Đồ án Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic ức chế nấm mốc sinh Aflatoxin

111 trang thiennha21 13/04/2022 6700

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic ức chế nấm mốc sinh Aflatoxin", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_phan_lap_va_tuyen_chon_vi_khuan_lactic_uc_che_nam_moc.pdf

Nội dung text: Đồ án Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic ức chế nấm mốc sinh Aflatoxin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ NẤM MỐC SINH AFLATOXIN Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực hiện : Nguyễn Trần Yến Tiên MSSV: 1311100092 Lớp: 13DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2017
Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của Tiến sĩ Nguyễn Hoài Hương khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi trường của trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Những kết quả này hoàn toàn không sao chép từ các nghiên cứu khoa học khác dưới bất kì hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án này đều hoàn toàn trung thực. Tôi xin chịu trách nhiệm toàn bộ về đồ án của mình. Tp.HCM, ngày 09 tháng 08 năm 2017 Sinh viên thực hiện Nguyễn Trần Yến Tiên
Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành được đồ án “Phân lập và định danh vi khuẩn lactic có khả năng ức chế nấm mốc sinh Aflatoxin” trong suốt quá trình học tập, rèn luyện và trau dồi kiến thức. Cũng không ít lần gặp khó khăn trắc trở nhưng nhờ sự hướng dẫn tận tình của Cô Nguyễn Hoài Hương nay em đã hoàn thành được đồ án của mình. Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ tận tình của Cô Nguyễn Hoài Hương. Khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường trường Đại học Công nghệ TPHCM. Chính nhờ Cô đã truyền tải kiến thức và những kỹ năng để em đạt được thành quả trong đồ án mà em thực hiện hôm nay. Chân thành gửi lời cám ơn sâu sắc đến các Thầy cô giảng viên và Ban lãnh đạo Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường trường Đại học Công nghệ TPHCM đã tạo điều kiện cho em tìm hiểu tài liệu để hoàn thành được đồ án tốt nghiệp đúng thời gian quy định. Dù hoàn thành được đồ án nhưng cũng khó tránh khỏi những sai sót nhất định do khả năng hiểu biết hạn hẹp và thông tin tài liệu không mấy khả quan để phục vụ quá trình thực hiện đồ án. Kính mong có sự góp ý và hướng dẫn tận tình của các thầy cô để em học hỏi thêm những kinh nghiệm, tích lũy cho quá trình học tập rèn luyện và chuẩn bị hành trang bước sang một môi trường làm việc mới sau này. Kính chúc Cô Nguyễn Hoài Hương và các Thầy cô giảng viên, Ban lãnh đạo Khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường trường Đại học Công nghệ TPHCM sức khỏe, thành công và may mắn. Em xin chân thành cảm ơn! TP.HCM, ngày 09 tháng 08 năm 2017 Sinh viên thực hiện Nguyễn Trần Yến Tiên
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 4 DANH MỤC CÁC BẢNG 5 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH 7 MỞ ĐẦU 10 1. Tính cấp thiết đề tài 10 2. Tình hình nghiên cứu 11 3. Mục tiêu nghiên cứu 12 4. Nội dung nghiên cứu 12 5. Phương pháp nghiên cứu 12 5.1. Phương pháp luận 12 5.2. Phương pháp xử lý số liệu 13 6. Kết cấu đồ án 13 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 14 1.1. Tổng quan về nấm 14 1.1.1. Giới thiệu chung 14 1.1.2. Độc tố nấm 15 1.1.3. Tác hại của nấm 17 1.1.4. Một số chủng nấm gây độc trong thực phẩm 18 1.1.5. Một số phương pháp khử nhiễm độc tố 19 1.2. Tổng quan về vi khuẩn lactic 21 1.2.1. Giới thiệu vi khuẩn lactic 21 1.2.2. Phân loại 22 1.2.3. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn lactic. 23 1.2.4. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa 25 1.2.5. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic 26 1.2.6. Quá trình trao đổi chất 28 1.2.7. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men, quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic 31 1.2.8. Ứng dụng của vi khuẩn lactic 32 1
Đồ án tốt nghiệp 1.2.9. Hoạt tính sinh học 33 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1. Địa điểm nghiên cứu 38 2.2. Thời gian thực hiện 38 2.3. Vật liệu 38 2.3.1. Nguồn phân lập 38 2.3.2. Thiết bị và dụng cụ 38 2.3.3. Hóa chất 38 2.3.4. Giống nấm 40 2.4. Phương pháp luận 40 2.5. Phương pháp thí nghiệm 43 2.5.1. Thu thập mẫu 43 2.5.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic 43 2.5.3. Khảo sát hình thái, sinh lý, sinh hoá. 45 2.6. Khảo sát khả năng tăng trưởng và lên men lactic. 49 2.7. Khảo sát khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic bằng phương pháp in vitro. 49 2.7.1. Khảo sát khả năng đối kháng nấm trực tiếp theo phương pháp in vitro. 49 2.7.2. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào 53 2.8. Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic trong bảo quản hạt. 55 2.8.1. Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 102/12g hạt: 55 2.8.2. Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 101/12g hạt: 57 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 60 3.1. Kết quả khảo sát hình thái, sinh lý, snh hoá. 60 3.1.1. Thử nghiệm Catalase 61 3.1.2. Nhuộm Gram 62 3.1.3. Nhuộm bào tử 63 3.1.4. Khả năng lên men đường và khả năng sinh khí 64 3.1.5. Thử nghiệm khả năng di động bằng phương pháp thạch mềm. 66 2
Đồ án tốt nghiệp 3.2. Khảo sát khả năng tăng trưởng và lên men lactic. 71 3.3. Khảo sát khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic bằng phương phap in vitro. 73 3.3.1. Khảo sát khả năng kháng nấm trực tiếp của chủng vi khuẩn lactic. 73 3.3.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào. 76 3.4. Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 102/12g hạt: 78 3.5. Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 101/12g hạt: 87 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 94 4.1 Kết luận 94 4.2 Kiến nghị 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO 95 PHỤ LỤC 1 3
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT LAB lactic acid bacteria /Lactobacillales VK Vi khuẩn MRS de Man, Rogosa and Sharpe PDA Potato Detrose Agar ĐC Đối chứng TN Thí nghiệm. 4
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh trưởng của các chi vi khuẩn lactic 25 Bảng 1.2. Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men (Corsetti và cộng sự, 1998) 34 Bảng 1.3. Các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic có tính kháng sinh. (Holzapfel và cộng sự, 1995) 35 Bảng 1.4 Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn LAB. (Holzapfel và cộng sự, 1995) 37 Bảng 2.1: Kí hiệu các nguồn phân lập 43 Bảng 3.1: Bảng kí hiệu các chủng vi khuẩn phân lập 61 Bảng 3.2 Trình bày hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các vi khuẩn phân lập. 67 Bảng 3.3. Trình bày tóm tắt về các chủng phân lập có đặc điểm đặc trưng cho vi khuẩn lên men lactic. 70 Bảng 3.4: Bảng xử lý số liệu khả năng sinh acid và giá trị OD của 11 chủng vi 71 khuẩn phân lập. 71 Bảng 3.5: Phân nhóm các chủng vi khuẩn lactic 72 Bảng 3.6 .Thống kê số liệu phần trăm tỉ lệ ức chế của 11 chủng vi khuẩn phân lập được với 2 chủng nấm mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn. 74 Bảng 3.7. Kết quả khả năng sinh enzyme của các chủng vi khuẩn 76 Bảng 3.8. Khả năng kháng nấm CĐP1 của Canh trường nuôi cấy các chủng vi khuẩn ứng dụng trên đậu phộng với mật độ nhiễm 102 bào tử/g đậu phộng. 78 Bảng 3.9. Khả năng kháng nấm CĐP2 của Canh trường nuôi cấy các chủng vi khuẩn ứng dụng trên đậu phộng với mật độ nhiễm 102 bào tử/g đậu phộng. 82 Bảng 3.10. Khả năng kháng nấm CĐP1 của Canh trường nuôi cấy các chủng vi khuẩn ứng dụng trên đậu phộng với mật độ nhiễm 101 bào tử/g đậu phộng. 87 Bảng 3.11. Khả năng kháng nấm CĐP2 của Canh trường nuôi cấy các chủng vi khuẩn ứng dụng trên đậu phộng với mật độ nhiễm 101 bào tử/g đậu phộng. 89 5
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.12. Thời gian bắt đầu xuất hiện tơ nấm (ngày) của 11 chủng vi khuẩn với mật độ cảm nhiễm 101bt/g đậu phộng và 102bt/g đậu phộng. 90 Bảng 3.13. So sánh khả năng tăng trưởng, lên men lactic, kháng nấm in vitro và in vivo của các chủng vi khuẩn phân lập. 91 6
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH Hình 1.1: Một số vi khuẩn lactic điển hình 24 Hình 1.2. Sơ đồ các con đường lên men lactose của vi khuẩn lactic 29 Hình 2.1 Sơ đồ phân lập và định danh sơ bộ vi khuẩn lactic 42 Hình 2.2: Cách pha loãng mẫu 44 Hình 2.3: Sơ đồ khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn. 50 Hình 2.4: Mô tả cách đo đường kính vòng ức chế của phương pháp vạch 2 đường vi khuẩn 52 Hình 2.5: Sơ đồ thí nghiệm khả năng sinh enzyme của các chủng LAB. 53 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn lactic 60 Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn lactic trên môi trường có chứa chất chỉ thị 61 Hình 3.3: Thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn (Từ trái qua phải): Thử nghiệm âm tính của chủng vi khuẩn KC1A, Đối chứng âm là nước cất, thử nghiệm dương tính đối với Bacillus spp. 62 Hình 3.4 Kết quả nhuộm gram của chủng vi khuẩn: A. Vi khuẩn Bacillus subtilis bắt màu tím. B. Vi khuẩn E.coli bắt màu hồng. C. Vi khuẩn phân lập 63 Hình 3.5 Kết quả nhuộm bào tử của chủng vi khuẩn. A. Vi khuẩn Bacillus subtilis sinh bào tử. B. Vi khuẩn E.coli không sinh bào tử. C. Vi khuẩn phân lập không sinh bào tử 64 Hình 3.6. Thử nghiệm lên men đường. Ống 1: Vi khuẩn không lên men đường. Ống 2: Vi khuẩn lên men đường có sinh khí. Ống 3: Vi khuẩn lên men đường nhưng không sinh khí . 65 Hình 3.7 Vi khuẩn lactic phân lập được có khả năng lên men đường. 66 Sau thử nghiệm lên men đường, thu được kết quả cho thấy trong số 11 chủng phân lập thì có 10 chủng là vi khuẩn lên men đồng hình, 1 chủng còn lại là lên men dị hình. Các chủng phân lập từ Kim chi đều lên men đồng hình sinh acid lactic, còn với các chủng phân lập từ Nem chua có duy nhất 1 chủng là lên men dị hình, 4 7
Đồ án tốt nghiệp chủng còn lại đều lên men đồng hình. Chủng lên men dị hình đó thường mang lại cho Nem chua nhiều giá trị cảm quan hơn do hình thành sản phẩm phụ ngoài acid lactic. 66 Hình 3.8. Kiểm tra tính di động của vi khuẩn. Ống a: Vi khuẩn có khả năng di động. Ống b: Vi khuẩn không có khả năng di động. Ống c: Vi khuẩn phân lập được không có khả năng di động. 67 Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn %Acid tổng và sinh khối của 11 chủng vi khuẩn sau 24h nuôi cấy. 72 Hình 3.10. Khả năng đối kháng nấm CĐP2 của chủng vi khuẩn phân lập. 74 Hình 3.11. Khả năng đối kháng nấm CĐP1 của chủng vi khuẩn phân lập 74 Hình 3.12. Biểu đồ thể hiện phần trăm tỉ lệ ức chế nấm của các chủng vi khuẩn. 75 Hình 3.13. Khả năng đối kháng CĐP1 của NC412 sau 3 ngày. 75 Hình 3.14. Khả năng đối kháng CĐP2 của KC1A sau 3 ngày. 75 Hình 3.15. Khả năng đối kháng CĐP1 của KC242 sau 3 ngày. 76 Hình 3.16. Khả năng phân giải Tinh bột của chủng vi khuẩn KC13 77 Hình 3.17. Khả năng phân giải Protein của chủng vi khuẩn KC1B 77 Hình 3.18. Khả năng phân giải Chitin của chủng vi khuẩn KC1A 77 Hình 3.19 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7. Từ trên xuống: ĐC (-) – Đối chứng nước cất, ĐC (+) – Đối chứng Carbezim, Chủng VK KC211, Chủng VK KC1A. 79 Hình 3.20 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7. Từ trên xuống: Chủng VK KC1B, KC13, KC106, KC242. 80 Hình 3.21 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7. Từ trên xuống: Chủng VK NC2, NC12, NC172, NC412. 81 Hình 3.22 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7, ngày 13, ngày 19. Từ trên xuống: ĐC (-) – 8
Đồ án tốt nghiệp Đối chứng nước cất, ĐC (+) – Đối chứng Carbezim, Chủng VK KC211, Chủng VK KC1A. 83 Hình 3.23 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7, ngày 13, ngày 19. Từ trên xuống: Chủng VK KC1B, KC13, KC106, KC242. 84 Hình 3.24 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7, ngày 13, ngày 19. Từ trên xuống: Chủng VK NC2, NC12, NC172, NC412. 85 Hình 3.25. Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày (Từ trái sang: ngày 1, 2, 3, 4, 6 và 12 ngày. Từ trên xuống: ĐC (-) – Đối chứng nước cất, ĐC (+) – Đối chứng Carbezim, Chủng VK KC1A và chủng NC412. 92 Hình 3.26. Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày (Từ trái sang: ngày 1, 2, 3, 4, 6 và 12 ngày. Từ trên xuống: ĐC (-) – Đối chứng nước cất, ĐC (+) – Đối chứng Carbezim, Chủng VK KC1A và chủng NC412. 93 9
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết đề tài Song song với sự phát triển về kinh tế, chính trị và xã hội thì bên cạnh đó lĩnh vực Công nghệ sinh học cũng đang dần phát triển ngày càng rộng mở. Ngày nay con người ta đã ứng dụng các thành tựu khoa học công nghệ vào trong cuộc sống, áp dụng trên tất cả các loại hình từ công nghiệp, nông nghiệp, an ninh quốc phòng cho đến giải trí, v.v Công nghệ sinh học chính là kết quả của các quá trình nghiên cứu khoa học công nghệ. Các nhà khoa học, các nhà nghiên cứu, ứng dụng các kiến thức từ các tài liệu trên toàn Thế Giới và áp dụng các biện pháp kỹ thuật để cho ra đời các giống cây trồng, vật nuôi, vi sinh vật có tính năng ưu việt hơn các loại giống hiện có. Bên cạnh đó còn có thể tạo ra những loại thức ăn mới, nghiên cứu ra các loại thuốc, chất xét nghiệm bệnh, những mầm móng mới có giá trị phục vụ đời sống, phát triển kinh tế - xã hội và bảo vệ môi trường. Đặc biệt hơn là áp dụng trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm. Các nghiên cứu Công nghệ sinh học cho ra đời các loại vi sinh vật dùng trong chế biến và bảo quản thực phẩm, điều tiết các loại vi khuẩn, nấm mốc có trong thực phẩm. Hạn chế mầm bệnh và sự lây lan đến môi trường sống. Xã hội ngày càng phát triển nên con người luôn phải chạy theo sự phát triển đó. Cuộc sống của họ trở nên bận rộn hơn, họ bắt đầu “sống vội” hơn. Thay vì sử dụng các thực phẩm xanh, sạch thì con người lại chọn những thực phẩm chế biến sẵn mà không biết hầu hết chúng đều được bảo quản bằng chất hóa học. Bản thân thực phẩm cũng có thể chứa các mầm bệnh là nguyên nhân trực tiếp gây ra các dịch bệnh hiện nay. Mặc dù áp dụng tiến bộ kỹ thuật trong công nghệ và quy phạm vệ sinh an toàn thực phẩm (GMP, HACCP ), nhưng nguy cơ nhiễm các vi sinh vật gây bệnh trong quá trình chế biến thực phẩm ngày càng gia tăng (Theo Besselink, et al., 2008). Chính vì thế, các cơ sở sản xuất thực phẩm phải dùng đến các chất bảo quản hóa học. Mặc dù, nếu chúng được sử dụng với liều lượng cho phép nhưng các chất 10
Đồ án tốt nghiệp phụ gia này vẫn gây ra các tác dụng không mong muốn cho người tiêu dùng. Nhưng còn có rất nhiều trường hợp, do lợi nhuận, các nhà sản xuất còn sử dụng các loại hóa chất bị nghiêm cấm để có thể tăng hương vị sản phẩm hoặc kéo dài được hạn sử dụng hơn. Có thể nói: Hiện nay con người dường như đang sống cùng hóa chất và sức khỏe con người đang đứng trước bờ vực thẳm. Theo đó tôi đã dựa trên những nghiên cứu, những tài liệu mà các thầy cô cung cấp, và tìm hiểu thêm trên các trang thông tin khoa học để thực hiện đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic ức chế nấm mốc sinh Aflatoxin”. Loại vi khuẩn này có khả năng kháng lại các loại nấm mốc dùng trong chế biến và bảo quản thực phẩm. Đảm bảo thực phẩm đạt chất lượng dinh dưỡng hợp lý, nâng cao chất lượng sản phẩm nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng cao trên thị trường nội địa lẫn quốc tế. Do đó, tôi đã thực hiện đề tài này nhằm phục vụ quá trình làm đồ án tốt nghiệp cũng như là tìm tòi, học hỏi, tích lũy các kinh nghiệm thực tiễn trong quá trình tham khảo, nghiên cứu các ứng dụng của khuẩn lên men lactic cùng với các phương pháp xử lý nguyên liệu và chế biến hợp lý nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm, tạo ra sự đồng nhất của sản phẩm sau khi lên men, kéo dài thời gian bảo quản góp phần vào việc đáp ứng nhu cầu sử dụng đa dạng sản phẩm và đảm bảo hợp vệ sinh cho người sử dụng. 2. Tình hình nghiên cứu Phân lập và định danh vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng nấm chống bệnh than (Asma Saleh Elmabrok et al ,2012) Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic mới phân lập (Nora LAREF*, Bettache GUESSAS, 2013) Phân lập và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sản sinh hợp chất kháng khuẩn của Lactobacillus plantarum (Lê Ngọc Thùy Trang và cộng sự, 2014) Phân lập, định danh và xác định các chủng Lactobacillus có tiềm năng Probiotic từ người (Hoàng Quốc Khánh và cộng sự) 11
Đồ án tốt nghiệp Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic dùng trong chế biến và bảo quản thưc ăn thô xanh và phụ phẩm nông nghiệp cho gia súc nhai lại (Đào Thị Lương và các cộng sự, 2010) Nghiên cứu đặc điểm và vai trò của Lactobacillus acidophilus trong chế biến Probiotic (Trần Thị Ái Liên, 2011) Ngoài ra còn có nhiều công trình nghiên cứu khác về vi khuẩn lactic trong và ngoài nước 3. Mục tiêu nghiên cứu Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng nấm mốc gây nhiễm độc trên thực phẩm. 4. Nội dung nghiên cứu - Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống như kim chi và nem chua. - Khảo sát khả năng tăng trưởng và lên men lactic của các chủng phân lập. - Khảo sát khả năng đối kháng nấm sinh aflatoxin in vitro. - Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của cac chủng phân lập. - Khảo sát khả năng kháng nấm in vivo qua thí nghiệm bảo quản đậu phộng. 5. Phương pháp nghiên cứu 5.1. Phương pháp luận - Lựa chọn nguồn phân lập là các loại thực phẩm lên men truyền thống như kim chi, nem chua, vì các nguồn này chứa các vi khuẩn sống và có tiềm năng kháng nấm cao. - Phân lập vi khuẩn lên men lactic bằng môi trường chuyên biệt có bổ sung NaN3 và khăng định khả năng sinh acid bằng chỉ thị, dựa vào khoá phân loại của Bergey’s Manual (Theo Benson Lab Manual, 2001) và định danh sơ bộ vi khuẩn lên men lactic. - Tuyển choṇ các chủng vi khuẩn phân lập qua khảo sát sinh khối và acid tổng tạo thành. 12
Đồ án tốt nghiệp - Tuyển choṇ các chủng vi khuẩn phân lập kháng nấm in vitro của các chủng phân lập áp dụng phương pháp đối kháng trực tiếp (cấy 2 đường vi khuẩn). - Tuyển choṇ các chủng vi khuẩn phân lập qua kháng nấm in vivo qua thí nghiệm bảo quản đậu phộng. 5.2. Phương pháp xử lý số liệu - Sử dụng phần mềm excel để vẽ đồ thị - Sử dụng phần mềm SAS 9.4 để xử lý số liệu 6. Kết cấu đồ án Mở đầu Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung chương đề cập đến các nội dung liên quan đến tài liệu nghiên cứu Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án. Chương 3: Kết quả và biện luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề tài thực hiện được và đưa ra những biện luận cho kết quả thu được. Kết luận và kiến nghị – nội dung chương tóm lại những kết quả mà đề tài đạt được và đề nghị cho những hướng cải thiện thêm trong đề tài. 13
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về nấm 1.1.1. Giới thiệu chung Giới Nấm (tên khoa học: Fungi) bao gồm những sinh vật nhân chuẩn dị dưỡng có thành tế bào bằng chitin. Phần lớn nấm phát triển dưới dạng các sợi đa bào được gọi là sợi nấm (hyphae) tạo nên hệ sợi (mycelium), một số nấm khác lại phát triển dưới dạng đơn bào. Quá trình sinh sản (hữu tính hoặc vô tính) của nấm thường qua bào tử, được tạo ra trên những cấu trúc đặc biệt hay quả thể. Một số loài lại mất khả năng tạo nên những cấu trúc sinh sản đặc biệt và nhân lên qua hình thức sinh sản sinh dưỡng. Những đại diện tiêu biểu của nấm là nấm mốc, nấm men và nấm lớn (nấm quả thể). Giới Nấm là nhóm sinh vật đơn ngành (monophyletic) mà có nguồn gốc hoàn toàn khác biệt với những sinh vật có hình thái tương tự như nấm nhầy (myxomycetes) hay mốc nước (oomycetes). Nấm có mối quan hệ gần với động vật hơn thực vật, cho dù thế thì môn học về nấm, hay nấm học, lại thường được xếp vào thành một nhánh của thực vật học. Trên Trái Đất, đa phần các nấm đều không thể nhìn thấy được bằng mắt thường, chúng sống phần lớn ở trong đất, chất mùn, xác sinh vật chết, cộng sinh hoặc ký sinh trên cơ thể động, thực vật và nấm khác. Vi nấm đóng một vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân hủy các vật chất hữu cơ và không thể thiếu được trong chu trình chuyển hóa và trao đổi vật chất. Một số loài nấm có thể nhận thấy được khi ở dạng quả thể, như nấm lớn và nấm mốc. Nấm được ứng dụng rất rộng rãi trong đời sống lẫn sản xuất. Nhiều loài được sử dụng trong công nghệ thực phẩm, sử dụng làm thức ăn hoặc trong quá trình lên men. Nấm còn được dùng để sản xuất chất kháng sinh, hoóc môn trong y học và nhiều loại enzyme. Tuy vậy, nhiều loại nấm lại có chứa các chất hoạt động sinh học được gọi là mycotoxin như ancaloit và polyketit-là những chất độc đối với động vật lẫn con người. Một số loại nấm được sử dụng để kích thích hoặc dùng trong các nghi lễ truyền thống với vai trò tác động lên trí tuệ và hành vi của con người. Vài loại nấm có thể gây ra các 14
Đồ án tốt nghiệp chứng bệnh cho con người và động vật, cũng như bệnh dịch cho cây trồng, mùa màng và có thể gây tác động lớn lên an ninh lương thực và kinh tế. Nấm mốc (hay còn gọi là vi nấm) là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản, là tế bào không có diệp lục tố, thường sinh sản thông qua bào tử hoặc sống dị dưỡng (hoại sinh, kí sinh, cộng sinh), quá trình sinh sản có thể là vô tính nhay hữu tính.Vách tế bào chủ yếu là chitin, có hoặc không có cenllulose và một số thành phần khác có hàm lượng thấp. Nấm mốc thường thường phát triển dưới dạng sợi đa bào gọi là sợi nấm (hyphae) tạo hệ sợi (mycelium). Có 2 loại sợi: Sợi nấm dinh dưỡng: nằm trong lớp môi trường, làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng cho toàn bộ hệ nấm. Sợi nấm khí sinh: thường nhô ra môi trường, giữ vai trò sinh sản (tạo bào tử). 1.1.2. Độc tố nấm 1.1.2.1. Các loại độc tố do nấm tiết ra Độc tố nấm mốc (mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa đạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc đối với động vật có vú, cá, gia cầm và con người. Theo Nguyễn Thị Hiền (2009) hiện nay có khoảng 300 loài độc tố được phát hiện và nghiên cứu. Tuy nhiên chỉ có khoảng 20 loài độc tố có trong thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng và liên quan đến an toàn thực phẩm. Được tạo bởi năm chi nấm là Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaría và Claviceps, chúng bao gồm: - Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2), ochratoxin A, stermatocystin, acid cyclopianxoic. - Các độc tố của Penicillium: Pautulin, ochratoxin A, citrinin, penitrem A và axit cyclopianzoic toxin, fumonisin, moniliformin, diacetocyscirpenon. - Các độc tố của Fusarium: deoxynivalenon, nivalenon, zearalenon, T-2 toxin. - Các độc tố của Alternaria: Acid tenuazoic, alternarion, methyl ether alternarion. - Các độc tố của Claviceps: Các alkaloid của nấm cựa gà Một số độc tố gây hội chứng chảy máu, triệu chứng ngưng kết hồng cầu hay hiện tượng tiêu máu rất nguy hiểm thường gặp ở động vật và người bị nhiễm độc tố. 15
Đồ án tốt nghiệp Mycotoxin còn làm suy yếu hệ thống miễn dịch của cơ thể. Nhiều độc tố như aflatoxin, ochratoxin, funomisin có thể là các chất gây biến dị, ung thư, quái thai. Có 4 tác động gây độc của độc tố vi nấm là: Độc cấp tính, mãn tính, gây đột biến và quái thai. Phổ biến nhất là độc cấp tính, làm hư gan và rối loạn chức năng hoạt động của thận, có thể gây chết đối với trường hợp nặng. Các độc tố vi nấm tác động lên hệ thần kinh, ở nồng độ thấp gây tê liệt động vật và ở nồng độ cao có thể gây tổn thương não và chết. Những bệnh do độc tố nấm mốc (Mycotoxin) gây nên trước tiên là biểu hiện tổn thương ở gan và thận. Có thể quan sát được sự xuất hiện các u gan, thoái hoá tế bào nhu mô gan, xơ hoá. Mycotoxin còn phá hủy tế bào gan và thận, ảnh hưởng trực tiếp lên hệ miễn dịch, ăn mòn thành ruột và dạ dày. Ngoài ra còn có các dấu hiệu tăng ure huyết, albumin niệu và viêm cầu thận. 1.1.2.2. Độc tố Aflatoxin Độc tố gây độc chủ yếu và nguy hại nhất là Aflatoxin. Chúng là độc tố vi nấm do nấm mốc Aspergillus flavus, A.parasiticus sản sinh, thường gây ô nhiễm trên một số hạt (như lạc). Phản ứng gây độc của chúng chủ yếu là trong gan. Nếu mức độ nhiễm độc thấp sẽ tích lũy dần trong gan và làm giảm khả năng sinh sản của động vật và nặng hơn sẽ gây ung thư. Các loài sinh aflatoxin thuộc chi Aspergillus phân bố rất rộng trong tự nhiên. Chúng có thể tạo khuẩn lạc và gây nhiễm vào hạt trước khi thu hoạch và trong quá trình bảo quản. Cây chủ rất dễ bị gây nhiễm bởi Aspergillus sau phơi nhiễm kéo dài trong môi trường có độ ẩm cao hoặc bị tổn thương các điều kiện xấu như hạn hán. Các môi trường sống bản địa của Aspergillus là trong đất, thực vật mục nát và ngũ cốc đang bị giảm sức đề kháng vi sinh vật và nó xâm nhập tất cả các loại chất hữu cơ mỗi khi có điều kiện được thuận lợi cho sự phát triển của nó. Điều kiện thuận lợi bao gồm độ ẩm cao (ít nhất là 7%) và nhiệt độ cao. Các loại nông sản thường bị nhiễm aflatoxin là ngũ cốc (ngô, kê, lúa miến, gạo, lúa mì), hạt có dầu (lạc, đậu tương, hạt hướng dương, hạt bông), gia vị (ớt, hạt tiêu đen, rau mùi, nghệ, gừng) và các loại quả hoặc hạt khác như hạt dẻ, 16
Đồ án tốt nghiệp dừa Aflatoxin cũng có thể xuất hiện trong sữa của động vật được cho ăn bằng thức ăn nhiễm aflatoxin. Ở người, aflatoxin gây ngộ độc cấp tính qua đường ăn uống và nhiễm ở liều lượng cao trong thời gian ngắn. Những triệu chứng cấp tính chuyên biệt bao gồm: Xuất huyết, huỷ hoại gan cấp tính, phù nề, cản trở hấp thu các chất và tử vong. Trong khi đó, nếu hấp thu ở liều lượng từ thấp đến trung bình trong một thời gian dài thì khó có thể nhận biết, một số triệu chứng có thể kể đến như là chuyển hoá thức ăn kém, sụt cân, nhưng rõ nhất chính là ngộ độc mãn tính trên gan và ung thư gan. Ở động vật, các triệu chứng nhiễm độc aflatoxin được nghiên cứu thông qua các vụ nhiễm độc tự nhiên và qua thí nghiệm trên động vật. Sự nhiễm độc mãn tính aflatoxin có tính di truyền theo ba kiểu: Gây ung thư, quái thai, đột biến. Hậu quả của việc nhiễm aflatoxin còn phụ thuộc vào tuổi, giới tính, loài, tình trạng dinh dưỡng và mức độ tiếp xúc. Chẳng hạn như động vật càng non thì khả năng mẫn cảm với tác nhân càng cao. Ngoài Aflatoxin, một số độc tố vi nấm thường gặp là ochratoxin Penicillium do nấm Aspergillus tiết ra. Độc tố zearalemon và tricothecenes chủ yếu do nấm Fusarium tiết ra. Độc tố patulin lại do nấm Penicillium và Fumonisin tiết. 1.1.3. Tác hại của nấm 1.1.3.1. Tác hại của nấm gây ra cho thực vật Những loài nấm gây bệnh trên cây trồng có thể gây thiệt hại lớn cho ngành nông nghiệp và lâm nghiệp. Ví dụ như nấm đạo ôn (Magnaporthe oryzae) gây bệnh cho lúa. Những loài gây bệnh cho cây thuộc các chi Fusarium, Ustilago, Alternaría và Cochliobolus. Chúng làm thối rễ, tổn thương các bộ phận của cây trồng, hoa, quả, làm giảm năng suất hoặc chất lượng sản phẩm nông nghiệp do bị ẩm mốc, 1.1.3.2. Tác hại của nấm gây ra cho người và động vật Dị ứng hoặc ngộ độc do ăn hoặc tiếp xúc với nấm: Có khoảng 70 loài nấm sinh bào tử là những tác nhân gây dị ứng. Chúng có thể là nấm mốc trong nhà hay 17
Đồ án tốt nghiệp ngoài trời, đa phần là nấm sợi như các chi Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Helminthosporium, Epicoccum, Penicillium, Fusarium , chỉ có vài loài là nấm đơn bào như Candida, Rhodotorula, có một số loài là nấm lớn như Agaricus, Coprinus, Fomes, Ganoderma Bào tử nấm có thể gây ra những chứng như hen suyễn, viêm mũi dị ứng, các bệnh nấm dị ứng phế quản phổi và viêm phổi quá mẫn. Ngộ độc do ăn phải nấm độc, có thể từ rối loạn tiêu hoá, ảo giác, hoặc trầm trọng có thể tử vong. Nấm kí sinh trên cơ thể người gây bệnh trực tiếp: Những loài có thể gây bệnh cho người thuộc các chi như Aspergillus, Candida, Cryptococcus, Histoplasma và Pneumocystis. Chúng có thể gây ra các bệnh ngoài da ở người như nấm chân, nấm móng, nấm tóc, hắc lào, lang ben, cho đến những bệnh nguy hiểm có thể gây chết người như viêm màng não (nấm Cryptococcus) hay viêm phổi do nấm Pneumocystis carinii. 1.1.4. Một số chủng nấm gây độc trong thực phẩm Trong hệ vi khuẩn, nấm mốc thiên nhiên hiện có 3 chủng nấm mốc chiếm ưu thế đã và đang gây độc cho thực phẩm là Aspergillus, Fusarium và Penicillium thường tiết độc tố vi nấm vào thực phẩm vào khoảng thời gian trước, trong và sau khi thu hoạch ngũ cốc, hạt có dầu, Một trong những nguyên nhân được nhắc đến là do con người đã ăn thực phẩm có nấm mốc chứa aflatoxin, một độc tố vi nấm đã được chứng minh có thể gây ung thư gan trên thực nghiệm. Bệnh do nhiễm aflatoxin cấp tính với các biểu hiện chính là suy chức năng gan cấp, xơ gan và hoại tử nhu mô gan. Nhưng cơ chế tác động của aflatoxin gây ung thư gan ở người cũng còn rất nhiều tranh cãi. Tuy nhiên ở một số nghiên cứu, các nhà khoa học đã tìm thấy có sự gắn kết của aflatoxin B1 với DNA của tế bào gan cũng như có sự đột biến gen mà đặc biệt là gene p53 – một gene kiểm soát sự chết tế bào, ở những bệnh nhân mắc ung thư gan. 18
Đồ án tốt nghiệp 1.1.5. Một số phương pháp khử nhiễm độc tố 1.1.5.1. Phương pháp vật lý Phân loại cơ học: Quá trình này loại bỏ các hạt nhiễm độc tố Mycotocxin. Giai đoạn này rất quan trọng vì rất có thể việc loại bỏ không hết sẽ đến việc độc tố đi vào thức ăn. Rửa bằng nước hoặc bằng dung dịch Na2CO3 cũng làm giảm nồng độ Mycotocxin trong hạt ngũ cốc. Có thể cho hạt vào nước và loại bỏ những hạt nổi. Phương pháp này cũng có thể loại bỏ Mycotocxin nhưng cần chú ý rằng, có một số hạt nổi nhưng không chứa mycotocxin. Phân hủy aflatoxin bằng không khí nóng: Dùng không khí nóng thổi qua nguyên liệu có chứa aflatoxin để làm giảm thiểu lượng aflatoxin đã được nhiều tác giả nghiên cứu, phương pháp này đã đem lại nhiều kết quả đáng kể. Nếu nhiệt độ không khí nóng đưa vào là 100°C - 145°C ở ngô hạt thì lượng aflatoxin B1 có thể giảm từ 877 ppb còn 452 ppb, từ 378 ppb còn 213 ppb. Nếu tăng nhiệt độ lên tới 165°C có thể làm cho lượng aflatoxin B1 giảm đến 65% (Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003). Phân hủy aflatoxin bằng hấp ướt ở áp suất cao: Phương pháp hấp ướt ở nhiệt độ cao dưới áp lực hơi nước đem lại kết quả khả quan hơn. Quá trình này phá hủy nhanh chóng vòng lacton trong cấu trúc phân tử của aflatoxin. Theo Rehana (1979) nhận thấy nếu gạo nhiễm aflatoxin từ 40 - 4000 ppb được hấp ướt trong 5 phút ở 120°C (thêm nước vào gạo tỷ lệ là 1:4) có thể làm giảm hàm lượng aflatoxin đến 68%. Ở đậu phộng có độ ẩm 10%, chứa 7000 ppb aflatoxin B1 được hấp ướt ở 120°C trong 4 giờ giảm còn 370 ppb. Ở hàm lượng aflatoxin thấp (760ppb) được hấp ở 1,5 atm trong vòng một giờ đã phân hủy hoàn toàn aflatoxin. (Theo Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003). Tách aflatoxin bằng dung môi hữu cơ: Đây là phương pháp có thể áp dụng đối với thức ăn và nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi, do ít có khả năng tạo sản phẩm khác có hoạt tính từ aflatoxin và có thể thu hồi được dung môi mà không ảnh hưởng đến thành phần dinh dưỡng của thức ăn. Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đã thu được bằng việc dùng hệ thống chiết suất bao gồm hỗn hợp hexan-methanol, 19
Đồ án tốt nghiệp hexan-ethanol, hexan-ethanol-nước và hexan-acetone-nước. Hệ thống bao gồm 54% acetone, 44% hexan và 2% nước (tính theo trọng lượng) là hệ thống thành công nhất được tìm thấy có thể đồng thời loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12% - 15% dầu và dư lượng lipid gần bằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40 μg/kg. 1.1.5.2. Phương pháp hóa học Phương pháp sử dụng các chất oxi hóa-khử: Các chất oxy hóa-khử như Natri Hypochlorite (NaOCl), Hydrogen Peroxide (H2O2) được sử dụng để làm mất độc tính của aflatoxin. Tuy nhiên sử dụng NaOCl để xử lý hạt nhiễm aflatoxin có thể làm mất màu sắc của hạt và biến chất các acid amin. Khí ozone (O3) cũng được thử nghiệm về khả năng phân hủy aflatoxin trong mẫu và đạt được hiệu quả tốt, song có bằng chứng là chất lượng các thành phần của thức ăn bị giảm đặc biệt là protein, vitamin. Phương pháp sử dụng khí NH3: Nhiều thí nghiệm đã chứng minh hiệu quả của việc dùng khí NH3 làm vô hoạt aflatoxin. Xử lý ngô bằng khí NH3 được đặc biệt quan tâm ứng dụng hơn cả. Người ta nhận thấy, nếu hàm lượng NH3 là 0,5 - 1,5% và nhiệt độ bên ngoài là 25°C, trong 14 ngày tiếp xúc, lượng aflatoxin từ 200ppb có thể giảm xuống còn 10 ppb (theo Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003). 1.1.5.3. Phương pháp sinh học Mặc dù các biện pháp phòng chống nấm mốc sinh độc tố đã được khuyến cáo áp dụng, nhưng sự nhiễm aflatoxin trên nông sản ở mức độ cao quá giới hạn là không thể tránh được trong những điều kiện bảo quản bất lợi. Vấn đề khử nhiễm aflatoxin bằng con đường sinh học nhằm thay thế cho biện pháp khử nhiễm aflatoxin bằng các hóa chất có giá thành cao và làm biến đổi phẩm chất lượng lương thực nên khó áp dụng vào thực tiễn bảo quản được chứng minh là các phương pháp hứa hẹn nhất. Khử nhiễm độc tố aflatoxin bằng phương pháp sinh học có thể được định nghĩa như sự phân giải bằng enzyme hay chuyển hóa sinh học của các độc tố nấm mốc trực tiếp nhờ vi sinh vật. 20
Đồ án tốt nghiệp 1.2. Tổng quan về vi khuẩn lactic 1.2.1. Giới thiệu vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic (LAB) có vai trò rất quan trọng trong cuộc sống của chúng ta. Chúng tạo ra các thực phẩm lên men và bảo quản thực phẩm khỏi bị hư hỏng. Từ đầu thế kỷ 20, Elie Metchnikoff (1845-1916) đã đề xuất sử dụng các LAB cho mục đích chữa bệnh. Từ đó, lĩnh vực nghiên cứu probiotic đã ra đời và phát triển. Đến nay, những nghiên cứu về probiotic đã không ngừng cung cấp những bằng chứng có tính khoa học về hiệu quả thực sự của probiotic đối với sức khỏe con người. Bên cạnh đó, các sản phẩm chức năng sử dụng các vi khuẩn probiotic xuất hiện ngày càng nhiều ở Châu Âu, Nhật, Mỹ Hiện nay, một số sản phẩm probiotic cũng được bày bán trên thị trường Việt Nam như: sữa bột Gain IQ (Abbott Laboratories), (Hoàng Quốc Khánh và cộng sự) Từ lâu vi khuẩn lactic đã được con người ứng dụng rộng rãi để chế biến các loại thức ăn chua (sữa chua, muối dưa, muối cà, ), ủ chua thức ăn cho gia súc hoặc để sản xuất acid lactic và các loại muối của acid lactic. Từ năm 1780, lần đầu tiên nhà hóa học người Thụy Điển Scheele đã tách được acid lactic từ sữa bò lên men chua. Năm 1875, L.Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic. 21 năm sau đó (1878), Lister đã phân lập được vi khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactic (ngày nay gọi là Streptococcus lactic) và đến năm 1881 ngành công nghiệp lên men nhờ vi khuẩn lactic đã được hình thành. Vi khuẩn lên men lactic gọi là vi khuẩn lactic, chúng được Pasteur tìm ra từ sữa bị chua và hiện nay chúng được công nhận là an toàn sinh học (generally recognized as safe - GRAS), được sử dụng thường xuyên trong thực phẩm và có đóng góp trong hệ vi sinh vật có ích của con người. Một đặc tính quan trọng khác của vi khuẩn lactic là chúng có khả năng tạo ra bacteriocin (chất kháng khuẩn) như lactacin, brevicin, lacticin, helveticin, sakacin, plantacin, có tác dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển của các nguồn bệnh trong thực phẩm (Theo Batt, 1999; Dubernet et al., 2002). 21
Đồ án tốt nghiệp Vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn diện rộng do có khả năng sản xuất ra các chất ức chế: như một số acid hữu cơ, hydrogen peroxide, diacetyl, các chất có khối lượng phân tử thấp và bacteriocin là chất có khả năng ức chế cả vi khuẩn gram (+) và vi khuẩn gram (-). Các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sản sinh acid hữu cơ, đặc biệt là acid lactic trong quá trình sinh trưởng và phát triển. Đối với hydroxy peroxide thì khả năng kháng khuẩn là do việc tạo ra các chất oxy hóa mạnh như oxygen nguyên tử, các gốc tự do superoxide và các gốc tự do hydroxyl. Đối với bacteriocin, cơ chế kháng khuẩn do vi khuẩn lactic tổng hợp đã được nghiên cứu đầu tiên ở nisin, bacteriocin gram (+) (Theo Thomas L. V. et al,2002). Dựa trên bản chất cation và tính kị nước, hầu hết các peptide hoạt động như màng tế bào thấm. Bacteriocin có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải DNA, RNA và tấn công vào lớp peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào (Theo Rattanachaikunsopon P. et al, 2010). 1.2.2. Phân loại Nhóm vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriaccae và được xếp vào năm giống: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và Leuconostoc, Aerococcus. Nhóm vi khuẩn này có rất nhiều hình dạng khác nhau, chẳng hạn như chúng là trực khuẩn ngắn hay que (rod) dài ở dạng đơn, đôi hoặc xếp thành chuỗi và cầu khuẩn (cocci). Theo bảng phân loại được sửa đổi hiện nay, vi khuẩn lactic gồm khoảng 20 giống thuộc họ Lactobacillaceae, chúng thường có dạng hình cầu (hoặc ovan) và hình que, trong đó các giống chủ yếu nhất là: Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Tetragenococcus, Vagococcus và Weisslella. Việc phân loại vi khuẩn lactic vào các chi khác nhau phần lớn là dựa trên hình thái sinh học, chế độ và con đường lên men khác nhau, tăng trưởng ở nhiệt độ khác nhau, qui trình sản xuất acid lactic, khả năng phát triển ở nồng độ muối cao, và chịu được acid hoặc kiềm. Phân loại theo con đường hóa học như thành phần acid béo và các thành phần của thành tế bào, ngoài ra phương pháp sinh học di truyền hiện đại cũng được sử dụng trong phân loại. 22
Đồ án tốt nghiệp 1.2.3. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn lactic. Vi khuẩn lactic (Lactic acid bacteria – LAB) là vi khuẩn Gram dương, chịu acid, không hình thành bào tử, không có khả năng di động, hình que hoặc hình cầu (Nguyễn Đức Lượng, Vi sinh công nghệ, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 2004.). Vi khuẩn lactic phát triển tốt nhất với pH 5.5 – 5.8 và có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp đối với các amino acid, peptide, vitamin, khoang, acid béo và carbonhydrate. (Nguyễn Lân Dũng và cs, Vi sinh vật học, NXB Giaó Dục, 2002.) Khuẩn lạc của vi khuẩn lactic tròn nhỏ, trong bề mặt bóng, màu trắng đục hoặc màu vàng kem, hoặc khuẩn lạc có kính thước to hơn tròn lồi trắng đục. Đặc biệt khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của acid. Về kích thước tế bào thì đối với các dạng cầu khuẩn là từ 0.5 – 1.5μm. Các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau. Còn với trực khuẩn thì từ 1 - 8μm. Trực khuẩn đứng riêng rẻ hoặc kết thành chuỗi.  Đặc điểm hình thái giống vi khuẩn lactic điển hình: Trong số các vi khuẩn lactic, giống Lactobacillus được xem là đại diện cho chủng vi khuẩn này. Tùy thuộc vào hình thái tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành 2 dạng : hình cầu và hình que. Kích thước của chúng thay đổi tùy theo từng loài. - Giống Lactobacillus • Giới : Vi khuẩn • Ngành : Firmicutes • Lớp: Bacilli • Bộ: Lactobacillales • Họ: Lactobacillacea 23
Đồ án tốt nghiệp • Giống: Lactobacillus Hình 1.1: Một số vi khuẩn lactic điển hình Chi Lactobacillus hiện bao gồm hơn 125 loài như: L. acidophilus, L. brevis, L. casei, L. fermentum, L. plantarum, L. bulgaricus Tế bào có dạng hình que nhưng hình dạng của chúng có thể thay đổi tùy vào điều kiện của môi trường sống, có thể là dạng que ngắn hoặc dài, xếp thành chuỗi hay đứng riêng lẻ hoặc ở dạng que kép. Lactobacillus là vi khuẩn Gram dương, không di động, không sinh bào tử, âm tính với catalase, kỵ khí chịu oxy, có khả năng chịu được môi trường có pH thấp. Một số loài có thể phát triển ở môi trường nghèo chất dinh dưỡng, và chịu được nhiệt độ cao. Ngoài trừ loài L.plantarum thì những loài khác không có khả năng chuyển hóa nitrate khi ở điều kiện nhất định. Các loài Lactobacillus thường được tìm thấy các sản phẩm lên men từ động vật và thực vật, đặc biệt là trong các sản phẩm sữa, trong hệ tiêu hóa, hệ bài tiết và hệ sinh dục người. Các loại thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩm chức năng cũng có chứa các vi khuẩn này như: Lactobacillus pasterian, Lactobacillus brevis, Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus sake, Lactobacillus plantarum. 24
Đồ án tốt nghiệp Sự phân chia của vi khuẩn lactic dựa theo các sản phẩm của quá trình trao đổi chất của chúng. Vì vậy có thể chia các loài Lactobacillus thành 3 nhóm như sau: - Nhóm I (Lên men đồng hình bắt buộc): Chúng được gọi là Thermobacterium, có fructose - 1,6 - diphosphate aldolase (FDP aldolase) nhưng không có phosphoketolase. Chúng lên men được hexose để tạo acid lactic nhưng không lên men được pentose, thường phát triển ở 45oC. - Nhóm II (Lên men dị hình tùy nghi): Chúng được gọi là Streptobacterium (có FDP aldolase và cảm ứng phosphoketolase). Tuy nhiên, hexose là lên men đồng hình và pentose được chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acid acetic. - Nhóm III (Lên men dị hình bắt buộc): Chúng được gọi là Betabacterium (có phosphoketolase nhưng không có FDP aldolase), quá trình trao đổi chất cả hexose và pentose lên men dị hình. Trên thực tế, đã có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng Lactobacillus rất hữu ích trong việc điều trị hoặc ngăn ngừa nhiễm nấm, nhiễm trùng đường ruột, hội chứng ruột kích thích, tiêu chảy do dùng thuốc kháng sinh, tiêu chảy do nhiễm khuẩn Clostridium difficile, cơ thể không phân giải được lactose, bệnh về da như: ban đỏ do sốt, chàm, viêm loét da và ngăn ngừa nhiễm trùng đường hô hấp. 1.2.4. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh trưởng của các chi vi khuẩn lactic Chi Hình Lên Nhiệt độ Khả năng pH tăng Lactic thái tế men tăng trưởng, chịu trưởng aicd bào lactic oC muối,% isomer 10 45 6,5 18 4,4 9,6 Lactobacillus que đh/dh ± ± ± - ± - D,L,DL Lactococcus Cầu đh + - - - ± - L Leuconostoc Cầu dh + - ± - ± - D 25
Đồ án tốt nghiệp Oenococcus Cầu dh + + ± - ± - D Pediococcus Tứ cầu đh ± ± ± - + - D,L,DL Streptococcus Cầu đh - + - - - - L Tetragenococcus Tứ cầu đh + - + + - + L Aerococcus Tứ cầu đh + - + - - + L Carnobacterium Que dh + - - - - - L Enterococcus Cầu đh + + + - + + L Vagococcus Cầu đh + - - - ± - L Weissella Cầu dh + - ± - ± - D,L,DL (đh: đồng hình ; dh: dị hình) Vi khuẩn lactic là vi khuẩn gram (+), hoạt tính catalase, nitratase, oxidase âm tính, không có khả năng di động đồng thời không sinh bào tử, có khả năng lên men carbonhydrate, thử nghiệm MR-VP, citrate, indol, khả năng sinh H2S. 1.2.5. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao. Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau. Ngoài các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cơ bản như carbon, nitơ một phần dưới dạng các acid amin, photphat và lưu huỳnh chúng còn cần một số chất cần thiết khác như vitamin, muối vô cơ, các chất sinh trưởng để sinh trưởng một cách bình thường. - Nhu cầu dinh dưỡng carbon: Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydrate carbon từ các monosaccaride (glucose, fructose, manose), các disaccharide (saccharose, lactose, maltose) cho đến các polysaccharide (tinh bột, dextrin). Chúng sử dụng nguồn carbon nhằm cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ như acid citric, lactic, pyruvic, fumaric, acetic, - Nhu cầu dinh dưỡng Nitơ: Đa số vi khuẩn lactic không thể tự tổng hợp được các hợp chất chứa nitơ mà phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi 26
Đồ án tốt nghiệp trường. Các nguồn nitơ có thể sử dụng như: cao thịt, pepton, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, - Nhu cầu dinh dưỡng Vitamin: Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin. Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men - Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác: Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các baz nitơ hay các acid hữu cơ. Một số acid hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như acid citric, acid oleic. Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrate, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quả các chủng vi khuẩn lactic. Tương tự như hai acid hữu cơ trên, acid acetic cũng có những tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào. Nên người ta thường sử dụng acid acetic dưới dạng các muối acetate để làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic. - Nhu cầu các muối vô cơ khác: Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vô cơ. Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magie đặc biệt là mangan, vì mangan tham gia và đảm bảo chức năng hoạt động của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào. - Nhu cầu dinh dưỡng oxi: Lactobacilli là những vi khuẩn vi hiều khí (microaerophile), sinh trưởng trên bề mặt môi trường thạch ở điều kiện kỵ khí, một số loài là vi khuẩn kỵ khí. (Theo Wood B.J.B and Holzapfel W.H. 1995). Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống được trong môi trường có oxy, vừa sống được trong môi trường không có oxy. Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với trong điều kiện kị khí. 27
Đồ án tốt nghiệp 1.2.6. Quá trình trao đổi chất Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông qua việc lên men lactic. LAB có khả năng lên men các loại đường hexose (glucose, mannose, galactose, fructose ), disaccharide (lactose, saccharose ); pentose (arabinose, xylose, ribose ) và các hợp chất liên quan. Chúng chỉ sử dụng được các loại đường ở dạng đồng phân D. Tuy nhiên, LAB có thể thích ứng với nhiều điều kiện khác nhau làm thay đổi cách thức trao đổi chất và dẫn đến các sản phẩm cuối cùng tạo ra cũng khác nhau. Quá trình lên men lactic có thể đồng hình hoặc dị hình. Lên men đồng hình gồm con đường EMP chuyển hóa đường thành pyruvate, sau đó pyruvate bị khử thành lactic acid 90% đường được chuyển hóa thành acid lactic. Trong khi đó ở lên men lactic dị hình chỉ 50% đường được chuyển hóa thành acid lactic, còn lại là CO2, acetaldehyde, ethanol. 28
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2. Sơ đồ các con đường lên men lactose của vi khuẩn lactic A) Lên men đồng hình . B) Lên men dị hình - Lên men lactic đồng hình Lên men đồng hình là quá trình lên men trong đó có các sản phẩm acid lactic tạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng nhỏ acid acetic, acetol, di-acetiyl. Phương trình chung biểu diễn quá quá trình lên men: 29
Đồ án tốt nghiệp C6H12O 2CH3CHOHCOOH + 21,8.104 J Con đường Glycolysis hay con đường EMP (Embden-Meyerhof-Parnas pathway) được sử dụng bởi hầu hết các LAB (ngoại trừ leuconostocs, nhóm III Lactobacilli, Oenococci và Weissellas) tạo ra fructose-1,6-diphosphate (FDP) và nhờ FDP aldolase để tiếp tục chuyển thành dihydroxyacetonephosphate (DHAP) và glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) đối với những chất có mức phosphoryl hóa ở 2 vị trí, sau đó tạo thành pyruvate. Trong điều kiện có nhiều đường và hạn chế oxy, pyruvate bị khử thành acid lactic bởi lactate dehydrogenase (nLDH) và NAD+, do đó NADH đã được oxy hóa trước đó, khi thế oxy hóa khử được cân bằng, sản phẩm cuối cùng được tạo ra chủ yếu là acid lactic và quá trình này được gọi là lên men lactic đồng hình. ( Hình 1.7A) - Lên men lactic dị hình Đặc điểm của con đường này là sự khử hidro ngay từ bước đầu tạo 6- phosphogluconate. Theo sau đó là sự tách carbon tạo pentose-5-phosphate và tiếp tục chuyển hóa thành glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) và acetyl phosphate. GAP được tạo thành tương tự như trong con đường glycolysis và kết quả là tạo ra acid lactic. Trong điều kiện không có mặt của các chất nhận điện tử, acetyl phosphate sẽ bị khử tạo thành ethanol thông qua CoA và acetaldehyde. Khi quá trình này ngoài sản phẩm acid lactic còn tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như CO2, ethanol, acid acetic, acid succinic thì nó được gọi là lên men lactic dị hình. Phương trình chung biển diễn quá trình lên men: C6H12O6 CH3CHOHCOOH + HOOC(CH2)COOH + CH3COOH + C2H5OH +CO2 Trong đó, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%, rượu etylic và acid acetic 10% các loại khí 20% đôi khi không có các khí mà thay vào đó là sự tích luỹ một lượng ít acid foocmic. 30
Đồ án tốt nghiệp 1.2.7. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men, quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic Trong công nghiệp, vật liệu dùng để làm môi trường cho vi sinh vật phát triển cần đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, không có độc tố, cho hiệu suất thu hồi là lớn nhất và giá thành rẻ (Theo Lương Đức Phẩm, 2004). Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy mà còn ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm sinh khối sau này. - Thành phần môi trường nuôi cấy Vi khuẩn lactic thuộc loại vi sinh vật dị dưỡng. Nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống và phát triển của chúng là nguồn năng lượng do trao đổi chất với môi trường bên ngoài. Thành phần môi trường MRS để nuôi cấy vi khuẩn lactic có chứa nhiều chất dinh dưỡng và dễ bị tạp nhiễm cũng ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn lactic. Ngoài ra, để duy trì sự sống, điều hòa các quá trình chuyển hóa trong tế bào, chúng cần sử dụng nguồn glucid có trong môi trường dinh dưỡng làm nguồn carbon (chủ yếu là đường lactose), nguồn nitơ (pepton, acid amin), vitamin, muối khoáng và các yếu tố vi lượng. - Yếu tố môi trường • Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng, ảnh hưởng đến enzyme của tế bào vi sinh vật. Khi nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các enzyme, dẫn đến ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Nhiệt độ càng cao thì sự lên men càng mạnh. Phần lớn vi khuẩn lactic sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 30 – 40oC. Một số có thể sinh trưởng dưới 15oC và thậm chí một số dòng có thể sinh trưởng dưới 5oC (Wood B.J.B and Holzapfel W.H, 1995). • Ảnh hưởng của pH Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh acid làm pH môi trường giảm và khi nó giảm tới mức nào đó nó sẽ ảnh hưởng lên sự phát triển của vi khuẩn lactic. 31
Đồ án tốt nghiệp Do đó, cần phải luôn điều chỉnh pH về khoảng tối thích cho vi khuẩn trong suốt quá trình nuôi, pH tối ưu phải giữa 5.5 và 6.0. • Ảnh hưởng của nồng độ acid Acid là sản phẩm chính của quá trình lên men lactic do hoạt động sống của vi khuẩn lactic tạo nên. Các vi khuẩn này chịu được acid, tuy nhiên với lượng acid tích lũy trong môi trường ngày một nhiều sẽ ức chế chúng. Để giúp vi khuẩn lactic phát triển bình thường không bị chính sản phẩm do hoạt động của chúng để tạo ra, người ta cho vào môi trường các chất đệm thích hợp với một lượng đủ để trung hòa lượng acid sinh ra thông thường chất đệm này là CaCO3. • Vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình lên men Hệ vi sinh vật tạp nhiễm, thường ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men ở những mức độ khác nhau có thể phá hủy các tế bào giống hoặc phá vỡ tế bào quá trình trao đổi chất cần thiết cho sự tạo thành sản phẩm lên men. 1.2.8. Ứng dụng của vi khuẩn lactic Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn carbohydrate khác nhau, hoạt tính kháng nhiều loại vi sinh vật có hại mà các chủng vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều trong công nghệ lên men truyền thống và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: - Thực phẩm: Chúng giúp giảm việc sử dụng các chất hóa học cũng như cường độ xử lý nhiệt, có thể thay thế các chất bảo quản thực phẩm, làm cho thực phẩm sau bảo quản vẫn giữ được trạng thái tự nhiên và đảm bảo tính chất cảm quan và dinh dưỡng, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng về tính an toàn, độ tươi ngon, thực phẩm ăn liền, thực phẩm chế biến tối thiểu và gia tăng sản phẩm có tính cảm quan mới lạ như giảm tính acid hoặc giảm nồng độ muối đồng thời kéo dài được thời gian bảo quản của các sản phẩm thực phẩm như bánh mì. - Công nghiệp: Vi khuẩn lactic là nguồn để lên men sản xuất acid lactic, đem lại nguồn thu hàng tỷ đô vì đây là chất được sử dụng rất rộng rãi ở nhiều lĩnh vực khác nhau. - Y học: Chữa các bệnh đường ruột, cải thiện hệ tiêu hoá 32
Đồ án tốt nghiệp - Nông nghiệp và môi trường: Vi khuẩn lactic hạn chế sự phát triển của nấm Fusarium, Aspergillus, chế phẩm EM có vai trò cải tạo đất và không gây ô nhiễm, ức chế một số vk gây bệnh trên các loài thuỷ hải sản. Ngoài ra còn được ứng dụng trong bảo quản hạt giống do sự phát triển của nấm mốc như: bắp, đậu phộng, . 1.2.9. Hoạt tính sinh học Các vi khuẩn lactic (LAB) có thể sản xuất một số chất kháng sinh như acid lactic và reuterin, ngoài ra còn có các acid hữu cơ, peroxit hydro, bacteriocin kháng khuẩn và các loại peptide kháng nấm. LAB đã được biết đến trong nhiều năm và đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất của một loạt các thực phẩm lên men. Lợi ích sức khỏe của LAB được biết là ảnh hưởng tích cực nhất định trong đường tiêu hóa của con người (Cogan và cộng sự năm 1995, Hafidh và cộng sự, 2010). 1.2.9.1. Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic Giống Lactobacillus đã được nghiên cứu là có hoạt tính kháng nấm khi đánh giá bằng khảo nghiệm thạch lớp phủ chống lại loạt các nấm hư hỏng. Hoạt động kháng nấm của L.coryniformis cornyformis subsp ổn định khi bị nung nóng ở nhiệt độ cao và độ pH 3-4,5 (Magnusson và Schnurer, 2001). Hầu hết các nghiên cứu khả năng kháng nấm của LAB là do việc sản xuất một loại protein kháng nấm hoặc hợp chất proteinaceous và một số các LAB như L.Plantarum và L.Sanfrancisco đặc biệt sản xuất acid hữu cơ với các đặc tính kháng nấm (Corsetti và cộng sự năm 1998; Lavermicocca và cộng sự, 2003.). Hiện nay, hợp chất bảo quản sinh học (biopreservative) duy nhất - nisin có thể được thêm vào thực phẩm sản phẩm của vi khuẩn acid lactic (Theo Gardiner và cộng sự, 2000; Corcoran và cộng sự, 2004.) 33
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.2. Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men (Corsetti và cộng sự, 1998) Hợp chất được xác định Nguồn sản xuất 4-hydroxy-phenyllacticacid Lactobacillus plantarum 3-phenyllacticacid 21B 3-hydroxydecanoicacid Lactobacillus plantarum 3-hydroxydodecanoicacid MILAB14 3-hydroxytetradecanoicacid 3-hydroxy-5-cis – dodecenoicacid Cyclo(Gly-Leu) methylhydantoin Lactobacillus plantarum mevalonolactone VTTE-78076 Caproic-, propionic-, buturic-, acetic-, Lactibacillus formicand n- valeric acid. sanfranciscensis CB1 Roy và cộng sự đã phân lập được 2100 khuẩn lạc lactic từ phô mai cũ và sữa trâu sống, đã cho thấy hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI và phân lập nhiều nhất vi khuẩn Lactococcus subsp CHD-28.3 có hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI, A.flavus NCIM 555, A.parasiticus NCIM 898 và Fusarium sp Nấm Aspergillus IARI được xem là chất cảm ứng cho chủng lactic này (Roy và cộng sự, 1996). Chi Lactobacillus thường được phân lập và nghiên cứu nhiều nhất. Các chủng kháng nấm được phân lập từ các sản phẩm khác nhau như bột nhào chua (Corsetti và cộng sự, 1996), xúc xích (Coloretti và cộng sự, 2007), thức ăn ủ chua (Magnusson và Schnurer, 2001), phô mai và sữa (Roy và cộng sự, 1996). Vi khuẩn lactic có khả năng sản xuất một lượng lớn các sản phẩm có tính acid và các hợp tố khác với hoạt tính kháng nấm mạnh. Đa số các chất kháng nấm được xác định đều có trọng lượng phân tử thấp bao gồm acid hữu cơ, H2O2, hợp chất proteinaceous, acid béo hydroxyl, 34
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.3. Các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic có tính kháng sinh. (Holzapfel và cộng sự, 1995) Sản phẩm Các sinh vật chính Acid hữu cơ Acid lactic Vi khuẩn gram âm, 1 vài loài nấm Acid acetic Nấm men, nấm, vi khuẩn gây thối rữa H2O2 Sinh vật gây bệnh đặc biệt trong thức ăn giàu protein Hệ thống Vi khuẩn gây bệnh lactoperosidase với (sữa và các sản phẩm H2O2 làm từ sữa) Enzyme Isozyme Vi khuẩn gram dương Reuterin(3-OH-propionaldehyde) Nấm mốc, nấm men Diacetyl Vi khuẩn gram âm Acid béo Các loại vi khuẩn khác nhau Nisin Một số loài vi khuẩn lactic, vi khuẩn gram dương, các thể nội Bacteriocin bào tử 1 số loại khác Vi khuẩn gram dương Ngoài sự ức chế tăng trưởng thực tế của nấm, LAB cũng có thể ức chế sản phẩm đặc biệt của độc tố nấm mốc (Theo Gourama và Bullerman, 1997) hoặc làm bất động độc tố thông qua liên kết với bề mặt của chúng (Theo El-Nezami và cộng sự, 2004). Các hợp chất kháng nấm và phương thức hoạt động: Chất ức chế tăng trưởng nấm có tầm quan trọng cả trong việc kiểm soát tác nhân gây bệnh của con người và 35
Đồ án tốt nghiệp động vật, và trong công tác phòng chống nấm mọc trong thực phẩm và các vật liệu khác. Các phương thức hoạt động của kháng sinh chống nấm hiện nay là rất quan trọng cho sự ức chế nấm. Nhiều chất trong số các chất này được dành riêng cho sử dụng lâm sàng nhưng một số đang được sử dụng trong sự kiểm soát của nấm gây bệnh thực vật. Thuốc kháng sinh được xác định là chất được sản xuất bởi các vi sinh vật có tác dụng diệt hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật khác ở nồng độ thấp. 1.2.9.2. Khả năng kháng khuẩn của chủng vi khuẩn lactic LAB cũng ức chế sự phát triển của ci sinh vật có hại gây thối rửa thong qua các sản phẩm chuyển hoá như hydrogen peroxide, carbon dioxide, diacetyl và đặc biệt là bacteriocin. - Bacteriocin: Bacteriocin là protein có hoạt tính sinh học do vi khuẩn tiết ra, có thể tiêu diệt hoặc ức chế sự tăng trưởng của các vi khuẩn khác có quan hệ họ hàng với chúng (Theo Hikmate Abriouel, 2007). Bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn, được sản sinh ra bởi nhiều nhóm vi khuẩn đa dạng, có thể khác nhau bởi phương thức và phổ hoạt động, phân tử lượng, đặc điểm sinh hóa và nguồn gốc gene (Theo Klaenhamme, 1993). Ưu điểm của bacteriocin là có hoạt tính kháng khuẩn cao ngay cả khi ở nồng độ rất thấp. Tuy nhiên, bacteriocin thường có phổ kháng khuẩn hẹp hơn kháng sinh. Khác với chất kháng sinh, bacteriocin thường được dùng trong thực phẩm và không có ảnh hưởng độc lên tế bào nhân chuẩn còn chất kháng sinh chỉ được dùng trong y tế và có ảnh hưởng độc lên tế bào nhân chuẩn. Trên thế giới bacteriocin được sản xuất bằng công nghệ lên men vi sinh bởi vi khuẩn lactis. Bacteriocin còn có một số hạn chế như: ít được biết đến hơn chất bảo quản hoá học. Bị thoái biến nhanh chóng bởi các enzyme phân giải protein. Bacteriocin được ứng dụng: Bổ sung bacteriocin tinh chế hay bán tinh chế như là các chất bảo quản thực phẩm, dùng màng polyethylen hoạt tính bacteriocin cho đóng gói thực phẩm. 36
Đồ án tốt nghiệp - Sản phẩm chuyển hoá của LAB sử dụng để chống lại các vi sinh vật gây thối rữa và chức năng hoá có thể ức chế vi sinh vật của chúng được tóm tắt như sau: Bảng 1.4 Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn LAB. (Holzapfel và cộng sự, 1995) Sản phẩm Các sinh vật ảnh hưởng Acid lactic Vi khuẩn gram âm, 1 vài loài nấm Acid acetic Nấm men, nấm, vi khuẩn gây thối rửa Sinh vật gây bệnh, đặc biệt trong thức ăn H2O2 giàu protein Vi khuẩn gây bệnh (sữa và các sản phẩm Hệ thống lactoperoxidase với H O 2 2 làm từ sữa) Lysozyme Vi khuẩn gram dương Reuterin (3-OH- propoonaldehyde) Nấm mốc, nấm men Diacetyl Vi khuẩn gram âm Acid béo Các loại vi khuẩn khác nhau 37
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm nghiên cứu Phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường trường Đại học Công nghệ TP HCM. 2.2. Thời gian thực hiện Đề tài được thực hiện từ ngày 15/2/2017 đến ngày 15/7/2017 2.3. Vật liệu 2.3.1. Nguồn phân lập - Nem chua: thu mua ở cơ sở sản xuất nem lai vung Nguyễn Bình, Đồng Tháp. - Kim chi: mua từ Công ty cổ phần Kim&Kim, Tân Bình, TpHCM. - Giống nấm: Chủng nấm Aspergillus sp.CĐP1 và Aspergillus sp.CĐP2, từ phòng thí nghiệm vi sinh Trường ĐH Công Nghệ TpHCM. 2.3.2. Thiết bị và dụng cụ - Máy đo quang phổ (UV – Vis) specific 20 genesis (USA) - Máy đo pH Horiba (Nhật Bản) - Autoclave (Memmmert – Đức) - Kính hiển vi quang học Olympus – Nhật Bản - Cân phân tích, cân kỹ thuật - Tủ cấy vô trùng, tủ ấm (Memmmert – Đức), tủ sấy (Memmmert – Đức) - Lò vi sóng (Microwave) - Pipetman 100 – 1000 µl - Bếp điện - Bông thấm nước, bông không thấm nước - Giấy lọc, lame, lamelle - Các dụng cụ thí nghiệm: becher, erlen, que cấy, đèn cồn, bình định mức, ống đong, pipet, 2.3.3. Hóa chất - Các hóa chất dùng để pha các loại thuốc nhuộm, thuốc thử, chất chỉ thị màu: 38
Đồ án tốt nghiệp • Crystal violet • Ethanol 95% • Ammonoxalat • Iod • KI • Thuốc nhuộm Safranin • Chất chỉ thị màu Bromoresol green • Malachite green • Methylene blue • Ethanol • Phenolphthalein • NaOH • H2O2 - Các hóa chất dùng để pha môi trường MRS Broth. Đây là môi trường tổng hợp đặc hiệu cho việc nuôi cấy vi khuẩn lactic, tên đầy đủ là: de Man, Rogosa and Sharpe (Robinson, 2007) • Peptone 10g • Meat extract 10g • Yeast extract 5g • D- Glucose 20g • Natri acetate 5g • Diamoni citrate 2g • MgSO4.7H2O 0,1g • MnSO4.4H2O 0,05g • K2HPO4 2g • Tween 80 1ml • Nước cất 1000ml Điều chỉnh pH = 6.5 ± 0.2 tại 25oC. Khử trùng ở 121 oC trong 15 phút. 39
Đồ án tốt nghiệp - Các hóa chất dùng để pha môi trường MRS Agar (de Man, Rogosa and Sharpe (Robinson, 2007)) • Peptone 10g • Meat extract 10g • Yeast extract 5g • D- Glucose 20g • Natri acetate 5g • Diamoni citrate 2g • MgSO4.7H2O 0,1g • MnSO4.4H2O 0,05g • K2HPO4 2g • Tween 80 1ml • Nước cất 1000ml • Agar 20g Điều chỉnh pH = 6.5 ± 0.2 tại 25oC. Khử trùng ở 121oC trong 15 phút - Các hóa chất pha môi trường PDA (Potato Detrose Agar) nuôi cấy nấm mốc. - Các hóa chất pha môi trường Casein, Gelatin, Chitin, Tinh bột. 2.3.4. Giống nấm Các loại nấm CĐP1, CĐP2 do phòng thí nghiệm vi sinh thuộc khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường trường Đại học Công nghệ TP.HCM cung cấp. 2.4. Phương pháp luận Để thực hiện được đề tài tôi chọn các nguồn vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống chứa vi khuẩn sống phân lập ra các chủng vi khuẩn lactic và thông qua các kiểm tra sinh lý, sinh hóa, so sánh với khóa phân loại của Bergey để phân loại, định danh chúng đến cấp giống. Lựa chọn nguồn phân lập là các loại thực phẩm lên men truyền thống như kim chi, nem chua, vì các nguồn này chứa các vi khuẩn sống và có tiềm năng kháng nấm cao. 40
Đồ án tốt nghiệp Phân lập vi khuẩn lên men lactic bằng môi trường chuyên biệt có bổ sung NaN3 và khẳng định khả năng sinh acid bằng chỉ thị màu, dựa vào khoá phân loại của Bergey’s Manual (Theo Benson Lab Manual, 2001) và định danh sơ bộ vi khuẩn lên men lactic. Tuyển choṇ các chủng vi khuẩn phân lập qua khảo sát sinh khối và acid tổng tạo thành. Tuyển choṇ các chủng vi khuẩn phân lập kháng nấm in vitro của các chủng phân lập áp dụng phương pháp đối kháng trực tiếp (cấy 2 đường vi khuẩn). Tuyển choṇ các chủng vi khuẩn phân lập qua kháng nấm in vivo qua thí nghiệm bảo quản đậu phộng . 41
Đồ án tốt nghiệp Kim chi Nem chua Tăng sinh trong MRS Broth MRS có bổ sung 0,02% NaN3 để ức chế vi khuẩn hiếu khí Cấy truyền sang MRS Agar bắt buộc Kiểm tra chủng thuần khiết trên MRS Agar có chứ chất chỉ thị Bromogresol gre egreen Phân lập giống thuần khiết Khảo sát hình thái, Khảo sát khả năng Khảo sát kháng Khảo sát kháng sinh lý, sinh hóa tăng trưởng và lên nấm in vitro nấm in vivo men lactic - Phương pháp kháng trực - Nhuộm Gram. tiếp cấy 2 đường vi khuẩn - Nhuộm bào tử. - Sinh enzyme ngoại bào - Catalase. - Khả năng lên men đường. - Khả năng di động. Chủng chọn lọc Hình 2.1 Sơ đồ phân lập và định danh sơ bộ vi khuẩn lactic 42
Đồ án tốt nghiệp 2.5. Phương pháp thí nghiệm 2.5.1. Thu thập mẫu Mẫu là những sản phẩm lên men truyền thống có chứa vi sinh vật sống được dùng làm nguồn phân lập vi khuẩn lactic gồm: kim chi, nem chua. Bảng 2.1: Kí hiệu các nguồn phân lập Sản phẩm Kí hiệu các nguồn phân lập Kim chi KC Nem chua NC 2.5.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic 2.5.2.1. Tăng sinh Mục đích: Làm cho các vi khuẩn có trong mẫu phát triển lại bình thường do chúng có thể bị suy yếu hoặc bị ức chế trong quá trình bảo quản mẫu. Trong đó các vi khuẩn lactic có khả năng phát triển nhiều hơn vì ta đã sử dụng môi trường chọn lọc đối với vi khuẩn lactic. Đồng thời đây cũng là bước đầu giúp ta thu được lượng sinh khối để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Tiến hành: Môi trường dùng để tăng sinh là môi trường MRS Broth có bổ 1210C sung 0.02% NaN3, hút 10ml cho vào mỗi ống nghiệm đem hấp khử trùng ở trong 15 phút. Với các mẫu là dạng rắn như: cơm mẻ, nem chua, dưa cải chua: Nghiền nhỏ 2g rồi cho vào ống nghiệm chứa MRS Broth. Quấn màng PVC (màng bọc thực phẩm) quanh nắp ống nghiệm cho kín rồi đem ủ ở 37oC trong 24 giờ. 43
Đồ án tốt nghiệp 2.5.2.2. Phân lập Mục đích: Tách các khuẩn lạc rời rạc khác nhau, giúp chọn lựa được các chủng vi khuẩn đồng nhất. Tiến hành: Các mẫu sau khi tăng sinh đem pha loãng tới độ pha loãng là 10 -9. Sử dụng môi trường phân lập là môi trường MRS bổ sung 2% agar. Các mẫu sau khi tăng sinh sẽ được đem pha loãng bằng nước muối vô trùng, mỗi ống chứa 9ml. + Hút 1 ml mẫu vào ống nước muối vô trùng thứ nhất có độ pha loãng 10 -1. + Hút 1 ml hỗn hợp nước muối và mẫu ở ống thứ nhất cho vào ống thứ hai có độ pha loãng 10-2. - Tiếp tục thao tác tương tự để có độ pha loãng là 10-9. Hình 2.2: Cách pha loãng mẫu Lấy các ống nghiệm có độ pha loãng từ 10-5 ÷ 10-9, mỗi ống lấy 0,1ml cho lên bề mặt thạch chứa trong đĩa petri. Tương ứng với mỗi độ pha loãng sẽ thực hiện trên hai đĩa petri. Dùng que trang, trang điều canh trường với điều kiện không làm rách bề mặt thạch và trang thật đều nhằm tách khuẩn lạc riêng lẻ. Ghi độ pha loãng tương ứng lên nắp đĩa petri đưa vào nuôi trong tủ ấm ở 37oC trong 24 giờ, các khuẩn lạc riêng lẻ vào các ống thạch nghiêng đã được chuẩn bị sẵn. Nuôi vi khuẩn đã được cấy chuyền sang ống thạch nghiêng trong tủ ấm ở nhiệt độ 35 – 37oC, thời gian từ 24 giờ, bảo quản ống giống ở nhiệt độ 4oC. 44
Đồ án tốt nghiệp 2.5.2.3. Kiểm tra chủng thuần khiết. Sau khi cấy chuyền nhiều lần sang môi trường MRS Agar, các chủng được phân lập tiếp tục cấy chuyền sang môi trường MRS Agar có bổ sung 0.018g/l chất chỉ thị màu Bromocresol green khi đó nếu vi khuẩn sinh acid sẽ làm giảm pH và môi trường sẽ chuyển từ xanh dương sang vàng nhằm tăng khả năng chọn lọc được các chủng vi khuẩn lactic. 2.5.3. Khảo sát hình thái, sinh lý, sinh hoá. 2.5.3.1. Nhuộm Gram Mục đích: Giúp ta phân loại được 2 nhóm lớn: Vi khuẩn Gram dương (Gram-positive) bắt màu tím và Vi khuẩn Gram âm (Gram-negative) bắt màu hồng. Ngoài ra nhuộm Gram cho phép ta quan sát rõ hình thái tế bào hơn so với soi vi khuẩn sống. Tiến hành: Sử dụng phương pháp Hucker cải tiến - Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa miếng lame, làm khô trong không khí. - Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần. - Nhuộm bằng dung dịch Crystal violet trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. - Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol trong 1 phút, tẩy cồn 960 trong 20 giây, sau đó rửa lại bằng nước cất rồi thấm khô. - Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 30 giây, rửa nước, để khô trong không khí. - Soi kính: dùng vật kính dầu 100x. Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ. 2.5.3.2. Thử Catalase Mục đích: Kiểm tra khả năng phân hủy H2O2 tạo ra O2 của vi sinh vật nhờ sản sinh enzyme catalase. 45
Đồ án tốt nghiệp Các chủng vi khuẩn thu được sau bước nhuộm gram được tiến hành thử nghiệm Catalase. Trong thí nghiệm này, chỉ có những chủng vi khuẩn cho catalase âm tính là có khả năng là vi khuẩn lactic. Tiến hành: - Chuẩn bị dung dịch H2O2 nồng độ 3-10%, nhỏ một giọt lên phiến kính. - Dùng đầu que cấy lấy một ít vi khuẩn mới hoạt hoá (24 giờ) hòa vào 1 giọt H2O2 trên phiến kính. Kết quả: Nếu thấy sủi bọt là dương tính, không sủi bọt là âm tính. Có thể nhỏ trực tiếp dung dịch H2O2 lên khuẩn lạc trên thạch đĩa cũng cho kết quả tương tự. 2.5.3.3. Nhuộm bào tử Mục đích: Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử (dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipid). Đầu tiên xử lý để tế bào chất bào tử dễ bắt màu bằng nhiệt và acid. Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh. Tẩy màu tế bào chất của tế bào và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm khác bổ sung. Nhờ đó tế bào chất của bào tử và tế bào chất của tế bào bắt màu phân biệt. Trong đó bào tử sẽ có màu xanh và tế bào có màu hồng. Các vi khuẩn Gram dương thu được từ bước nhuộm Gram sẽ tiếp tục kiểm tra khả năng sinh bào tử. Sử dụng sinh khối vi khuẩn khi đã già (khoảng 7 ngày) để nhuộm bào tử. Từ kết quả thu được ta loại bỏ các chủng có bào tử, do LAB là vi khuẩn Gram dương không sinh bào tử. Tiến hành: dùng phương pháp Schaeffer-Fulton - Nuôi cấy vi khuẩn ở 37oC, 5 – 7 ngày. - Làm vết bôi và cố định tế bào trên lame như đối với nhuộm Gram. - Nhuộm bằng dung dịch malachite green trong 10 phút, đặt trên 1 cốc nước đang đun sôi, rửa nước, thấm khô. - Nhuộm lại bằng dung dịch Safranine trong 30-90 giây, rửa nước, thấm khô. - Soi kính: dùng vật kính dầu 100x Kết quả: Bào tử có màu lục, tế bào sinh dưỡng có màu đỏ. 46
Đồ án tốt nghiệp 2.5.3.4. Thử nghiệm khả năng sinh acid Mục đích: Kiểm tra khả năng sinh acid của vi khuẩn trong quá trình trao đổi chất của chúng. Trong thí nghiệm này các chủng cho kết quả không sinh bào tử thu được từ các bước trên sẽ được kiểm tra với môi trường Phenol Red Lactose Broth nhưng thay thế chất chỉ thị Phenol red thành Bromocresol green. Các chủng phân lập là vi khuẩn lactic khi chúng tạo acid lactic và làm đổi màu chất chỉ thị từ màu xanh dương xuống màu vàng. Tiến hành: - Chuẩn bị môi trường Bromocresol green lactose broth sau đó phân phối vào các ống nghiệm, mỗi ống 5ml môi trường. - Sau đó cấy sinh khối VK vào mỗi ống nghiệm - Ủ ở 370C trong 1-3 ngày. Kết quả: - Nếu có acid lactic sẽ làm giảm pH dung dịch sẽ chuyển sang màu vàng. 2.5.3.5. Thử nghiệm khả năng di động Mục đích: Xác định khả năng di động của vi sinh vật trong môi trường thạch mềm MRS Agar với (0,5 – 0,7% agar). Vì vi khuẩn lactic không có khả năng di động, chỉ mọc theo đường cấy thẳng đứng trong ống chứa môi trường thạch mềm và không làm đục môi trường xung quanh nên trong thử nghiệm này, ta loại bỏ được các vi khuẩn di động không phải là vi khuẩn lactic, chúng sẽ mọc lan ra khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung quanh. Tiến hành: - Dùng que cấy có đầu nhọn cấy vi khuẩn theo kiểu chích sâu vào môi trường thạch bán lỏng. - Đặt ống nghiệm thẳng đứng, ủ ở 370C và quan sát sau 1-3 ngày, có khi lâu hơn. 47
Đồ án tốt nghiệp Kết quả: Vi khuẩn mọc lan rộng quanh vết cấy tức là chúng có khả năng di động. Vi khuẩn chỉ mọc theo vết cấy tức là chúng không có khả năng di động. 2.5.3.6. Thử nghiệm khả năng lên men đường và khả năng sinh khí Mục đích: kiểm tra xem vi sinh vật có khả năng lên men các loại đường nào. Các loại đường được sử dụng là: glucose, lactose, saccharose và xylose. Kết quả từ thí nghiệm này giúp ta định danh đến cấp giống các chủng vi khuẩn lactic phân lập được dựa theo khóa phân loại của Bergey. Sử dụng Bromocresol green làm chỉ thị màu. Tiến hành: - Môi trường MRS broth với lượng đường glucose lần lượt thay thế bằng các loại đường cần kiểm tra. - Phân môi trường vào các ống nghiệm, mỗi ống 10ml Đặt vào mỗi ống nghiệm 1 ống nhỏ (ống Durham) lộn ngược đầu để hứng khí CO2 sinh ra nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường. Khử trùng trong 15 phút ở 1210C. Đường xylose, và saccharose cần khử trùng riêng rồi mới bổ sung vào môi trường. - Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá vào các ống nghiệm, đặt ở 37 0C, theo dõi hiện tượng sinh acid sau 1-3 ngày. Trường hợp dùng nút bông cần quấn bằng màng PVC (màng bọc thực phẩm) để bịt kín miệng ống nghiệm. Kết quả: - Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường (sinh acid) chất chỉ thị Bromocresol green sẽ chuyển màu vàng. - Nếu có bọt khí bên trong ống durham thì chủng vi khuẩn đó lên men có sinh khí - Đối với những ống nghiệm không có bọt khí trong (ống durham) thì ta cần kiểm tra lại bằng cách đốt đỏ que cấy và đặt sát bề mặt môi trường, nếu thấy có bọt khí nổi lên thì chủng vi khuẩn đó cũng lên men có sinh khí. 48
Đồ án tốt nghiệp 2.6. Khảo sát khả năng tăng trưởng và lên men lactic. Mục đích: Xác định hàm lượng acid tổng bằng phương pháp quy về acid lactic để xác định hàm lượng acid lactic sinh ra từ các chủng vi khuẩn lactic thử nghiệm nhằm chọn ra chủng vi khuẩn lactic mạnh nhất để kháng nấm. Hàm lượng acid trong dịch lên men có thể định lượng bằng dung dịch kiềm chuẩn nhờ có sự đổi màu của dung dịch thuốc thử Phenolphatalein. Tiến hành: Định lượng acid lactic bằng dung dịch NaOH 0.1N với chất chỉ thị Phenolphtalein 1% . Cho vào bình tam giác 10ml dịch lên men vi khuẩn, thêm 3-5 giọt Phenolphtalein và chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0.1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt. Sử dụng máy đo pH để chuẩn độ đến khi pH đạt 8.0 và ghi nhận kết quả. Kết quả: Hàm lượng acid tổng được quy về acid lactic theo công thức: × . × × % Acid lactic= × VNaOH 0 1 90 100 Trong đó: 1000 10 VNaOH: Thể tích NaOH 0.1 N chuẩn độ được 10: Số ml dịch Dx được đem đi chuẩn độ 0.1: Nồng độ NaOH dùng để chuẩn độ 1000: Hệ số chuyển đổi ra gam 90: Mỗi ml NaOH chuẩn độ tương đương với 90 mg acid lactic trong dịch Dx 2.7. Khảo sát khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic bằng phương pháp in vitro. 2.7.1. Khảo sát khả năng đối kháng nấm trực tiếp theo phương pháp in vitro. Để xác định khả năng đối kháng nấm của các vi khuẩn có lợi thì ta sẽ sử dụng phương pháp đối kháng trực tiếp (Dual Culture Two Line Culture Method) trên môi trường rắn theo mô tả của Brunner và cộng sự (2005): Đầu tiên, ta cấy khoanh thạch của nấm chỉ thị (đường kính 7mm) và đặt vào tâm đĩa petri có môi trường thạch đã chuẩn bị, sau đó ủ 24h cho nấm phát triển. Tiếp theo, ta 49
Đồ án tốt nghiệp tiến hành cấy 2 vạch vi khuẩn chỉ thị vào đĩa và đặt cách ngoài mép đĩa 1,5cm (2 vạch chủng vi khuẩn phải nằm đối diện nhau qua tâm đĩa trên cùng một đường kính). Cuối cùng, ủ các đĩa thạch trong 72h, nhiệt độ phòng. Sau đó, xác định tỉ lệ ức chế.  Quy trình thí nghiệm Hoạt hóa chủng nấm mốc trên Hoạt hóa chủng vi khuẩn môi trường PDB LAB trên môi trường MRS- Tăng sinh chủng nấm mốc trên môi trường PDB Tăng sinh chủng vi khuẩn LAB trên môi trường MRS- Cấy vào đĩa chứa môi b th trường PDA Đặt thạch nấm Đặt thạch nấm Lặp lại Ria 2 ĐC âm 3 lần đường VK Ủ 72h ở 370C Đo đường kính ức chế nấm Tỷ lệ ức chế nấm bệnh Hình 2.3: Sơ đồ khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn. 50
Đồ án tốt nghiệp  Thuyết minh quy trình: - Mục đích: Khảo sát khả năng kháng các chủng nấm mốc của 11 chủng vi khuẩn vừa phân lập theo phương pháp vạch 2 đường vi khuẩn. - Tiến hành: . Chuẩn bị môi trường vi khuẩn: • Hoạt hóa 11 chủng vi khuẩn vừa phân lập: hoạt hóa trong môi trường MRS broth ở 370C trong 24h. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong môi trường MRS broth ở 370C 24h. . Chuẩn bị chủng nấm để đối kháng: • Hoạt hóa chủng nấm mốc có sẵn trong phòng thí nghiệm: hoạt hóa trong môi trường PDB ở 370C trong. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong môi trường PDB ở 370C trong 24h. • Cấy điểm vào đĩa petri chứa môi trường PDA và ủ 72h ở nhiệt độ phòng. . Chuẩn bị môi trường khảo sát đối kháng: • Môi trường MRS cải tiến được hấp khử trùng ở 1210C trong 30 phút. Sau đó, phối vào đĩa petri đã được hấp khử trùng, mỗi đĩa 15ml. • Khi thạch đã đông, ta tiến hành đục thạch ở đĩa nấm mốc rồi đặt vào tâm các đĩa. Mỗi đĩa lặp lại 3 lần. Sau đó, ủ 24h ở nhiệt độ phòng. • Sau 24h, ta tiến hành cấy 2 vạch vi khuẩn cách ngoài mép đĩa 1,5cm (2 vạch chủng vi khuẩn phải nằm đối diện nhau qua tâm đĩa trên cùng một đường kính) cần thử đối kháng vào. Mẫu đối chứng chỉ cấy nấm vào tâm đĩa, không cấy 2 vạch vi khuẩn lên. Tiếp tục ủ 72h ở nhiệt độ phòng. • Quan sát, đọc kết quả đối kháng dựa vào sự phát triển của nấm sau 3 ngày. 51
Đồ án tốt nghiệp • Ta tiến hành đo tỉ lệ ức chế theo hình và công thức phần trăm: Hình 2.4: Mô tả cách đo đường kính vòng ức chế của phương pháp vạch 2 đường vi khuẩn Trong đó: Dđc: đường kính (cm) đĩa nấm đối chứng Dtn: đường kính (cm) đĩa thí nghiệm Số liệu được xử lí bằng phần mền SAS 9.4 52
Đồ án tốt nghiệp 2.7.2. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào  Quy trình thí nghiệm Đĩa petri chứa Chủng vi môi trường thử khuẩn LAB Hút Tăng sinh trong môi Đục thạch 0.1 trường MRS-broth ml Ủ 370C 48h Thuốc thử Đo đường kính vòng Hình 2.5: Sơ đồ thí nghiệm khả năng sinh enzyme của các chủng LAB. a) Enzyme protease  Thuyết minh quy trình: - Nguyên tắc: Thí nghiệm theo phương pháp của Egorow NX (1976), dựa vào khả năng khuếch tán của các enzyme được bơm vào lỗ thạch, phân giải protein của các chủng VSV bằng cách đo kích thước vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc. - Tiến hành: + Chuẩn bị dịch enzyme, tiến hành tăng sinh các chủng vi khuẩn trong môi trường MRS-broth ủ ở 370C trong 24 giờ. + Hút 0,1 ml dịch tăng sinh cho vào các lỗ thạch đã đục sẵn. 53
Đồ án tốt nghiệp + Ủ ở nhiệt độ phòng 48 giờ, quan sát vòng phân giải. + Nếu xảy ra hiện tượng phân giải protein thì sẽ hình thành vòng phân giải trong suốt xung quanh giếng thạch khi cho TCA 10% vào và ngược lại thì không. + Khả năng phân giải protein được đánh giá qua hiệu số (D-d) mm. D-d càng lớn thì khả năng phân giải protein càng cao. Trong đó : D : là đường kính vòng phân giải (mm) d : là đường kính giếng thạch (mm) b) Enzyme amylase  Thuyết minh quy trình: - Nguyên tắc: Thí nghiệm theo phương pháp của Egorow NX (1976), dựa vào khả năng khuếch tán của các enzyme được bơm vào lỗ thạch, phân giải amylase của các chủng VSV bằng cách đo kích thước vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc. - Tiến hành: + Chuẩn bị dịch enzyme, tiến hành tăng sinh các chủng vi khuẩn trong môi trường MRS-broth ủ ở 370C trong 24 giờ. + Hút 0,1 ml dịch tăng sinh cho vào các lỗ thạch đã đục sẵn. + Ủ ở nhiệt độ phòng 48 giờ, quan sát vòng phân giải. + Nếu xảy ra hiện tượng phân giải amylase thì sẽ hình thành vòng phân giải trong suốt xung quanh giếng thạch khi cho Lugol vào và ngược lại thì không. + Khả năng phân giải protein được đánh giá qua hiệu số (D-d) mm. D-d càng lớn thì khả năng phân giải protein càng cao. Trong đó : D: là đường kính vòng phân giải (mm) d: là đường kính giếng thạch (mm) c) Enzyme chitinnase  Thuyết minh quy trình: 54
Đồ án tốt nghiệp - Nguyên tắc: Thí nghiệm theo phương pháp của Egorow NX (1976), dựa vào khả năng khuếch tán của các enzyme được bơm vào lỗ thạch, phân giải chitinnase của các chủng VSV bằng cách đo kích thước vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc. - Tiến hành: + Chuẩn bị dịch enzyme, tiến hành tăng sinh các chủng vi khuẩn trong môi trường MRS-broth ủ ở 370C trong 24 giờ. + Hút 0,1 ml dịch tăng sinh cho vào các lỗ thạch đã đục sẵn. + Ủ ở nhiệt độ phòng 48 giờ, quan sát vòng phân giải. + Nếu xảy ra hiện tượng phân giải chitinnase thì sẽ hình thành vòng phân giải trong suốt xung quanh giếng thạch khi cho Lugol vào và ngược lại thì không. + Khả năng phân giải chitin được đánh giá qua hiệu số (D-d) mm. D-d càng lớn thì khả năng phân giải chitin càng cao. Trong đó: D: là đường kính vòng phân giải (mm) d: là đường kính giếng thạch (mm) 2.8. Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic trong bảo quản hạt. 2.8.1. Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 102bào tử/g đậu phộng: 55
Đồ án tốt nghiệp Hạt đậu phộng Khử trùng bề mặt bằng cồn 700 Tráng nước cất Để ráo Ngâm trong dịch nuôi cấy VK trong 30 phút Để ráo ở nhiệt độ phòng Cho 12g hạt Huyền phù nấm mốc mật Chai thủy tinh 100ml vô trùng độ 102/12g Bảo quản ở nhiệt độ phòng Theo dõi theo thời gian Hạt đậu phộng sau khi được sàng lọc, loại bỏ các hạt nứt, bể hay héo, được ngâm trong cồn 70° để khử trùng bề mặt và rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3 lần. Sau đó để ráo. Cứ mỗi 12g đậu phộng, sẽ được ngâm trong 50ml dung dịch nuôi cấy VK được chuẩn bị như sau: 56
Đồ án tốt nghiệp Đối chứng 1 50ml nước cất Đối chứng 2 50ml cardabenzim 0.4% Thí nghiệm 1 50ml dịch nuôi cấy vi khuẩn Hạt đậu phộng sau khi ngâm được để khô ở nhiệt độ phòng, kế đến phối vào các chai thuỷ tinh vô trùng và được cảm nhiễm 0,1ml huyền phù nấm mốc mật độ 102. Theo dõi từng ngày ở nhiệt độ thường. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần. 2.8.2. Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 101bào tử/g đậu phộng: 57
Đồ án tốt nghiệp Hạt đậu phộng Khử trùng bề mặt bằng cồn 700 Tráng nước cất Để ráo Ngâm trong dịch nuôi cấy VK trong 30 phút Để ráo ở nhiệt độ phòng Cho 12g hạt Huyền phù nấm mốc mật Chai thủy tinh 100ml vô trùng độ 101/12g Bảo quản ở nhiệt độ phòng Theo dõi theo thời gian Hạt đậu phộng sau khi được sàng lọc, loại bỏ các hạt nứt, bể hay héo, được ngâm trong cồn 70° để khử trùng bề mặt và rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3 lần. Sau đó để ráo. Cứ mỗi 12g đậu phộng, sẽ được ngâm trong 50ml dung dịch nuôi cấy VK được chuẩn bị như sau: 58
Đồ án tốt nghiệp Đối chứng 1 50ml nước cất Đối chứng 2 50ml cardabenzim 0.4% Thí nghiệm 1 50ml dịch nuôi cấy vi khuẩn Hạt đậu phộng sau khi ngâm được để khô ở nhiệt độ phòng, kế đến phối vào các chai thuỷ tinh vô trùng và được cảm nhiễm 0,1ml huyền phù nấm mốc mật độ 101. Theo dõi từng ngày ở nhiệt độ thường. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần. 59
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Kết quả khảo sát hình thái, sinh lý, snh hoá. Người thực hiện đồ án đã tiến hành phân lập vi khuẩn lactic từ 2 nguồn thực phẩm lên men truyền thống như kim chi và nem chua với mục đích thu thập thêm các chủng vi khuẩn lactic có nguồn gốc tự nhiên có hoạt lực cao hơn so với các chủng công nghiệp và có thể đóng góp thêm vào bộ sưu tập giống. Môi trường sử dụng để phân lập là MRS agar là môi trường chọn lọc chứa nhiều thành phần thích hợp với sự tăng trưởng của vi khuẩn lactic (Theo DeMan et al., 1960). Ở vi khuẩn khi ta nuôi cấy ở điều kiện hiếu khí sẽ loại bỏ được những vi khuẩn kỵ khí và ngược lại khi nuôi ủ ở điều kiện kỵ khí sẽ loại bỏ bớt được vi khuẩn hiếu khí. Vi khuẩn lactic là vi khuẩn kỵ khí chịu oxy (aerotolerant organisms) và không hô hấp nên để tăng khả năng chọn lọc, nên tôi đã bổ sung natri azide (NaN3) vào môi trường MRS với nồng độ 0.02% nhằm ức chế vi khuẩn hiếu khí và tăng điều kiện kỵ khí bằng cách dán kín các đĩa pettri bằng màng nhựa PVC đồng thời bổ sung thêm 0.018g/l chất chỉ thị Bromoresol green vào môi trường MRS Agar. Vi khuẩn xuất hiện trên đĩa thạch với các khuẩn lạc trắng, nhỏ(Sharpe, 1979) như hình (3.1) và khi có chất chỉ thị màu sẽ làm môi trường chuyển từ màu xanh dương sang vàng sẽ được chọn (hình 3.2). Từ đó chọn lựa và nuôi cấy được 35 chủng có hình thái khuẩn lạc đồng nhất có khả năng là vi khuẩn lactic. Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn lactic 60
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn lactic trên môi trường có chứa chất chỉ thị Các chủng tuyển chọn được kí hiệu như bảng 3.1: Bảng 3.1: Bảng kí hiệu các chủng vi khuẩn phân lập. Sản phẩm Kí hiệu của các chủng phân lập Kim chi KC Nem chua NC Sau khi có được các chủng vi khuẩn đồng nhất, tiếp tục tiến hành định danh sơ bộ các chủng phân lập bằng phương pháp cổ điển: khảo sát hình thái, sinh hoá, sinh lý. 3.1.1. Thử nghiệm Catalase Ở vi khuẩn, loài có enzyme catalase thì vi khuẩn đó có khả năng chuyển hóa H2O2 thành H2O và O2 khi cho H2O2 lên sinh khối của chúng thì sẽ có hiện tượng sủi bọt khí, sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis và nước cất có ở phòng thí nghiệm để làm đối chứng dương và âm (hình 3.3). Theo khóa phân loại của Bergey thì vi khuẩn lactic có thử nghiệm catalase âm tính. 61
Đồ án tốt nghiệp Kết quả : Có 22 chủng không có hiện tượng sủi bọt khí chứng tỏ chúng không có hệ enzyme catalase, còn lại 13 chủng có hiện tượng sủi bọt khí chứng tỏ chúng có hệ enzyme catalase. Hình 3.3: Thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn (Từ trái qua phải): Thử nghiệm âm tính của chủng vi khuẩn KC1A, Đối chứng âm là nước cất, thử nghiệm dương tính đối với Bacillus spp. 3.1.2. Nhuộm Gram Vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram dương nên bước đầu tiên ta tiến hành nhuộm Gram đối với các tế bào còn non (trong khoảng 24 giờ nuôi cấy) vì khi già vi khuẩn lactic đều trở thành Gram âm. Khi tiến hành nhuộm Gram, trước tiên tiến hành nhuộm hai chủng biết trước là vi khuẩn Bacillus subtilis Gram dương (hình 3.4) và vi khuẩn E.coli Gram âm (hình 3.5) có ở phòng thí nghiệm để làm đối chứng. Sau đó tiến hành nhuộm Gram 22 chủng phân lập được và dựa vào mẫu đối chứng để kết luận. Trong số 22 chủng phân lập, có 5 chủng Gram âm, 6/17 chủng Gram dương còn lại có hình thái, kích thước tế bào trùng với các chủng khác có cùng nguồn phân lập, nên số chủng Gram dương còn 11 chủng. 62
Đồ án tốt nghiệp A B C Hình 3.4 Kết quả nhuộm gram của chủng vi khuẩn: A. Vi khuẩn Bacillus subtilis bắt màu tím. B. Vi khuẩn E.coli bắt màu hồng. C. Vi khuẩn phân lập Sau bước nhuộm Gram, ta thu được 11 chủng vi khuẩn có hình thái khuẩn lạc và tế bào khác nhau, hoặc một số trong đó giống nhau về hình thái khuẩn lạc nhưng khác nhau về hình dạng tế bào và khác nhau về nguồn phân lập. Vì thế, dựa vào kết quả nhuộm Gram và quan sát hình thái vi khuẩn, từ 35 chủng có khả năng là vi khuẩn lactic, ta rút lại được 11 chủng có nhiều khả năng là vi khuẩn lactic hơn. Để khẳng định có phải là vi khuẩn lactic hay không ta tiếp tục tiến hành các bước kiểm tra tiếp theo đối với 11 chủng trên để sàng lọc ra những chủng mang đặc điểm của vi khuẩn lactic dựa vào những mô tả trong Berger’s manual. 3.1.3. Nhuộm bào tử Sự hình thành bào tử là hình thức đổi mới tế bào khi vi khuẩn sống trong môi trường bất lợi như nhiệt độ, áp suất, dinh dưỡng không phù hợp cho việc sinh trưởng và phát triển bình thường của chúng hoặc khi tế bào trở nên già. Ở vi khuẩn lactic, chúng không có khả năng này nên đây cũng trở thành đặc điểm của chúng. Sau khi nhuộm bào tử vi khuẩn bằng phương pháp Schaeffer-Fulton, sử dụng vi khuẩn Bacillus subtilis nuôi cấy ở hơn 1 tuần làm đối chứng dương, quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100x sẽ thấy được các bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis bắt màu xanh của thuốc nhuộm Malachite green (hình 3.6) và vi khuẩn E.coli làm đối chứng âm (hình 3.7) 63
Đồ án tốt nghiệp Nhuộm bào tử, ngoài việc xác định những chủng có khả năng là vi khuẩn lactic, ta còn loại bỏ được các mầm bệnh có khả năng sinh bào tử ví dụ như Clostridium spp gây bệnh viêm ruột, là vi khuẩn hình que, gram dương và có khả năng sinh bào tử. Tiến hành nhuộm bào tử 11 chủng vi khuẩn vừa phân lập. Kết quả: Các tế bào của mỗi chủng sau khi nhuộm đều bắt màu đỏ của thuốc nhuộm Safranin. Như vậy, 11 chủng vi khuẩn đều không sinh bào tử. A B C Hình 3.5 Kết quả nhuộm bào tử của chủng vi khuẩn. A. Vi khuẩn Bacillus subtilis sinh bào tử. B. Vi khuẩn E.coli không sinh bào tử. C. Vi khuẩn phân lập không sinh bào tử 3.1.4. Khả năng lên men đường và khả năng sinh khí Các chủng vi khuẩn được cấy vào các môi trường chứa các loại đường khác o nhau và được ủ ở 37 C trong 24 - 48 giờ sau đó tiến hành đọc kết quả thông qua các đặc điểm sau: Nếu các ống nghiệm sau 24 - 48 giờ nuôi cấy làm đục môi trường, chứng tỏ vi khuẩn đó có khả năng sử dụng loại đường đó. Khi cho thuốc thử Bromocresol green vào nếu thuốc thử đổi màu vàng, chứng tỏ vi khuẩn đó có khả năng lên men đường tạo acid. Nếu thuốc thử không đổi màu, điều này chứng tỏ vi khuẩn không lên men đường. 64
Đồ án tốt nghiệp Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường và trong ống durham có bọt khí tạo ra, đó chính là khí CO2. Ngoài ra đối với những ống không có bọt khí trong ống durham, ta khẳng định lại bằng việc nung đỏ que cấy và đặt sát phía trên bề mặt môi trường, nhưng không chạm vào dung dịch nếu có những bọt khí li ti nổi lên thì ta vẫn kết luận đó là lên men dị hình. Còn nếu không có bọt khí thì đó là lên men đồng hình. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.3 gồm: - 11 chủng có khả năng lên men đường glucose. - 11 chủng có khả năng lên men đường saccharose. - 11 chủng có khả năng lên men đường lactose. - 11 chủng có khả năng lên men đường xylose, trong đó có 1 chủng sinh khí. 1 2 3 Hình 3.6. Thử nghiệm lên men đường. Ống 1: Vi khuẩn không lên men đường. Ống 2: Vi khuẩn lên men đường có sinh khí. Ống 3: Vi khuẩn lên men đường nhưng không sinh khí . 65
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.7 Vi khuẩn lactic phân lập được có khả năng lên men đường. Sau thử nghiệm lên men đường, thu được kết quả cho thấy trong số 11 chủng phân lập thì có 10 chủng là vi khuẩn lên men đồng hình, 1 chủng còn lại là lên men dị hình. Các chủng phân lập từ Kim chi đều lên men đồng hình sinh acid lactic, còn với các chủng phân lập từ Nem chua có duy nhất 1 chủng là lên men dị hình, 4 chủng còn lại đều lên men đồng hình. Chủng lên men dị hình đó thường mang lại cho Nem chua nhiều giá trị cảm quan hơn do hình thành sản phẩm phụ ngoài acid lactic. 3.1.5. Thử nghiệm khả năng di động bằng phương pháp thạch mềm. Ở vi khuẩn có tiên mao, chúng sẽ có khả năng di động, vì thế trên môi trường thạch mềm, chúng sẽ phát triển lan ra môi trường xung quanh vết cấy chứ không mọc theo vết cấy, tạo thành những vệt mờ đục môi trường. Vi khuẩn lactic là vi khuẩn hiếu khí chịu oxy nên chúng vừa có thể phát triển ở phía trên vừa có thể phát triển ở sâu trong môi trường ở những chủng không có tiên mao, chúng sẽ tăng sinh khối theo vết cấy vì chúng không có khả năng di chuyển, vì vậy ta thấy một vệt thẳng theo vết cấy (hình 3.8). Kết quả thử nghiệm tính di động của 11 chủng đã qua định tính sinh acid lactic. Quan sát vết cấy sau 2 ngày và so sánh với ống đối chứng, tất cả các chủng đều mọc theo vết cấy và không làm đục môi trường xung quanh chứng tỏ chúng không có khả năng di động, và ngược lại. 66
Đồ án tốt nghiệp A B C Hình 3.8. Kiểm tra tính di động của vi khuẩn. Ống a: Vi khuẩn có khả năng di động. Ống b: Vi khuẩn không có khả năng di động. Ống c: Vi khuẩn phân lập được không có khả năng di động. Bảng 3.2 Trình bày hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các vi khuẩn phân lập. Kí hiệu Quan sát hình thái Mô tả hình Quan sát nhuộm Gram Mô tả chủng khuẩn lạc thái khuẩn hình thái phân lập lạc tế bào KC211 Khuẩn lạc Vi khuẩn to,tròn không hình que đều, có tâm ngắn sáng ,màu trắng đục 67
Đồ án tốt nghiệp KC1A Khuẩn lạc Vi khuẩn tròn, nhỏ,lồi, hình que rìa đều, trắng ngắn đục. KC1B Khuẩn lạc Vi khuẩn tròn đều, to hình que ,lồi, rìa đều, ngắn trắng đục. KC106 Khuẩn lạc Vi khuẩn tròn, to, rìa hình cầu đều, trắng nhỏ đục KC242 Khuẩn lạc Vi khuẩn vừa, tròn đều, hình que lồi, rìa đều. ngắn 68
Đồ án tốt nghiệp KC13 Khuẩn lạc Vi khuẩn tròn đều, nhỏ hình que ,lồi, rìa đều, nhỏ nhẵn bóng, trắng đục NC2 Khuẩn lạc Vi khuẩn vừa, tròn, hình que trắng đục, lồi, nhỏ. mép gợn sóng NC12 Khuẩn lạc Vi khuẩn vừa,không hình que tròn, trắng dài đục, lồi, mép có răng cưa, tâm đen. NC15 Khuẩn lạc Vi khuẩn vừa, trắng hình que đục, lồi,bầu, ngắn rìa đều. NC172 Khuẩn lạc Vi khuẩn vừa, trắng hình que đục, lồi, có nhỏ tâm đen, không tròn đều, mép hơi gợn sóng. 69
Đồ án tốt nghiệp NC412 Khuẩn lạc Vi khuẩn tròn đều, nhỏ, hình que lồi, trắng đục, ngắn rìa đều. Bảng 3.3. Trình bày tóm tắt về các chủng phân lập có đặc điểm đặc trưng cho vi khuẩn lên men lactic. Catalas Gram Sinh Sin Di Lên Lên Lên Lên Sin e acid h động men men men men h bào Sacch Xylo Lactos Glu khí tử arose se e cose KC21 - + + - - + + + + - 1 KC1A - + + - - + + + + - KC1B - + + - - + + + + - KC10 - + + - - + + + + - 6 KC24 - + + - - + + + + - 2 KC13 - + + - - + + + + - NC2 - + + - - + + + + - NC12 - + + - - + + + + - NC15 - + + - - + + + + - NC17 - + + - - + + + + - 2 NC41 - + + - - + + + + + 2 70
Đồ án tốt nghiệp 3.2. Khảo sát khả năng tăng trưởng và lên men lactic. Các vi khuẩn vừa phân lập thuộc nhóm vi khuẩn len men lactic, khả năng lên men lactic được thể hiện qua sinh khối tạo thành (độ đục đo ở bước sóng 600nm) và acid tổng trong dịch nuôi cấy. Để thử nghiệm môi trường khảo sát kháng nấm tốt, người thực hiện đã tiến hành thử nghiệm xác định hàm lượng acid tổng và lượng sinh khối để tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic có lượng sinh khối lớn, acid lactic cao, có hoạt tính kháng nấm tốt. Kết quả hàm lượng % acid lactic của 11 chủng vi khuẩn lactic được nuôi cấy trong môi trường MRS broth ở 370C trong 24 giờ. Bảng 3.4: Bảng xử lý số liệu khả năng sinh acid và giá trị OD của 11 chủng vi khuẩn phân lập. Chủng %Acid tổng TB OD hiệu chỉnh TB A A KC1A 3.94 ±0.03 7.59 ±0.16 KC1B 3.88AB±0.04 6.32C±0.07 KC13 2.33F±0.06 6.98B±0.1 B E KC106 3.87 ±0.04 2.24 ±0.02 KC211 2.94E ±0.02 7.12B±0.05 KC242 1.26I±0.02 3.2D±0.27 J E NC2 0.97 ±0.01 2.07 ±0.05 NC12 1.42H±0.03 6.26C±0.07 G D NC15 1.75 ±0.05 2.93 ±0.05 NC172 3.58D±0.07 7.8A±0.1 NC412 3.72C±0.04 7.55A±0.5 (Kết quả được so sánh theo cột sau khi xử lý ANOVA với độ tin cậy 95%) 71
Đồ án tốt nghiệp 4.5 9 4 8 3.5 7 3 6 nh ng chỉ tổ 2.5 5 u u 2 4 hiệ Acid % 1.5 3 OD 1 2 0.5 1 0 0 KC1A KC1B KC13 KC106 KC211 KC242 NC2 NC12 NC15 NC172 NC412 ACID OD Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn %Acid tổng và sinh khối của 11 chủng vi khuẩn sau 24h nuôi cấy. Sau khi xử lý ANOVA (phân tích phương sai) với độ tin cậy là 95%, người thực hiện đề tài phân các chủng vi khuẩn lactic phân lập được thành 4 nhóm dựa theo các bảng 3.4 và hình 3.11 Bảng 3.5: Phân nhóm các chủng vi khuẩn lactic Chủng vừa sinh Chủng sinh acid Chủng sinh acid Chủng vừa sinh acid mạnh vừa có mạnh nhưng có yếu nhưng có sinh acid yếu vừa có sinh khối mạnh sinh khối yếu khối mạnh sinh khối yếu KC1A KC106 NC12 KC242 KC1B KC13 NC2 KC211 NC15 NC172 NC412 72
Đồ án tốt nghiệp 3.3. Khảo sát khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic bằng phương phap in vitro. 3.3.1. Khảo sát khả năng kháng nấm trực tiếp của chủng vi khuẩn lactic. Theo một số nghiên cứu gần đây cho biết vi khuẩn lactic có khả năng kháng nấm nhờ sản xuất 1 số chất như acid hữu cơ và reuterin, các peptide, các enyzme để ức chế sự tăng trưởng của nấm hư hỏng trong các sản phẩm thực phẩm và thức ăn. Nhằm mục đích tuyển chọn ra các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm tốt thì người thực hiện đề tài đã chọn ra phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và kết quả đạt được cũng phần nào nói lên được khả năng ức chế nấm bệnh của vi khuẩn lactic phân lập. Khả năng đối kháng nấm của vi khuẩn lactic sau 3 ngày thể hiện khác nhau và được trình bày đại diện qua chủng mạnh nhất qua các hình. Khả năng đối kháng được xác định dựa trên đường kính vòng ức chế của vi khuẩn đối với nấm mốc so với đối chứng và được trình bày trên hình và bảng dưới. 73
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.10. Khả năng đối kháng nấm CĐP2 của chủng vi khuẩn phân lập. Hình 3.11. Khả năng đối kháng nấm CĐP1 của chủng vi khuẩn phân lập Bảng 3.6 .Thống kê số liệu phần trăm tỉ lệ ức chế của 11 chủng vi khuẩn phân lập được với 2 chủng nấm mốc theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn. Vi khuẩn CĐP1 CĐP2 KC1A 42.581B±1.117 39.394A±1.389 F F KC1B 19.355 ±1.118 23.333 ±1.893 KC13 44.516AB±1.118 30.909CD±1.818 AB DE KC106 43.871 ±1.676 27.879 ±1.389 KC211 23.872E±1.118 34.545B±1.819 KC242 29.033D±1.117 41.818A±1.818 NC2 36.194C±0.968 28.485DE±1.05 NC12 35.484C±1.117 26.667EF±1.05 C BC NC15 35.484 ±1.117 33.333 ±1.389 NC172 36.129C±0.968 4.849G±1.05 NC412 45.807A±0.968 33.03BC±1.05 (Kết quả được so sánh theo cột sau khi xử lý ANOVA với độ tin cậy 95%) 74
Đồ án tốt nghiệp 50 45 40 35 30 25 CĐP1 20 CĐP2 15 10 5 0 KC1A KC1B KC13 KC106 KC211 KC242 NC2 NC12 NC15 NC172 NC412 Hình 3.12. Biểu đồ thể hiện phần trăm tỉ lệ ức chế nấm của các chủng vi khuẩn. Chủng có khả năng đối kháng nấm CĐP1 mạnh nhất: NC412. Hình 3.13. Khả năng đối kháng CĐP1 của NC412 sau 3 ngày. Các chủng có khả năng đối kháng nấm CĐP2 mạnh nhất: KC242 và KC1A. Hình 3.14. Khả năng đối kháng CĐP2 của KC1A sau 3 ngày. 75
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.15. Khả năng đối kháng CĐP1 của KC242 sau 3 ngày. Sau khi xử lý ANOVA với độ tin cậy là 99%, thì người thực hiện đề tài dựa theo hình 3.12 và bảng 3.5 đã lựa chọn các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm: − Chủng nấm CĐP1:  Μạnh nhất: NC412 (45.807%)  Yếu nhất: KC1B (19.355%) − Chủng nấm CĐP2:  Mạnh nhất: KC1A (39.394%), KC242 (41.818%)  Yếu nhất: NC172 (4.849%) 3.3.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào. Bảng 3.7. Kết quả khả năng sinh enzyme của các chủng vi khuẩn Đường kính vòng phân giải (D-d) mm trên môi trường tương ứng. Amylase Protease Chitinase KC1A 0 0 0,63±0,16 KC1B 0 0,66±0,08 0 KC211 0 0,275±0,04 0 KC13 1,7±0,087 0 0 KC106 0 0,53±0,05 0 KC242 0 0,275±0,04 1,3±0,18 NC2 0 0 0 NC12 0 0 0,98±0,23 NC15 0 0 0 NC172 0 0 0 76
Đồ án tốt nghiệp NC412 0 0,5±0,07 0 Hình 3.16. Khả năng phân giải Tinh bột của chủng vi khuẩn KC13 Hình 3.17. Khả năng phân giải Protein của chủng vi khuẩn KC1B Hình 3.18. Khả năng phân giải Chitin của chủng vi khuẩn KC1A 77
Đồ án tốt nghiệp Sau khi khảo sát khả năng đối kháng nấm và khả năng sinh enzyme ngoại bào của 11 chủng vi khuẩn, người thực hiện đề tài nhận thấy các chủng có khả năng kháng nấm mạnh nhất đa số đều có khả năng sinh enzyme nhằm phân giải các môi trường khác nhau điển hình như đối với chủng KC1A có tỉ lệ ức chế nấm CĐP1 mạnh nhất đồng thời có thể sinh enzyme protease phân giải cơ chất trên môi trường Gelatin. Như vậy, có thể giả định rằng khả năng sinh enzyme của vi khuẩn cũng ảnh hưởng phần nào đến việc ức chế nấm của vi khuẩn. Ta suy ra rằng khả năng kháng nấm còn phụ thuộc vào các yếu tố khác có thể là hợp chất thứ cấp của vi khuẩn. 3.4. Ứng dụng bảo quản hạt đậu phộng với mật độ nấm mốc 102 bào tử/g đậu phộng: Để khảo sát khả năng kháng nấm in vivo, người thực hiện đề tài đã lựa chọn mô hình bảo quản hạt đậu phộng trong canh trường nuôi cấy của vi khuẩn lactic. Sử dụng 11 chủng vi khuẩn đã phân lập được để ứng dụng bảo quản. Mẫu Thành phần Đối chứng âm ( ĐC -) Nước cất Đối chứng dương ( ĐC +) Carbenzim 0.4% Thí nghiệm Canh trường nuôi cấy Bảng 3.8. Khả năng kháng nấm CĐP1 của Canh trường nuôi cấy các chủng vi khuẩn ứng dụng trên đậu phộng với mật độ nhiễm 102 bào tử/g đậu phộng. Ngày 1 2 3 7 Lần 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 ĐC(-) - - - + + + + + + + + + ĐC(+) - - - - - - - - - - - - KC211 - - - + - - + + + + + + KC1A - - - - - - - - - + + + KC1B - - - + + + + + + + + + KC13 - - - + + + + + + + + + KC106 - - - + + + + + + + + + KC242 - - - + + + + + + + + + NC2 - - - + + + + + + + + + NC12 - - - - - - + + + + + + NC15 - - - + + + + + + + + + NC172 - - - + + + + + + + + + 78
Đồ án tốt nghiệp NC412 - - - + + + + + + + + + Chú thích: - : không nhiễm +: bị nhiễm Ngày đầu tiên, tất cả các chai đều chưa có hiện tượng mọc nấm. Ngày thứ 2, những tơ nấm nhỏ li ti bắt đầu mọc trong các bình đối chứng (nước cất) và các bình của 8 chủng vi khuẩn, ngoài ra thì đã có 1 bình của chủng KC211 đã xuất hiện tơ nấm. Các bình còn lại chưa có hiện tượng mọc nấm. Ngày thứ 3, thì 2 bình còn lại của chủng KC211 đã có tơ nấm phát triển song song với tơ nấm thì bào tử cũng đã xuất hiện, theo đó thì có tất cả các bình của chủng NC12 đều có sự phát triển của nấm. Các bình còn lại chưa có hiện tượng mọc nấm. Ngày 7, ngoài các chai của đối chứng (carbezim) ra thì các chai của chủng vi khuẩn KC1A đã bị nhiễm nấm. Hình 3.19 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7. Từ trên xuống: ĐC (-) – Đối chứng nước cất, ĐC (+) – Đối chứng Carbezim, Chủng VK KC211, Chủng VK KC1A. 79
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.20 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7. Từ trên xuống: Chủng VK KC1B, KC13, KC106, KC242. 80
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.21 Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của dịch nuôi cấy vi khuẩn (Từ trái sang: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 7. Từ trên xuống: Chủng VK NC2, NC12, NC172, NC412. 81
Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.9. Khả năng kháng nấm CĐP2 của Canh trường nuôi cấy các chủng vi khuẩn ứng dụng trên đậu phộng với mật độ nhiễm 102 bào tử/g đậu phộng. Ngày 1 2 3 7 13 19 Lần 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 ĐC(-) - - - + + + + + + + + + + + + + + + ĐC(+) - - - - - - - - - - - - + + + + + + KC211 - - - - + + + + + + + + + + + + + + KC1A - - - - - - - - - + + - + + - + + + KC1B - - - + + + + + + + + + + + + + + + KC13 - - - + + + + + + + + + + + + + + + KC106 - - - + + + + + + + + + + + + + + + KC242 - - - + + + + + + + + + + + + + + + NC2 - - - + + + + + + + + + + + + + + + NC12 - - - + + + + + + + + + + + + + + + NC15 - - - + + + + + + + + + + + + + + + NC172 - - - + + + + + + + + + + + + + + + NC412 - - - + + + + + + + + + + + + + + + Chú thích: - : không nhiễm +: bị nhiễm Ngày đầu tiên, tất cả các chai đều chưa có hiện tượng mọc nấm. Ngày thứ 2, những tơ nấm nhỏ li ti bắt đầu mọc trong các bình đối chứng (nước cất) và các bình của 8 chủng vi khuẩn, ngoài ra thì đã có 1 bình của chủng KC211 đã xuất hiện tơ nấm. Các bình còn lại chưa có hiện tượng mọc nấm. Ngày thứ 3, thì 2 bình còn lại của chủng KC211 đã có tơ nấm phát triển song song với tơ nấm thì bào tử cũng đã xuất hiện, theo đó thì có tất cả các bình của chủng NC12 đều có sự phát triển của nấm. Các bình còn lại chưa có hiện tượng mọc nấm. Ngày 7, đã có 2 chai của chủng KC1A đã bị nhiễm nấm, còn với đối chứng dương(carbezim) thì vẫn chưa có dấu hiệu bị nhiễm. Ngày 13, tất cả các chai mẫu đối chứng đã bị nhiễm nấm, song song đó thì chỉ còn duy nhất 1 chai của chủng KC1A vẫn chưa có dấu hiệu nhiễm nào. Ngày 19, 1 chai còn lại của chủng KC1A đã lên nấm. 82