ 30,02 30,3 2,02 NT3 Thịt 48,53 35,7 2,38 NT4 Lõi 6,14 24,6 1,64 Số liệu ở bảng 3.1 cho thấy, phần thịt quả của quả dứa chỉ chiếm 30,53% còn lại là phế phẩm. Trong các phần phế phẩm thì vỏ chiếm tỷ lệ cao nhất (48%), phần chồi ngọn chiếm 15,3% và phần lõi chiếm 6,14%. Riêng phần vỏ chiếm đến 37%. Vỏ, chồi ngọn và lõi là phần phế phẩm của ngành công nghiệp 42
52. chế biến dứa đóng hộp có thể tận dụng như nguồn enzyme bromelin dùng thủy phân phụ phế phẩm cá tra. Nghiên cứu với giống dứa Queen, Lại Thị Ngọc Hà (2009) cho biết, phần vỏ quả chiếm đến 70% và tác giả cũng cho rằng có thể tận dụng để thu hồi enzyme bromelin. Tất cả các phần của quả dứa đều có hoạt tính enzyme. Hoạt tính chung cao nhất ở phần chồi (38,4 U/ml), tiếp đến là phần thịt (35,7 U/ml), tiếp đến là phần vỏ (30,3U/ml) và sau cùng là phần lõi. Phân vỏ cũng có hoạt tính khá cao (hoạt tính chung là 30,3U/ml, hoạt tính riêng là 2,02 U/mg). Đây là nguồn nguyên liệu quý được sử dụng như nguồn enzyme bromelin để thủy phân protein có trong cá thành các acid amin cung cấp cho cây trồng. Nghiên cứu với giống dứa Queen, tác giả Lại Thị Ngọc Hà (2009) cho biết, Hoạt lực protease trong phần chồi ngọn và vỏ quả là cao nhất. 3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dứa đến quá trình thủy phân phụ phế phẩm cá tra Bảng 3.3: Lượng N tổng số (g/l), N formol (g/l) ở các nghiệm thức. Nghiệm Tỷ lệ Ngày 3 Ngày 5 Ngày 7 thức (dứa/ cá) N tổng N N tổng N formol N tổng N formol số (g/l) formol số (g/l) (g/l) số (g/l) (g/l) (g/l) NT1 0,5:1 1,3850c 0,3700c 3,5700d 2,0500c 5,62500c 3,8750c NT2 0,75:1 3,2000b 1,7250b 5,2900a 3,4800a 7,39800a 5,9250a NT3 1:1 3,3750a 1,9250a 4,6175c 2,7750b 6,79350b 5,6250b NT4 1,25:1 3,5250a 2,0700a 4,8390b 2,8000b 6,79200b 5,6900b CV% 4,6040 4,6040 4,6040 4,6040 4,6040 4,6040 LSD0,01 0,162 0,1611 0,1892 0,193 0,2328 0,2719 Ghi chú: Các trung bình cùng ký tự không khác biệt có nghĩa ở mức xác suất p < 0,01. 43
53. g/l 7 6 5.925 5.625 5.625 5 Tỷ lệ 0,5:1 3.875 4 0,75:1 3.48 1:01 2.8 3 2.775 1,25:1 2.07 2.05 1.925 2 1.725 1 0.37 0 Ngày 3 Ngày 5 Ngày 7 Ngày Hình 3.1: Lượng N formol (g/l) của các nghiệm thức Nồng độ enzyme là một trong những yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình thủy phân cơ chất nói chung và thủy phân dịch cá nói riêng. Tỷ lệ enzyme cho vào càng cao, tốc độ thủy phân càng nhanh. Điều này thể hiện ở thời điểm 3 ngày sau thủy phân, hàm lượng N tổng số ở các tỷ lệ dứa/cá là 1:1 và 1,25:1 đạt tương ứng là 3,2 và 3,37g/lít. Đạm formol là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá hiệu quả thủy phân của enzyme. Kết quả ở bảng 3.1. cũng cho thấy đạm formol cũng đạt tương ứng là 1,7 và 1,9g/lít. Tuy nhiên, ở ngày thứ 5 và ngày thứ 7, lượng N tổng số và N formol đạt cao nhất ở tỷ lệ dứa/cá là 0,75:1. Có lẽ ở những ngày sau (5 ngày và 7 ngày) với lượng protein còn lại không cao thì tỷ lệ dứa/protein cao đã ức chế sự hoạt động của enzyme nên tốc độ thủy phân ở cá tỷ lệ enzyme cao có xu hướng giảm đi. Như vậy, kết quả này cũng cho thấy tỷ lệ phế phẩm dứa trên phế phẩm cá Tra là 0,75:1 (tính theo khối lượng) là thích hợp nhất cho enzyme hoạt động thủy phân phế phẩm cá tra. Tuy nhiên, để tính sự chuyển hóa từ N tổng số sang N formol thì cần phải tính tỷ lệ (%) N formol trên N tổng số. Kết quả ở 44
54. bảng 3.4 cho thấy, tỷ lệ chuyển hóa từ N tổng số sang N formol đạt cao nhất ở ngày thứ 7 sau khi ủ. Trong đó, tỷ lệ N formol/N tổng số tương ứng với các nghiệm thức như sau từ NT1 – NT4 tương ứng là 68,88%, 84,21%, 82,79% và 83,18%. Như vậy, tỷ lệ dứa: cá tối ưu nhất là 0,75:1. Bảng 3.4: Tỷ lệ (%) N formol/N tổng số ở các nghiệm thức Nghiệm thức Tỷ lệ (dứa/ cá) Tỷ lệ (%) N formol/ N tổng số sau các ngày ủ Ngày 3 Ngày 5 Ngày 7 NT1 0,5:1 26,71 57,42 68,88 NT2 0,75:1 53,91 65,78 84,21 NT3 1:01 57,04 60,09 82,79 NT4 1,25:1 58,72 57,86 83,18 % 90.00 84.21 83.19 82.80 80.00 68.89 70.00 65.78 Tỉ Lệ 60.10 58.72 57.86 57.42 60.00 57.04 53.91 0,5:1 50.00 0,75:1 40.00 1,0:1 30.00 26.71 1,25:1 20.00 10.00 0.00 Ngày 3 Ngày 5 Ngày 7 Ngày Hình 3.2: Tỷ lệ (%) N formol/N tổng số ở các nghiệm thức 45
55. 3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu (dứa,cá) và nước đến quá trình thủy phân Xác định tỷ lệ mẫu (dứa, cá) với nước trong quá trình thủy phân là việc làm rất quan trọng. Vì việc sử dụng tỷ lệ mẫu (dứa, cá) với nước ngoài đảm bảo hiệu quả thủy phân cao nhất mà còn phải tối ưu nguồn nguyên liệu. Bảng 3.5: Lượng N tổng số và N formol trên số gam phế phẩm cá ở các nghiệm thức Nghiệm Tỷ lệ mẫu Ngày 3 Ngày 6 Ngày 9 thức và nước N tổng N N tổng N N tổng N số/g cá formol/ số/g cá formol/g số/g cá formol/g g cá cá cá NT1 1:0,5 17,659b 11,918b 19,023b 16,308b 20,12b 17,457b NT2 1:1 21,035a 17,675a 22,47a 19,774a 23,111a 20,825a NT3 1:1,5 19,586ab 16,133a 19,994b 17,195b 20,657b 17,992b CV% 5.84091 5.84091 5.84091 5.84091 5.84091 5.84091 LSD0,01 2.4389 2.5204 1.1605 2.1646 2.2858 2.7467 Ghi chú: Các trung bình cùng ký tự không khác biệt có nghĩa ở mức xác suất p < 0,01. 46
56. N/g 25 20.825 20 19.774 17.992 17.675 17.457 Tỷ lệ 17.195 16.308 16.133 15 01:00,5 1:01 11.918 01:01,5 10 5 0 Ngày 3 Ngày 6 Ngày 9 Ngày Hình 3.3: Hàm lượng N formol trên số gam phế phẩm cá Từ kết quả bảng 3.5 và biểu đồ 3.3 cho thấy lượng N tổng số/g cá và lượng N formol/g cá qua các ngày ủ đều tăng dần đều và đạt hiệu quả cao nhất ở NT2 (tỷ lệ mẫu/nước là 1:1) ở tất cả các ngày. Như vậy có thể thấy lượng nước cho vào quá nhiều hay quá ít sẽ ảnh hưởng tới quá trình thủy phân ở thời gian lâu dài. Mà dựa vào kết quả trên thì cho ta được tỷ lệ mẫu và nước là 1:1 là mang lại hiệu quả tốt nhất. Tuy nhiên, để tính sự chuyển hóa từ N tổng số sang N formol thì cần phải tính tỷ lệ (%) N formol trên N tổng số. 47
57. Bảng 3.6 : Tỷ lệ N formol/ N tổng số ở các nghiệm thức Nghiệm thức Tỉ lệ mẫu/nước Tỷ lệ N formol/N tổng số sau các ngày ủ (%) Ngày 3 Ngày 6 Ngày 9 NT1 1:0,5 67 86 87 NT2 1:1 84 88 90 NT3 1:1,5 82 86 87 Ghi chú: Các trung bình cùng ký tự không khác biệt có nghĩa ở mức xác suất p < 0,01 % 100% 90% 86% 88% 86% 87% 87% 90% 84% 82% 80% 67% 70% Tỉ lệ 60% 0,5 50% 1 40% 30% 1,5 20% 10% 0% Ngày Ngày 3 Ngày 6 Ngày 9 Hình 3.4: Tỷ lệ (%) N formol/N tổng số ở các nghiệm thức Qua bảng 3.6 và biểu đồ 3.4 tổng lượng N formol/ tổng lượng N tổng số qua các ngày 3,6 và 9 cho thấy hiệu quả thủy phân và chuyển hóa từ N tổng số sang N formol cho kết quả tối ưu nhất ở NT2 ( tỷ lệ 1:1) . Kết quả ngày 9 cho thấy rõ nhất tỷ lệ N formol/N tổng số lên đến 90% (tỷ lệ 1:1). Vì vậy nhóm sinh viên chọn tỷ lệ 1:1 để tiến hành thí nghiệm tiếp theo. 48
58. 3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân phụ phế phẩm cá tra. Xác định môi trường pH trong quá trình thủy phân là việc làm rất quan trọng. Vì sự hoạt động của enzyme bị ảnh hưởng lớn bởi pH của môi trường. Bảng 3.7 : Hàm lượng N tổng số và N formol ở các nghiệm thức pH Ngày 5 Ngày 9 N tổng số N formol N tổng số N formol 5 3.6700c 2,4850c 3.8135b 2.83500b 6 5.5915a 4,3750a 6.4050a 6.08500a 7 4.3970b 3,0800bc 6.3417a 5.70750a 8 4.3580b 3,1500b 6.2222a 5.60000a CV% 4.60409 4,60409 4.60409 4,60409 LSD0,01 0.6675 0,6241 0.2433 0.2999 Ghi chú: Các trung bình cùng ký tự không khác biệt có nghĩa ở mức xác suất p < 0,01. g/l 7 6.085 5.708 6 5.600 pH 5 4.375 5 4 6 3.150 3.080 7 3 2.835 2.485 8 2 1 0 Ngày Ngày 5 Ngày 9 Hình 3.5: Hàm lượng N formol ở các nghiệm thức Qua bảng 3.7 Khi sử dụng môi trường pH khác nhau trong quá trình thủy phân protein trong phụ phẩm cá Tra bằng enzyme Bromelin có trong phế phẩm dứa thì kết quả ủ ở 49
59. ngày 5 cho thấy kết quả lượng N tổng số và N formol có sự khác biệt ở các môi trường pH khác nhau. Kết quả chuyển hóa tốt nhất ở môi trường pH =6 .Và lượng N tổng số và N formol được thủy phân có sự khác biệt rõ rệt ở trong các điều kiện môi trường pH khác nhau, thủy phân tốt nhất ở pH = 6. Tuy nhiên với 5 ngày ủ thì chưa thể khẳng định là ở pH = 6 là tốt nhất hay không nên cần ủ thêm 4 ngày để kiểm tra lại kết quả. Sau khi ủ thêm 4 ngày thì kết quả ủ ở ngày 9 cho thấy lượng N tổng số và lượng N formol đều tăng lên ở các môi trường pH so với ủ ngày thứ 5, kết quả lượng N tổng số không có sự khác biệt ở các môi trường pH = 6,7 và 8 nhưng có sự khác biệt rõ rệt so với môi trường pH = 5. Và lượng N tổng số và N formol được thủy phân có sự khác biệt rõ rệt ở trong các điều kiện môi trường pH khác nhau, trong đó thủy phân tốt nhất ở pH = 6. Từ kết quả qua 5 và 9 ngày ủ cho ta thấy thủy phân phụ phẩm cá Tra ở môi trường pH = 6 mang lại hiệu quả tốt nhất. Tuy nhiên, để tính sự chuyển hóa từ N tổng số sang N formol thì cần phải tính tỷ lệ (%) N formol trên N tổng số. Bảng 3.8: Tỷ lệ (%) N formol/N tổng số ở các nghiệm thức Nghiệm thức pH N formol/N tổng số sau các ngày ủ (%) Ngày 5 Ngày 9 NT 1 pH 5 68 80 NT 2 pH 6 78 95 NT 3 pH 7 70 90 NT 4 pH 8 72 90 Ghi chú: Các trung bình cùng ký tự không khác biệt có nghĩa ở mức xác suất p < 0,01 50
60. 100% 95% 90% 90% 90% 80% 78% 80% 72% 68% 70% 70% 60% ngày 5 50% Ngày 9 40% 30% 20% 10% 0% pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 Hình 3.6 Tỷ lệ (%) N formol/N tổng số ở các nghiệm thức Qua bảng 3.8 biểu đồ 3.6 cho thấy, với các mức pH theo dõi, chỉ sau 5 ngày ủ, có > 60- 70% đạm tổng số chuyển sang đạm amin. Đến 9 ngày sau ủ, ở pH= 6 đã có 95% đạm tổng số chuyển sang đạm formol. Các pH =7 và 8 có khoảng 90% đạm tổng số chuyển hóa sang đạm formol. Trong khi ở pH =5 chỉ khoảng 80% N tổng số được chuyển sang N formol. Như vậy, pH tối ưu cho hoạt động của enzyme Bromelin với cơ chất phế phẩm cá là pH = 6. 51
61. 3.1.5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân phụ phế phẩm cá tra bằng enzym bromelin trong phế phẩm dứa Để có hiệu quả thủy phân cao nhất thì ngoài việc lựa chọn tỷ lệ lượng phế phẩm dứa, lượng nước thêm vào , pH phù hợp với cơ chất thì việc xác định thời gian thủy phân thích hợp là rất cần thiết để vừa đem lại hiệu quả thủy phân tối ưu nhất. Bảng 3.9: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân protein cá Tra. Thời gian ( ngày) N tổng số N formol N formol/ N tổng số (%) 3 3,8673c 3,0250c 78.21 6 4,7250b 3,4700c 73,49 9 6,6183a 5,5917b 84.48 12 6,7840a 6,1650a 90,88 15 6,8600a 6,1883a 90,20 CV% 3,16927 3,16927 LSD0,01 0,3556 0,7819 Ghi chú: Các trung bình cùng ký tự không khác biệt có nghĩa ở mức xác suất p < 0,01. g/l 8 6.86 6.784 7 6.6183 6.1883 6.165 6 5.5917 5 4.725 N tổng số 4 3.8673 3.47 N formol 3.025 3 2 1 0 Ngày 3 6 9 12 15 Hình 3.7: Hàm lượng N formol và N tổng số (g/l) ở các nghiệm thức 52
62. 100% 91% 90% 90% 84% 78% 80% 73% 70% Tỷ lệ 60% đạm 50% 40% 30% 20% 10% 0% Ngày 3 Ngày 6 Ngày 9 Ngày 12 Ngày 15 Hình 3.8 Tỷ lệ (%) N formol/N tổng số ở các nghiệm thức Số liệu ở bảng 3.9 và biểu đồ 3.7 cho thấy, enzyme Bromelin trong phế phẩm dứa có khả năng thủy phân protein cá rất tốt và có khả năng chuyển hóa từ đạm tổng số sang đạm amin rất cao. Thể hiện, lượng N tổng số đạt cao so các ngày phân hủy. Chỉ sau 12 ngày ủ, với tỷ lệ phế phẩm dứa trên phế phẩm cá Tra là 1:1 (tính theo khối lượng), đã có 90% đạm tổng số chuyển sang đạm ở dạng acid amin. Số liệu ở bảng 3.10 và biểu đồ 3.8 cũng cho thấy, không có sự sai khác về tỷ lệ phần trăm N formol/ N tổng số ở ngày thứ 12 và ngày thứ 15. Vì vậy theo sinh viên, để sản xuất phân bón lá từ nguồn vỏ dứa và phế phẩm cá tra chỉ cần ủ trong vòng 12 ngày. 3.1.6.: Ổn định dung dịch thủy phân bằng rỉ đường Sản phẩm thủy phân từ protein cá nếu không bảo quản đúng cách thì có thể làm thay đổi màu sắc và giảm hàm lượng các chất có trong dịch thủy phân qua thời gian. Do đó, việc bổ sung chất bảo quản vào dịch thủy phân là hết sức quan trọng. 53
63. Bảng 3.10: Ảnh hưởng của nồng độ rỉ đường bổ sung. Nghiệm thức Nồng độ rỉ đường Ntổng số trước bổ Ntổng số sau bảo bổ sung sung rỉ đường quản 1 tháng NT1 0 6,7840 4,6150 NT2 5% 6,7840 6,7450 NT3 10% 6,7840 6,7160 g/l 8 6.784 6.816 7 6.745 6 5 4.615 N tổng số 4 3 2 1 0 Trước ổn định 0% 5% 10% Rỉ đường Hình 3.9: Ảnh hưởng của nồng độ rỉ đường bổ sung đến lượng đạm tổng số sau thời gian bảo quản Qua bảng 3.10 và biểu đồ 3.9 ta tháy khi bổ sung rỉ đường với các liều lượng khác nhau vào dịch thủy phân từ phụ phẩm cá tra và sau 1 tháng bảo quản cho thấy: hàm lượng N tổng số giảm hẳn ở nghiệm thức không bổ sung rỉ đường. Trong khi đó, các nghiệm thức bỏ sung rỉ đường 5 và 10%, lượng N tổng số không giảm so với ban đầu và không có sự khác nhau về lượng N tổng số giữa nghiệm thức bổ sung 5% và 10% rỉ đường. Có lẽ, bổ sung rỉ đường vào dịch thủy phân đã hạn chế sự tiêu hao lượng đạm trong dịch. Mặt khác, trong quá trình bảo quản thì mùi hôi ở nghiệm thức 54
64. không sử dụng rỉ đường nặng hơn nhiều so với khi sử dụng rỉ đường. Sở dĩ có kết quả này vì khi bổ sung rỉ đường vào dịch thủy phân thì đã làm hạn chế sự hoạt động của các vi sinh vật nên lượng đạm mất đi ít và hạn chế sinh ra các khí gây mùi như H2S Từ các kết quả trên, nhóm sinh viên khuyến cáo bổ sung rỉ đường từ 5%- 10% vào dịch thủy phân để tạo phân bón lá cho cây trồng. 55
65. SƠ ĐỒ QUY TRÌNH THỦY PHÂN PHỤ PHẨM CÁ Phụ phẩm cá Loại bỏ mỡ Xay nhuyễn Bổ sung nước Bổ sung phế phẩm dứa Thủy phân Lọc bỏ cặn Dịch thủy phân Phối trộn Thành phẩm 56
66. Phụ phẩm cá Tra sau khi lấy về từ nhà máy chế biến phile thì tiến hành loại bỏ mỡ. Tiến hành xay nhuyễn phụ phế phẩm cá Tra. Lấy 20 kg phụ phế phẩm cá Tra thêm 35 lít nước khuấy đều, sau đó thêm 15 kg phế phẩm dứa xay nhuyễn và tiếp tục khuấy đều. Tiến hành thủy phân hỗn hợp này trong điều kiện pH = 6, nhiệt độ phòng thí nghiệm trong thời gian 12 ngày. Khi hết thời gian thủy phân, tiến hành lọc qua 2 lần để loại bỏ cặn (lần 1: lọc qua lưới lọc kích thước 0,5 mm để loại bỏ xương; lần 2: lọc qua vải lọc kích thước 0,05 mm để loại bỏ các chất cặn còn lại). Cuối cùng thu được dịch thủy phân với lượng khoảng 42 lít, bổ sung 5% rỉ đường vào dịch thủy phân để hạn chế sự phát triển của vi sinh vật. Sản phẩm thu được là dịch thủy phân làm nguyên liệu để sản xuất phân bón lá từ phụ phẩm cá Tra. 3.2. KHẢO NGHIỆM CHẾ PHẨM PHÂN BÓN LÁ TỪ PHỤ PHẨM CÁ TRA CHO MỘT RAU CẢI NGOÀI ĐỒNG RUỘNG. 3.2.1. Khảo nghiệm chế phẩm phân bón lá cho cải xanh trồng ngoài đồng. Dịch thủy phân từ phụ phẩm cá Tra chưa phối trộn và dịch thủy phân sau khi được phối thành chế phẩm phân bón lá được sử dụng cho cải xanh trồng ngoài đồng thu được kết quả như sau: Bảng 3.11: Ảnh hưởng của phân bón lá đến chiều cao của cây cải Nghiệm thức Mẫu Các ngày 10 17 30 NT1 Nước 6,2000 b 15,1000 b 24,300 b NT2 Dịch chiết 6,7000 b 18,3000 a 28,467 a NT3 Chế phẩm 7,7000 a 19,4000 a 30,500 a NT4 Phân bón 7,6000 a 19,2000 a 30,200 a CV% 2,30600 2,30600 2,30600 LSD 0,01 0,6657 1,6142 2,985 Ghi chú: Các trung bình cùng ký tự không khác biệt có nghĩa ở mức xác suất p < 0,01. 57
67. Qua theo dõi chiều cao cây của rau cải ở các thời kỳ cho thấy: sau trồng 10 và 17, 30 ngày thì chiều cao cây rau cải ở các công thức đều có sự khác biệt. Sau trồng 30 ngày, công thức sử dụng chế phẩm với liều lượng 2% có hiệu quả nhất với chiều cao cây rau cải đạt 30,5 cm và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng. cm 35 30.530.2 30 28.7 24.3 25 Nước 19.419.2 20 18.5 dịch chiết 15.1 chế phẩm 15 phân bón 10 7.7 7.6 6.2 6.7 5 0 Ngày 9 Ngày 17 Ngày 30 Hình 3.10: Chiều cao cây cải ở các nghiệm thức Biểu đồ 3.10 cho thấy sự khác biệt về chiều cao của cây cải trong quá trình phun xịt theo các công thức khác nhau, kết quả cho thấy chiều cao của cây phát triển tốt nhất ở công thức chế phẩm chiều cao của cây ngày 10 là 7,7 cm , ngày 30 là 30,5 cm và chiều cao cây phát triển chậm nhất ở công thức nước. Qua đó thấy được chế phẩm mang lại hiệu quả nhất trong các công thức thí nghiệm. 58
68. Bảng 3.12 : Ảnh hưởng của phân bón lá đến số lá rau cải Nghiệm thức Mẫu Các ngày 10 17 30 NT1 Nước 3,60000c 5,8000c 7,5000c NT2 Dịch chiết 3,85000b 6,1000b 7,7000bc NT3 Chế phẩm 4,20000a 6,7000a 8,4000a NT4 Phân bón Sen 4,10000a 6,6000a 8,2000ab Trắng CV% 2,30600 2,30600 2,30600 LSD 0,01 0,1489 0,2578 0,5879 Ghi chú: Các trung bình cùng ký tự không khác biệt có nghĩa ở mức xác suất p < 0,01 số lá 9 8.4 8.2 8 7.5 7.7 7 6.7 6.6 6.1 5.8 6 Nước dịch chiết 5 4.2 4.1 3.85 chế phẩm 4 3.6 phân bón 3 2 1 0 Ngày 10 Ngày 17 Ngày 30 Hình 3.11: Số lá/cây ở các nghiệm thức Qua bảng 3.13 và biểu đồ 3.11 cho ta thấy số lá của rau cải qua các giai đoạn có sự chênh lệch khi sử dụng các loại chế phẩm phân bón lá khác nhau. Số lá tốt nhất ở NT3 (8,4 lá/cây) không có sự khác biệt so với cây cải được phun bằng phân bón lá 59
69. được bán trên thị trường ở NT4 (8,2 lá/cây). Nhưng cao hơn hẵn so với cây cải được phun bằng nước lã (7,5 lá/cây). Qua đó thấy được chế phẩm ảnh hưởng tốt đến cây cải Bảng 3.13: Ảnh hưởng của chế phẩm phân bón lá đến năng suất Nghiệm Loại phân bón Nồng độ sử Trọng lượng Năng suất thức dụng (g/cây) Kg/m2 NT1 (ĐC) Phun nước 60,2 2,408 NT2 Dịch thủy 2% 72,4 2,896 phân NT3 Chế phẩm 2% 80,1 3,204 NT4 Phân bón 2% 80,4 3,216 bông sen trắng Ghi chú: Các trung bình cùng ký tự không khác biệt có nghĩa ở mức xác suất p < 0,01 g 90 80.1 80.4 80 72.4 70 60.2 60 50 cải 40 30 20 10 0 Nước Dịch chiết Chế phẩm Phân bón Sen Trắng Hình 3.12:Khối lượng trung bình của cây cải 60
70. kg 3.5 3.204 3.216 2.896 3 2.408 2.5 2 Cải xanh 1.5 1 0.5 0 Nước Dịch chiết Chế phẩm Phân bón Sen Trắng Hình 3.13 Năng suất thực thu của cây cải ở các nghiệm thức Kết quả bảng 3.14 và biểu đồ 3.12 và 3.13 cho thấy việc sử dụng dịch chiết thô với nồng độ 2% và chế phẩm sản xuất từ phế phẩm cá tra (nồng độ 2%) giúp cho cây phát triển tốt hơn, trọng lượng cây đạt tương ứng là 72,4g/cây và 80,1 g/cây. Đặc biệt trọng lượng cây ở công thức phun chế phẩm không sai khác so với phun phân bón lá sen trắng được bán trên thị trường (80,4g/cây) trong khi đối chứng phun nước lã chỉ đạt 60,2 g/cây. Về năng suất thực thu, công thức phun dịch chiết thô và chế phẩm cho năng suất tương ứng là 2,9 và 3,2 kg/m2 cao hơn hẳn so với đối chứng (2,04 kg/ m2) ,. Riêng công thức phun chế phẩm cho năng suất không thua kém so với phân bón lá bông sen trắng đang bán trên thị trường (3,2 kg/ m2 ). 61
71. A B C D B Hình 3.14: Cây cải được 10 ngày tuổi (A: phun nước; B: phun dịch chiết thô 2%; C: phun chế phẩm 2%; D: phun phân bón Sen Trắng 2%) 62
72. A B C D B Hình 3.15: Cây cải được 17 ngày tuổi (A: phun nước; B: phun dịch chiết thô 2%; C: phun chế phẩm 2%; D: phun phân bón Sen Trắng 2%) 63
73. A B B C D Hình 3.16: Cây cải được 30 ngày tuổi (A: phun nước; B: phun dịch chiết thô 2%; C: phun chế phẩm 2%; D: phun phân bón Sen Trắng 2%) 64
74. IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận - Tỷ lệ phế phẩm trong trái dứa chiếm đến 69,98% và có hoạt tính enzyme cao, thích hợp cho việc tận dụng để phân hủy phế phẩm cá tra. - Tỷ lệ vỏ dứa: phế phẩm cá thích hợp nhất là 0,75: 1. - Lượng nước bổ sung thích hợp nhất là 1: 1 tính theo khối lượng dứa + cá : nước. - Sử dụng enzym bromelin trong phế phẩm dứa thủy phân phụ phế phẩm cá Tra tối ưu trong điều kiện pH = 6, nhiệt độ bình thường phòng thí nghiệm và thời gian là 12 ngày. - Bổ sung rỉ đường với nồng độ từ 5- 10% cho hiệu quả tốt trong bảo quản dịch thủy phân từ phế phẩm cá tra. - Đưa ra được quy trình tạo phân bón lá từ phế phẩm dứa và phế phẩm cá tra. - Dich thủy phân thô và chế phẩm với nồng độ 2% cho hiệu quả cao trong việc tăng năng suất cây cải. Trong đó, phun chế phẩm 2% trên cây rau cải cho năng suất tương đương với phân bón lá đang bán trên thi trường. 4.2. Đề nghị - Định lượng P và K có trong dịch thủy phân từ phụ phế phẩm cá tra. - Thử nghiệm chế phẩm trên một số cây trồng khác - Phổ biến quy trình cho nông dân tự sản xuất để sử dụng trong sản xuất nhằm giảm lượng phân hóa học trên cây cải 65
75. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Mai Thị Phương Anh. Trần Văn Lài và Trần Khắc Thi, Rau và trồng rau. NXB Nông nghiệp. Hà Nội, 1996, 19-20. [2] Nguyễn Trọng Cẩn và Đỗ Minh Phụng, Công nghệ chế biến thực phẩm thủy sản (tập 2)-Ướp muối. chế biến nước mắm. chế biến khô. thức ăn chín. Tp.Hồ Chí Minh: NXB Nông Nghiệp, 1990. [3] Choudhari. S.M. and More T.A., Fertigation. fertilizer and spacing requirement of Tropical gynoecious cucmber hybrids. ISHS. Tsukuba. Japan. Acta Hort., 2002, 61: 588. [4] Diniz F. M and Martin A.M., Influence of process variables on the hydrolysis of shark muscle protein. Food Science and Technology International, 1998, 4. 91 – 98. [5] Nguyễn Thị Xuân Dung, Sử dụng enzym papain để thủy phân bánh dầu đậu nành và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân. Luận văn tốt nghiệp cử nhân ngành Công Nghệ Sinh Học. Đại học Cần Thơ, 2005 [6] Guler. S. and H. Ibrikci, Yield and elemental composition of cucumber as affected by drip and furrow irrigation. ISHS Acta Horticulturae. 571: Workshop Towards and Ecologically Sound Fertilisation in Field Vegetable Production, 2004 [7] Nguyễn Như Hà, Giáo trình bón phân cho cây trồng. Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội, 2006. [8] Hiệp hội rau quả Việt Nam, Tình hình xuất khẩu rau quả Việt Nam. diện tích sản lượng. kim ngạch xuất khẩu. thị trường và thị phần thanh long trong kim ngạch xuất khẩu rau quả. Hội thảo: Giải pháp phát triển sản xuất. tiêu thụ trái thanh long tỉnh Long An năm 2013. Ngày 29 tháng 8 năm 2013. [9] Mạc Xuân Hòa và Trần Bích Lam. Tối ưu hóa quá trình thu nhận protein hydrolysate có hoạt tính liên kết canxi từ phế phẩm cá tra (Pangasiidae). Error! Hyperlink reference not valid. 66
76. [10] Ibrahim G. Rubeiz. Response of greenhouse cucumber to mineral fertilizers on a high phosphorus and potassium soil. Faculty of Agricultural and Food Sciences. American University of Beirut. New York. NY [11] Nguyễn Đình Khôi, Sử dụng enzym và nghiền cá để lên men nhanh nước mắm cá Trích. Luận án thạc sĩ khoa học ngành Công Nghệ Sinh Học. Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học. Đại học Cần Thơ, 2003 [12] Kotsiras. A. C. M. Olympios and H. C. Passan, Effect of nitrogen form and concenda trơntions on the yield and quality of cucumbers grown on rockwool during spring and winter in Southern Greece. J. Pl. Nutr., 2005, 28 (11):2027-2035. [13] Đoàn Ngọc Lân, Nghiên cứu khả năng thích ứng và các biện pháp kỹ thuật trồng trọt để tăng năng suất. chất lượng sản phẩm của một số giống dưa chuột nhập nội trên địa bàn tỉnh Thanh Hóa. Luận án tiến sĩ Nông nghiệp. Hà Nội, 2006 [14] Võ Thị Bạch Mai, Thủy canh cây trồng. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh, 2003 [15] Mackie. I.M., Fish protein hyprolysates. Process Biochemistry, 1982 17: 26-32. [16] Mahmoudreza O. Majid T. Ali M. Barbara R. and Abbas E. M., Optimization of enzymatic hydrolysis of visceral waste proteins of beluga sturgeon Huso huso using Alcalase. Int Aquat Res (2009) 1: 31-38 [17] Min-T. G. Makoto H. Eiichi T. and Tadashi H., Acid-hyprolysis of fish wastes for lactic acid fermentation. Bioresource Technology 97 (2006), 2005, 2414-2420. [18] Muzaifa M. Novi S. and Fahrizal Z., Production of protein hydrolysates from fish byproduct prepared by enzymatic hydrolysis. Aquaculture, Aquarium, Conservation & Legislation, 2012, (5) :1, 36 [19] Nguyễn Thị Nếp, Khảo sát khả năng thủy phân protein phụ phẩm cá tra bằng enzym protease từ Bacillus subtilis S5. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành Công Nghệ Thực Phẩm. Khoa Nông Nghiệp. Đại học Cần Thơ, 2005 [20] Trần Thanh Nhãn, Tối ưu hóa quy trình sản xuất Gelatin từ da cá Basa bằng 67
77. phương pháp dùng enzym. Nghiên cứu y học – Y học TP. Hồ Chí Minh. Tập 3. Phụ bản số 2, 2009 [21] Trần Thanh Nhãn và Trần Nguyễn Tú Oanh, Tối ưu hóa quy trình xử lý máu cá Basa bằng enzym. Nghiên cứu y học – Y học TP. Hồ Chí Minh. Tập 3. Phụ bản số 2, 2009 [22] Osman. A. M. S. Sidahmed Al-Rawahi and F. S. Al-Raisy., Response of cucumber to nitrogen fertigation under plastic house conditions. Sudan J. Agri. Res.,2004, (4):13-17. [23] Đặng Thị Mộng Quyên và Trần Thị Xô, Nghiên cứu tận dụng cá phế liệu để sản xuất dịch cao đạm dùng trong thức ăn nuôi tôm. cá. Tạp chí Nông Nghiệp & Phát Triển Nông Thôn 16, 2006, (2): 41- 43. [24] See. S. F. Hoo L. L., and Babji. A. S., Optimization of enzymatic hydrolysis of Salmon (Salmo salar). International Food Research Journal 18 (4), 2011, 1359 – 1365. [25] Nguyễn Hữu Thanh và Nguyễn Thị Thanh Xuân, Bài giảng vi sinh vật đại cương. Khoa Nông Nghiệp & Tài Nguyên Thiên Nhiên. Đại học An Giang, 2003 [26] Trần Khắc Thi, Kỹ thuật trồng rau sạch – NXB Nông nghiệp. Hà Nội, 1999 [27] Viện CISDOMA - Trung tâm nghiên cứu xuất bản sách và tạp chí, Bảo quản chế biến nông sản. sản phẩm chăn nuôi và cá. Hà Nội: NXB Lao Động Xã Hội, 2005 [28] Waseem. K. Q.M. Kamran and M.S. Jilani., Effect of different levels of nitrogen on the growth and yield of Cucumber (Cucumis sativus L.). J. Agric. Res. 46, 2008, 259-266. 68
78. PHỤ LỤC 69