›

Đồ án Phân lập và khảo sát hoạt tính sinh học của Photorhabdus spp. và Xenorhabdus spp. từ Heterorhabditis indica và Steinernema guangdongense

pdf 49 trang thiennha21 12/04/2022 8340
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Phân lập và khảo sát hoạt tính sinh học của Photorhabdus spp. và Xenorhabdus spp. từ Heterorhabditis indica và Steinernema guangdongense", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_phan_lap_va_khao_sat_hoat_tinh_sinh_hoc_cua_photorhabd.pdf

Nội dung text: Đồ án Phân lập và khảo sát hoạt tính sinh học của Photorhabdus spp. và Xenorhabdus spp. từ Heterorhabditis indica và Steinernema guangdongense

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA PHOTORHABDUS SPP. VÀ XENORHABDUS SPP. TỪ HETERORHABDITIS INDICA VÀ STEINERNEMA GUANGDONGENSE Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực hiện: PHẠM THỊ HƯƠNG MSSV: 0851110063 Lớp: 08DSH4 TP. Hồ Chí Minh, 2012
  2. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC CHƯƠNG I : GIỚI THIỆU 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài 8 1.2. Mục đích của nghiên cứu 9 1.3. Nhiệm vụ của nghiên cứu 9 1.4. Các kết quả đạt được của đề tài 9 CHƯƠNG II : TỔNG QUAN 11 2.1. Giới thiệu về tuyến trùng ký sinh côn trùng (EPN) 11 2.1.1. Khái niệm EPN 11 2.1.2. Vai trò và ưu thế của EPN 11 2.2. Khái quát về tuyến trùng ký sinh côn trùng 12 2.2.1. Phân loại 12 2.3. Khái quát về vi khuẩn cộng sinh Photorhabdus và Xenorhabdus 14 2.3.1. Một số đặc điểm của họ Enterobacteriaceae: 14 2.3.2. Phân loại Photorhabdus và Xenorhabdus 15 2.3.3. Một số đặc điểm phân biệt cơ bản 16 2.3.4. Một số yếu tố độc lực 25 2.4. Mối quan hệ cộng sinh 34 2.4.1. Vai trò của tuyến trùng 34 2.4.2. Vai trò của vi khuẩn cộng sinh 35 2.4.3. Tổng quát mối quan hệ trong tổ hợp tuyến trùng – vi khuẩn 35 2.5. Khái quát về các loài côn trùng bị EPN và vi khuẩn tiêu diệt 38 2.5.1. Đặc trưng côn trùng bị EPN tiêu diệt 39 2.5.2. Các loài côn trùng bị EPN tiêu diệt 39 2.5.3. Các loài côn trùng bị vi khuẩn Xenorhabdus tiêu diệt 40 2.6. Tình hình nghiên cứu Photorhabdus và Xenorhabdus trên thế giới và Việt Nam 41 2.6.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 42 2.6.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 45 CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined. 3.1. Thời gian và địa điểm Error! Bookmark not defined. 1
  3. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.1.1. Thời gian Error! Bookmark not defined. 3.1.2. Địa điểm Error! Bookmark not defined. 3.2. Vật liệu Error! Bookmark not defined. 3.2.1. Nguồn tuyến trùng EPN Error! Bookmark not defined. 3.2.2. Nguồn vi sinh vật Error! Bookmark not defined. 3.2.3. Môi trường nuôi cấy và hóa chất sử dụng Error! Bookmark not defined. 3.3. Phương pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined. 3.3.1. Phương pháp phân lập Error! Bookmark not defined. 3.3.2. Hình thái Error! Bookmark not defined. 3.3.3. Sinh lý Error! Bookmark not defined. 3.3.4. Kiểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập . Error! Bookmark not defined. 3.3.5. Thử nghiệm sinh hóa Error! Bookmark not defined. 3.3.6. Hoạt tính sinh học Error! Bookmark not defined. CHƯƠNG IV : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined. 4.1. Kết quả phân lập hai chủng vi khuẩn khảo sát Error! Bookmark not defined. 4.2. Hình thái khuẩn lạc Error! Bookmark not defined. 4.2.1. Quan sát khuẩn lạc Error! Bookmark not defined. 4.2.1. Nhuộm Gram (quan sát vi thể) Error! Bookmark not defined. 4.2.3. Nhuộm tiên mao Error! Bookmark not defined. 4.3. Thử nghiệm sinh lý Error! Bookmark not defined. 4.3.1. Di động Error! Bookmark not defined. 4.4. Kiểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập Error! Bookmark not defined. 4.5. Thử nghiệm sinh hóa Error! Bookmark not defined. 4.5.1. Kết quả thử nghiệm catalase Error! Bookmark not defined. 4.5.2. Lên men lactose Error! Bookmark not defined. 4.5.3. Indole Error! Bookmark not defined. 4.5.4. Khử nitrate Error! Bookmark not defined. 4.5.5. Phân giải tinh bột Error! Bookmark not defined. 4.5.6. Sinh hơi H2S Error! Bookmark not defined. 4.5.7. Thử nghiệm phân giải lipase Error! Bookmark not defined. 4.5.8. Thử nghiệm phân giải protease Error! Bookmark not defined. 4.6. Khả năng đối kháng với vi sinh vật gây hại của hai chủng vi khuẩn khảo sát Error! Bookmark not defined. 2
  4. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 4.6.1. Kết quả đối kháng với vi khuẩn gây bệnh Error! Bookmark not defined. 4.6.2. Kết quả đối kháng với nấm gây bệnh Error! Bookmark not defined. CHƯƠNG V : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 5.1. Kết luận 47 5.2. Kiến nghị . 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 90 3
  5. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BSL: Bướm sáp lớn LB: Luria-Bertani LPS: Lipopolysaccharide EPN: Entomopathogenic Nematodes HBHL: Hydroxybutanoyl homoserine lactone IJs: Infective Juveniles NBTA: Nutrient bromothymol blue agar PDA: Potato glucose agar QS: Quorum Sensing TSA: Tryptone Soya Agar VKCS: Vi khuẩn cộng sinh 4
  6. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Phân loại tuyến trùng ký sinh côn trùng 13 Bảng 2.2. Phân loại chi Photorhabdus và Xenorhabdus 15 Bảng 2.3. Đặc điểm phân biệt giữa hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus 16 Bảng 2.4. Một số đặc điểm phân biệt giữa hai pha sơ cấp và thứ cấp của Xenorhabdus / Photorhabdus 18 Bảng 2.6. Các đặc điểm sinh hóa cơ bản Xenorhabdus Error! Bookmark not defined. Bảng 2.7. Đặc điểm của một số loài Photorhabdus 23 Bảng 2.8. Đặc điểm của một số loài Xenorhabdus 24 Bảng 2.9. Các chất kháng sinh trong Photorhabdus 30 Bảng 2.10. Các chất kháng sinh trong Xenorhabdus 32 Bảng 2.11. Vòng đời của tuyến trùng – vi khuẩn cộng sinh 38 Bảng 2.12. Các chế phẩm EPN tại Việt Nam 45 Bảng 3.1. Thành phần thuốc nhuộm tiên mao Error! Bookmark not defined. Bảng 3.2. Thành phần thuốc thử trong thí nghiệm khả năng phân giải nitrate Error! Bookmark not defined. Bảng 3.3. Thành phần thuốc thử protease Error! Bookmark not defined. Bảng 3.4. Quy ước đường kính vòng phân giải Error! Bookmark not defined. Bảng 4.2. Khả năng phân giải protein của P1 và X1trên môi trường agar gelatin và chicken offal Error! Bookmark not defined. Bảng 4.3. Khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn khảo sát với Salmonella,E .Coli, B. subtilis. Error! Bookmark not defined. Bảng 4.4. Khả năng đối kháng của chủng P1 và X1 với Salmonella, E .Coli, B. subtilis, sau lần cấy chuyền thứ 7. Error! Bookmark not defined. Bảng 4.5. Kết quả đối kháng nấm Phytophthora spp sau lần cấy chuyền thứ nhất Error! Bookmark not defined. Bảng 4.6. Kết quả đối kháng Phytophthora spp sau lần cấy chuyền thứ bảy Error! Bookmark not defined. 5
  7. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Vòng đời tuyến trùng trong cơ thể côn trùng 14 Hình 2.2. Phân loại các chủng Photorhabdus và Xenorhabdus 16 Hình 2.3. Vai trò của pha I 19 Hình 2.4. Vai trò của pha II 19 Hình 2.5. Giả định về khả năng gây độc của X.nematophila 25 Hình 2.6. Cấu trúc nội độc tố vi khuẩn Gram âm (lypopolysaccharide) 28 Hình 2.7. Các hướng ứng dụng của vi khuẩn cộng sinh 42 Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát Error! Bookmark not defined. Hình 3.2. Phân lậpPhotorhabditis từ Heterorhabditis indica Error! Bookmark not defined. Hình 3.3. Phân lập Xenorhabdus từ Steinernema guangdongense Error! Bookmark not defined. Hình 4.1. Hình thái khuẩn lạc quan sát trực diện Error! Bookmark not defined. Hình 4.2. Hình thái khuẩn lạc quan sát qua kính hiển vi Error! Bookmark not defined. Hình 4.3. Hình thái khuẩn lạc soi nghiêng qua kính hiển vi Error! Bookmark not defined. Hình 4.4. Hình thái khuẩn lạc quan sát trực diện Error! Bookmark not defined. Hình 4.5. Hình thái khuẩn lạc quan sát dưới kính hiển vi Error! Bookmark not defined. Hình 4.6. Hình thái khuẩn lạc soi nghiêng qua kính hiển vi Error! Bookmark not defined. Hình 4.7. Hình thái tiên mao Error! Bookmark not defined. Hình 4.8. Hình thái vi khuẩn khi nhuộm gram Error! Bookmark not defined. Hình 4.9. Hiện tượng thử nghiệm catalase Error! Bookmark not defined. Hình 4.10. Hiện tượng thử nghiệm di động trên đĩa thạch Error! Bookmark not defined. Hình 4.11. Hiện tượng thử nghiệm di động trong ống nghiệm Error! Bookmark not defined. Hình 4.12. Hiện tượng thử nghiệm lên men lactose Error! Bookmark not defined. Hình 4.13. Hiện tượng thử nghiệm indole Error! Bookmark not defined. Hình 4.14. Hiện tượng thử nghiệm khử nitrate Error! Bookmark not defined. Hình 4.15. Hiện tượng thử nghiệm phân giải tinh bột Error! Bookmark not defined. Hình 4.16. Hiện tượng thử nghiệm sinh hơi H2S Error! Bookmark not defined. Hình 4.17. Hiện tượng phân giải lipase trên tween 20 Error! Bookmark not defined. Hình 4.18. Hiện tượng phân giải lipase trên chicken offal Error! Bookmark not defined. Hình 4.19. Hiện tượng phân giải gelatin của P1 Error! Bookmark not defined. 6
  8. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 4.20. Hiện tượng phân giải gelatin của X1 Error! Bookmark not defined. Hình 4.21. Hiện tượng phân giải gelatin của P1 Error! Bookmark not defined. Hình 4.22. Hiện tượng phân giải gelatin của X1 Error! Bookmark not defined. Hình 4.23. Thử nghiệm hoạt tính kháng B. subtilis với P1 . Error! Bookmark not defined. Hình 4.24.Thử nghiệm hoạt tính kháng B. subtilis với X1 Error! Bookmark not defined. Hình 4.25.Thử nghiệm hoạt tính kháng E. coli với P1 Error! Bookmark not defined. Hình 4.26. Thử nghiệm hoạt tính kháng Salmonella với P1 Error! Bookmark not defined. Hình 4.27. Thử nghiệm hoạt tính kháng B. subtilis với P1 . Error! Bookmark not defined. Hình 4.29.Thử nghiệm hoạt tính kháng E. coli với P1 Error! Bookmark not defined. Hình 4.30. Thử nghiệm hoạt tính kháng Salmonella với P1 Error! Bookmark not defined. Hình 4.31. Mẫu đối chứng Phytophthora spp. Error! Bookmark not defined. Hình 4.32. Mẫu P1 đối kháng Phytophthora spp. Error! Bookmark not defined. Hình 4.33. Mẫu X1 đối kháng Phytophthora spp. Error! Bookmark not defined. Hình 4.34. Mẫu đối chứng Phytophthora spp. Error! Bookmark not defined. Hình 4.35. Mẫu P1 đối kháng Phytophthora spp. Error! Bookmark not defined. Hình 4.36. Mẫu X1 đối kháng Phytophthora spp. Error! Bookmark not defined. Hình 4.37. Mẫu đối chứng Phytophthora spp. Error! Bookmark not defined. Hình 4.38. Mẫu P1 đối kháng Phytophthora spp. Error! Bookmark not defined. Hình 4.39. Mẫu X1 đối kháng Phytophthora spp. Error! Bookmark not defined. 7
  9. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG I : GIỚI THIỆU oOo 1.1. Tính cấp thiết của đề tài Ngày nay ngành nông nghiệp Việt Nam đang trên đà phát triển hết sức mạnh mẽ cả về số lượng và chất lượng, trong đó một số mặt hàng nông sản như cà phê, lúa gạo có kim nghạch xuất khẩu cao và có vị thế trên thị trường quốc tế. Nhu cầu tăng sản lượng, rút ngắn thời gian sản xuất để nâng cao lợi nhuận đang được đặt ra, đi đôi với nó luôn đòi hỏi những kiến thức để sản xuất sản phẩm an toàn. Tuy nhiên không phải chỉ riêng Việt Nam mà hầu như tất cả các nước nông nghiệp người nông dân ít được trang bị đầy đủ kiến thức về sản xuất để đảm bảo tính bền vững. Vì vậy ở không ít nơi người nông dân sử dụng ồ ạt các loại thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ có nguồn gốc hóa học vì không hiểu biết hay đã biết được tác hại nhưng vẫn cố ý sử dụng để tăng sản lượng, thu lợi nhuận. Chính việc sử dụng mà không tuân thủ các quy định về liều lượng và cách thức đã làm dịch bệnh trở nên nhiều hơn, nghiêm trọng hơn, diễn biến phức tạp hơn. Không những vậy, thế giới đang phải đối mặt với vấn đề nhức nhối là tồn dư quá mức của các chất hóa học có thể gây hại cho sức khỏe con người trong các sản phẩm nông nghiệp. Vì vậy xu hướng sử dụng các biện pháp phòng trừ sinh học đang trở nên rất hữu ích vì tiết kiệm chi phí, có tác dụng phòng trừ lâu dài, đảm bảo sức khỏe cho con người, đồng thời tính an toàn môi trường cao. Trong các biện pháp sinh học được sử dụng hiện nay thì dùng tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (EPN) gồm hai giống Steinernema và Heterorhabditis đang được các nước trên thế giới và Việt Nam đặc biệt chú ý. Tuy nhiên, các loài tuyến trùng EPN này sẽ không thực sự phát huy hiệu quả nếu không có mặt vi khuẩn cộng sinh trong ruột chúng, nguyên nhân chính gây ra cái chết của côn trùng, gồm Photorhabdus trong Heterorhabditis và Xenorhabdus trong Steinernema. Với vai trò đặc biệt, hai loài vi khuẩn trở thành mấu chốt trong mối quan hệ giữa sâu hại – tuyến trùng – vi khuẩn. Đây được coi là những loài vi khuẩn có đời sống rất đặc biệt khi cộng sinh trong một vật chủ và gây hại cho một vật chủ khác thông qua vật chủ mà nó cộng sinh. Mặt khác có thể thấy được khả năng kháng mạnh với các loài vi 8
  10. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP khuẩn có hại gây bệnh cho gia súc và các loài nấm gây hại cho nông nghiệp, điều này mở ra những ứng dụng rất lớn. Tuy nhiên ở Việt Nam hiện chỉ có một số nghiên cứu tại Hà Nội có liên quan đến hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus, ở các tỉnh thành miền Nam chưa có nghiên cứu về vấn đề phân lập và ứng dụng vi khuẩn cộng sinh này. Trong nghiên cứu này sử dụng hai nguồn tuyến trùng gồm Heterorhabditis indica và Steinernem guangdongense, trên thế giới Heterorhabditis indica được ứng dụng rộng rãi vì những tác dụng mang lại trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và Steinernema guangdongense là một loài tuyến trùng mới chưa có bất kỳ nghiên cứu về loài vi khuẩn cộng sinh với nó. Vì những lợi ích rất quan trọng của loài vi khuẩn này và yêu cầu mở rộng kiến thức khoa học mà người tiến hành đề tài đã chọn hướng cho đồ án tốt nghiệp là : “Phân lập và khảo sát hoạt tính sinh học của Photorhabdus spp. và Xenorhabdus spp. từ Heterorhabditis indica và Steinernema guangdongense ” 1.2. Mục đích của nghiên cứu Phân lập các chủng vi khuẩn thuộc hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus có khả năng đối kháng với các vi sinh vật gây hại cho gia súc và nông nghiệp. Khi thành công đề tài sẽ đánh dấu cho triển vọng về việc sử dụng vi khuẩn Xenorhabdus và Photohabdus trong hoạt động sản xuất nông nghiệp đáp ứng được yêu cầu có thể sản xuất quy mô lớn, nhanh chóng, hiệu quả cao. 1.3. Nhiệm vụ của nghiên cứu - Phân lập các chủng thuộc hai chi vi khuẩn Photorhabdus và Xenorhabdus. - Khảo sát khả năng đối kháng của các chủng phân lập được với ba loài vi khuẩn Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella và loài nấm Phytophthora tại hai thời điểm cấy chuyền là sau lần đầu tiên và lần thứ 7 cấy chuyền. 1.4. Các kết quả đạt được của đề tài - Phân lập được hai chủng vi khuẩn P1 và X1 thuộc hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus. 9
  11. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Kết quả khả năng đối kháng cho thấy sự thể hiện khả năng đối kháng của P1 và X1 với các vi khuẩn, nấm gây hại. Mức đối kháng của mỗi chủng với mỗi loài thử nghiệm là khác nhau và sau hai thời điểm cấy chuyền là khác nhau. 10
  12. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG II : TỔNG QUAN oOo 2.1. Giới thiệu về tuyến trùng ký sinh côn trùng (EPN) 2.1.1. Khái niệm EPN EPN viết tắt của từ Entomopathogenic Nematodes, đây là thuật ngữ dùng để chỉ các loài tuyến trùng kí sinh thuộc hai giống Steinernema và Heterorhabditis, chúng vừa có khả năng ký sinh lại vừa có khả năng gây bệnh giết chết côn trùng. Thực chất các loài tuyến trùng kí sinh này là tổ hợp được hình thành trong tự nhiên và có sự chuyên hóa cao, trong đó các loài tuyến trùng thuộc giống Steinernema cộng sinh với vi khuẩn Xenorhabdus, còn Heterorhabditis thì cộng sinh với vi khuẩn Photorhabdus. Sở dĩ được gọi là cộng sinh vì cả vi khuẩn và tuyến trùng đều dựa vào nhau để tồn tại, phát triển, sinh sản. Đây là một hiện tượng cộng sinh bắt buộc, cả tuyến trùng và vi khuẩn không thể tồn tại độc lập trong tự nhiên (Nguyễn Ngọc Châu, 2008). 2.1.2. Vai trò và ưu thế của EPN Vai trò của EPN được thấy trước tiên như là các thiên địch tự nhiên có tác dụng điều chỉnh mật độ quần thể côn trùng, trong đó có nhiều loài sâu hại. Thực tế cho thấy, trong tự nhiên nơi đâu có sự tồn tại của EPN thì nơi đó hầu như không bùng phát dịch hại do côn trùng gây ra (Nguyễn Ngọc Châu, 2008). EPN đang nhận được sự quan tâm trong nghiên cứu và ứng dụng là vì chúng có những ưu thế sau : a. Phương pháp sử dụng EPN trong phòng trừ sinh học đã được xác nhận là an toàn với người, động vật và thực vật. b. EPN có khả năng ký sinh và gây hại trên một diện rộng đối với các loài sâu hại và côn trùng. c. Các loài sâu hại và côn trùng không có khả năng kháng lại tổ hợp này. d. Có khả năng sản xuất sinh khối lớn trong điều kiện in vitro và in vivo. e. Áp dụng thực tiễn dễ dàng bởi biện pháp và thiết bị phun thuốc chuẩn đang được sử dụng. 11
  13. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP f. Có khả năng kết hợp với nhiều loại thuốc hóa học để tăng hiệu quả sử dụng. g. Có khả năng chủ động đi tìm vật chủ và giết chết chúng sau 48h. h. Tồn tại bền bỉ trong đất và nhân nhanh khi gặp sâu hại nên chỉ cần phun chế phẩm EPN cho cả một quá trình lâu dài. i. Dễ dàng tuyển chọn các chủng đạt yêu cầu theo nhu cầu sử dụng. 2.2. Khái quát về tuyến trùng ký sinh côn trùng 2.2.1. Phân loại Tuyến trùng ký sinh côn trùng đã được tìm thấy trong sáu bộ tuyến trùng: - Aphelenchida - Diplogasterida - Mermithida - Oxyurid - Rhabditida - Tylenchida Trong các bộ trên thì bộ Rhabditida, Mermithida và Tylenchida là quan trọng nhất. Trong bộ Rhabditida, tuyến trùng trong hai họ sau đây đã được đề cập: - Họ Steinernematidae với hai giống Steinernema và Neosteinernema - Họ Heterorhabditidae với chỉ một giống Heterorhabditis. Steinernema đã được Steiner mô tả năm 1923 với tên gọi Aplectana, vì tên này đã được sử dụng trước đó, nên năm 1927, Travassos đổi tên thành Steinernema, trước năm 1982 rất nhiều loài của tuyến trùng này có tên khác là Neoaplectana. Hiện nay có khoảng 56 loài đã được mô tả. Neosteinernema được Nguyễn và Smart mô tả năm 1994, tuyến trùng này chỉ có một loài và ký sinh trên mối. Heterorhabditis được Poinar mô tả năm 1976, Heterorhabditis có 12 loài. Đây được đánh giá là nhóm tuyến trùng quan trọng nhất trong bảo vệ mùa màng, vì vậy có nhiều nghiên cứu tập trung về các giống này (Nguyễn Bá Khương). Vòng đời của EPN khoảng 10 - 12 ngày và trung bình từ một vật chủ cho khoảng 5×104 ấu trùng tùy thuộc vào loài và trọng lượng vật chủ. 12
  14. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 2.1. Phân loại tuyến trùng ký sinh côn trùng Tên Phân loại Ngành Nematoda Lớp Chromadorea Phân lớp Chromadoria Bộ Rhabditida Phân bộ Panagrolaimomorpha Họ Steinernematidae Heterorhabditiae Giống Steinernema Neosteinernema Heterorhabditis 2.2.2. Chu trình sống của tuyến trùng Steinernema và Heterorhabditis Ấu trùng tuyến trùng xâm nhiễm tuổi 3 (IJs) mang vi khuẩn cộng sinh trong ruột. Khi vào đến bên trong vật chủ, chúng xâm nhập vào xoang máu, tuyến trùng sẽ phóng thích các vi khuẩn cộng sinh từ ruột của chúng vào trong máu của côn trùng. Vi khuẩn sẽ phát triển nhanh nhờ huyết tương của côn trùng tạo ra hiện tượng ngộ độc máu làm côn trùng chết trong khoảng từ 24 đến 48 giờ đồng hồ. Vi khuẩn sẽ phân hủy mô trong cơ thể côn trùng giúp ấu trùng tuyến trùng hấp thu chất dinh dưỡng để phát triển sang tuổi 4 và thành thành trùng thế hệ 1. Phụ thuộc vào nguồn dinh dưỡng mà tuyến trùng có cách phát triển khác nhau trong cơ thể côn trùng như hình 2.1. 13
  15. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 2.1. Vòng đời tuyến trùng trong cơ thể côn trùng a. Chu trình sống khi đầy đủ dinh dưỡng Khi nguồn thức ăn phong phú thì tuyến trùng sẽ sống theo vòng tròn như hình 2.1. Trứng của tuyến trùng thế hệ 1 sẽ nở ra ấu trùng tuyến trùng thế hệ 1 và chúng lại tiếp tục ăn vi khuẩn để phát triển sang ấu trùng tuổi 2, 3, 4 và thành trùng thế hệ thứ 2. Thành trùng thế hệ mới sẽ tiếp tục chu trình sống và sinh sản như ở thế hệ 1. b. Chu trình sống khi không đủ dinh dưỡng Khi không có đủ nguồn dinh dưỡng thì tuyến trùng sẽ sống theo chu kỳ ngắn như vòng nửa vòng cung phía dưới của hình 2.1. Trứng của thành trùng thế hệ thứ 1 sẽ nở ra ấu trùng tuổi 1, từ đây phát triển sang dạng ấu trùng tuổi 2, kế đó sẽ chuyển sang dạng trung gian giữa ký sinh và tiềm sinh, cuối cùng thành ấu trùng gây nhiễm, chờ thời cơ để xâm nhập vào vật chủ. 2.3. Khái quát về vi khuẩn cộng sinh Photorhabdus và Xenorhabdus Photorhabdus và Xenorhabdus đóng vai trò quan trọng trong quá trình gây bệnh với côn trùng cũng như cung cấp dinh dưỡng cho tuyến trùng. Đây được đánh giá là hai chi vi khuẩn đặc biệt nhất trong giới vi sinh vật khi cộng sinh với một vật chủ là tuyến trùng và ký sinh gây hại với một vật chủ khác là côn trùng (Steven Forst và David Clarke, 2011). Vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng thuộc hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus thuộc họ Enterobacteriaceae (vi khuẩn đường ruột). 2.3.1. Một số đặc điểm của họ Enterobacteriaceae Enterobacteriaceae là một họ vi khuẩn lớn, gồm trên 100 loài mang những đặc điểm cơ bản sau: a. Nơi cư trú Họ vi khuẩn đường ruột gồm những vi khuẩn thường trú trên cơ thể, ở ống tiêu hóa của người và động vật, có thể gây bệnh hoặc không gây bệnh. b. Hình thái 14
  16. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae là những trực khuẩn, không sinh nha bào. Một số giống vi khuẩn thường không di động (Klebsiella, Shigella), một số vi khuẩn khác di động (E. coli, Salmonella) nhờ có tiên mao ở xung quanh thân tế bào. Một số giống có vỏ nhìn thấy được nhờ kính hiển vi thường như Klebsiella. c. Sinh lý Các vi khuẩn đường ruột là gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện, phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường. d. Tính chất sinh hóa Lên men glucose, có sinh hơi hoặc không sinh hơi, oxidase âm tính, hầu hết catalase dương tính, khử nitrate thành nitrite. Lên men một số đường như glucose, galactose hoặc không lên men một số đường như lactose, manose, saccharose. Có thể có một số enzyme như urease, tryptophanase. Khả năng sinh ra H2S khi dị hóa protein, axít amin hoặc các dẫn chất có lưu huỳnh. 2.3.2. Phân loại Photorhabdus và Xenorhabdus Bảng 2.2. Phân loại chi Photorhabdus và Xenorhabdus STT Phân loại 1 Giới Bacteria 2 Ngành Proteobacteria 3 Lớp Gramma proteobacteria 4 Bộ Enterobacteriales 5 Họ Enterobacteriaceae 6 Chi Photorhabdus Xenorhabdus Hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus có mối quan hệ với nhau, có thể thấy mối quan hệ giữa hai chi qua hình 2.1. 15
  17. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 2.2. Phân loại các chủng Photorhabdus và Xenorhabdus 2.3.3. Một số đặc điểm phân biệt cơ bản Đây là hai chi có sự tương tự cả về hình thái, sinh lý và sinh hóa, tuy nhiên có thể phân biệt chúng theo một số đặc điểm cơ bản được nhắc đến trong bảng 2.3. Bảng 2.3. Đặc điểm phân biệt giữa hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus STT Đặc điểm Photorhabdus Xenorhabdus Tại vị trí 208 – 213 Tại vị trí 208 – 211 1 Trình tự 16S rRNA TGAAAG TTCG Tế bào có hình que, kích Tế bào có hình que và 2 Đặc điểm hình thái thước vào khoảng (0,5 - 2 × kích thước là (0,3 - 2 × 2 – 1 – 10 µm) 10 µm) 16
  18. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Điều kiện phát triển tốt Phát triển tối ưu ở 280C, nhất là 280C hoặc nhỏ 3 Điều kiện nuôi cấy một vài chủng phát triển ở hơn, một vài chủng phát 37 - 380C. triển ở 40C. Loài vật chủ cộng 5 Heterorhabditis Steinernema sinh Ngoài ra còn có một số đặc điểm cơ bản khác về mặt sinh hóa thì tùy thuộc từng loài và chủng cụ thể. a. Đặc điểm sinh lý nổi bật Photorhabdus và Xenorhabdus là Gram âm, kỵ khí tùy nghi, có cả hai quá trình lên men và hô hấp trong tế bào. Đặc điểm nổi bật nhất phải nhắc đến là hiện tượng biến đổi pha, đây được coi là một hiện tượng rất độc đáo trong hai chi vi khuẩn này.  Hiện tượng biến đổi pha: Đây là thuật ngữ để chỉ giai đoạn biến đổi tự nhiên xảy ra ở một số vi khuẩn về một số điểm như hình thái, màu sắc, tính chất hóa lý trong tế bào vi khuẩn. Nguyên nhân do biến đổi trong cấu trúc DNA đã làm thay đổi cấu trúc phân tử của các protein mà chúng tổng hợp ra điều này làm thay đổi các kiểu hình và kháng nguyên ở pha thứ cấp. Đối với vi khuẩn Photorhabdus và Xenorhabdus, pha I (sơ cấp) là dạng tế bào tự nhiên có quan hệ với tuyến trùng, còn pha II (thứ cấp) có thể xuất hiện một cách tự phát khi vi khuẩn đi vào pha cân bằng không tăng trưởng.  Đặc điểm của hai pha: Đặc điểm trước tiên để dễ dàng phân biệt hai pha là khả năng hấp thu màu môi trường để tạo màu khuẩn lạc ở pha sơ cấp nhưng ngược lại pha thứ cấp lại không thể hấp thu màu nên không tạo màu đặc trưng như pha I. Một đặc điểm rất quan trọng khác là khả năng sinh enzyme và chất kháng sinh mạnh ở pha I nhưng hầu như không có ở pha II. Có thể thấy được một số các đặc điểm khác nhau cơ bản ở bảng 2.4. 17
  19. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 2.4. Một số đặc điểm phân biệt giữa hai pha sơ cấp và thứ cấp của Xenorhabdus / Photorhabdus Đặc điểm Dạng sơ cấp Dạng thứ cấp Hình thái khuẩn lạc trên Tròng, lồi, dạng hạt, màu Phẳng, trong mờ, cạnh đều. nutrient agar đục, cạnh không đều. Hình thái khuẩn lạc trên Các khuẩn lạc hút nước, có Không xốp, màu đỏ, trung MacConkey màu đỏ trung tính, đỏ, đỏ tính, trắng, vàng. hồng. Hình thái khuẩn lạc trên Dạng xốp, xanh dương, Không có dạng xốp, màu NBTA oliu hoặc xanh lá. đỏ hoặc nâu sẫm. Xung quanh khuẩn lạc có Không tạo thành vùng vùng trong, một phần agar trong suốt bao quanh. bị biến màu. Sắc tố tạo thành trong môi Phụ thuộc chủng và môi Phụ thuộc chủng và môi trường lỏng trường. Ở P. luminesens có trường. Thường có màu màu thay đổi từ tím đến vàng thẫm, da cam. Màu màu tía khi tăng nồng độ thay đổi không mạnh khi NaOH. thêm NaOH do nồng độ sắc tố thấp. Hình dạng và hình thái tế Tế bào dạng que, kích Tế bào tương đối dài, kích bào thước nỏ đến trung bình thước nhỏ đến trung bình (dài 3 - 5 , rộng 1,5 – (6-7 , rộng 1 - 1,5 ). 2 ). Cơ thể có thể vùi Cơ thể ít có thể vùi hình oval hoặc hình vuông. Phát huỳnh quang ở Dương tính Âm tính Photorhabdus Hoạt tính kháng khuẩn Dương tính Âm tính Sinh trưởng của tuyến Tuyến trùng sinh trưởng Nhân giống tuyến trùng trùng trong nhân nuôi vi tốt, tăng nhanh kích thước, khó khăn, sinh trưởng đình khuẩn số lượng thế hệ sau và khả trệ, chết nhiều. năng sống sót. 18
  20. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Vai trò của hai pha: Pha I (pha sơ cấp): Tế bào vi khuẩn cộng sinh Tạo các enzyme Tạo các chất kháng ngoại bào sinh Cung cấp dinh Bảo vệ xác côn dưỡng trùng Hình 2.3. Vai trò của pha I Đây là pha được coi là đóng vai trò quan trọng nhất trong quá trình gây bệnh đối với côn trùng gây hại và cung cấp dinh dưỡng để tuyến trùng phát triển, sinh sản. Pha I có rất nhiều enzyme như protease, lipase, lecithinase, các enzyme này đóng vai trò trong việc phá vỡ các đại phân tử trong cơ thể côn trùng để cung cấp dinh dưỡng cho sự phát triển của chính nó và tuyến trùng. Mặt khác, có rất nhiều các hợp chất kháng sinh đã được tìm thấy ở pha này, chúng có nhiệm vụ tấn công côn trùng và bảo vệ xác côn trùng khỏi sự xâm nhập của các loài vi sinh vật cạnh tranh chất dinh dưỡng ở xác côn trùng. Tế bào vi khuẩn cộng sinh Biến đổi kháng nguyên Tránh hàng rào miễn dịch vật chủ Hình 2.4. Vai trò của pha II 19
  21. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Pha II (thứ cấp): Ở pha thứ cấp có sự giảm mạnh của việc sản xuất phospholipase, lipase, siderophores, khó di động hơn (N. Boemare và R.J. Akhurst, 1988; A. Givaudan và cộng sự, 1995). Như vậy, pha II không đóng vai trò trong việc gây độc cho côn trùng hay cung cấp dinh dưỡng cho tuyến trùng, điều này có thể giải thích một phần lý do tại sao tuyến trùng không sinh sản và phát triển hiệu quả khi tế bào pha II chiếm đa số trong xác côn trùng (R.J. Akhurst và N. E. Boemare. 1990). Tuy nhiên việc biến đổi sang pha II giúp vi khuẩn tránh được hàng rào miễn dịch của vật chủ nhờ việc đột biến ở trên DNA mã hóa cho protein kháng nguyên, kết quả là sự biến đổi kháng nguyên của chúng (A. Barbour 2002). b. Đặc điểm hình thái nổi bật * Khuẩn mao: Khuẩn mao là những sợi lông rất mảnh, rất ngắn, cứng, mọc quanh bề mặt tế bào nhiều vi khuẩn Gram âm. Chúng có đường kính khoảng 7 - 9 nm, rỗng ruột (đường kính trong là 2 - 2,5 nm), số lượng khoảng 250 - 300 sợi/vi khuẩn, có một tiểu đơn vị lớn hơn 17 kDa, vai trò chính là giúp vi khuẩn bám dính. Khuẩn mao của vi khuẩn Photorhabdus và Xenorhabdus được đánh giá có vai trò trong gây độc vì bám vào tế bào, mô côn trùng tạo điều kiện cho các yếu tố gây độc khác hoạt động. * Tiên mao: Tiên mao là những sợi lông dài, dưới kính hiển vi quang học chỉ có thể thấy rõ khi nhuộm theo phương pháp riêng, vai trò chính là giúp cho vi khuẩn vận động. Mặt khác, chúng đóng một vai trò quan trọng trong gây độc vì nó sẽ đưa vi khuẩn đến những vị trí thích hợp để gây bệnh, né tránh những vị trí bất lợi và tìm đến các nguồn dinh dưỡng. Trong hầu hết chủng X. nematophila đã được kiểm tra, tế bào sơ cấp đều thể hiện hai đặc tính là di động và quần tụ bầy đàn trong khi tế bào thứ cấp không có tiên mao và không thể di động. Trong một nghiên cứu để tìm ra nguyên nhân thiếu tiên mao trong tế bào thứ cấp, Givaudan và cộng sự (1996) tách dòng gen mã hóa 20
  22. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP tiên mao fliC và filD của X. nematophila cho thấy fliCD operon không bị thay đổi trong tế bào thứ cấp nhưng không được sao chép. Sự sao chép của fliCD operon bị điều khiển bởi flhDC (đây là operon ở Enterobacteriaceae kiểm soát sự biểu hiện của hơn 50 gen mã hóa chức năng tiên mao). Việc không có tiên mao ở tế bào thứ cấp là do thiếu yếu tố sigma fliA đây là yếu tố cần cho việc sao chép của fliCD. c. Đặc điểm sinh hóa * Photorhabdus Các đặc tính sinh hóa có sự khác nhau giữa các chủng của chi Photorhabdus, hầu hết âm tính trong các mô tả của Enterobacteriaceae Bảng 2.5. Các đặc điểm sinh hóa cơ bản Photorhabdus Kết quả Tên thử nghiệm Pha I Pha II Catalase + Khử nitrate - Thủy phân gelatine + Tan huyết cừu Hầu hết + Tan máu ngựa Hầu hết + Phân giải tween 20 + Tween - 40, 60, 80 và 85 Hầu hết + Acid hóa fructose, D - mannose, maltose, Hầu hết + ribose, N – acetylglucosamine Lên men từ glycerol + yếu Nguồn cacbon và năng lượng từ fumarate, + glucosamine, L - glutamate, L - malate, L - proline, Succinate, L – tyrosine Phát quang + + yếu Hấp thu màu môi trường + - * Xenorhabdus Xenorhabdus âm tính với hầu hết thử nghiệm của Enterobacteriaceae. 21
  23. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 2.6. Các đặc điểm sinh hóa cơ bản Xenorhabdus Kết quả Tên thử nghiệm Pha I Pha II Catalase + Khử nitrate - Thủy phân gelatine + Tan huyết cừu Hầu hết + Tan máu ngựa Hầu hết + Phân giải tween 20 + Tween - 40, 60, 80 và 85 Hầu hết + Acid hóa glucose + Di động + + yếu Hấp thu màu môi trường + - Kháng sinh + - d. Đặc điểm một số loài đã được nghiên cứu * Photorhabdus Photorhabdus được nghiên cứu khá nhiều nhưng tập trung chủ yếu vào P. luminescens và P. temperata. Bảng 2.7 nêu một số đặc điểm cơ bản của các loài này. 22
  24. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 2.7. Đặc điểm của một số loài Photorhabdus P. P. P. P. luminescens Thử nghiệm luminescens luminescens P. temperata luminescens laumondii luminescens akhustii H. H. Heterorha bacteriopho Heterorhabdi Phân lập bacteriophor H. indica bditis spp. ra nhóm tis spp. a nhóm HP88 Brecon Nhiệt độ (0C) 35 - 39 38 - 39 35 - 36 38 - 39 33 - 35 Hấp thụ màu + + + + + Kháng sinh + + + + + Indole + + + d [-] Simon’s citrate d + D d d Phân hủy + + + + [+] aesculin Urease d - [+] d d Phenylalanine [-] - D - [+] deaminase Tryptophan [-] - D - [-]w deaminase Myo- inositol d + [+] [+] dw d- mannitol d dw - + [-] L-fucose d d - [+] d lecithinase + + + + + Phân hủy máu d + [-] + + cừu Phân hủy máu d + - d + ngựa Nguồn: Entomopathogenic Nematology (2011) 23
  25. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP * Xenorhabdus Xenorhabdus có vai trò rất quan trọng trong các ứng dụng bảo vệ thực vật vì vậy có rất nhiều nghiên cứu về các loài của chi này. Các đặc điểm cơ bản được thấy trong bảng 2.8. Bảng 2.8. Đặc điểm của một số loài Xenorhabdus Thử X. X. X. X. Nội dung X. bovienii nghiệm nematophila poinarii beddingii japonica S. carpocapsae + - - - - S. feltiae, S. intermedium, - + - - - S. affine, S. kraussei Nguồn S. glaseri, S. phân lập - - + - - cubanum Steinernema spp. chưa được - - - + - mô tả S. kushidai - - - - + Nhiệt độ tối ưu 35 32 40 39 35 để phát triển Gây độc cho + + - + - lepidopteran Di động d D D + d Hấp thụ màu ow Y Br lb yb sắc Simmon’s + + + + - citrate Phân giải - - D + - aesculin Phenylalanine d [-] [-] - dw deaminase Tryptophan - + - +w - deaminase Myo-inositol +w dw - - - Sản xuất acid từ Ribose - + - + - Salicin - - - + - Diaminobutane - [+] - - - D,L-Glycerate + + [-] + - L(-)Histidine - + [+] + - Sử dụng Myo-inositol +w dw - - - Ribose - [+] - + - L-Tyrosine - [+] - + - 24
  26. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Lipase d + +w +w - (Twenn-80) Tất cả các test được thực hiện ở 280C, + là với 90 – 100% số chủng là dương tính, [+] là 76 – 89% là dương tính; d là 26 – 75% là dương tính; [-] là 11 – 25% là dương tính; - là 0 – 10% là dương tính. Các từ ở trên là w ( ví dụ +w) là dương tính nhưng yếu. Hấp thụ màu sắc: ow là trắng sữa, y là vàng, br là nâu, lb là nâu sáng, yb là nâu vàng. 2.3.4. Một số yếu tố độc lực Hiện nay chưa có nhiều nghiên cứa về khả năng gây độc của vi khuẩn với vật chủ, có thể thấy tổng quát về sự gây độc này qua một giả định về tác động với vật chủ của Xenorhabdus nematophila: Hình 2.5. Giả định về khả năng gây độc của X.nematophila X. nematophila sản xuất ra chất tiết và protein thụ quản phân bố trên bề mặt có mối liên hệ với việc tiếp xúc vật chủ. Màng ngoài vi khuẩn có các ngang là các mụn nước gây độc với tế bào máu, và các tiểu đơn vị khuẩn mao gây độc ngoài ra còn có LPS. LPS, độc tố tiết ra và chất tiêu hồng cầu đóng góp cho việc phá hủy tế 25
  27. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP bào máu côn trùng và lipase là chất được tiết qua hệ thống khuẩn mao phức tạp để cung cấp dinh dưỡng cho vi khuẩn và tuyến trùng thông qua việc biến đổi sinh học xác côn trùng. Tuy nhiên cơ chế của việc tiết chất tiêu hồng cầu và phức hệ độc tố thì chưa được biết đến. X. nematophila có protein ngoài màng OpaB ở dạng bám dính trên bề mặt, giống với yếu tố độc tố Sil của Yersinia và nó có tác dụng tấn công trực tiếp lên bề mặt sâu khi tiếp xúc. NilA, B và X là protein màng làm nhiệm vụ là phân tử tín hiệu hay bám dính (Nil B). Pix A và IP2 là thể vùi, cũng có giả thiết là nó cung cấp dinh dưỡng cho tuyến trùng. Dưới đây là những phân tích cụ thể về các yếu tố gây độc cụ thể: a. Hệ thống Quorum Sensing (QS) * QS là cơ chế: - Thông tin liên lạc giữa tế bào với tế bào. - Phối hợp sự biểu hiện gen trong tế bào vi khuẩn. - Đáp lại mật độ tế bào bằng cách sản xuất, giải phóng, dò tìm các phân tử autoinducer. * Vai trò của QS : Cho phép vi khuẩn phối hợp của với nhau, khi điều kiện môi trường thường xuyên thay đổi nhanh chóng, vi khuẩn cần phải đáp ứng một cách nhanh chóng để tồn tại. Những phản ứng này bao gồm thích ứng với sự sẵn có mặt của chất dinh dưỡng, phòng thủ chống lại các vi sinh vật khác cạnh tranh cho các chất dinh dưỡng với chúng và tránh các hợp chất độc hại có khả năng gây nguy hiểm cho các vi khuẩn. Điều rất quan trọng cho vi khuẩn gây bệnh trong quá trình lây nhiễm vào một vật chủ để phối hợp độc lực của chúng để thoát khỏi các phản ứng miễn dịch của vật chủ. * Autoinducer Là một yếu tố hóa học kích thích các gen mã hóa cho độc lực hay phát quang trong vi khuẩn. Ở vi khuẩn Photorhabdus thì autoinducer là autoinducer 2 (AI – 2) (Evelyne Krin và cộng sự 2006). 26
  28. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Ở Xenorhabdus thì autoinducer là homoserine lactose autoinducer cụ thể là trong X. nematophila là N – beta - Hydroxybutanoyl homoserine lactone (HBHL) (Dunphy và cộng sự (1997)). * Vai trò của QS trong Photorhabdus và Xenorhabdus - Phát sáng (Evelyne Krin và cộng sự 2006). - Sự hình thành biofilm (Evelyne Krin và cộng sự 2006). Màng sinh học bao quanh vi khuẩn để chống lại quá trình thực bào của vật chủ. - Sản xuất các enzyme thủy phân, siderophore. b. Nội độc tố Nội độc tố là phức hợp lipopolysaccaride (LPS) và là thành phần chính của lớp màng ngoài vi khuẩn Gram âm. * Cấu tạo gồm : - Một nhóm lipid rất kị nước liên kết cộng hóa trị với đuôi polysaccharide dài. - Lipid A: gồm hai phân tử đường phosphoryl hóa liên kết với nhiều phân tử acid béo. Lipid A giúp gắn các phân tử LPS với màng tế bào và chịu trách nhiệm cho hầu hết các hiệu ứng sinh học của nội độc tố. - Đuôi polysaccharide dài ưu nước, gồm hai vùng chính: - Vùng chứa một nhóm nhỏ đường: phân tử đường 7 cacbon liên kết với 2 phân tử đường 8 cacbon, có vai trò liên kết lipid A với kháng nguyên O. - Vùng lớn hơn và đặc biệt dễ biến đổi kháng nguyên O, gây ra các phản ứng kháng nguyên cụ thể. * Cơ chế tác động: - LBP là một glycoprotein kích thước 60 kDa liên kết với LPS thông qua đuôi lipid A làm tăng cường các tương tác của nó với tế bào miến dịch. - Thụ thể CD14 là một glycoprotein đặc biệt kích thước 55 kDa nằm trên các tế bào miễn dịch. - Trong huyết thanh, khi LPS – LBP liên kết với CD14 sẽ khởi động các tín hiệu bên trong tế bào, tác động lên nhân, làm tăng cường phiên mã mRNA mã hóa cho cytokine, từ đó rất nhiều phân tử cytokine được tiết ra ngoài tế bào. Các 27
  29. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP cytokine có tác dụng tham gia vào rất nhiều tương tác giữa các tế bào với nhau trong đáp ứng miễn dịch tự nhiên Hình 2.6. Cấu trúc nội độc tố vi khuẩn Gram âm (lypopolysaccharide) c. Thành phần protein * Protein xuyên màng: Nằm xuyên qua chiều dày của lớp lipid kép, hầu hết là các glycoprotein với thành phần đường nằm quay ra phía ngoài của màng tế bào. * Protein ngoại vi: Chỉ gắn lỏng lẻo với mặt ngoài hoặc mặt trong của màng lipid kép. Vai trò của protein trên màng tế bào: Đảm nhận vai trò vận chuyển các chất, cho một số chất nhất định đi qua màng, xác định một số phân tử như hormon và chất dẫn truyền thần kinh để gắn với chúng và khởi động các chức năng của tế bào, nhận dạng và đáp ứng với các tế bào lạ. * Tinh thể protein: Bowen và Ensign đánh giá 4 chủng của P.luminescens tiết độc tố và tìm thấy chủng W - 14 tiết ra một loại độc tố có thể giết ấu trùng khi đưa vào bằng đường miệng hay tiêm, W - 14 có thể chống lại 4 bộ khác của sâu. Việc nhiễm độc tố vào xoang máu và nhiễm theo đường miệng có mô bệnh học như nhau, cho thấy là độc tố có thể tấn công từ ruột giữa. D.Bowen lưu ý là các mô khác (cơ vân, hệ thần kinh, ống malpighian) thì xoang máu không bị tấn công, nhưng vị trí ban đầu hoạt động của độc tố in vivo có thể không phải là ruột giữa. Hai loại tinh thể protein tự nhiên rất phức tạp đã được tìm thấy trong giai đoạn tế bào sơ cấp nhưng không được tìm thấy ở tế bào thứ cấp. Dạng tinh thể I của X. nematophila là hỗn hợp giàu methionine nặng 26 kDa trong khi dạng II nặng 22 kDa. Gen mã hóa hai tinh thể (Cip) protein của P. luminescens NC1 đã được xác 28
  30. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP định trình tự. Gen CipA mã hóa protein giàu methionine nặng 11,6 kDa và gen CipB mã hóa protein nặng 11,3 kDa. d. Thể vùi Thể vùi là cấu trúc có mặt trong dịch bào tương, chứa các sản phẩm bài tiết hoặc dự trữ của tế bào. Người ta chia các thể vùi làm bốn loại: Thể vùi acid nucleic (hạt vô lutin), thể vùi lipoid (giọt mỡ); thể vùi glucid; thể vùi vô cơ. e. Các chất kháng sinh * Photorhabdus Pha I của Photorhabdus sản xuất ra nhiều chất kháng sinh rất quan trọng, hai nhóm chất đặc trưng là hydroxystilbenes và polyketides (là dẫn xuất của anthraquinone dẫn xuất). Các chất này khác nhau ở sự thay đổi nhóm hydroxyl và methoxyl xung quanh vòng anthraquinone (bảng 2.10). Thành phần môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng đáng kể đến thành phần của các hợp chất kháng sinh này (Webster và cộng sự, 1998). Ở Photorhabdus có hiện tượng phát sáng và con đường để tạo ra ánh sáng tương tự nhưcơ chế vi khuẩn biển (Frackman và cộng sự 1990b; Frackman và Nealson, 1990a). Sự phát sáng là do enzyme luciferase vi khuẩn oxy hoá FMNH2 (riboflavin phosphate) trong sự hiện diện của một aldehyd mạch dài và O2 , kết quả tạo ra FMN, acid tương ứng, H2O và ánh sáng 490 nm (Balny và Hasting 1975). Phương trình phản ứng: Luciferase FMNH2 + RCHO + O2 → FMN + RCOOH + H2O + 0,2hv 29
  31. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 2.9. Các chất kháng sinh trong Photorhabdus 1. Trans-stibenes Nhóm thay thế R Sản xuất Sản xuất in Hấp thu màu Kháng lại các đối in vivo vitro sắc môi trường tượng 3,5-dihydroxy-4- + - - Vi khuẩn, nấm. ethyistibene 3,5-dihydroxy-4- + + + Vi khuẩn, nấm, isopropyistibene tuyến trùng. Loài: P. luminescens luminescens Hb, Hm P. temperate Nearctic nhóm NC19, C9, HK. (Hu và cộng sự 1998; Li và cộng sự; Paul và cộng sự, 1981; Richardson và cộng sự 1988; Sundar và Chang, 1992). 2. Polyketides Nhóm thế R1, R2, R3 Sản xuất Sản xuất Sắc tố Kháng lại in vivo in vitro các đối tượng 3,8-dimethoxy-1-hydroxy-9,10- + + Vàng Vi khuẩn anthraquinone 1,3-dimethoxy-8-hydroxy-9,10- + + Vàng Vi khuẩn anthraquinone 1,8-dihydroxy-3-methoxy-9,10- + - Vàng Vi khuẩn anthraquinone 1-hydroxy-2,6,8-trimethoxy- + - Vàng Vi khuẩn 9,10-anthraquinone 1,4-dihydroxy-2,5-dimethoxy- + - Đỏ Vi khuẩn 9,10-anthraquinone Loài : P. luminescens luminescens Hb, Hm P. temperate Nearctic nhóm NC19, C9, HK. 30
  32. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP (Hu và cộng sự 1998; Li và cộng sự; Paul và cộng sự, 1981; Richardson và cộng sự 1988; Sztaricskai và cộng sự, 1992). * Xenorhabdus Xenorhabdus có khả năng sản xuất nhiều chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính kháng sinh rất mạnh mẽ (Akhurst, 1982a; bảng 2.11.). Có bốn nhóm chất kháng sinh đã được tìm thấy gồm dẫn xuất của indole, xenorhabdins, xenorxides và xenocoumacins. Các chất này có vai trò quan trong việc bảo vệ xác côn trùng chống lại các loại vi khuẩn gây hại tranh dành xác côn trùng. 31
  33. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 2.10. Các chất kháng sinh trong Xenorhabdus Indole Các nhóm thế Sản xuất Đối tượng kháng lại R1, R2 in vitro 3-(2’-hydroxy-3’-keto-4’- + Vi khuẩn methylpentyl)-indole 3-(2’-hydroxy-3’-keto-4’- + Vi khuẩn methylhexyl)-indole 3-(2’-acetoxy-3’-keto-4’- + Vi khuẩn methylpentyl)-indole 3-(2’-acetoxy-3’-keto-4’- + Vi khuẩn methylhexyl)-indole Nhóm thế R Sản xuất Đối tượng kháng lại in vitro 3-indoleethyl(3’-methyl-2’- + _ hydroxy)pentamide 3-indoleethyl(3’-methyl-2’- + Vi khuẩn và nấm oxo)pentamide (nematophin) Loài: X. nematophila ATCC 19601, B1, All X. bovienii DN, B1, BC1, D1 (Li và cộng sự, 1996; Li và cộng sự, 1997; Paul và cộng sự, 1981; Sundar và Chang, 1993; Webster và cộng sự, 1996) 2. Xenorhabdins Dẫn xuất N-acyl Sản xuất Đối tượng kháng lại in vitro 6-amino-4,6-dihydro-6-oxo- + Vi khuẩn, côn trùng 1,2-dithiolo(4,3-b)pyrrole 32
  34. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 6-amino-4,5-dihydro-4- + Vi khuẩn, côn trùng methyl-5-oxo-1,2- dithiolo(4,3-b)pyrrole Loài: Xenorhabdus bovienii (Mclnerney et al., 1991; Rhodes et al., 1987) 3. Xenorxides Dẫn xuất Sản xuất Đối tượng kháng lại in vitro oxidized xenorhabdins + Vi khuẩn, nấm Loài: Xenorhabdus bovienii (Li et al., 1997) 4. Xenocoumacins Nhóm thế Sản xuất Đối tượng kháng lại in vitro 3,4-dihydro-8-hydroxy-1H- + Vi khuẩn, nấm 2-benzopyran-1-one Loài: Xenorhabdus nematophila (Gregson and Mclnerney, 1989; McInemey et al., 1991) f. Các enzyme ngoại bào Một số enzyme ngoại bào và các tác nhân khác trong vi khuẩn đã được xác định cho vai trò hỗ trợ việc gây độc. Enzyme ngoại bào được tạo ra bởi nhiều chủng của Photorhabdus và Xenorhabdus dù sự sản xuất ra chúng có thể khác nhau trong cá nhân mỗi chủng. Lecithinases được sản xuất bởi X. nematophila và X. bovienii nhưng không có trong một vài chủng Photorhabdus. Lecithinases đóng vai trò phân hủy phospholipd của cơ thể côn trùng để cung cấp nguồi lipid cho sự phát triển của tuyến trùng. Lipase tấn công mô vật chủ để phân giải lipid có trong mô cho tuyến trùng 33
  35. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP và vi khuẩn sử dụng. Clarke và Dowds (1995) cho thấy lip - 1 sở hữu nội độc tố ảnh hưởng lên G. mellonella. Dunphy (1997) cho thấy một chủng đột biến không độc (AV1) của X. nematophila sản xuất mức thấp lipase và tiết ra ít phân tử tín hiệu hydroxybutanoyl homoserine lactone (HBHL), nếu được bổ sung HBHL từ Vibrio harveyi sẽ kích thích sản xuất lipase phục hồi tính độc của AV1. Như vậy lipase có khả năng liên quan đến việc gây độc của tế bào vi khuẩn. Protease đóng vai trò phá hủy protein của sâu để cung cấp dinh dưỡng cho cả vi khuẩn và tuyến trùng được tiết ra mức cao trong tế bào sơ cấp của Photorhabdus và Xenorhabdus trong khi ở tế bào thứ cấp hoạt tính của protease thấp. Wee (2000) chỉ ra rằng tế bào thứ cấp của P. luminescens sản xuất protease nhưng không có ở tế bào thứ cấp. Số lượng khác nhau của loại protease và mức hoạt tính protease có thể biến đổi giữa các cá nhân cùng một chủng. 2.4. Mối quan hệ cộng sinh 2.4.1. Vai trò của tuyến trùng Tuyến trùng đóng một vai trò quan trọng trong tổ hợp cộng sinh. Bao gồm: - Vector vận chuyển VKCS: Các IJs khi xâm nhập vào côn trùng thì chúng được coi như vector vận chuyển các vi khuẩn vào trong. Khi đã vào trong vật chủ côn trùng, các tuyến tùy sẽ đi thẳng đến xoang máu côn trùng, giải phóng vi khuẩn qua lỗ hậu môn để vi khuẩn vào xoang máu côn trùng. Tại đây vi khuẩn sẽ sinh sôi, tạo độc tố giết chết vật chủ. - Bảo vệ VKCS: Vì vi khuẩn cộng sinh không thể tồn tại độc lập trong môi trường đất nên việc tuyến trùng mang vi khuẩn cộng sinh trong bọc của ruột sẽ giúp bảo vệ nó trong tự nhiên. Khi vào côn trùng vật chủ, theo phản xạ tự nhiên thì côn trùng sẽ tiết ra các chất kháng thể để chống lại vi khuẩn cộng sinh, tuyến trùng sẽ tiết ra các chất làm trung hòa và làm mất tác dụng của kháng thể này (Nguyễn Ngọc Châu, 2008). 34
  36. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.4.2. Vai trò của vi khuẩn cộng sinh - Sản sinh độc tố giết chết côn trùng bị nhiễm: Vi khuẩn cộng sinh tiết ra các loại độc tố giết chết côn trùng một cách nhanh chóng trong vòng 24 giờ - 48 giờ, thời gian này phụ thuộc vào tổ hợp tuyến trùng, vi khuẩn và loài côn trùng cụ thể. - Cung cấp thức ăn cho tuyến trùng: Vi khuẩn cộng sinh sẽ sử dụng vi khuẩn cộng sinh khi chúng vừa được giải phóng ra sau khi vào cơ thể côn trùng. Bằng cách này các IJs (tuổi 3) sẽ phát triển sang tuổi 4 và đạt trưởng thành. Từ thế hệ thứ hai, tuyến trùng sẽ chuyển sang sử dụng dinh dưỡng bằng mô côn trùng đã được vi khuẩn cộng sinh hoạt hóa. - Hoạt hóa xác chết côn trùng: Vi khuẩn cộng sinh tiết ra các enzyme để hoạt hóa xác côn trùng thành dạng dinh dưỡng thích hợp cho tuyến trùng. Đây là nguồn thức ăn hết sức quan trọng để tuyến trùng sinh sản và phát triển. - Ngăn cản các vi khuẩn khác xâm nhập vào xác chết côn trùng: Vi khuẩn cộng sinh sản sinh ra các hoạt chất kháng sinh để ngăn các loài như nấm, vi khuẩn xâm nhập và phát triển bên trong xác côn trùng. 2.4.3. Tổng quát mối quan hệ trong tổ hợp tuyến trùng – vi khuẩn Mối liên hệ giữa tuyến trùng và vi khuẩn có thể được khái quát hóa qua ba giai đoạn như sau: a) Giai đoạn I Tuyến trùng sẽ tồn tại ở dạng ấu trùng xâm nhiễm tuổi 3 (IJs) được bao bọc bởi lớp vỏ cutin của ấu trùng tuổi 2. Đây là hình thức tồn tại mà không cần đến dinh dưỡng, chúng sẽ tồn tại bền bỉ trong đất cho đến khi tìm được vật chủ. IJs của Steinernema sẽ mang vi khuẩn ở bọng trước ống ruột, trong khi đó Ciche và Ensign (2000) cho thấy Heterorhabditis mang vi khuẩn nằm rải rác giữa ruột nhưng chủ yếu vẫn là nửa trước ống ruột. IJs tìm vật chủ theo hai hình thức: * Hình thức thứ nhất: Với hầu hết Heterorhabditis và một số loài Steinernema thì có tập tính săn lùng vật chủ. Nhờ khả năng nhận biết khí CO2 mà vật chủ thải ra giúp chúng định hướng được mục tiêu và di chuyển nhanh đến vật chủ. * Hình thức thứ hai: Với hầu hết Steinernema thì chúng ở một chỗ trong 35
  37. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP đất chờ khi vật chủ đi qua chúng sẽ tấn công. Sau khi đã tìm thấy vật chủ chúng sẽ vào cơ thể vật chủ theo hai hình thức: * Hình thức thứ nhất: Heterorhabditis sẽ dùng mấu kitin dạng sừng ở gần miệng để đâm thủng biểu bì tại nơi xung yếu nhất là ranh giới giữa các đốt trong cơ thể,sau đó đi trực tiếp vào xoang máu của vật chủ. * Hình thức thứ hai: Steinernema sẽ đi vào xoang máu vật chủ gián tiếp qua miệng, lỗ thở, hậu môn và sau cùng sẽ di trú vào xoang máu. b) Giai đoạn II (sớm) Đây là giai đoạn kết hợp việc phục hồi của IJs, sự phóng thích vi khuẩn vào huyết tương và giết chết vật chủ côn trùng. Tuy nhiên đồng thời với việc xâm nhập của IJs là một loạt các phản ứng của cơ thể vật chủ côn trùng để chống lại cả tuyến trùng và vi khuẩn. Phản ứng của tế bào để đáp lại thông qua tế bào máu để tiêu diệt các vi sinh vật bằng cơ chế thực bào. Khi mà sinh vật xâm nhập trên diện rộng (ở đây là tuyến trùng) thì tế bào máu sẽ phối hợp với nhau tạo thành một lớp bao vây quanh sinh vật là gọi là nốt sần. Cách khác là tế bào máu hoạt hóa enzyme phenoloxidase tạo thành lớp melanin quanh vi sinh vật gây hại. Và các phản ứng miễn dịch dịch thể gồm sản xuất lyzozyme và sản xuất các pepetide kháng sinh như cecropin. * Phục hồi IJs: Trong huyết tương, tuyến trùng vẫn tồn tại ở dạng IJs và tiếp tục phát triển. Bước phát triển này của tuyến trùng gọi là sự phục hồi. IJs của Heterorhabditis sẽ phục hồi và phát triển thành dạng lưỡng tính, trong khi đó IJs của Steinernema phát triển thành hai dạng giới tính rõ ràng. * Gây bệnh: Đây là yếu tố mấu chốt của mối quan hệ cộng sinh giữa tuyến trùngvà vi khuẩn, vi khuẩn sẽ sản xuất ra các yếu tố độc tố gây ra cái chết của côn trùng chuẩn bị cho các bước kế tiếp. 36
  38. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP c) Giai đoạn II (muộn) Trong giai đoạn này là sự phát triển mạnh của vi khẩn đạt mật độ tế bào cao nhất và quá trình biến đổi sinh học xác côn trùng thành nguồn dinh dưỡng thích hợp cho tuyến trùng sinh sôi và phát triển. * Biến đổi sinh học xác côn trùng: Huyết tương là một nguồn dinh dưỡng rất phong phú cho sự phát triển của vi khuẩn. Gian đoạn này bắt đầu sau khoảng 24 giờ – 48 giờ sau khi nhiễm, côn trùng sẽ bị khống chế hoàn toàn bởi các chất gây độc của vi khuẩn sau đó bị phân hủy dần vì các enzyme ngoại bào mà vi khuẩn tiết ra. Ví dụ như trong môi trường nhân tạo Photorhabdus và Xenorhabdus sản xuất ra phức hợp protease, lipase, lecithinase, chitinase trong suốt giai đoạn tăng trưởng. Ngoài ra P. luminescens cũng tiết ra một metalloprotease trong cả điều kiện invitro và invivo. * Nâng đỡ sự phát triển của tuyến trùng: Sản xuất enzyme phân giải cơ thể côn trùng để lấy dinh dưỡng cho tuyến trùng và chính nó: Khả năng sinh sôi của tuyến trùng phụ thuộc vào sự hiện diện của vi khuẩn trong cơ thể côn trùng. Trong trường hợp của Photorhabdus – Heterorhabditis cho thấy Heterorhabditis chỉ phát triển khi có Photorhabdus, điều này cho thấy vai trò rất quan trọng trong việc chuyển hóa sinh học xác côn trùng. Ở một nghiên cứu khác, Steinernema có thể sinh sôi dù không có sự hiện diện của Xenorhabdus, nhưng sự sinh sôi này có sự hạn chế về số lượng. * Bảo vệ xác chết để tuyến trùng có nơi cư trú và duy trì nguồn dinh dưỡng Phụ thuộc điều kiện nuôi cấy, thời gian của một thế hệ ấu trùng xâm nhiễm thoát ra ngoài là khoảng 7 – 21 ngày sau khi chúng vào côn trùng. Trong suốt thời gian này điều rất quan trọng là xác chết côn trùng phải được bảo vệ khỏi sinh vật lạ. Cả Photorhabdus và Xenorhabdus sản xuất ra kháng sinh để chống lại các loài sinh vật khác. d) Giai đoạn III Giai đoạn trưởng thành của IJs và hình thành tập đoàn IJs mới cộng sinh với vi khuẩn. 37
  39. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Sự trưởng thành của IJs: IJs sẽ sử dụng dinh dưỡng được cung cấp để phát triển thành dạng thành trùng trưởng thành. Hình thành tập đoàn IJs: Khi phát triển đến trưởng thành trong cơ thể vật chủ, tuyến trùng tiếp tục phát triển qua một, hai hay nhiều thế hệ và tạo ra nhiều IJs sau khi kết thúc quá trình sinh sản trong vật chủ. Sau đó các IJs đồng loạt chui ra ngoài xác côn trùng và phát tán vào môi trường đất xung quanh xác chết và trở thành ấu trùng xâm nhiễm. Bảng 2.11. Vòng đời của tuyến trùng – vi khuẩn cộng sinh Giai đoạn Vòng đời của tuyến trùng Vòng đời của vi khuẩn Tuyến trùng đã nhiễm vi khuẩn nằm trong đất. Vi khuẩn vẫn được giữ trong I Tìm vật chủ (côn trùng) ruột tuyến trùng Xâm nhập vào xoang máu vật chủ côn trùng. Vi khuẩn được phóng thích Phục hồi trong xoang máu của vào huyết tương. II (sớm) côn trùng Sản xuất yếu tố gây độc. Làm chết côn trùng. Vi khuẩn vào pha cân bằng. Sản xuất kháng sinh, enzyme II (muộn) Tuyến trùng sinh sôi ngoại bào, tinh thể protein. Biến đổi sinh học xác sâu. Hình thành tổ hợp vi khuẩn III Tuyến trùng mới phát triển trong ruột tuyến trùng 2.5. Khái quát về các loài côn trùng bị EPN và vi khuẩn tiêu diệt Côn trùng là nguồn cung cấp dinh dưỡng hết sức phong phú gồm protein, lipid và một số thành phần khác, ngoài ra nó còn cung cấp chỗ trú ngụ tạm thời cho một vài thế hệ tuyến trùng. 38
  40. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.5.1. Đặc trưng côn trùng bị EPN tiêu diệt Nếu nhiễm Steinernema thì xác chết có màu nâu hoặc nâu đen. Nếu nhiễm Heterorhabditis thì da có màu đỏ hoặc đỏ gạch. Da xác chết khô và dai, không có mùi hôi thối. 2.5.2. Các loài côn trùng bị EPN tiêu diệt a) Sâu hại EPN có hiệu quả trong diệt trừ nhiều loài sâu hại như: sâu khoang (Spodopetera litura); sâu keo da láng (S. exigua); sâu keo (S. mauritia); sâu xám (Agrotis ypsilon); sâu đo xanh (Plusia sp.); sâu cuốn lá đậu tương (Lamprosema indicata); sâu xanh bông (Helicoverpa armigera); sâu cuốn lá bông (Sylepta flava); sâu xanh bướm trắng ( Pieris rapae); sâu cuốn lá đơn (Parnara guttata); sâu tơ (Plutella xylostella). b) Bọ rầy Sùng bọ rầy là một loài côn trùng gây hại trầm trọng cho các sân cỏ và sân golf ở nước Mỹ. Hai loại tuyến trùng Steinernema và Heterorhabditis đã được thí nghiệm bằng cách xịt lên sân cỏ và cho thấy có thể diệt 100% côn trùng hiện diện trên sân cỏ. Các loài S. carpocapsae, S. glaseri, S. arenarium, H. bacteriophora, H. megidis. c) Côn trùng họ Curculionidae trên cam quýt Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, nhà kính, ngoài đồng với các loại tuyến trùng S. carpocapsae, S. glaseri, S. riobrave và H. bacteriophora cho thấy các loại tuyến trùng này có thể diệt trừ một phần hoặc toàn bộ côn trùng gây hại cam quýt trong tiểu bang Florida. d) Dế nhũi Dế nhũi là một côn trùng gây hại trầm trọng cho sân cỏ, sân đánh golf. Nguyễn và Smart, 1990 đã tìm ra được một loài tuyến trùng từ Brazil và Uruguay và được đặt tên là S. scapterisci. Loài tuyến trùng này có khả năng ký sinh hầu hết các loài dế nhũi trong tiểu bang Florida và các tiểu bang Florida và các tiểu bang có khí hậu ấm ở miền nam nước Mỹ. 39
  41. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.5.3. Các loài côn trùng bị vi khuẩn Xenorhabdus tiêu diệt Theo biểu mẫu patent số 6,048,838 ngày 11 tháng 5 năm 2000, đã khái quát hóa các loài côn trùng mà Xenorhabdus có thể tiêu diệt hặc gây ức chế sự phát triển. Độc tố sử dụng là một tinh thể protein nặng 100 kDa gây độc bằng đường miệng, được lọc từ dịch nuôi cấy của các chủng thuộc X. nematophila, X. poinarii, X. bovienii, X. beddingii hoặc các loài Xenorhabdus khác. Chúng được dùng để chống lại côn trùng thuộc bộ cánh cứng,bộ cánh vảy, bộ hai cánh, bộ ve bét. a) Bộ cánh cứng Southern corn rootworm (sâu đục rễ ngô): Đây là một loại sâu đục thân hại rễ cây bắp, chúng tạo thành màu nâu của rễ sau đó là hiện tượng thối rễ, dẫn đến giảm sản lượng. Boll Weevil: Đây là một dạng mọt, chúng ăn nụ và hoa của cây bông. Chúng được coi là nguyên nhân gây ra thiệt hại nặng nề cho người nông dân ở miền Nam nước Mỹ vào những năm 1920 – 1930. Wireworms: Loài này chủ yếu tấn công các hạt như ngô, cây họ bầu bí, rau,trước và sau khi nảy mầm, chúng cư trú dưới gốc làm cây giảm sản lượng và chết. Ngoài ra còn có một số loài:Pollen, Flea beetles, Seed beetles, Colorado potato beetle. b) Bộ cánh vảy Beet armyworm: Chúng tấn công lá cây làm giảm sự phát triển của cây như đậu, củ cải đường, khoai tây, cà chua, bông, ngũ cốc, hạt có dầu, thuốc. European corn borer: Chúng tấn công thân cây ngô, cản trở sự vận chuyển nước và dinh dưỡng làm cây trở nên yếu và chết. Và ngoài ra còn có:Tobaco hornworm, Tobaco budworm, cabbage looper, black cutworm, corn earworm, codling month, clothes moth, indian mealmoth, leaf rollers, cabbage worm, cotton bollworm, bagworm, eastern tent caterpillar, sod webworm, fall armyworm. 40
  42. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP c) Bộ hai cánh Pea midge: Đây là một loại muỗi gây hại với hoa của cây họ đâu, làm cho hoa bị hư thối. Chúng cũng phá hoại vỏ hạt, làm vỏ nhăn nheo, hạt bị teo lại. Carrot fly: Là loại gây hại cho cây cà rốt, rau mùi, cần tây, chúng tấn công tán lá làm héo và đổi màu. Ngoài ra còn có một số loài khác:Cabbage root fly, turnip root fly, onion fly, crane fly, house fly và nhiều loài mosquito khác. d) Bộ ve bét Twoo-spotted spider mites: Đây là một loại nhện, chúng ăn lá non của cây như rau hay cây cảnh. Strawbery spider mites: Chúng phá hoại trên lá cây dâu tây. Ngoài ra có một số loài khác:Broad mites, citrus red mite, European red mite, pear rust mite và tomato russet mite. 2.6. Tình hình nghiên cứu Photorhabdus và Xenorhabdus trên thế giới và Việt Nam Hiện nay trên thế giới Photorhabdus và Xenorhabdus đang là hai chi vi khuẩn rất được quan tâm vì những tác dụng rất to lớn mà chúng mang lại. Trong đó có hai hướng ứng dụng được đặc biệt quan tâm bao gồm lên men Photorhabdus và Xenorhabdus để sản xuất chế phẩm tuyến trùng EPN, hướng thứ hai cũng hết sức quan trọng là sản xuất chế phẩm để diệt nấm hại cây trồng, hướng thứ ba là sử dụng trong lĩnh vực thú y. Có thể thấy một số nghiên cứu theo hai hướng trên ở ngoài và trong nước. 41
  43. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Vi khuẩn cộng sinh Tế bào Sản phẩm trao đổi chất Bảo vệ thực vật Bảo vệ thực Thú y vật Sản xuất chế Đối kháng nấm Đối kháng vi phẩm EPN hại khuẩn gây bệnh viêm vú ở bò sữa Hình 2.7. Các hướng ứng dụng của vi khuẩn cộng sinh 2.6.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới a) Phân lập vi khuẩn Có hai phương pháp phân lập được ứng dụng rất rộng rãi gồm: * Phương pháp của Poinar (1966) sử dụng trực tiếp ruột của tuyến trùng để cấy lên môi trường phân lập. * Cách thứ hai là của Akhurst (1980) là ly tâm tuyến trùng đã gây nhiễm, thu dịch ly tâm và cấy lên môi trường phân lập. b) Phương pháp định danh * Phương pháp nuôi cấy: Điểm hình thái: Nhuộm gram. Nhuộm tiên mao. Nhuộm tinh thể protein. 42
  44. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Quan sát trên các môi trường nuôi cấy về hình thái khuẩn lạc, khả năng tạo màng biofilm, độ đục, màu môi trường. Đặc điểm sinh hóa: Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ. Khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ thống enzym. Nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu. Tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất. Đặc điểm sinh lý: Khả năng di động, môi trường nuôi cấy, điều kiện sống hiếu khí, kỵ khí hay kị khí tùy nghi. Kỹ thuật phân tử: So sánh cấu trúc 16S rRNA của vi khuẩn phân lập được với các trình tự nucleotide của đoạn gen 16S rRNA tương ứng tại ngân hàng gen quốc tế EMBL. * Kết quả phân lập: Ở hầu hết các nghiên cứu thì hình thái khuẩn lạc ở pha sơ cấp được ghi nhận như sau: Khuẩn lạc bắt hấp thu màu đỏ hoặc nâu của neutral red trên môi trường MacConkey agar và hấp thụ màu xanh lục của bromothymol blue trên môi trường NBTA. Tạo khuẩn lạc màu vàng sẫm, nâu sáng hoặc màu sữa trên môi trường NA. Khuẩn lạc tròn, lồi, mép không đều. * Kết quả định danh sơ bộ: Tính chất hình thái, sinh lý, sinh hóa, của từng chủng trong cùng loài và giữa các loài có sự khác nhau. Các kết quả định danh sơ bộ đã được nhắc đến trong các bảng 2.8 và bảng 2.9. c) Bảo quản vi khuẩn 43
  45. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Có hai cách cơ bản để bảo quản vi khuẩn Photorhabdus và Xenorhabdus: * Cách thứ nhất: là bảo quản trong ống thạch nghiêng chứa môi trường NBTA hoặc MacConkey agar để có thể nhanh chóng phát hiện ra pha II để loại bỏ. Các ống nghiệm này được cấy chuyền thường xuyên, nếu lưu trữ ở 120C thì cấy chuyền hàng tháng và nếu ở 250C thì cấy chuyền hàng tuần. * Cách thứ hai là theo Akhusrt (1980), bằng cách giữ vi khuẩn ở 17% môi trường dinh dưỡng Glycerol trong chai Martney và giữ ở - 180C và để sử dụng làm tan nhanh ở nước nóng 600C (Bedding, 1984). d) Nhân nuôi sinh khối với lượng lớn kết hợp với tuyến trùng để tạo chế phấm EPN Việc nhân nuôi tổ hợp tuyến trùng và vi khuẩn đang được quan tâm vì vai trò của nó trong công tác bảo vệ thực vật. Trong nhân nuôi tuyến trùng EPN thì môi trường chicken offal do Bedding tìm ra (1984) là môi trường đem lại hiệu quả cao nhất, vì vậy đây là một môi trường được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu và thực tiễn. Thành phần chính của môi trường này là lòng gà được xay nhỏ và hấp khử trùng, có bổ sung thêm bông xốp. Vi khuẩn sẽ được nuôi trên môi trường YS để tăng sinh, Sau thời gian tăng sinh, vi khuẩn sẽ được thêm vào môi trường chicken offal để giúp thích nghi môi trường và gia tăng mật độ tế bào. Sau đó tuyến trùng sẽ được bổ sung vào môi trường chicken off đã có vi khuẩn để phát triển và sinh sản. e) Tiêu diệt nấm hại Có khá nhiều nghiên cứu về vấn đề đối kháng nấm hại, có thể nói đến như nghiên cứu của các nhà khoa học M. Inam – Ul – Haq và cộng sự đã nghiên cứu về khả năng diệt F. oxysporum f.sp., lycopersici bởi X.nematophila và Xenorhabdus spp. Có sự ức chế mạnh của các vi khuẩn với F. oxysporum f.sp., lycopersici và nồng độ tế bào vi khuẩn ức chế tốt nhất là ở 4 × 107 tế bào/ml. 44
  46. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nghiên cứu khác của X.L. Fang và cộng sự đã sử dụng X. bovienii YL002 ức chế nấm Phytophthora capsici và Botrytis cinerea. Kết quả cho thấy X. bovienii YL002 ức chế trên 98% sự phát triển của Phytophthora capsici và Botrytis cinerea. f) Ứng dụng trong công tác thú y Theo một nghiên cứu của các tác giả Furgani G và cộng sự đã sử dụng 13 chủng từ các loài X. nematophila, X. budapestensis và X. szentirmaii đối kháng với các vi khuẩn gây ra bệnh viêm vú ở bò sữa gồm Staphylococcus aureus, Escherichia coli và Klebsiella pneumoniae. Kết quả cho thấy KL. Pneumoniae là ít bị các chủng của Xenorhabdus kháng nhất, trong khi đó S. aureus lại có độ nhạy rất cao với kháng sinh của các chủng này. Và trong 3 loài thì X. szentirmaii và X. budapestensis sản xuất kháng sinh mạnh hơn là X. nematophila. Kết quả trên cho thấy triển vọng sử dụng kháng sinh từ Xenorhabdus để phòng trừ bệnh viêm vú ở bò sữa. 2.6.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Tuy EPN là một vấn đề thu hút nhiều sự quan tâm của giới khoa học trên thế giới nhưng ở Việt Nam thì chỉ có một số nghiên cứu ở Hà Nội và ở thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh miền Nam thì chưa có nghiên cứu nào về hai vi khuẩn này. Thành tựu đáng chú ý nhất là của PGS.TS. Nguyễn Ngọc Châu, công tác tại Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, đã phân lập được 26 loài tuyến trùng tại 23 tỉnh thành Việt Nam, trong đó có 2 loài Heterorhabditis và 24 loài là Steinernema.Trong đó thì có 9 loài Steinernema được công bố là loài mới của khoa học. Sau khi tiến hành tuyển chọn đã tìm được các chủng tốt nhất để ứng dụng để sản xuất chế phẩm sinh học với phổ diệt sâu rộng, sinh sản tốt và cho sinh khối cao, bảo quản được lâu dài. 45
  47. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Bảng 2.12. Các chế phẩm EPN tại Việt Nam Tên chủng EPN Loài tuyến trùng Tên chế phẩm Nồng độ IJs S-TK10 S. loci BIOSTAR-1 15×106 S-CTL S. carpocapsae BIOSTAR-2 10×106 S-TX1 S. sangi BIOSTAR-3 10×106 S-XS4 S. sangi BIOSTAR-4 10×106 S-TN10 S. robustispiculum BIOSTAR-5 10×106 H-MP11 H. indica NEMASTAR-1 15×106 H-NT3 H. indica NEMASTAR-2 15×106 46
  48. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG V : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ oOo 5.1. Kết luận Phân lập được hai chủng P1 từ Heterorhabditis indica, X1 từ Steinernema guangdongense nghi ngờ là Photorhabdus và Xenorhabdus. Các thử nghiệm về hình thái tế bào cho thấy X1 và P1 có hình thái đúng như các mô tả trước đây gồm đặc điểm khuẩn lạc, tế bào, và sự có mặt của tiên mao. Thử nghiệm sinh lý cho thấy sự di động trên bề mặt thạch và ống nghiệm như các thí nghiệm trước. Qua việc phân lập lại trên môi trường MacConkey, soi khuẩn lạc và nhuộm Gram thì cho thấy giống đảm bảo sự tinh khiết, không bị nhiễm tạp. Thử nghiệm sinh hóa với chủng P1 là hoàn toàn giống với các kết luận trước, tuy nhiên X1 có thử nghiệm catalase âm tính là không giống với các thử nghiệm trước đây. Hoạt tính sinh học cho thấy P1 có thể đối kháng tốt với các loài vi khuẩn thử nghiệm và nấm Phytophthora, tuy nhiên khả năng kháng này giảm ở lần cấy chuyền thứ 7. Ở X1 khả năng kháng vi khuẩn thử nghiệm rất yếu, nhưng kháng mạnh với nấm Phytophthora, khả năng kháng này giảm đáng kể ở lần cấy chuyền thứ 7. Điều này cho thấy việc có thể ứng dụng hai chủng mới phân lập P1 và X1 vào đối kháng với nấm Phytophthora gây hại trên cây trồng. Như vậy có thể hai chủng vi khuẩn P1 và X1 đã phân lập được là vi khuẩn cộng sinh thuộc hai chi Photorhabdus và Xenorhabdus và có thể sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo. 5.2. Kiến nghị Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử để kiểm tra và khẳng định về hai chủng P1 và X1 phân lập được. Đồng thời khảo sát tìm phương pháp giữ giống tối ưu nhất để lưu trữ hai chủng này. Khảo sát sự tăng trưởng của hai chủng theo pH, nhiệt độ, thành phần môi trường nuôi cấy để tìm ra điều kiện thích hợp nhất cho sự phát triển của hai chủng. 47
  49. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Tìm môi trường nhân tạo thích hợp để kết hợp cả tuyến trùng và vi khuẩn nhằm tạo điều kiện cho việc tạo chế phẩm EPN. Chọn môi trường tối ưu cho hai chủng phân lập được sinh kháng sinh tốt nhất nhằm ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và thú y. 48