Đồ án Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính trên mô hình in vitro

119 trang thiennha21 12/04/2022 7221

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính trên mô hình in vitro", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_nghien_cuu_trich_ly_thanh_phan_flavonoid_tu_la_cu_dau.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính trên mô hình in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TRÍCH LY THÀNH PHẦN FLAVONOID TỪ LÁ CỦ ĐẬU VÀ THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH TRÊN MÔ HÌNH IN VITRO Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS.NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Sinh viên thực hiện: HUỲNH KIM KHÁNH MSSV: 1211100258 Lớp: 12DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2016
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong đồ án này là trung thực và chưa từng được các tác giả khác công bố trong các nghiên, đồ án nào Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ trong việc hoàn thành luận án đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong đồ đã được ghi rõ nguồn gốc. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong đồ án này. TP.HCM, ngày tháng năm 2016 Sinh viên
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, bên cạnh sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự động viên và giúp đỡ rất lớn từ cá nhân và tập thể. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn ThS. Nguyễn Thị Thu Hương, giảng viên Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, người đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Phòng thí nghiệm Trường Đại học Công nghệ TP. HCM đã tạo mọi điều kiện cơ sở vật chất tốt cho tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các bạn trong nhóm sinh viên làm nghiên cứu khoa học đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã động viên giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn này. TP.HCM, ngày tháng năm 2016 Sinh viên thực hiện Huỳnh Kim Khánh
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC MỤC LỤC 1 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 4 DANH MỤC BẢNG 5 DANH MỤC SƠ ĐỒ 6 DANH MỤC HÌNH 7 MỞ ĐẦU 9 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 14 1.1. Tổng quan về cây củ đậu 14 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại 14 1.1.2. Đặc điểm và sinh thái 15 1.1.3. Tình hình trồng trọt, tiêu thụ và kỹ thuật canh tác cây củ đậu ở Việt Nam 16 1.1.4. Thành phần hóa học 21 1.1.5. Tính vị và công dụng 21 1.2. Hợp chất Phenol, Flavonoid và Rotenone 22 1.2.1. Phenol 22 1.2.2. Flavonoid 25 1.2.3. Rotenone 30 1.3. Các phương pháp tách chiết hợp chất thứ cấp trong thực vật 33 1.3.1. Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng 33 1.3.2. Kỹ thuật chiết rắn – lỏng 35 1.4. Phương pháp đánh giá độc tính và xác định giá trị LC50 41 1.5. Phương pháp xác định khả năng đối kháng với vi sinh vật gây bệnh 45 1
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.6. Sinh vật thí nghiệm 47 1.6.1. Động vật giáp xác - Artemia Nauplii 47 1.6.2. Các chủng vi sinh vật thí nghiệm 49 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 56 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 56 2.2. Vật liệu nghiên cứu 56 2.3. Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm 56 2.3.1. Dụng cụ 56 2.3.2. Hóa chất 57 2.4. Phương pháp 57 2.5. Nội dung thí nghiệm 58 2.5.1. Phương pháp tách chiết và thu cao chiết 59 2.5.2. Phương pháp định tính một số hợp chất thứ cấp trong lá cây củ đậu 62 2.5.3. Phương pháp định lượng một số hợp chất thứ cấp trong lá củ đậu . 63 2.5.4. Phương pháp đánh giá độc tính 66 2.5.5. Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn 68 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 73 3.1. Thu nhận cao chiết từ lá củ đậu bằng các phương pháp và dung môi khác nhau 73 3.2. Định tính một số hợp chất thứ cấp trong lá củ đậu 74 3.2.1. Định tính flavonoid 74 3.2.2. Định tính rotenone 75 2
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.3. Định lượng một số hợp chất thứ cấp và chất khô trong các loại cao chiết 76 3.3.1. Hàm lượng chất khô 76 3.3.2. Định lượng polyphenol tổng số 76 3.3.3. Định lượng Flavonoid tổng số 80 3.4. Khảo sát độc tính 84 3.5. Thử hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao chiết 86 3.5.1. Hoạt tính kháng Enterotoxigenic E.Coli của các loại cao chiết 86 3.5.2. Hoạt tính kháng Listeria monocytogenes của các loại cao chiết 88 3.5.3. Hoạt tính kháng Pseudomonas aeruginosa của các loại cao chiết 89 3.5.4. Không có hoạt tính kháng một số vi sinh vật của các loại cao chiết . 90 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO 95 PHỤ LỤC 3
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AG: Acid Gallic BVTV: Bảo vệ thực vật db: vật liệu ĐC: Đối chứng DMSO: Dimethyl sulfoxide LC50: Lethal concentration NA: Nutrient Agar NB: Nutrient Broth NĐ: Nồng độ OD: Optical density HTHC: Hợp chất thứ cấp 4
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC BẢNG Bảng 1. 1. Hiệu quả tác động của Nicotin Sulphat (trong dung dịch 1% saponin) đối với ruồi giấm 42 Bảng 1. 2. Phân tích nguồn biến lượng 43 Bảng 2. 1. Bố trí thí nghiệm thử độc tính trên Artemia Nauplii 67 Bảng 3. 1. Kết quả định tính một số hợp chất thứ cấp trong cao chiết và lá củ đậu 75 Bảng 3. 2. Kết quả hàm lượng chất khô của các loại cao chiết 76 Bảng 3. 3. Kết quả đường chuẩn Acid Gallic 77 Bảng 3. 4. Kết quả hàm lượng polyphenol tổng trong 4 loại cao chiết lá củ đậu 78 Bảng 3. 5. Bảng kết quả đường chuẩn Rutin 81 Bảng 3. 6. Bảng kết quả hàm lượng flavonoid tổng số trong 4 loại cao chiết 82 Bảng 3. 7. Kết quả các đường chuẩn và LC50 tương ứng của 4 loại cao chiết 84 Bảng 3. 8. Nồng độ LC50 (mg/L) của 4 loại cao chiết 86 Bảng 3. 9. Kết quả kháng Enterotoxigenic E.Coli của 4 loại cao chiết 87 Bảng 3. 10. Kết quả kháng Listeria monocytogenes của các loại cao chiết 88 Bảng 3. 11. Kết quả kháng Pseudomonas aeruginosa của 4 loại cao chiết 89 Bảng 3. 12. Kết quả kháng một số loại vi sinh vật của 4 loại cao chiết 91 5
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2. 1. Nội dung thí nghiệm 58 Sơ đồ 2. 2. Quá trình tách chiết và thu cao chiết từ lá củ đậu 59 Sơ đồ 2. 3. Quy trình định lượng polyphenol tổng 65 Sơ đồ 2. 4. Quy trình đánh giả khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá củ đậu 69 6
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC HÌNH Hình 1. 1. Cây củ đậu 14 Hình 1. 2. Thương lái thu mua củ đậu ngay tại đồng ruộng 17 Hình 1. 3. Cây củ đậu được trồng theo luống 19 Hình 1. 4. Củ đậu đến thời gian thu hoạch 20 Hình 1. 5. Tephrosin 21 Hình 1. 6. Rotenone 21 Hình 1. 7. Củ đậu tốt cho sức khỏe 22 Hình 1. 8. Một số món ăn được chế biến từ củ đậu 22 Hình 1. 9. Một số hợp chất phenol 24 Hình 1. 10. Một số Eucoflavonoid 25 Hình 1. 11. Công thức cấu tạo và cấu trúc 3D của rotenone 31 Hình 1. 12. Chuỗi truyền điện tử và cơ chế tác động của rotenone trong ty thể 32 Hình 1. 13. Rotenone ngăn cản sự truyền điện tử đến CoQ 32 Hình 1. 14. Chiết 2 lớp chất lỏng 34 Hình 1. 15. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt 35 Hình 1. 16. Bộ chiết Soxhlet 37 Hình 1. 17. Máy chiết Kumagawa 38 Hình 1. 18. Bộ lôi cuốn hơi nước 38 Hình 1. 19. Sơ đồ hệ thống chiết siêu tới hạn 39 Hình 1. 20. Cột chiết pha rắn 40 Hình 1. 21. Ấu trùng và trứng Artemia Nauplii 48 Hình 1. 22. Vi khuẩn Salmonella 50 Hình 1. 23. Vi khuẩn Staphylococcus aureus 51 Hình 1. 24. Listeria monocytogenes 52 Hình 1. 25. Vi khuẩn Escherichia coli 53 Hình 1. 26. Pseudomonas aeruginosa 54 Hình 2. 1. Lá cây củ đậu 56 7
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 2. 2. Phương pháp ngâm dầm 60 Hình 2. 3. Phương pháp chiết Soxhlet 61 Hình 2. 4. Ngâm lá với chloroform và dịch chiết sau khi cô trên kính đồng hồ 63 Hình 2. 5. Các loại cao chiết trên kính đồng hồ 63 Hình 2. 6. Bố trí thí nghiệm thử độc tính trên ấu trùng Artemia Nauplii 68 Hình 3. 1. 4 loại cao chiết 73 Hình 3. 2. Cao chiết chuyển từ nâu sang vàng sau khi cho 1% NaOH/etanol 96o 74 Hình 3. 3. Dịch chiết có màu tím khi nhỏ 1 giọt H2SO4đđ và thêm vài hạt natri nitrit 75 Hình 3. 4. Cao chiết có màu tím khi nhỏ 1 giọt H2SO4đđ và thêm vài hạt natri nitrit 75 Hình 3. 5. Dung dịch dựng đường chuẩn Acid Gallic 77 Hình 3. 6. Màu nâu vàng sang xanh lam của cao chiết sau khi ủ ở 40oC 77 Hình 3. 7. Đường chuẩn Acid Gallic 78 Hình 3. 8. Sự chênh lệch hàm lượng polyphenol tổng số của 4 loại cao chiết 78 Hình 3. 9. Dung dịch Rutin chuẩn 81 Hình 3. 10. Đo hàm lượng flavonoid tổng số của cao chiết 81 Hình 3. 11. Đường chuẩn Rutin 82 Hình 3. 12. Sự chênh lệch hàm lượng flavonoid tổng số của 4 loại cao chiết 82 Hình 3. 13. Đường chuẩn của cao chiết A 84 Hình 3. 14. Đường chuẩn của cao chiết C 85 Hình 3. 15. So sánh LC50 của 4 loại cao chiết 85 Hình 3. 17. Vòng kháng Enterotoxigenic E.Coli của 4 loại cao chiết 87 Hình 3. 18. Vòng kháng Listeria monocytogenes của 4 loại cao chiết 88 Hình 3. 19. Vòng kháng Pseudomonas aeruginosa 4 loại cao chiết 89 Hình 3. 20. Kết quả không kháng Salmonella của 4 loại cao chiết 90 Hình 3. 21. Kết quả không kháng Staphylococcus aureus của 4 loại cao chiết 91 8
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Từ xa xưa, nông dân ở nhiều nước trên thế giới đã biết sử dụng một số loài thực vật chứa chất độc để trừ một số loại côn trùng gây hại trên cây trồng và gia súc bằng cách phun lên cây hay dùng nước chiết để tắm cho gia súc. Trên thế giới có khoảng 2000 loài cây có chất độc, trong đó có 10 – 12 loài cây được dùng phổ biến. Thuốc thảo mộc diệt trừ côn trùng bằng con đường tiếp xúc và vị độc phổ tác động thường không rộng. Một số loài còn có khả năng diệt cả nhện hại cây. Sau khi sâm nhập, thuốc nhanh chóng tác động đến hệ thần kinh, gây tê liệt và làm chết côn trùng. Cây củ đậu là loại rau củ ngắn ngày, có thể trồng nhiều vụ trong năm, quen thuộc với con người Việt Nam và diện tích trồng trọt rất lớn do mang đến nhiều hiệu quả kinh tế cao. Tuy nhiên, nông dân chỉ thu hoạch và sử dụng củ (rễ phình to), cắt bỏ tất cả phần thân trên gồm thân, lá, hạt. Hạt và lá củ đậu có một số thành phần hóa học tương tự nhau, rất độc, gây ngộ độc và có thể dẫn đến tử vong cho con người nếu vô tình ăn phải hoặc cố ý ăn với liều lượng lớn. Dù vậy, các nghiên cứu về thành phần hóa học và độc tính bên trong hạt và lá củ đậu có thể ứng dụng trong trừ sâu, bệnh hại thực vật vẫn còn rất hạn chế ở nước ta. Việc nghiên cứu sản xuất và bổ sung các chất độc được tách chiết từ thiên nhiên vào thuốc bảo vệ thực vật, hạn chế việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật hóa học gây hại cho con người và môi trường luôn được quan tâm. Những hợp chất trừ sâu thảo mộc thông dụng như rotenone và rotenoit, arteminisinin, azadirachtin Hiện diện trong một số bộ phận của một số loài cây. Hàm lượng chất độc phụ thuộc loài cây, bộ phận cây, điều kiện sống và thời gian thu hái chúng. Nói chung, các chất này dễ bị phân huỷ dưới tác động của oxy hoá, ánh sáng (đặc biệt là các tia cực tím), ẩm độ, nhiệt độ và pH môi trường nên chúng ít gây độc cho môi sinh môi trường.[7] Sau khi thu hoạch nhiều vụ mùa củ đậu trong năm, nông dân thải bỏ số lượng lớn lá và hạt nhưng chỉ có một số ít nhà nông biết sử dụng hạt củ đậu ngâm nước để 9
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP bảo vệ cây trồng còn rất thủ công và đơn giản. Bên cạnh đó, các công trình nghiên cứu về lá củ đậu cũng như những thành phần độc tính có giá trị của nó rất ít. Do vậy, đề tài “Nghiên cứu trích ly thành phần flavonoid từ lá củ đậu và thử nghiệm độc tính trên mô hình in vitro” được thực hiện, tạo tiền đề khoa học cho các nghiên cứu tạo chế phẩm ứng dụng trong bảo vệ thực vật mang lại nhiều giá trị thực tiễn. 2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 2.1. Các nghiên cứu trong nước - Chuyên đề tốt nghiệp “Thử hiệu lực của một số thuốc trừ sâu có nguồn gốc thảo mộc đối với sâu hại chính trên lúa và trên rau cải trong vụ mùa năm 2013 tại xã Thanh An – huyện Điện Biên – tỉnh Điện Biên” Đỗ Đức Anh. Đề tài sử dụng chế phẩm được tách chiết từ hạt củ đậu. - Luận văn thạc sĩ nông nghiệp “Nghiên cứu tác dụng diệt ve kí sinh trên cho và bò của chế phẩm thuốc mỡ từ cây thuốc cá” Nguyễn Thanh Hải (2007). Trong đó, độc tính chủ yếu trong chế phẩm là rotenone tương tự như chất độc bên trong lá củ đậu. - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp “Đặc điểm dịch tễ bệnh ve chó ở hai huyện, thị của tỉnh Thái Nguyên, thử nghiệm thảo dược trong trị ve cho chó” Cù Xuân Đức (2011). Thảo dược của đề tài được dùng cho thử nghiệm là hạt củ đậu. - Luận án phó Tiến sĩ “ Nghiên cứu sử dụng một số loại cây có hoạt tính độc để làm thuốc trừ sâu ở phía Bắc Việt Nam” Nguyễn Duy Trang (2016). Trong đó, đề tài có nghiên cứu về hiệu lực trừ sâu của hạt củ đậu. 2.2. Các nghiên cứu ngoài nước - Sahu Rc, Hameed SF (1983), “Assessment of the rotenoids of Indian yam bean seeds”. Đánh giá rotenoid chiết xuất từ hạt củ đậu trừ các loài sâu, bướm. - Sahu RC, Hameed SF (1989), “Effect of Pachyrrhizus erosus urban seed extracts against tobacco caterpillar, Spodoptera litura F Tobacco Res 15(1):17-20”. Sự ảnh hưởng của hạt củ đậu đối với sâu. 3. Mục tiêu nghiên cứu 10
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Xác định được hàm lượng các chất polyphenol, flavonoid trong cao chiết lá củ đậu. - Đánh giá độc tính và khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá củ đậu làm tiền đề cho việc nghiên cứu ứng dụng làm dược liệu bổ sung vào BVTV. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu - Nhiệm vụ 1: Nghiên cứu về cơ sở khoa học, tổng quan tài liệu vấn đề nghiên cứu, làm cơ sở cho các nhiệm vụ tiếp theo. - Nhiệm vụ 2: Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm, thông qua các phương pháp xác định, khảo sát, phân tích. - Nhiệm vụ 3: Thu nhận cao chiết lá củ đậu bằng 2 phương pháp ngâm dầm và chiết Soxhlet trong etanol 90o và acetone. - Nhiệm vụ 4: Định tính sơ bộ một số thành phần hóa học chính có trong cao chiết lá củ đậu. - Nhiệm vụ 5: Xác định hàm lượng polyphenol tổng số, flavonoid tổng số từ cao chiết lá củ đậu. - Nhiệm vụ 6: Đánh giá độc tính thông qua giá trị LC50 (nồng độ gây chết trung bình) của cao chiết lá củ đậu, đánh giá khả năng kháng khuẩn trên mô hình in vitro. 5. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp nghiên cứu thu thập tài liệu: Các tài liệu về cây củ đậu, thành phần hóa học của lá và hạt củ đậu, các phương pháp xác định hàm lượng các hợp chất thứ cấp, mô hình đánh giá độc tính, phương pháp đục lỗ thạch, sinh vật thí nghiệm. - Phương pháp làm thí nghiệm: Tiến hành làm các thí nghiệm nhằm giải quyết các nhiệm vụ nghiên cứu. - Phương pháp xử lý số liệu bằng Excel và SAS. Các số liệu thu được sẽ được xử lý nhằm đưa ra kết luận cho đề tài. 11
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 6. Kết quả đạt được của đề tài - Thu nhận được các loại cao chiết lá củ đậu bằng 2 phương pháp ngâm dầm và chiết Soxhlet trong 2 loại dung môi etanol 90o và acetone. - Định tính được sự có mặt của flavonoid, rotenone có sự hiện diện học trong cao chiết lá củ đậu. - Định lượng được: polyphenol tổng số, flavonoid tổng số của các loại cao chiết. - Tìm ra giá trị LC50, so sánh độc tính giữa các loại cao chiết và khả năng kháng một số loại vi sinh vật của các loại cao chiết. 7. Kết cấu đồ án tốt nghiệp - Mở đầu - Chương 1: Tổng quan tài liệu, cơ sở khoa học của đề tài - Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu - Chương 3: Kết quả và thảo luận - Chương 4: Kiến nghị - Tài liệu tham khảo 12
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 13
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về cây củ đậu 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại Cây củ đậu hay củ sắn, sắn nước (theo cách gọi miền Nam, danh pháp hai phần: Pachyrhizus erosus) là một cây dây leo. Loài này được Carl von Linné miêu tả khoa học đầu tiên. Tên gọi cây gần như chủ yếu nói về củ của nó.[16] Chi Củ đậu (Pachyrhizus) là một chi nhỏ gồm khoảng 5 – 6 loài dây leo có rể phình to thành củ có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Châu Mỹ. Sau khi người Châu Âu khám phá ra Châu Mỹ một số loài quan trọng trong chi này được giới thiệu sang Châu Phi, Châu Á và Châu Úc. Loài Củ đậu hay củ sắn dây (Pachyrhizus erosus) có nguồn gốc từ Mexico và Trung Mỹ. Người Tây Ban Nha đưa dây củ sắn từ Mexico vào Philippines vào thế kỷ thứ 18 và từ đó cây củ đậu được lan truyền đến các khu vực khác của Đông Nam Á và Trung Quốc. Hiện nay, Cây củ đậu được trồng nhiều ở Châu Mỹ, Trung Quốc và Đông Nam Á. Ở Việt Nam, Cây củ đậu được người Pháp nhập vào đầu thế kỷ 20 và được trồng nhiều ở các tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long và Miền Đông Nam Bộ, ở Miền Bắc gọi là Cây củ đậu. Hình 1. 1. Cây củ đậu 14
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phân loại khoa học Giới (regnum) Plantae Bộ (ordo) Fabales Họ (familia) Fabaceae Phân họ (subfamilia) Faboideae Tông (tribus) Phaseoleae Phân tông (subtribus) Glycininae Chi (genus) Pachyrhizus Loài (species) P. erosus Danh pháp Pachyrhizus erosus 1.1.2. Đặc điểm và sinh thái Cây củ đậu có thể cao 4 – 5 m nếu có giàn. Lá kép gồm 3 chét hình tam giác rộng, mỏng. Hoa màu tím nhạt; ở Việt Nam thường ra vào tháng 4, tháng 5; hoa khá lớn, mọc thành chùm dài ở kẽ lá. Quả hơi có lông, không cuống, dài 12 cm, được ngăn vách nhiều rãnh ngang, thường chứa từ 4 – 9 hạt. Củ do rễ phình to mà thành, có thể dài tới 2 m và nặng đến 20 kg. Vỏ củ có màu vàng và mỏng như giấy còn ruột có màu trắng kem hơi giống ruột khoa tây hay quả lê. Củ đậu có chứa tinh bột 2,4%, 4,51% đường toàn bộ (glucose). Nó có chứa 86 – 90% nước; nó có một ít protein (1,46%) nhưng không có các chất béo. Trái với củ, phần còn lại của cây củ đậu rất độc; hạt có chứa độc tố rotenone, dùng để diệt côn trùng và thuốc cá, diệt rệp rau và rệp thuốc lá. Lá có chứa các chất độc đối với cá và động vật nhai lại (trừ ngựa). Củ đậu nên được bảo quản ở nơi khô ráo, nhiệt độ khoảng 12°C tới 16°C (53°F tới 60°F); nhiệt độ thấp hơn làm hư củ. Củ đậu tươi nếu được cất giữ ở nhiệt độ thích hợp có thể để lâu một hoặc hai tháng. Cây củ đậu được trồng ở châu Mỹ, Trung Quốc và Đông Nam Á, nơi củ đậu sống được chế biến thành nhiều món ăn đa dạng, phong phú. Tại Việt Nam, cây củ đậu được trồng khắp nơi vùng đồng bằng cũng như miền núi để lấy rễ củ ăn, hạt dùng làm thuốc, nhưng ít dùng vì có độc. Mùa thu hoạch hạt: tháng 11 – 12.[17] 15
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.1.3. Tình hình trồng trọt, tiêu thụ và kỹ thuật canh tác cây củ đậu ở Việt Nam 1.1.3.1. Tình hình trồng trọt và tiêu thụ Ở Việt Nam, Cây củ đậu được được trồng nhiều ở các tỉnh Miền Bắc, Đồng bằng Sông Cửu Long và Miền Đông Nam Bộ. Tại huyện Kim Thành, tỉnh Hải Dương, nơi có điều kiện tự nhiên thuận lợi cho phát triển nông nghiệp. Trong cơ cấu sản xuất nông nghiệp của huyện, các loại rau, củ, quả hiện là cây trồng ưu tiên hàng đầu, đặc biệt là cây củ đậu. Cây củ đậu có quy trình canh tác đơn giản, cho năng suất và hiệu quả kinh tế cao. Theo điều tra khảo sát tại 4 xã thuộc huyện Kim Thành, tổng diện tích trồng củ đậu đạt trên 347 ha, chiếm 37,5% diện tích gieo trồng vụ đông với bình quân 3,7 sào/hộ. Giống chủ yếu được cung cấp bởi hệ thống đại lý cung ứng thường là giống của các tỉnh miền Nam. Thời gian trồng chính vụ và trái vụ chênh lệch nhau không nhiều (khoảng 30 ngày) cho năng suất, chất lượng không cao. Sau khi áp dụng sản xuất theo quy trình VietGAP cho năng suất cao, đạt hiệu quả kinh tế lớn hơn so với củ đậu không thực hiện theo VietGAP. Năng suất chính vụ đạt trên 3.000 kg/sào, trái vụ đạt trên 1.800 kg/sào, do tiết kiệm được chi phí phân bón, thuốc bảo vệ thực vật, mỗi sào trồng củ đậu theo VietGAP cho lợi nhuận lớn hơn từ 400 – 500 ngàn đồng, qua đó tăng thu nhập trên 13 triệu đồng/ha/vụ.[18] Tại Đông Triều, tỉnh Quảng Ninh. Hiện nay, toàn huyện có gần 200 ha trồng củ đậu, tập trung ở các xã Tân Việt, Bình Khê, An Sinh, Tràng An, Đức Chính Trong đó, xã Tân Việt là địa phương có diện tích trồng củ đậu nhiều nhất huyện với hơn 72 ha. Được đưa vào trồng ở đồng đất địa phương từ năm 1997, đến nay cả 4 thôn trong xã, bà con nông dân đều tham gia mô hình này. Vụ mùa năm nay, cả xã Tân Việt gieo trồng 164 ha lúa và rau màu, thì củ đậu chiếm hơn 72 ha với gần 600 hộ nông dân tham gia. So với vụ mùa năm trước, diện tích cây củ đậu tăng gần 10 ha. 16
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1. 2. Thương lái thu mua củ đậu ngay tại đồng ruộng Theo đánh giá của địa phương, mỗi ha củ đậu cho thu nhập bình quân 150 triệu đồng, năng suất cao gấp 3 – 4 lần so với cấy lúa. Ngoài ra, cây củ đậu cũng được xã Tân Việt chọn đăng ký sản phẩm trong chương trình “Mỗi xã, thị trấn một sản phẩm nông nghiệp đặc trưng của huyện”. Theo bà con nông dân ở đây cho biết, mỗi sào củ đậu sau khi trừ chi phí, người nông dân thu lãi trung bình 4 – 5 triệu đồng.[19] Vụ mùa năm 2011, người dân ở thôn Mịn To, xã Trù Hựu (Lục Ngạn – Bắc Giang) đã có nguồn thu bạc tỷ từ củ đậu. Cả thôn Mịn To có 42 hộ trồng cây củ đậu với tổng diện tích lên đến gần chục ha. Những hộ trồng diện tích nhiều từ 4 sào trở lên có đến hàng chục hộ. Do điều kiện thời tiết thuận lợi, cộng với việc người dân đã áp dụng tốt kiến thức khoa học kỹ thuật và kinh nghiệm vào sản xuất, nên cây củ đậu sinh trưởng phát triển tốt cho năng suất cao đạt bình quân hơn 3 tấn/sào. Ngoài việc bán buôn cho tiểu thương vào tận ruộng thu mua, nhiều bà con nơi đây còn thu hoạch dần và mang đi bán lẻ ở các chợ trong huyện được giá 4 nghìn đồng/kg. Trước kia, chỉ có vài hộ dân trong thôn Mịn To đưa cây củ đậu về trồng với diện tích nhỏ lẻ. Nhưng từ năm 2007, thấy việc trồng cây củ đậu không khó lại cho hiệu quả kinh tế cao nên nhân dân đã học tập nhau cùng mua giống về trồng. Theo đó diện tích cây củ đậu ngày càng được mở rộng, đến nay đã có gần chục ha.[20] Năm 2011, Phòng Nông nghiệp và PTNT huyện Yên Thế, tỉnh Bắc Giang phối hợp với UBND xã Đồng Kỳ xây dựng cánh đồng mẫu củ đậu, diện tích 21,3 ha tại thôn Ngò 1. Mỗi hộ tham gia được hỗ trợ hơn 100 nghìn đồng/sào và hướng dẫn kỹ 17
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP thuật trồng, chăm sóc. Vụ đầu tiên, năng suất đạt 56 tấn/ha, giá tại ruộng bình quân 3 nghìn đồng/kg, một ha củ đậu người dân có thể thu lãi gần 100 triệu đồng/vụ. Nhờ mang lại hiệu quả kinh tế cao nên xã chủ trương mở rộng diện tích. Hiện xã Đồng Kỳ trồng hơn 70 ha củ đậu.[21] Ngoài ra còn một số tỉnh trồng cây củ đậu với diện tích lớn và đạt hiệu quả kinh tế cao như thị xã Long Khánh tỉnh Đồng Nai, tỉnh Vĩnh Long, tỉnh Thái Bình 1.1.3.2. Kỹ thuật trồng trọt Thâm canh cây củ đậu vụ thu đông đã và đang được nhiều địa phương quan tâm và phát triển trong sản xuất bởi giá trị mang lại của cây trồng này (trừ chi phí thu lãi trung bình từ 10 – 15 triệu đồng/sào, cá biệt có vụ thu lãi trên 20 triệu đồng/sào). Trong khi đó trồng củ đậu không đòi hỏi phải tốn nhiều công chăm sóc cũng như BVTV Tuy nhiên, để có được năng suất và chất lượng cao cho củ đậu thương phẩm, nhiều nông dân các vùng sản xuất vẫn còn chưa có nhiều kinh nghiệm.  Giống: Hiện tại có 2 giống Chiêm xanh Thái Bình và Chiêm lá nhỏ miền Nam có khả năng chịu được thời tiết khô hạn hoặc ngập úng cũng như lạnh giá.  Lượng hạt cần cho 1 sào (360 m2) khoảng 3,5 – 4,2 kg hạt.  Thời vụ trồng: Củ đậu có thể trồng từ tháng 6 – 9 dương lịch.  Kinh phí đầu tư trung bình khoảng 4 – 4,5 triệu đồng/sào.  Làm đất: Đất trồng củ đậu tốt nhất là đất cát pha hoặc thịt nhẹ giàu mùn. Đất được lên luống 2 lần: Lần 1 (luống sơ bộ - lõi luống), lần 2 luống hoàn chỉnh. Lên luống sơ bộ: Đất được cày vỡ, phân luống (khoảng 4 m/luống) rồi lên luống cao khoảng 40 cm. Tiến hành bón lót các loại phân bao gồm: - 2 – 3 tạ phân chuồng mục - 12 – 15 kg supe lân - 12 – 15 kg NPK - 4 – 5 kg ure. Sau đó, cày nhặt xá (cày cách xá) và lên luống hoàn chỉnh sao cho luống cao khoảng 60 – 70 cm theo hình mai rùa (đỉnh luống rộng khoảng 3 cm), thân luống rộng 1,8 – 2 m để thoát nước tốt. San phẳng bề mặt luống sao 18
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP cho phân lót được vùi sâu so với bề ngoài mặt luống khoảng 5 – 7 cm để không thất thoát phân. Đồng thời, hạt không bị thối do rễ chạm phân bón.  Đặt hạt: Bắt đầu đặt hạt cách dõng luống khoảng 20 – 25 cm. Hạt được đặt nằm ngang đều và so le nhau sao cho hạt cách hạt từ 8 – 10 cm. Hình 1. 3. Cây củ đậu được trồng theo luống  Rắc rạ phủ luống: Trồng củ đậu nhất thiết phải có rạ hoặc rơm phủ kín luống mới mang lại hiệu quả cao cho củ sau này và thuận tiện cho quá trình chăm sóc. Rạ phải được phủ dày tối thiểu khoảng 3 – 4 cm. Trung bình để trồng được 1 sào củ đậu cần khoảng 1,5 sào lúa để rạ (nên chọn rạ ở những ruộng không bị nhiễm nặng nấm khô vằn).  Chăm sóc: Cần tưới nước giữ ẩm thường xuyên luống củ đậu giúp cây phát triển thuận lợi. Sau trồng khoảng 1 tháng, bón phân thúc để nuôi cây với lượng khoảng 2 kg ure + 3 kg supe lân hoặc phân tổng hợp NPK (cần tưới đủ nước để lá cây không bị cháy). Tùy theo thời tiết và chân đất, quan sát màu sắc lá có thể tiến hành bón phân thúc tiếp cho cây từ tháng thứ 2 đến tháng thứ 4 khoảng 2 – 3 lượt (không nên bón đạm quá nhiều cây sẽ không phát triển được củ hoặc củ hay bị thối).  Bấm ngọn, ngắt hoa: Khi cây củ đậu có khoảng 5 – 6 lá thật, tiến hành bấm ngọn lần đầu tiên. Sau đó, khi cây bật ngọn phụ và ra hoa thì cần phải bấm và ngắt bỏ kịp thời để cây xuống củ được thuận lợi. Tuy nhiên, luôn luôn phải đảm bảo duy trì trên mỗi cây củ đậu phải có từ 10 – 12 lá thật để cây quang hợp tốt, củ sẽ nhanh to. 19
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Bảo vệ thực vật: Sâu hại: Củ đậu thu đông thường hay bị các loại sâu (sâu xanh, sâu khoang, rệp muội) gây hại. Cần thường xuyên thăm đồng kiểm tra, áp dụng các biện pháp tổng hợp và trừ sâu kịp thời khi đến ngưỡng. Bệnh hại: Một số bệnh chính gây hại củ đậu thu đông đó là: Bệnh chết thắt thân cây con, bệnh vàng lá, bệnh đốm nâu và bệnh gỉ sắt. Biện pháp: Sau khi hạt mọc mầm và phát triển thành cây con nên sử dụng thuốc Validacin để phòng bệnh chết thắt thân cây con (không được sử dụng thuốc Anvil lúc này sẽ dễ làm cây cháy lá).  Thu hoạch: Củ đậu có thể thu hoạch sau trồng khoảng 4 tháng. Song, thu hoạch tốt nhất khi cây được 5,5 – 6 tháng tuổi. Không nên để củ đậu trên 7 tháng tuổi rồi mới thu hoạch vì lúc này củ đã bị xốp, mất hết chất dinh dưỡng và độ ngọt. Với trình độ thâm canh của nông dân Tam Kì, trong nhiều năm gần đây đã đạt được năng suất củ trung bình 3 – 3,5 tấn củ/sào. Cá biệt có những hộ đạt được 5 tấn/sào.[22] Hình 1. 4. Củ đậu đến thời gian thu hoạch  Cách để giống Thu hoạch củ muộn: vào mùa thu, cây ra hoa, ngắt hết hoa, chỉ để lại 1 – 2 chùm, chờ quả chín khô đen, thu hái, đem phơi thật giòn, đập lấy hạt, phơi khô kiệt dưới nắng nhẹ. Trồng củ giống: thu hoạch củ sau 4 tháng trồng. Chọn củ to, đẹp, không sâu bệnh, rũ sạch đất, cắt chừa đoạn gốc cây, không cắt rễ. Mỗi củ trồng trong 1 hốc rộng, 20
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP sâu 50 x 50 cm, đổ khoảng 20 – 30 kg phân mục trộn thêm 0,5 – 1 kg supe lân. Khi cây mọc chồi, làm giàn cho leo đều, cây sẽ có nhiều chùm quả. Quả chín tới đâu thu hái và phơi tới đó. Khi cây tàn, mỗi gốc thu chừng 6 – 7 kg hạt và vẫn thu lại được củ giống to gấp 4 – 5 lần khi đem trồng lại.[23] 1.1.4. Thành phần hóa học Trong hạt củ đậu có 12,27% độ ẩm; 20,13% chất béo; 30,61% chất protein; 4,8% tanin; 5,85% tinh bột; 3,25% đường toàn bộ (biểu thị bằng đường glucose). Trong hạt củ đậu có một chất độc gọi là rotenone và tephrosin. Tỷ lệ rotenone trong hạt củ đậu khoảng từ 0,56 – 1,01%. Tuy thành phần hóa học trong lá cây củ đậu chưa được định tính nhưng lá cũng có một số hợp chất tương tự như trong hạt. Một trong số các flavonoid chủ yếu có trong lá củ đậu là rotenone (C23H22O6). Hình 1. 5. Tephrosin Hình 1. 6. Rotenone Trong rễ củ (củ đậu), sau khi đã bóc vỏ có tới 90% nước; 2,4% tinh bột; 4,51% đường toàn bộ (biểu thị bằng glucose); 1,46% protein; 0,39% hợp chất vô cơ; không thấy có chất béo, không thấy có tanin, không có acid xyanhydric. Có men peroxydase, amylase và photphatase. [16] 1.1.5. Tính vị và công dụng Củ đậu không độc, có vị ngọt nhạt, tính mát, ăn sống thì giải khát, nấu ăn thì bổ ích tràng vị, dùng xào với thịt, tôm, tép, nấu thay rau ăn ngon miệng. Người ta còn dùng củ đậu kho với thịt, hầm thịt, làm nộm, làm nhân bánh đa nem, lẫn với thịt nạc băm, thịt cua biển, thịt tôm tươi và mộc nhĩ, bún tàu làm nhân bánh xèo. Phụ nữ 21
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP thường dùng củ đậu tươi thái lát, xoa hoặc ép lấy nước để bôi mặt cho mịn da, khỏi nứt nẻ. Củ đậu khô có thể tán bột dùng làm phấn bôi mặt, xoa rôm sảy. Hình 1. 7. Củ đậu tốt cho sức khỏe Hình 1. 8. Một số món ăn được chế biến từ củ đậu Hạt cây củ đậu chỉ dùng giã nhỏ nấu với dầu vừng để nguội bôi chữa ghẻ. Có thể phối hợp với quả Bồ hòn và hạt Máu chó. Lá cây chỉ dùng chữa bệnh ngoài da chứ không được uống trong. Ở Ấn Độ, người ta dùng hạt giã nhỏ cho vào nước để thuốc cá. Hạt tán bột đắp trị bệnh ngoài da cũng như chứng nổi rôm; có khi chúng được dùng như thuốc nhuận tràng và trị giun. Hạt và lá rất độc đối với động vật như sâu, bọ, cá và với loài nhai lại (trừ ngựa). Làm thuốc phun trừ rệp rau và rệp thuốc lá. Hạt củ đậu ngâm với nước một đêm, sau giã nhỏ, thêm nước với tỷ lệ 1,5% đến 2% hoăc 4% trộn đều. Phun lên những cây bông, cây rau, cây thuốc lá ở ngoài ruộng. Sau 24 giờ đến 36 giờ rệp và nhện đỏ chết hết hay gần hết (90 – 100%). 1.2. Hợp chất Phenol, Flavonoid và Rotenone 1.2.1. Phenol 1.2.1.1. Đại cương về hợp chất phenol 22
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Các hợp chất phenol là các hợp chất mà trong cấu trúc có một hoặc nhiều vòng thơm (vòng benzen) mang một hoặc nhiều nhóm chức hydroxyl –OH. Trong thiên nhiên các hợp chất phenol là flavonoid, xanthan, coumarin, qiunon, các phenol đơn vòng, các polyphenol (lignin, tannin ). Các hợp chất polyphenol chiếm một vị trí quan trọng trong đời sống thực vật, chúng tham gia vào nhiều quá trình sinh lý và sinh hoá quan trọng; vào các quá trình trao đổi chất dưới nhiều hình thức khác nhau như quá trình hô hấp tế bào (vận chuyển H+ trong quá trình photphoryl hoá, oxy hoá ), quá trình quang hợp, điều hòa sinh trưởng phát triển của thực vật .[6] 1.2.1.2. Phân loại Dựa vào số lượng nhóm hydroxyl mà người ta phân biệt thành 2 nhóm: phenol đơn giản và phenol phức tạp (polyphenol). Nhóm phenol đơn giản: gồm các chất được cấu tạo từ 1 vòng benzen và 1 hay nhiều nhóm OH, được phân thành các: monophenol; diphenol (pyrocatechin, rezoxyn ); triphenol (pyrogalon, oxy hydroquinon ). Nhóm hợp chất phenol phức tạp (polyphenol): trong thành phần cấu tạo, ngoài vòng benzen còn có dị vòng mạch nhánh, được phân thành các nhóm: monomer và polymer. - Monome hay polyphenol đơn giản Nhóm C6 – C1 (axit phenol cacbonic): trong cấu trúc phân tử có thêm nhóm cacbonyl, thường gặp ở hạt nảy mầm. Nhóm C6 – C3 (axit cumaric, axit cafeic): có gốc cacbonyl được nối với nhân benzen qua hai nguyên tử cacbon, thường gặp ở thực vật bậc cao. Nhóm C6 – C3 – C6: gọi là các flavonoid và được chia thành các nhóm phụ như flavon, flavonol (sắc tố vàng), antoxyanidin (sắc tố xanh, đỏ và tím), catechin (không màu) 23
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nhóm hợp chất polyphenol polymer: được chia thành các nhóm phụ như Tanin, Lignin, Axit Humic .[4] Hình 1. 9. Một số hợp chất phenol 1.2.1.3. Tính chất hóa lý của polyphenol Các hợp chất phenol dễ tan trong nước vì chúng thường hiện diện trong cây ở dạng glycoside. Nhiều hợp chất phenol có màu sắc tự nhiên, nên có thể dựa vào đặc điểm này để theo dõi chúng trong quá trình tách chiết và cô lập chúng ra khỏi cây cỏ. Các hợp chất phenol thường bị hủy hoại do tác dụng của enzyme phenolase vốn luôn có mặt trong cây vì thế nên sự dụng acol nóng để tách chiết do acol giúp hạn chế tác dụng của enzyme. Các phenol đều tác dụng với thuốc thử FeCl3 để cho ra màu xanh lục, tím hoặc đen.[6] Các hợp chất phenol có cấu tạo và tính chất đa dạng nhưng do có những đặc điểm giống nhau ở cấu trúc được cấu thành từ các vòng benzen nên chúng có một số tính chất chung: Phản ứng của nhóm hydroxyl Phản ứng phá vòng benzen Phản ứng tạo phức với kim loại Phản ứng este hóa 24
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.2.2. Flavonoid 1.2.2.1. Đại cương về flavonoid Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa Phần lớn các flavonoid có màu vàng (do từ flavus là màu vàng); tuy vậy, một số các sắc tố có màu xanh, tím, đỏ, không màu cũng được xếp vào nhóm này vì về mặt hóa học, chúng có cùng khung sườn căn bản. Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1,3 – diphenylpropan, nghĩa là 2 vòng benzen A và B nối nhau qua một dây có 3 carbon, nên thường được gọi là C6 – C3 – C6. Thường các flavonoid có mang một hoặc nhiều nhóm -OH ở vị trí 5 và 7 trên nhân A và ở vị trí 3, 4, 5 trên nhân B. Các flavonoid có thể hiện diện ở dạng tự do hoặc dạng glycoside. Các đường thường gặp nhất là đường D - glucose, kế đó là D - galactose, L - rhamnose, L - arabinose, D - xylose, D - apiose và acid uronic.[6] 1.2.2.2. Phân loại Flavonoid có cấu trúc mạch C6C3C6, đều có 2 vòng thơm. Tùy thuộc vào cấu tạo phần mạch C3 trong bộ khung C6C3C6, flavonoid được phân thành các nhóm sau[24]:  Eucoflavonoid: flavon, flavonol, flavanol, flavanon, chalcon, antocyanin, anthocyanidin. Hình 1. 10. Một số Eucoflavonoid 25
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Flavon rất phổ biến trong thực vật: Thông, Hoàng cầm (rễ), Mè (lá), Anh thảo, cây la apirenin và luteolin. - Chalcon có chủ yếu ở trong một số cây họ Cúc - Asteraceac tập trung nhiều nhất ở vỏ cây, gỗ lõi (Keo, Bạch đàn, Dẻ, Đậu tương, Trinh nữ hoàng cung, Dương xỉ ). Không tìm thấy ở động vật.  Isoflavonoid: Isoflavon, isoflavanon, rotenoid.  Neoflavonoid: neoflavon và calophylloid 1.2.2.3. Lý tính Trong tự nhiên các hợp chất này thường tồn tại dưới dạng glycoside, dễ tan trong nước và dung môi phân cực, dễ bị thủy phân trong môi trường axit, kiềm nhẹ hoặc bởi enzyme β – glucosidase, emulsin. Có mùi thơm và vị đắng chát đặc trưng. Do các nối đôi liên hợp mà các flavonoid thường có màu, đặc biệt là màu vàng. Nếu các nối đôi bị phá vỡ thì hợp chất sẽ mất màu. Có khả năng hấp thụ ngoại tử ngoại do có hệ thống nối đôi liên hợp. Thường thu được 2 dải hấp thụ cực đại, dải 1 có λmax= 240 – 280 nm, dải hấp thụ 2 thường cố định dài hơn dải 1 và giữ 2 dải thường có 1 vai phụ, đặc biệt là đối với flavon và 26
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP flavonol. Tùy theo pH của môi trường và điều kiện tạo muối và phức với các kim loại (K, Na, Fe hoặc Al) mà các bước sóng hấp thụ có thể chuyển dịch.[25] 1.2.2.4. Hóa tính Flavonoid đa dạng về cấu trúc hóa học vì vậy khả năng phản ứng hóa học của chúng rất lớn. - Phản ứng oxy hóa: các flavonoid rất dễ bị oxy hóa. Quá trình này có kèm theo sự mở vòng pyron và đó cũng là nguyên nhân gây ra tác dụng của flavonoid đối với các enzyme oxy hóa khử (oxydoreductase). Nhiều phản ứng oxy hóa khác như với AgNO3, KmnO4 vẫn được dùng để định tính và định lượng flavonoid. - Phản ứng với kiềm: do các nhóm OH có nhóm axit nên dễ phản ứng với các hydroxit kiềm tạo muối tạo muối tan trong nước, khi có nhóm C=O (cacbonyl) trong phân tử thì tính axit lại càng tăng thêm và flavonoid có thể tan trong dung dịch NaHCO3. - Phản ứng este hóa: trong thiên nhiên ít gặp các este của phenol, nhưng trong thí nghiệm in vitro, các nhóm OH của phenol thường dễ cho este, thường gặp là este metylic. - Phản ứng tạo phức với kim loại: Nhóm OH thường tạo phức với AlCl3, NaOH, KOH, cho màu vàng đặc trưng và nhóm chức này cũng là nguyên nhân làm cho các flavonoid tự nhiên có ái lực mạnh với các ion kim loại nặng có hóa trị 2 như Fe, Cu, Zn, và có thể tạo phức chất bền vững với các nguyên tố thuộc chu kỳ 4. Những kim loại này thường có trong các tế bào sinh vật dưới dạng các nguyên tố vi lượng cần thiết cho sự sinh tồn của tế bào. Mặt khác, các flavonoid có thể ngăn chặn sự hình thành các gốc tự do có hại bằng cách kết hợp với những ion kim loại nặng (Fe, Mn) vốn là những tác nhân xúc tác nhiều quá trình sinh hóa làm xuất hiện các gốc tự do. - Tạo liên kết hydro: các nhóm OH tự do rất dễ nối với nhau bởi các liên kết hydro nội phân tử hoặc giữ các phân tử. Hiện tượng này ảnh hưởng nhiều đến 27
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP những tính chất hóa lý học như độ sôi, độ nóng chảy, tính hòa tan, Khả năng phản ứng cũng có thể giảm đi đáng kể.[25] 1.2.2.5. Hoạt tính sinh học Flavonoid là một nhóm các hợp chất được gọi là "những người thợ sửa chữa sinh hóa của thiên nhiên" nhờ vào khả năng sửa chữa các phản ứng cơ thể chống lại các hợp chất khác trong các dị ứng nguyên, virus và các chất sinh ung thư. Các chất flavonoid là những chất oxy hóa chậm hay ngăn chặn quá trình oxy hóa do các gốc tự do, có thể là nguyên nhân làm cho tế bào hoạt động khác thường. Các gốc tự do sinh ra trong quá trình trao đổi chất thường là các gốc tự do như -OH, ROO- (là các yếu tố gây biến dị, huỷ hoại tế bào, ung thư, tăng nhanh sự lão hoá ). Một trong những nhóm flavonoids thực vật hữu ích nhất là proanthocyanidins (còn được gọi là procyanidins). Nhóm này mang lại rất nhiều ích lợi cho sức khỏe. Mỗi proanthocyanidins liên kết với các loại proanthocyanidins khác. Một hỗn hợp gồm các proanthocyanidins liên kết với nhau dạng dime, trime polime được gọi chung là procyanidolic oligomer, gọi tắt là PCO. Năm 1986, Jacques Masquelier là người khám phá ra các đặc tính chống oxy hóa và thu dọn gốc tự do của PCO. Nhiều phương pháp hiện đại và phức tạp đã chứng minh hoạt động bảo vệ mạch máu của PCO và tạo cơ sở vững chắc cho việc sử dụng PCO trong điều trị các bệnh lý mạch máu. Các phương pháp này cho thấy PCO có khả năng: - Bắt giữ gốc tự do hydroxyl. - Bắt giữ lipide peroxide. - Làm chậm trễ đáng kể sự khởi đầu của quá trình peroxide hóa lipide. - Kìm giữ các phân tử sắt tự do, giúp ngăn chặn sự peroxide hóa lipide do sắt. - Ức chế sự sản sinh ra gốc tự do bằng cách ức chế không cạnh tranh men xanthin oxidase. - Ức chế sự tổn thương do các enzyme (hyaluronidase, elastase, collagenase ) có thể làm thoái hóa cấu trúc mô liên kết. 28
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Các flavonoid còn có khả năng tạo phức với các ion kim loại nên có tác dụng như những chất xúc tác ngăn cản các phản ứng oxy hoá. Do đó, các chất flavonoid có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hoá, thoái hoá gan, tổn thương do bức xạ. Năm 1936, Szent Gyorgy, dược sĩ người Hungari tách từ ớt và quả chanh một chất cùng với vitamin C có tác dụng chữa được chứng chảy máu mao mạch, củng cố thành mạch, ông gọi là vitamin C2 hoặc vitamin P (P là chữ đầu của từ tiếng Pháp perméabilité - có nghĩa là tính thấm). Về sau người ta thấy trong giới thực vật có nhiều hợp chất thứ sinh có đặc tính tương tự vitamin P và đặt cho chúng một tên chung là Flavonoid. Lavollay, Neumann Porrot (1941, 1942) đã chứng minh catechin có tác dụng mạnh hơn vitamin C trong việc giữ bền thành mạch. Thực nghiệm cho thấy các Flavonoid có các nhóm OH ở vị trí 3,4 có tác dụng tốt đối với sự nâng cao tính bền vững của thành mạch. Rutin là chất tiêu biểu về tác dụng này. Hyaluronidase là enzym làm tăng tính thấm của mao mạch, khi thừa enzyme này sẽ xảy ra hiện tượng xuất huyết dưới da. Flavonoid ức chế sự hoạt động của hyaluronidase. Trên hệ tim mạch, nhiều flavonoid như quercetin, rutin, myciretin, hỗn hợp các catechin của trà có tác dụng làm tăng biên độ co bóp tim, tăng thể tích phút của tim Các flavonoid có tác dụng củng cố, nâng cao sức chống đỡ và hạ thấp tính thẩm thấu các hồng huyết cầu qua thành mạch thông qua tác dụng lên các cấu trúc màng tế bào của nó. Hay nói cách khác, vitamin P và flavonoid nói chung duy trì độ mềm dẻo của thành mạch, ứng dụng vào điều trị các rối loạn chức năng tĩnh mạch, giãn hay suy yếu tĩnh mạch. Flavonoid còn có tác dụng chống độc, làm giảm thương tổn gan, bảo vệ chức năng gan. Nhiều flavonoid thuộc nhóm flavon, favanon, flavanol có tác dụng lợi tiểu rõ rệt, như là các flavonoid có trong lá Diếp cá, trong cây Râu mèo 29
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Các dẫn xuất của kaempferol, quercetin, isorhammetin có tác dụng tăng tuần hoàn máu trong động mạch, tĩnh mạch và mao mạch, dùng cho những người có biểu hiện lão suy, rối loạn trí nhớ, khả năng làm việc đầu óc sút kém, mất tập trung, hay cáu gắt Quercetin là một flavonoid làm xương sống cho nhiều loại flavonoid khác, gồm rutin, quercitrin, hesperidin – các flavonoid của cam quít. Những dẫn xuất này khác với quercetin ở chỗ chúng có các phân tử đường gắn chặt vào bộ khung quercetin. Quercetin là một flavonoid bền vững và hoạt động nhất trong các nghiên cứu, và nhiều chế phẩm từ dược thảo có tác dụng tốt là nhờ vào thành phần quercetin với hàm lượng cao. - Quercetin có khả năng chống oxy hóa và tiết kiệm lượng vitamin C sử dụng, giúp tích lũy vitamin C trong các mô tổ chức. - Quercetin có khả năng chống viêm do ức chế trực tiếp hàng loạt phản ứng khởi phát hiện tượng này: ức chế sự sản xuất và phóng thích histamin và các chất trung gian khác trong quá trình viêm và dị ứng. - Quercetin ức chế men aldose reductase rất mạnh, men này có nhiệm vụ chuyển glucose máu thành sorbitol - một hợp chất liên quan chặt chẽ với sự tiến triển các biến chứng của đái tháo đường (đục thủy tinh thể do đái tháo đường, thương tổn thần kinh, bệnh võng mạc, đái tháo đường).[26] 1.2.3. Rotenone 1.2.3.1. Cấu tạo Tỷ lệ rotenone trong hạt củ đậu khoảng từ 0,56 – 1,01%. Thành phần hóa học trong lá cây củ đậu cũng tương tự như trong hạt. Rotenone (C23H22O6) thuộc dẫn chất isoflavonoid. Có phân tử lượng: 394,41 g; Khối lượng riêng: 1,27 g/cm3; Nhiệt độ nóng chảy: 165 – 166oC; Nhiệt độ sôi: 210 - 220oC; Độ hòa tan: tan nhiều trong acetone và ít tan trong etanol.[33] 30
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1. 11. Công thức cấu tạo và cấu trúc 3D của rotenone Rotenone là một chất hóa học không mùi được sử dụng nhiều trong thuốc trừ sâu, piscicide, và pesticide. Nó có trong rễ và hạt của một số loài thực vật như jicama. Emmanuel Geoffroy đã chiết tách chất này đầu tiên (mà ông gọi là nicouline) từ một tiêu bản của loài Robinia nicou, hiện là Lonchocarpus nicou, khi ông đến Guiana thuộc Pháp. Ông đã viết về nghiên cứu này trong luận án của mình, được xuất bản năm 1895 ngay sau cái chết của ông do bệnh ký sinh trùng. Những nhà nghiên cứu sau đó xác định chất mà Geoffroy gọi là nicouline là rotenone.[27] 1.2.3.2. Ứng dụng Tại Hoa Kỳ và Canada, sử dụng tất cả ứng dụng của rotenone ngoại trừ tác dụng thuốc cá đang được loại bỏ. Rotenone đã được sử dụng bởi người dân bản địa để bắt cá. Thông thường, rotenone có chứa trong các cây Fabaceae họ đậu được nghiền nát và được đưa vào một vùng nước, và rotenone cản trở hô hấp tế bào, cá sẽ bơi lên gần mặt nước để lấy không khí và chúng dễ dàng bị bắt. Rotenone đã được sử dụng bởi các cơ quan chính phủ để giết cá trên sông và hồ ở Hoa Kỳ kể từ năm 1952. Các nhà nghiên cứu cá sử dụng rotenone để lấy mẫu ở quy mô nhỏ, nghiên cứu đa dạng sinh học của các loài cá biển, sử dụng rotenone để thu thập các loài cá khó bắt, hoặc ẩn, mà đại diện cho một thành phần quan trọng của cộng đồng cá ven bờ. Rotenone là công cụ hiệu quả nhất vì liều lượng nhỏ và tác dụng phụ ít ảnh hưởng đến môi trường. 31
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Rotenone cũng được sử dụng ở dạng bột để điều trị ghẻ và chấy trên người, và ký sinh bọ ve trên gà, chăn nuôi và nuôi động vật. Rotenone đã được sử dụng như là thuốc trừ sâu hữu cơ cho khu vườn. Bên cạnh đó, rotenone còn có tác dụng diệt được một số loại bọ hại cũng như hầu hết các động vật chân đốt khác. Nó nhanh chóng phân hủy sinh học trong điều kiện có nắng nhẹ, vì vậy dư lượng có hại là tối thiểu. Một lượng rất nhỏ trên lá của cây sẽ kiểm soát côn trùng trong vài ngày.[27] 1.2.3.3. Cơ chế tác dụng Rotenone hoạt động bằng cách can thiệp vào chuỗi vận chuyển điện tử trong ty thể. Nó ức chế sự chuyển electron từ các trung tâm sắt – lưu huỳnh trong phức hợp I đến coenzyme Q. Điều này gây trở ngại cho NADH trong quá trình tạo năng lượng mà tế bào sử dụng được (ATP). Phức hợp I là không thể vượt qua để mang electron đến một vật mang điện tử tan trong chất béo Coenzyme Q10, các điện tử bị giữ lại trong ty thể. Oxy di động bị giảm đến mức cực thấp, tạo ra một loại oxy phản ứng, có thể làm tổn hại DNA và các thành phần khác của ty thể. Hình 1. 12. Chuỗi truyền điện tử và cơ chế tác động của rotenone trong ty thể Hình 1. 13. Rotenone ngăn cản sự truyền điện tử đến CoQ 32
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Rotenone được sản xuất bằng cách chiết xuất từ rễ và thân cây của một số loài thực vật nhiệt đới và cận nhiệt đới, đặc biệt là những người thuộc các chi Lonchocarpus và chi Derris.[27] 1.2.3.4. Độc tính Rotenone được phân loại bởi Tổ chức Y tế Thế giới là tương đối nguy hiểm. Đó là độc tính nhẹ với con người và các động vật có vú, nhưng rất độc đối với côn trùng và động vật thủy sinh, bao gồm cả cá. Độc tính này cao hơn trong cá và côn trùng là do lipophilic rotenone có thể dễ dàng thông qua mang hoặc khí quản, nhưng không phải là dễ dàng qua da hoặc qua đường tiêu hóa. Rotenone gây độc cho tế bào hồng cầu trong ống nghiệm. Liều tử vong thấp nhất cho một đứa trẻ là 143 mg/kg. Trường hợp tử vong do ngộ độc rotenone là rất hiếm bởi vì nó kích thích của gây ra nôn mửa, nếu ăn có chủ ý của rotenone có thể gây tử vong. Các hợp chất phân hủy khi tiếp xúc với ánh sáng mặt trời và thời gian khoảng 6 ngày. Nó bị oxy hóa thành rotenolone, cường độ ít độc hại hơn rotenone. Trong nước, tỷ lệ thủy phân tùy thuộc nhiều yếu tố, bao gồm nhiệt độ, pH và ánh sáng mặt trời. Độc tính giảm ½ trong nửa ngày trong vùng nước tự nhiên nằm trong khoảng nhiệt độ 24°C đến 3,5 ngày ở 0°C.[27] 1.3. Các phương pháp tách chiết hợp chất thứ cấp trong thực vật 1.3.1. Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng Nguyên tắc của sự chiết lỏng – lỏng là dung môi không phân cực sẽ hòa tan tốt các hợp chất không phân cực, dung môi phân cực trung bình sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình và dung môi phân cực mạnh sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh. 33
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1. 14. Chiết 2 lớp chất lỏng Việc chiết lỏng – lỏng được thực hiện bằng bình lóng, trong đó cao alcol thô ban đầu được hoà tan vào pha nước. Sử dụng lần lượt các dung môi hữu cơ, loại không hoà tan với nước hoặc loại có thể hỗn hợp được với nước để chiết ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực khác nhau (tuỳ vào độ phân cực của dung môi). Tùy vào tỷ trọng so sánh giữa dung môi và nước mà pha hữu cơ nằm ở lớp trên hoặc ở dưới so với pha nước. Việc chiết được thực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi phân cực ví dụ như: ete dầu hỏa hoặc hexane, chloroform, ethyl acetate, buthanol Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi, chiết đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi thì đổi sang chiết với dung môi có tính phân cực hơn. Dung dịch của các lần chiết được gom chung lại, làm khan nước với các chất làm khan như Na2SO4, MgSO4, CaSO4 , đuổi dung môi ta thu được cao chiết.[6] 34
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.3.2. Kỹ thuật chiết rắn – lỏng 1.3.2.1. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt Phương pháp này được sử dụng khá phổ biến vì không đòi hỏi thiết bị tốn kém, phức tạp. Hình 1. 15. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt Bột cây được xay thô đạt kích cỡ thích hợp. Mẫu không nên to vì sẽ chiết không kiệt, mẫu xay quá mịn sẽ cản trở dòng chảy. Đáy của bình ngấm kiệt được lót bằng bông thủy tinh và một tờ giấy lọc. Bột cây được đặt vào bình, lên trên lớp bông thủy tinh, lên gần đầy bình. Đậy bề mặt lớp bột bằng một tờ giấy lọc và chặn lên bằng những viên bi thủy tinh để cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột. Từ từ rót dung môi cần chiết vào bình cho đến khi dung môi phủ xấp xấp phía trên lớp mặt. Có thể sử dụng dung môi nóng hoặc nguội. Để yên sau một thời gian, thường là 12 – 24 giờ. Mở van bình ngấm kiệt cho dung dịch chiết chảy ra từng giọt và đồng thời mở khóa bình lóng để dung môi tinh khiết chảy xuống bình ngấm kiệt. Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi tinh khiết chảy vào bình ngấm kiệt bằng với vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình này.[6] 1.3.2.2. Kỹ thuật chiết ngâm dầm Ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không rỉ, bình có nắp đậy. Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơ có thể hòa tan một ít nhựa, gây nhầm lẫn là hợp chất đó có chứa trong cây. Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của lớp bột cây. Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm 35
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên. Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc; thu hồi dung môi sẽ được cao chiết. Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm một lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây. Có thể gia tăng hiệu quả chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn bình vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung ra làm dung dịch chiết bị trào ra ngoài). Mỗi lần ngâm dung môi, chỉ cần 24 giờ là đủ, vì với một lượng dung môi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dung môi đến đạt mức bão hòa, không thể hòa tan thêm được nhiều hơn: có ngâm lâu hơn chỉ mất thời gian. Quy tắc chiết là chiết nhiều lần, mỗi lần một lượng ít dung môi. Dung môi sau khi được thu hồi, được làm khan nước bằng các chất làm khan và được tiếp tục sử dụng để chiết lần sau.[6] 1.3.2.3. Kỹ thuật chiết bằng máy Soxhlet Dụng cụ: Máy có bán sẵn với nhiều cỡ lớn nhỏ khác nhau, từ bình cầu 250 ml đến 15 lít. Máy gồm ba bộ phận tháo ráp được tại các vị trí nút mài (1), (2) và (3). Gồm một bình cầu A đặt trong một bếp đun có thể điều chỉnh nhiệt độ. Một bộ phận chứa mẫu bột cây, gồm ba ống: ống D có đường kính lớn, ở giữa, để chứa bột cây; ống B có đường kính trung bình, để dẫn dung môi từ bình A bay lên, đi vào ống D chứa bột cây; ống E có đường kính nhỏ, là ống thông nhau, để dẫn dung môi từ D trả ngược trở lại bình cầu A. Trên cao nhất là ống C ngưng hơi. Thực hành: bột cây xay thô được đặt trực tiếp trong ống D hoặc tốt nhất là đặt trong một túi vải để dễ lấy bột cây ra khỏi máy. Lưu ý: Đặt vài viên bi thủy tinh dưới đáy ống D đế tránh làm nghẹt lối ra vào của ống thông nhau E. Không được để lượng bột cây trong ống D cao vượt hơn mức cong của ống thông nhau E. Rót dung môi đã lựa chọn vào bình cầu bằng cách tháo hệ thống ở chỗ nút mài số (2), như thế dung môi sẽ thấm ướt bột cây rồi mới chạy xuống bình cầu, ngang qua ngõ ống thông nhau E. Lưu ý để thể tích lượng dung môi trong bình cầu không được nhiều hơn hai phần ba thể tích của bình cầu. 36
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Kiểm tra hệ thống kín. Mở cho nước chảy hoàn lưu trong ống ngưng hơi. Cắm bếp điện và điều chỉnh nhiệt độ sao cho dung môi trong bình cầu sôi nhẹ đều. Dung môi tinh khiết khi được đun nóng sẽ bốc hơi lên cao, theo ống B lên cao hơn, rồi theo ống ngưng hơi để lên cao hơn nữa, nhưng tại đây hơi dung môi bị ống ngưng hơi làm lạnh, ngưng tụ thành thể lỏng, rớt thẳng xuống ống D đang chứa bột cây. Dung môi ngấm vào bột cây và chiết những chất hữu cơ nào có thể hòa tan vào dung môi. Theo quá trình đun nóng, lượng dung mơi rơi vào ống D càng nhiều, mức dung môi dâng lên cao trong ống D và đồng thời cũng dâng cao trong ống E, vì đây là ống thông nhau. Đến một mức cao nhất trong ống E, dung môi sẽ bị hút về bình cầu A, lực hút này sẽ rút hết lượng dung môi đang chứa trong ống D. Bếp vẫn tiếp tục đun và một quy trình mới vận chuyển dung môi theo như mô tả lúc đầu. Các hợp chất được hút xuống bình cầu và nằm lại tại đó, chỉ có dung môi tinh khiết là được bốc hơi bay lên để tiếp tục quá trình chiết. Tiếp tục đến khi chiết kiệt chất trong bột cây (dung môi eter dầu hỏa chỉ chiết kiệt những chất kém phân cực nào có thể tan được trong eter dầu hỏa nóng). Kiểm tra sự chiết kiệt bằng cách tắt máy để nguội và mở hệ thống chỗ nút mài (3), rút lấy một giọt dung môi và thử trên mặt kiếng, nếu thấy không còn vết gì trên kiếng là đã chiết kiệt. Sau khi hoàn tất, lấy dung môi chiết ra khỏi bình cầu A, đuổi dung môi, thu được cao chiết.[6] Hình 1. 16. Bộ chiết Soxhlet 37
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.3.2.4. Kỹ thuật chiết bằng máy Kumagawa Sử dụng máy chiết Kumagawa với thiết bị, nguyên tắc giống như máy chiết Soxhlet, chỉ khác ở túi đựng bột cây được đặt gần nguồn nhiệt hơn. Có thể cải biến kỹ thuật này với dụng cụ thủy tinh đơn giản có thể dễ dàng tìm thấy trong phòng thí nghiệm: bình cầu (ngâm bột cây trực tiếp trong bình này) và ống ngưng hơi. Sau một thời gian đun cần thiết, dung dịch chiết được rót ra và lọc ngang giấy lọc. Dung môi được cho vào bình cầu và tiếp tục chiết vài lần như thế đến khi chiết kiệt.[6] Hình 1. 17. Máy chiết Kumagawa 1.3.2.5. Phương pháp chưng cất Khi đun sôi một hỗn hợp lỏng, chất nào có nhiệt độ thấp hơn sẽ chuyển thành hơi sớm hơn và nhiều hơn. Khi gặp lạnh, hơi sẽ ngành tụ thành dạng lỏng chứa chủ yếu là chất có nhiệt độ sôi thấp hơn. Quá trình đó gọi là sự chưng cất. Hình 1. 18. Bộ lôi cuốn hơi nước 38
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Thực hành: Sự lôi cuốn hơi nước thường được thực hiện trên cây tươi mới thu hái về. Mẫu cây được cắt nhuyễn, được đặt vào bình cầu, cho nước cất vào bình sao cho phần thể tích mẫu cây và nước chỉ chiếm tối đa 2/3 thể tích bình cầu. Lấp hệ thống và cắm bếp điện đun nóng. Nước trong bình cầu khi bị đun nóng sẽ bốc thành hơi bay lên, hơi nước bay lên mang theo tinh dầu, hơi này bị ống ngưng hơi làm lạnh, ngưng tụ trở lại thể lỏng, rớt xuống ống gạn. Trong ống gạn, dung dịch tách thành 2 lớp gồm lớp nước và lớp tinh dầu.[6] 1.3.2.6. Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn Nguyên lý của phương pháp siêu tới hạn: Đối với một chất thông thường, dưới mỗi điều kiện nhất định chúng sẽ tồn tại ở một trạng thái nào đó trong 3 trạng thái rắn, lỏng hoặc khí. Nếu nén chất khí tới một áp suất đủ cao, chất khí sẽ hóa lỏng. Tuy nhiên, có một giá trị áp suất mà ở đó, nếu nâng dần nhiệt độ lên thì chất lỏng cũng không thể trở về trạng thái khí, mà rơi vào một vùng trạng thái đặc biệt gọi là trạng thái siêu tới hạn (supercritical). Vật chất ở trạng thái này mang nhiều đặc tính của cả chất khí và chất lỏng, nghĩa là dung môi đó mang tính trung gian giữa khí và lỏng. Hình 1. 19. Sơ đồ hệ thống chiết siêu tới hạn o Vì vậy khi CO2 được đưa lên nhiệt độ, áp suất cao hơn nhiệt độ tới hạn (31 C), áp suất tới hạn (73,8 bar), CO2 sẽ chuyển sang trạng thái siêu tới hạn. Tại trạng thái này, CO2 có khả năng hòa tan rất tốt các đối tượng cần tách ra khỏi mẫu ở cả 3 dạng rắn, lỏng, khí. Sau quá trình chiết, để thu hồi sản phẩm chỉ cần 39
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP giảm áp suất thấp hơn áp suất tới hạn thì CO2 chuyển sang dạng khí ra ngoài còn sản phẩm được tháo ra ở bình hứng.[28] 1.3.2.7. Kỹ thuật chiết pha rắn Chiết pha rắn (hay chiết rắn – lỏng) là quá trình phân bố các chất tan giữa hai pha lỏng và rắn. Trong đó, chất tan ban đầu ở trong pha lỏng (nước hoặc dung môi hữu cơ), chất để hấp thụ chất tan ở dạng rắn (dạng hạt, nhỏ và xốp) gọi là pha rắn. Pha rắn (còn được gọi là pha tĩnh) thường là các hạt silica gel xốp trung tính, hạt oxit nhôm, silica gel trung tính đã được ankyl hoá nhóm –OH bằng các gốc hydrocarbon mạch thẳng -C2, -C4, -C8, -C18, hay nhân phenyl, các polyme hữu cơ, các loại nhựa hoặc than hoạt tính Các hạt này được nhồi vào cột chiết nhỏ (thường là cột có kích thước 5 x 1 cm) hoặc nén ở dạng đĩa dày 1 – 2 mm với đường kính 3 – 4 cm (đĩa chiết). Hình 1. 20. Cột chiết pha rắn Pha lỏng là pha chứa chất cần phân tích, chúng có thể là dung môi hữu cơ, dung dịch đệm Khi cho pha lỏng đi qua cột chiết (hoặc đĩa chiết), pha rắn tương tác với chất phân tích và giữ một nhóm (hoặc một số nhóm) của chất phân tích lại trên pha rắn, các chất còn lại đi ra khỏi cột cùng với dung môi hòa tan mẫu. Quá trình rửa giải (giải hấp) chất phân tích được thực hiện bằng một dung môi thích hợp.[29] 40
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.4. Phương pháp đánh giá độc tính và xác định giá trị LC50 Khảo sát một đường thẳng rõ ràng là dễ hơn khảo sát một đường cong. Hơn nữa, các sự tính toán, loại suy hoặc suy diễn dựa trên đường thẳng bao giờ cũng thuận tiện, nhanh chóng và chính xác hơn là thực hiện điều đó trên các đường cong. Do vậy mà trong nghiên cứu khoa học người ta thường tìm cách tuyến tính hóa các đường cong gặp phải. Ở đây như chúng ta đã thấy, bản chất của “giải tích Probit” chính là vấn đề tuyến tính hóa đường cong Sigmoid.[2] Từ đó chúng ta cũng có thể áp dụng giải tích Probit để xử lí số liệu nghiên cứu của chúng ta nhất thiết phải tuân theo luật phân phối chuẩn (còn gọi là phân phối bình thường, phân phối hình chuông hay phân phối Gauss). Ở phân phối này, trị trung bình bao giờ cũng chiếm tỉ lệ (tần số hay mật độ) cao nhất, càng xa trị trung bình, hay nói một cách nôm na là “thái quá”, thì chiếm tỉ lệ càng ít đi. Điều này thường hay gặp trong thế giới tự nhiên, đến nỗi chúng ta cảm thấy điều đó là hết sức “bình thường”. Chẳng hạn, trong một quần thể nào đó bao giờ cá thể có kích thước trung bình cũng chiếm đa số, càng thái quá (kích thước quá lớn hay quá nhỏ) thì chiếm tỉ lệ càng ít đi. Tương tự như vậy khi xét tới các khía cạnh khác như tình trạng sức khỏe, sức sống, sức chịu đựng của quần thể. Trong những trường hợp mà số liệu nghiên cứu của chúng ta không tuân theo luật phân phối bình thường, thì nhất thiết phải tiến hành “bình thường hóa” các số liệu đó bằng cách lấy căn bậc hai, căn bậc ba, lấy logarit cho số liệu nghiên cứu, nghĩa là thay các “x” bằng các “đại diện cho x”, điều này chúng tôi đã trình bày chi tiết ở chương “ thiết lập mô hình toán học”. Chẳng hạn, khi tác động chất độc vào quần thể sinh vậy như côn trùng, nấm, vi khuẩn, chuột, chim, thú, tôm, cá thì nồng độ hay liều lượng chất độc không phản ánh đúng bản chất sức chịu đựng của quần thể (biểu hiện ở tỉ lệ chết). Thực nghiệm cho thấy rằng trong đa số các trường hợp, logarit thập phân của nồng độ hay liều lượng của chất độc mới phản ánh đúng bản chất sức chịu đựng của quần thế sinh vật, nghĩa là logarit thập phân của nồng độ hay liều lượng độc chất mới đúng là thước đo dùng để đo sức chịu đựng của quần thể sinh vật, nói một cách khác, thang đo sức chịu đựng của quần thể sinh vật tương ứng với 41
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP thang logarit nồng độ hay liều lượng độc chất. Như vậy, sức chịu đựng của quần thể sinh vật phân bố bình thường qua “lăng kính” logarit nồng độ hay liều lượng độc chất. Tương tự như vậy, khi tác động vào quần thể sinh vật các loại chất kích thích, các loại hormon, pheromon, các loại vitamin, các loại huyết thanh, các loại thuốc kháng sinh thì trong đa số các trường hợp, mức độ phản ứng hay đáp ứng của quần thể sinh vật (biểu hiện ở tỉ lệ đáp ứng, tỉ lệ được cứu sống hay bình phục ) cũng phân bố bình thường qua “lăng kính” logarit nồng độ hay liều lượng các chất tác động vào quần thể sinh vật đó.[2] Về phương diện lý thuyết cũng như về mặt thực hành, dù sao chúng ta cũng phải luôn luôn “cảnh giác” một điều là, mặc dù thang “logarit” được sử dụng rất phổ biến và có hiệu quả trong việc “bình thường hóa” số liệu nghiên cứu, chúng ta cũng đừng bao giờ tuyệt đối hóa thang “logarit”, mà phải luôn luôn thận trọng là, trong những trường hợp cụ thể có thể sử dụng các thang khác, chẳng hạn như thang “căn bậc hai”, thang “căn bậc ba” để “bình thường hóa” số liệu nghiên cứu tốt hơn là sử dụng thang “logarit”. Để có thể đưa ra các kết luận một cách khách quan, tiến hành “phân tích biến lượng” cho mô hình toán học đã được thiết lập.[2] Dưới đây là một số ví dụ minh họa. Ví dụ 1: Xác định hiệu quả tác động của chất độc vào quần thể sinh vật. Bảng 1. 1. Hiệu quả tác động của Nicotin Sulphat (trong dung dịch 1% saponin) đối với ruồi giấm Nicotin Sulphat Số ruồi Số tử vong % tử vong log10 (nồng độ Probit g/200cc x100) X Y 0.6 150 97 64.7 1.78 5.38 0.8 150 120 80.0 1.90 5.82 1.1 150 133 88.7 2.04 6.17 1.4 150 137 91.3 2.15 6.36 1.3 150 145 96.7 2.25 6.85 Tổng 10.12 30.58 Trung bình 2.02 6.12 42
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Xét mô hình toán học dạng Y = a + bX. Tiến hành thiết lập “hệ bình thường” (xem mục “Thiết lập mô hình toán học”) và giải hệ ta được a = 0.2916 và b = 2.8826. Như vậy, mô hình toán học cho trường hợp này có thể là Y = 0.2916 + 2.8826X Bây giờ chúng ta cần thẩm định lại xem là mô hình này có thích hợp hay không bằng cách phân tích nguồn biến lượng của mô hình như sau: - SS (tổng) = ∑(Y – 푌̅)2 = ∑Y2 – (∑Y)2/n = (5.38)2 + + (6.85)2 – (30.58)2/5 = 1.20992 - SS (mô hình) = ∑(Y – 푌̅)2 = b∑(X – ̅)(Y – 푌̅) = b[∑XY – (∑X)( ∑Y)/n] = 2.8826[62.4048 – (10.12)(30.58)/5] = 1.18004 - SS (sai lệch) = ∑(Y – Y)2 = ∑(Y – 푌̅)2 – ∑(Y – 푌̅)2 = 1.20992 – 1.18094 = 0.02898 Bảng 1. 2. Phân tích nguồn biến lượng Nguồn biến lượng Độ tự do Tổng các bình phương Biến lượng Mô hình 1 1.18094 1.18094 Sai lệch 3 0.02898 0.00966 Tổng 4 1.20992 F = 1.18094 / 0.00966 = 122.25 ; P < 0.005 |푅| = 1.18094 / 1.20992 = 0.9879 43
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Từ kết quả trắc nghiệm F chúng ta thấy rằng, khả năng không tương thích của mô hình toán học đã được thiết lập trong thực tế là rất nhỏ (P < 0.005), do đó, mô hình toán học này là có thể chấp nhận được. Từ mộ hình toán học này chúng ta có thể tính được các ? 50% tử vong → Probit Y = 5, khi đó: 5 = 0.2916 + 2.8826X Hay X = (5 – 0.2916)/2.8826 = 1.63 2 Vì rằng X = log10(nồng độ . 10 ) Do đó: nồng độ = 10X/102 1.63 2 Hay LD50 = 10 /10 = 0.43 g/200ml Tương tự: 90% tử vong → Probit Y = 6.28, khi đó: 6.28 = 0.2916 + 2.8826X Hay X = (6.28 – 0.2916)/2.8826 = 2.08 Từ đó 2.08 2 LD90 = 10 /10 = 1.20 g/200ml Liều gây chết trung bình (được viết tắt là LD50, LC50 hay LCt50) của một chất là một liều cần thiết giết chết phân nửa số cá thể được dùng làm thí nghiệm trong một thời gian thí nghiệm. Thí nghiệm này được J.W. Trevan đưa ra năm 1927. Loại thuốc có trị số LC50 càng thấp là thuốc có độ độc cấp tính càng cao. Ứng dụng trong một số lĩnh vực như: - Môi trường: Để đánh giá mức độ độc của các chất trong không khí và nước. - Nông nghiệp: biểu thị độ độc cấp tính của một loại thuốc BVTV đối với động vật máu nóng. 44
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.5. Phương pháp xác định khả năng đối kháng với vi sinh vật gây bệnh 1.5.1. Cơ chế kháng vi sinh vật Hình 1.21 Cơ chế kháng khuẩn Các phenolics là làm thay đổi màng tế bào chất, gián đoạn lực đẩy proton và làm kết tủa các chất trong tế bào. Tầm quan trọng của sự có mặt nhóm hydroxyl trong các hợp chất phenolic đã được chứng minh, phenolics tác động lên các enzyme như ATPases nằm trong màng tế bào chất và được bao quanh bởi các phân tử lipid. Các phân tử lipophilic hydrocacbon có thể tích tụ trong lớp lipid kép và làm ảnh hưởng đến tương tác lipid – protein; ngoài ra có thể có sự tương tác trực tiếp của các hợp chất lipophilic với phần kỵ nước của protein.[13,14] 1.5.2. Xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch 1.5.2.1. Đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn khảo sát Các hỗn hợp vi khuẩn khảo sát được tăng sinh trong môi trường phù hợp. Mật độ vi khuẩn sử dụng trong thử nghiệm này là 107 cfu/ml. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Mật độ vi khuẩn chỉ thị sử dụng là 106 cfu/ml. Các chủng vi khuẩn khảo sát sau khi tăng sinh trên môi trường TSB được pha loãng, xác định mật độ và tiến hành pha loãng để có được mật độ 107 cfu/ml. Sau đó 45
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 100 µl dịch này được cấy trang trên môi trường phù hợp. Đem ủ ở nhiệt độ 300C trong 24 giờ. Xác định mật độ các chủng vi khuẩn chỉ thị rồi tiến hành cấy trang 100 µl trên môi trường phù hợp. Chờ cho đĩa thạch thật khô, sử dụng một ống trụ đường kính 5 mm đục 3 lỗ trên mỗi đĩa thạch. Đối với các đĩa thạch chứa vi khuẩn khảo sát sau khi nuôi cấy, chọn những vùng vi khuẩn phát triển dầy đặc, tiến hành đục các khối thạch chứa sinh khối vi khuẩn. Dùng kẹp vô trùng gắp từng khối thạch đặt vào trong các giếng trên đĩa đã trang các chủng vi khuẩn chỉ thị. Đem ủ ở nhiệt độ 300C trong 24 giờ. Sau thời gian 24 giờ, đo các vòng kháng khuẩn xung quanh các giếng thạch.[5] 1.5.2.2. Đánh giá khả năng đối kháng của dịch nuôi cấy vi khuẩn khảo sát sau ly tâm Các hỗn hợp vi khuẩn khảo sát được nuôi cấy trong môi trường thích hợp. Mật độ vi khuẩn sử dụng trong thử nghiệm này là 107 cfu/ml. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Mật độ vi khuẩn chỉ thị sử dụng lần lượt là 106 cfu/ml. Các chủng vi khuẩn khảo sát được nuôi trong môi trường thích hợp trên tủ ấm lắc trong 24 giờ. Sau đó, pha loãng, xác định mật độ và tiến hành pha loãng để có được mật độ 107 cfu/ml. Cấy chuyển 100 µl vào bình tam giác chứa môi trường thích hợp và nuôi cấy trong tủ ấm lắc nhiệt độ 300C trong 24 giờ. Đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị sau khi xác định mật độ, tiếng hành cấy trang 100 µl trên môi trường thích hợp. Chờ cho đĩa khô, dùng một ống trụ đường kính 5 mm đục 3 lỗ trên mỗi đĩa thạch. Hút 100 µl dịch nổi sau khi ly tâm cho vào các lỗ thạch sau khi đục. Sau đó, đem ủ ở nhiệt độ 300C trong 24 giờ. Sau 24 giờ đo các vòng kháng khuẩn xung quanh lỗ thạch.[5] Đánh giá khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn khảo sát thông qua khả năng tạo vòng tròng kháng khuẩn với vi khuẩn chỉ thị. Một đơn vị hoạt tính kháng khuẩn được định nghĩa như một đơn vị hoạt tính AU (Arbitrary unit). Một AU là một đơn vị diện tích của vùng ức chế trên mỗi đơn vị thể tích, trong trường hợp này là mm2/ml. Hoạt tính kháng khuẩn được tính theo công thức sau (Usmiati à Marwat, 2009): 46
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 퐿 −퐿푠 Hoạt tính kháng khuẩn (mm2/ml) = Trong đó: Lz: diện tích vòng kháng khuẩn, bao gồm cả diện tích lỗ (mm2) Ls: diện tích lỗ (mm2) V: thể tích mẫu cho vào (ml) 1.5.3. Xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp đo độ đục Các chủng vi khuẩn được đánh giá khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp đo độ đục được thực hiện như sau: Tiến hành tăng sinh các chủng vi khuẩn khảo sát trong erlen chứa 10 ml môi trường phù hợp ở 300C trong 24 giờ, sau đó tiến hành ly tâm để loại bỏ sinh khối, thu lấy dịch trong. Chuẩn bị các ống nghiệm mỗi ống chứa 2 ml TSB vô trùng. Hút 2 ml dịch sau ly tâm cho vào ống chứa 2 ml môi trường TSB. Hút 200 µl vi khuẩn chỉ thị đã tăng sinh trong môi trường TSB trong 24 giờ và chỉnh về mật độ 107 cfu/ml cho vào ống nghiệm đã chứa sẵn dịch sau ly tâm vi khuẩn và môi trường TSB. Tiến hành 0 ủ ở 37 C trong 24 giờ và đo OD600nm để xác định tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị.[5] Đánh giá phần trăm tỷ lệ ức chế vi khuẩn chỉ thị được tính theo công thức sau (Schillinger và Lucke, 1989; Nguyễn Hoài Hương và ctv, 2012): % tỷ lệ ức chế = (1 – ) x100% 1.6. Sinh vật thí nghiệm 1.6.1. Động vật giáp xác - Artemia Nauplii 1.6.1.1. Đặc điểm sinh học Artemia Nauplii là tên khoa học của một loài giáp xác có tính rộng muối (từ vài phần ngàn đến 250‰). Chúng thường sống ở biển tự nhiên hoặc được nuôi trong ruộng muối. Artemia ăn lọc không có tính chọn lựa, thức ăn chủ yếu là các hạt lơ lững trong nước và các sinh vật cỡ như tảo và vi khuẩn. Với chu trình biến thái ngắn, sau 10 – 15 ngày chúng có thể đạt giai đoạn trưởng thành và tham gia sinh sản, tùy theo điều kiện môi trường Artemia có sự sinh trưởng và sinh sản khác nhau, có dòng đơn tính, dòng lưỡng tính, đẻ con hay đẻ trứng. 47
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Khi nồng độ muối cao hơn 70‰ và dinh dưỡng kém, nhiệt độ cao thì Artemia có xu hướng đẻ trứng bào xác. Ấu trùng Artemia vừa mới đẻ hay mới nở có kích thước 400 - 500 µm, con trưởng thành dài không quá 20 mm. Trong quá trình phát triển Artemia trải qua 15 lần lột xác, sau mỗi lần thay đổi cả về hình dạng lẫn kích thước. Artemia có thể sinh sản lần đầu sau 8 ngày phát triển, thường là sau 12 – 15 ngày. Mỗi lần đẻ khoảng 300 trứng hoặc con, với chu kỳ đẻ 4 ngày/lần. Trong điều kiện tốt Artemia sống được vài tháng (6 tháng).[30] Hình 1. 21. Ấu trùng và trứng Artemia Nauplii 1.6.1.2. Trứng bào xác Cấu trúc gồm 2 phần vỏ trứng và phần phôi. Vỏ trứng gồm 3 lớp: lớp chlorin, lớp màng ngoài bì và lớp màng phôi. - Lớp chlorin cứng, màu nâu nhạt đến nâu đen. Lớp này có vai trò bảo vệ phôi khỏi bị tác động cơ học và phóng xạ. Khi bị oxy hóa bởi thuốc tẩy, lớp này sẽ bị phá hủy. - Lớp màng ngoài bì có tác dụng bảo vệ phôi không bị các phân tử lớn hơn phân tử CO2 xâm nhập vào. - Màng phôi là một lớp trong suốt và cách biệt với phôi bởi màng nội bì. Màng này sẽ biến thành màng nở trong quá trình trứng nở. 48
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Phôi là một phôi vị đồng nhất. Phôi sẽ ngừng trao đổi chất khi hàm lượng nước trong trứng dưới 10%. Khi hàm lượng nước trên 10% phôi sẽ bắt đầu hoạt động và trong điều kiện có oxy sẽ làm phá vỡ hệ enzym chuyên biệt trong trứng bào xác.[30] 1.6.1.3. Phương pháp sử dụng trứng bào xác Sự phát triển của trứng bào xác: sau khi ấp trứng từ 1 – 2 giờ, trứng sẽ hút nước. Sau 12 – 15 giờ vỏ trứng vỡ ra, xuất hiện tiền ấu trùng nằm trong màng nở. Khi màng nở vỡ ra. Ấu trùng sẽ bơi tự do trong nước. Các thông số môi trường về điều kiện nở trứng Artemia: - Nhiệt độ: thích hợp là 25 – 30oC. Dưới 25oC trứng chậm nở. Trên 35oC trứng ngừng trao đổi chất. - Độ mặn: Độ mặn 5 – 35‰ sẽ cho tỉ lệ nở và hiệu xuất cao hơn. Ấu trùng cũng chứa nhiều năng lượng hơn. - pH: thích hợp 8 – 8,5. - Oxy: Hàm lượng Oxy³ 2 mg/l. Do đó nên điều chỉnh tốc độ sục khí cho thích hợp. - Mật độ trứng ấp: Mật độ trứng ấp không nên quá 5 gr/l - Ánh sáng: Cường độ chiếu sáng trên mặt nước 2000 lux thì thích hợp nhất.[30] 1.6.2. Các chủng vi sinh vật thí nghiệm 1.6.2.1. SALMONELLA Về phân loại khoa học Vực (domain) Bacteria Liên giới(superregnum) Bacteria Giới (regnum) Bacteria Ngành (phylum) Proteobacteria Lớp (class) Gammaproteobacteria Bộ (ordo) Enterobacteriales Họ (familia) Enterobacteriaceae Chi (genus) Salmonella 49
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1. 22. Vi khuẩn Salmonella Samonella là một ví dụ kinh điển về ngộ độc thực phẩm. Đây là một loại trực khuẩn gram âm, kỵ khí tùy nghi, không sinh bào tử, di động bằng tiên mao. Salmonella không lên men lactose (trừ S. arizona) và sucrose nhưng lên men được dulcitol, mannitol và glocose. Chúng kém chịu nhiệt nhưng chịu được một số hóa chất: brilliant green, sodium lauryl sulfate, selenite Để có thể gây ngộ độc, số lượng Salmonella phải lên đến cả triệu tế bào trong 1 g thực phẩm. Có 3 dạng bệnh thực sự do Salmonella gây ra: sốt thương hàn do S.typhi, nhiễm trùng máu do S.cholera-suis, rối loại tiêu hóa do S.typhirium và S.enteritidis. Các triệu chứng do Salmonella gây ra chủ yếu là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn xuất hiện sau 12 – 36 giờ sau khi tiêu thụ thực phẩm nhiễm Salmonella. Các triệu chứng thường kéo dài 2 – 7 ngày.[5] 1.6.2.2. Staphylococcus aureus Phân loại khoa học Giới (regnum) Bacteria Ngành (phylum) Firmicutes Lớp (class) Bacilli Bộ (ordo) Bacillales Họ (familia) Staphylococcaceae Chi (genus) Staphylococcus 50
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1. 23. Vi khuẩn Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus là cầu khuẩn gram dương, hiếu khí, thường kết dạng chùm có mặt phổ biến ở khắp nơi thường thấy trên da, xoang mũi và tóc Staphylococcus aureus sản sinh ra một loại độc tố đường ruột enterotoxin bền nhiệt, không bị phân huỷ ở 1000C trong 30 phút. Khi ăn phải thực phẩm có chứa độc tố này, sau 4 – 6 giờ ủ bệnh sẽ bộc phát nên các triệu chứng lâm sàng như tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ 6 – 8 giờ.[5] Staphylococcus aureus cho phản ứng đông huyết tương dương tính do chúng tiết ra enzyme coagulase. Đây được xem là tính chất đặc trưng của S. aureus, là tiêu chuẩn để phân biệt Staphylococcus aureus với các tụ cầu khác. 1.6.2.3. Listeria monocytogenes Theo George M. Garrity, Julia A.Bell và Timothy G.Lilburn, phân loại học của Listeria spp. Trong giới vi sinh vật như sau: Giới (regnum) Bacteria Ngành (phylum) Firmicutes Lớp (class) Bacilli Bộ (ordo) Bacillales Họ (familia) Listeriaceae Chi (genus) Listeria 51
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 1. 24. Listeria monocytogenes Trong những năm gần đây, Listeria monocytogenes nổi lên như một tác nhân gây bệnh ở trẻ em, phụ nữ mang thai hay người già trong những năm gần đây. Đây là một loại trực khuẩn gram dương, ngắn, nhỏ không sinh bào tử, thường có kiểu chuyển động xoay tròn quanh trục thân thành từng đợt rất đặc trưng trong tiêu bản giọt treo. Listeria monocytogenes thuộc loại ưa lạnh, có thể phát triển ở nhiệt độ thấp đến 2,50C và cao đến 440C. Cách thức gây bệnh của Listeria monocytogenes hoàn toàn khác với các loài vi khuẩn gây bệnh khác. Các loài vi sinh vật gây bệnh khác chỉ gây bệnh khi con người hấp thu đủ liều lượng, sau thời gian ủ bệnh là có các triệu chứng lâm sàng biểu hiện. Ngược lại ở Listeria monocytogenes thì chỉ hiện diện với một sớ lượng nhỏ trong thực phẩm, khi được đưa vào cơ thể, chúng tồn tại và chờ cơ hội. Khi có điều kiện thuận lợi, chúng nhân lên xâm nhiễm và các mô sâu và gây bệnh. Các triệu chứng xuất hiện từ đường tiêu hóa như tiêu chảy, sốt nhẹ. Sau đó, chúng xâm nhiễm vào các đại thực.[5] 52
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.6.2.4. Escherichia Coli Phân loại khoa học Vực (domain) Bacteria Ngành (phylum) Proteobacteria Lớp (class) Gamma Proteobacteria Bộ (ordo) Enterobacteriales Họ (familia) Enterobacteriaceae Chi (genus) Escherichia Loài (species) E. Coli Hình 1. 25. Vi khuẩn Escherichia coli E.Coli là trực khuẩn gram âm, kỵ khí tùy nghi, không sinh bào tử, khá phổ biến trong tự nhiên đặc biệt trong đường tiêu hóa của con người và động vật. Hầu hết các dòng E.Coli tồn tại một cách tự nhiên và không gây hại trong đường tiêu hóa, chúng còn đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định đường tiêu hóa. Tuy nhiên, tồn tại ít nhất 4 dòng sau đây có thể gây bệnh cho người và cho động vật: - Enteropathogenic E.Coli (EPEC) - Enterotocigenic E.Coli (ETEC) - Enteroinvasive E.Coli (EIEC) - Enterohaemorrhagic E.Coli (EHEC) hoặc Verocytoxin E.Coli (VTEC) hay E.Coli O157:H& Như vậy, có thể được phân lập được dễ dàng ở khắp nơi trong môi trường sống, phân hoặc nước thải. Vi sinh vật này có thể tồn tại rất lâu trong môi trường. Với sự phân bố rộng rãi như vậy nên E.Coli cũng được dễ dàng phân lập từ các mẫu thực phẩm bị nhiễm nguyên liệu hay thông qua nguồn nước. 53
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Khi các dòng E.coli gây bệnh xâm nhập vào con người qua con đường tiêu hóa gây ra các bệnh rối loạn đường tiêu hóa, các biểu hiện lâm sàn có thể biểu hiện từ nhẹ đến rất nặng, có thể đe dọa mạng sống của con người tùy thuộc vào liều lượng, dòng gây nhiễm và mức độ đáp ứng của từng người.[5] 1.6.2.5. Pseudomonas aeruginosa - Phân loại Giới (regnum) Bacteria Ngành (phylum) Proteobacteria Lớp (class) Gamma Proteobacteria Bộ (ordo) Pseudomonadales Họ (familia) Pseudomonadaceae Chi (genus) Pseudomonas Loài (species) Pseudomonas aeruginosa Hình 1. 26. Pseudomonas aeruginosa Là trực khuẩn gram âm, di động, không sinh bào tử, đứng một mình hay thành đôi hoặc thành các chuỗi ngắn. Hình thể có thể thay đổi trong phase ổn định. Có khả năng tiết ra nhiều loại sắc tố bao gồm: pyocyanin, fluorescein, pyoverdin. Thường gây bệnh nhiễm khuẩn tai, mắt, vết thương, vết bỏng, đường tiểu, đường hô hấp. Chúng cũng gây nhiễm khuẩn huyết và viêm màng não.[5] 54
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 55
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ tháng 3 năm 2016 đến tháng 7 năm 2016 tại trung tâm thí nghiệm Công nghệ sinh học trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh. 2.2. Vật liệu nghiên cứu - Lá sắn thu hái tại thị xã Long Khánh, tỉnh Đồng Nai. - Lá sắn thu hái lúc 9 – 10 giờ sáng, lá trưởng thành. Hình 2. 1. Lá cây củ đậu 2.3. Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm 2.3.1. Dụng cụ - Bộ chiết Soxhlet - Bộ lôi cuốn hơi nước - Bể điều nhiệt - Bếp đun cách thủy - Cân phân tích - Máy quang phổ UV – Vis 2000, máy lắc - Bộ sục khí 56
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Pipet, micropipet, ống nhỏ giọt, đũa thủy tinh, que cấy trang - Tủ ủ 37oC, tủ sấy 101oC, bình hút ẩm - Ống nghiệm sạch, erlen - Cốc thủy tinh, ly nhựa trong - Kính đồng hồ - Đĩa petri sạch 2.3.2. Hóa chất - Thuốc thử Folin – Ciocateau của hãng Sigma; Dung dịch Na2CO3 bão hòa - Dung dịch AlCl3 2%; nước cất - 1% NaOH/etanol 96o - Etanol 96o, 90o, 70o; acetone - Chloroform, axit sunfuric đặc, natri nitrit - Muối biển 2.4. Phương pháp Đề tài sử dụng các phương pháp nghiên cứu sau: - Phương pháp nghiên cứu lý thuyết: thu thập, chọn lọc và nghiên cứu các tài liệu liên quan đến cơ sở của đề tài như: tổng quan về cây củ đậu và các hợp chất thứ cấp có trong lá, phương pháp tách chiết, phương pháp đánh giá độc tính, kháng khuẩn, sinh vật thử nghiệm - Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm: tiến hành triển khai các nội dung thí nghiệm, thiết kế, bố trí các nghiệm thức (xem sơ đồ), theo dõi và ghi nhận kết quả các thí nghiệm. - Phương pháp xử lý số liệu: dùng các phần mềm SAS, excel để tiến hành phân tích kết quả nghiên cứu, nhằm đưa ra kết luận cho các nội dung và các thí nghiệm nghiên cứu. - Phương pháp so sánh, đối chiếu: từ kết qủa thực nghiệm đạt được sẽ tiến hành so sánh với cơ sở khoa học liên quan cũng như đối chiếu với kết quả của các công trình nghiên cứu khác nhằm đưa ra kết luận cho đề tài. 57
2.5. Acetone Dung môi tách Thu nhận cao chiết từ lá củ o chiết Etanol 90 N Thu nhận cao chiết từ lá củ ộ đậu bằng các phương pháp i dung đậu bằng các phương pháp và dung môi khác nhau Phương pháp tách Ngâm dầm chiết thí nghi Chiết Soxhlet Flavonoid ệ Flavonoid m Định tính một số HCTC Định tính một số HCTC Đ Rotenone Ồ ÁN T Nội dungNội dung nghiên nghiên cứu Ố 58 Polyphenol tổng cứu Polyphenol tổng T NGHI Định lượng một số HCTC Flavonoid tổng Ệ Pseudomonas P Hàm lượng chất Hàm lượng chất aeruginosa khô Staphylococcus aureus Thử độc tính ArtemiaArtemia NaupliiNauplii Listeria monocytogenes Salmonella Kháng khuẩn Enterotoxigenic E.Coli Sơ đồ 2. 1. Nội dung thí nghiệm
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.5.1. Phương pháp tách chiết và thu cao chiết 2.5.1.1. Sơ đồ quy trình Lá sắn phơi trong bóng râm Nghiền nhỏ Ngâm dầm Chiết soxhlet to phòng, 50 – 80oC, 8h 24h Etanol 90o Acetone Etanol 90o Acetone Thu dịch chiết Lọc Cô dịch chiết loại dung môi Cao chiết Sơ đồ 2. 2. Quá trình tách chiết và thu cao chiết từ lá củ đậu 59
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.5.1.2. Thuyết minh quy trình  Nguyên liệu Lá củ đậu được thu hái vào khoảng 9 – 10 giờ sáng. Lựa chọn những lá xanh và loại bỏ những lá vàng héo, rửa sạch, phơi khô trong bóng râm. Sử dụng 100 g lá củ đậu cho quá trình tách chiết.  Nghiền Sử dụng cối sứ nghiền nhỏ lá củ đậu. Quá trình nghiền sẽ phá vỡ tế bào lá, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tách chiết.  Tách chiết Chiết các hợp chất có trong lá củ dậu nhờ dung môi etanol 90o và acetone, sử dụng hai phương pháp là ngâm dầm và chiết với bộ Soxhlet, nhằm khảo sát dung môi và phương pháp nào phù hợp với từng đối tượng lá củ đậu. Cách thực hiện : - Ngâm dầm Cân 100 g lá củ đậu sau khi nghiền nhỏ và 300 ml dung môi cho vào erlen 1000 ml, sử dụng hai loại dung môi là etanol 90o và acetone, đậy kín miệng và bọc vải đen xung quanh bình erlen. Quá trình chiết được diễn ra trong thời gian 24 giờ, trên máy lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ phòng. Hình 2. 2. Phương pháp ngâm dầm 60
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Chiết Soxhlet Cân 100 g lá củ đậu sau khi nghiền nhỏ vào một túi vải mỏng và lấp vào hệ thống chiết Soxhlet, bình cầu chứa 300 ml lần lượt các dung môi etanol 90o và acetone. Phải đảm bảo hệ thống được lắp đặt kín, luôn có nước ở ống sinh hàn. Quá trình chiết được diễn ra trong thời gian 8 giờ, nhiệt độ của quá trình chiết phụ thuộc vào nhiệt độ bay hơi của dung môi, đối với etanol 90o là 80oC và acetone là 56oC. Hình 2. 3. Phương pháp chiết Soxhlet  Lọc Để thu hồi dịch chiết cần phải qua khâu lọc thô để loại cặn lá lẫn trong dịch chiết, sử dụng giấy lọc và máy hút chân không để lọc nhanh dịch chiết, thu dịch trong để chuẩn bị quá trình loại dung môi.  Cô dịch chiết Nhằm thu hồi dung môi etanol 90o, acetone để tái sử dụng và thu cao chiết cho thí nghiệm. Sử dụng bộ lôi cuốn hơi nước để tách dung môi ra khỏi dịch chiết ở nhiệt độ 50 – 80oC, cô đến khi dịch chiết còn thể tích là V = 50 ml. Thu được cao chiết dạng lỏng và đậm đặc. 61
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 2.5.2. Phương pháp định tính một số hợp chất thứ cấp trong lá cây củ đậu 2.5.2.1. Flavonoid  Nguyên tắc Flavonoid thường tan trong etanol và nhóm OH trong flavonoid thường tạo phức với AlCl3, NaOH, KOH, cho màu vàng.  Dụng cụ và hóa chất: - Ống nghiệm sạch - 1% NaOH/etanol 96o  Tiến hành: Nhỏ khoảng 2 ml mẫu vào 6 ml 1% NaOH/etanol 96o, dung dịch sẽ có màu vàng đến cam đỏ. Nếu là flavon, isoflavon, isoflavanon, flavanon, chalcon, leucoantocanidin sẽ có màu vàng. Flavonol cho màu từ vàng đến cam. Auron cho màu đỏ đến đỏ tím.[6] 2.5.2.2. Rotenone  Dụng cụ và hóa chất - Kính đồng hồ - Chloroform, axit sunfuric đặc, natri nitrit  Tiến hành Định tính rotenone trong bên trong lá bằng phương pháp Durham Howard Ngâm 0,5 g lá cây củ đậu nghiền nhỏ với 5 ml chloroform khoảng 30 phút, lọc. Phần lọc được cô khi trên kính đồng hồ, thêm 2 giọt axit sunfuric đặc sẽ xuất hiện màu vàng nâu và nâu tím sau khi thêm 1 vài hạt natri nitrit.[7] 62
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 2. 4. Ngâm lá với chloroform và dịch chiết sau khi cô trên kính đồng hồ Định tính rotenone trong cao chiết lá cây củ đậu Hút 5 ml cao chiết và cô khi trên kính đồng hồ, thêm 2 giọt axit sunfuric đặc sẽ xuất hiện màu nâu tím và ngả màu vàng nâu sau khi thêm 1 vài hạt natri nitrit. Hình 2. 5. Các loại cao chiết trên kính đồng hồ 2.5.3. Phương pháp định lượng một số hợp chất thứ cấp trong lá củ đậu 2.5.3.1. Xác định hàm lượng chất khô bằng phương pháp cân và sấy  Nguyên tắc: Xác định hàm lượng chất khô gián tiếp dựa vào khối lượng xác định ban đầu (khối lượng cốc sứ hoặc đĩa petri) và khối lượng sau khi làm bay hơi hàm lượng ẩm, nước kết tinh hoặc các tập chất bay hơi khác bằng phương pháp cân và sấy. 63
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Tiến hành: - Hút 1ml dịch mẫu vào đĩa petri sạch đã được sấy khô và biết rõ khối lượng. Cho đĩa vào tủ sấy nhiệt độ 101oC trong 45 phút. Sau đó, cân lại đĩa petri và ghi nhận khối lượng mới của đĩa petri. - Tiếp tục cho đĩa petri vào tủ sấy cho đến khi khối lượng không đổi. - Quan sát, ghi nhận và tính toán kết quả theo công thức Hàm lượng chất khô = a – b (g/ml) a: Khối lượng đĩa petri và 1 ml mẫu sau khi sấy khô đến không đổi. b: Khối lượng đĩa petri ban đầu. 2.5.3.2. Định lượng polyphenol tổng số  Nguyên tắc: dựa vào phản ứng oxy hóa của các polyphenol với thuốc thử Folin - Ciocateau, tạo ra sản phẩm có màu xanh lam. Đo độ hấp thụ ánh sáng dung dịch màu xanh lam ở bước sóng λ = 765 nm. Hàm lượng polyphenol được tính toán theo đường chuẩn acid Gallic.[15]  Đường chuẩn acid Gallic: - Chuẩn bị các dung dịch acid Gallic có các nồng độ khác nhau: 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 mg/ml, - Cho 60 휇푙 mỗi nồng độ vào ống nghiệm sạch đã có 4,74 ml nước cất, sau đó cho 300 휇푙 thuốc thử Folin - Ciocateau vào và trộn đều. Sau khoảng 30 giấy đến 8 phút cho vào 900 휇푙 dung dịch Na2CO3 20%, lắc đều. Hỗn hợp phản ứng được giữ ở 400C trong vòng 30 phút. So màu ở bước sóng λ = 765 nm - Đối với mẫu nghiên cứu, pha loãng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất nghiên cứu có phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn) rồi làm thí nghiệm như trên, hàm lượng polyphenol được tính toán dựa theo đường chuẩn acid Gallic trên.  Thí nghiệm:  Dụng cụ và hóa chất - Ống nghiệm sạch - Thuốc thử Folin – Ciocateau, Na2CO3 bão hòa 64
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Tiến hành 10ml H20 1ml mẫu 1ml H20 1ml mẫu 1ml H20 1 10-1 1 2 2 ĐC -1 10 -2 10 120µl H2O 120µl 120µl 9,5ml H20 3 4 5 3 4 5 600µl Folin-Ciocateau 3 4 5 Đo OD Sơ đồ 2. 3. Quy trình định lượng polyphenol tổng Chuẩn bị 2 ống nghiệm, mỗi ống chứa 10ml H2O. - Ống nghiệm 1: Hút bỏ 1 ml H2O thay bằng 1 ml mẫu => pha loãng mẫu thành nồng độ 10-1. -1 - Ống nghiệm 2: Hút bỏ 1 ml H2O thay bằng 1 ml mẫu ở nồng độ 10 để tiếp tục pha loãng mẫu thành nồng độ 10-2. Mỗi loại cao chiết được thí nghiệm ở 2 nồng độ 10-1 và 10-2. Chuẩn bị 3 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9,5 ml H2O. - Ống nghiệm 3: Thêm vào 120 µl mẫu nồng độ 10-1. - Ống nghiệm 4: Thêm vào 120 µl mẫu nồng độ 10-2. - Ống nghiệm 5: Thêm vào 120 µl H2O làm mẫu đối chứng. Sau đó, thêm vào 3 ống nghiệm mỗi ống nghiệm 600 µl thuốc thử Folin – o Ciocateau và 1,8 ml Na2CO3 bão hòa, ủ ở 40 C trong thời gian 30 phút. Đo độ hấp 65
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP thụ ánh sáng ở bước sóng 765 nm. Quan sát, ghi nhận lựa chọn kết quả khả quan và tính toán kết quả dựa trên đường chuẩn acid Galic. 2.5.3.3. Định lượng flavonoid tổng số  Nguyên tắc: Đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch khi phản ứng với AlCl3 tại bước sóng λ = 420 nm; tạo ra dung dịch có màu vàng (theo phương pháp của Woisky and Salatino).  Dựng đường chuẩn Rutin - Pha các dung dịch Rutin chuẩn bằng etanol 960 theo dãy nồng độ sau: 0; 0,0125; 0,025; 0,05; 0,075; 0,1 (mg/ml) - Hút 2 ml từ mỗi nồng độ vào 6 ống nghiệm sạch - Thêm 2 ml dung dịch AlCl3 2% - Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 giờ, So màu ở bước sóng λ = 420 nm, - Đối với mẫu nghiên cứu, pha loãng tới nồng độ thích hợp (nồng độ chất nghiên cứu có phản ứng màu nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn) rồi làm thí nghiệm như trên, hàm lượng flavonoid được tính toán dựa theo đường chuẩn Rutin.  Tiến hành: - Pha các dịch mẫu về nồng độ 0,5 mg/ml hàm lượng chất khô. - Hút 2 ml của từng dịch mẫu vào 4 ống nghiệm sạch và 2 ml H2O vào một ống nghiệm khác làm mẫu đối chứng. Tiếp tục hút 2 ml AlCl3 2% vào các ống nghiệm trên. Các ống nghiệm chứa dịch mẫu sẽ xuất hiện màu vàng. - Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 giờ. Sau đó, đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch ở bước sóng λ = 420 nm. - Quan sát, ghi nhận và tính toán kết quả dựa vào đường chuẩn Rutin. 2.5.4. Phương pháp đánh giá độc tính  Dụng cụ và hóa chất: - Bình erlen 1000 – 2000ml. - Hệ thống sục khí - Đèn chiếu sáng hoặc nơi có ánh sáng vừa đủ 66
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Muối biển, nước máy hoặc nước cất - Trứng Artemia Nauplii  Các bước tiến hành như sau: - Bước 1: ấp nở ấu trùng Artemia Nauplii Cân 0,5g trứng Artemia Nauplii cho vào môi trường nước biển có độ mặn từ 0 15 – 35 /00, pH 7,5 – 8,5, 0,5 trứng/1 lít nước biển, ấp trứng trong điều kiện sục khí liên tục trong vòng 20 giờ ở nơi thoáng mát, có ánh sáng, nhiệt độ khoảng 28 – 290C. Ấu trùng sau khi nở được sử dụng để thử độc tính của cao chiết. - Bước 2: Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, đơn yếu tố, lặp lại 3 lần ở mỗi nghiệm thức, mỗi ô nghiệm thức là 1 cốc nhựa chứa 30 ấu trùng Artemia Nauplii và khoảng 20 ml dịch. Để xác định nồng độ gây chết LC50 của chế phẩm ta bố trí: cao chiết được pha loãng thành dãy các dãy nồng độ phù hợp (tương ứng với 7 nghiệm thức). Bảng 2. 1. Bố trí thí nghiệm thử độc tính trên Artemia Nauplii Nồng độ 0,03 – 0,15% Đối chứng 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml Thí nghiệm 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml Thí nghiệm 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml Thí nghiệm 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml Ở mỗi cốc cho vào chính xác 30 con ấu trùng Artemia Nauplii và hút bỏ lần lượt 100 µl, 200 µl, 300 µl, 400 µl, 500 µl dịch đã hút tương ứng với các nghiệm thức 0,5%, 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5% nồng độ cao chiết. Ở mẫu đối chứng hút hoàn lại thể tích đã hút bỏ bằng etanol 90o hoặc acetone tùy vào dung môi sử dụng để chiết, còn ở các mẫu thử nghiệm thì hút hoàn lại thể thích đã hút bỏ bằng mẫu chứa cao chiết. Để yên trong vòng 2 giờ. 67
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Hình 2. 6. Bố trí thí nghiệm thử độc tính trên ấu trùng Artemia Nauplii - Bước 3: Xử lí số liệu Đếm số lượng ấu trùng Artemia Nauplii sống, ghi nhận và tìm số con chết trong từng nghiệm thức, chia lấy giá trị trung bình cho từng nghiệm thức rồi lấy kết quả vẽ đường chuẩn cho độc tính cao chiết và tính giá trị LC50 dựa trên phương trình đường chuẩn % tử vong với nồng độ cao chiết và bằng phương pháp Probit.[12] 2.5.5. Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn 2.5.5.1. Sơ đồ quy trình  Nguyên tắc Các hợp chất kháng khuẩn có trong cao chiết sẽ khuếch tán vào trong môi trường thạch và tác động lên các vi sinh vật chỉ thị. Nếu cao chiết có khà năng tiêu diệt vi khuẩn thì sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch. Từ đó, xác định được hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết bằng đường kính vòng kháng khuẩn (mm).[8] 68
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Sơ đồ quy trình Giống vi khuẩn Tăng sinh trong NB Pha loãng Cấy trang trên NA Đục lỗ thạch Nhỏ cao chiết, nhỏ kháng sinh ĐC Ủ 37oC, 24 giờ Đo kích thước vòng kháng khuẩn và chụp hình Sơ đ ồ 2. 4. Quy trình đánh giả khả năng kháng khuẩn của cao chiết lá củ đậu 2.5.5.2. Thuyết minh quy trình  Chuẩn bị giống vi khuẩn Chuẩn bị 5 loại vi khuẩn: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterotoxigenic E.Coli, salmonella, Listeria monocytogenes.  Chuẩn bị môi trường Môi trường tăng sinh: sử dụng môi trường NB. Hút 10 ml NB vào 7 lọ nhỏ để hấp khử trùng 1210C, 1 atm, 15 phút. Để nguội đến nhiệt độ phòng sau đó cấy Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterotoxigenic E.coli, Salmonella, Listeria monocytogenes lần lượt vào 6 lọ, còn lọ cuối dùng để set máy. Sau đó mang đi lắc 24 giờ. 69
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Thạch nền: sử dụng môi trường NA. Hấp khử trùng môi trường 1210C, 1 atm, 15 phút. Để nguội đến khoảng 500C đến 600C sau đó đổ vào các đĩa petri đã tiệt trùng. Để nguội sau đó úp ngược đĩa pitri lại.[31] Kháng sinh đối chứng: pha dung dịch thuốc kháng sinh Amoxicillin 1%, nếu thuốc không tan trong nước thì hòa tan với DMSO. Dung dịch để bảo quản trong tủ lạnh. Chuẩn bị 10 ống nước muối sinh lý 0,9%, mỗi ống 10 ml, 2 chai nước cất hấp khủ trùng 1210C, 1 atm, 15 phút.  Tiến hành Lấy khoảng 2 ml sinh khối vi khuẩn đem đo OD. Mật độ vi sinh vật được tính theo công thức: c = A/(e.l) (cfu/ml) A: Độ hấp thụ e: bước sóng l: chiều dài cuvetle c: mật độ vi khuẩn Hút 0.1 ml dịch vi khuẩn đã được hoạt hóa và đạt mật độ 106 cfu/ml lên mặt thạch NA và tiến hành trang đều cho tới khô. Sau đó tạo 6 giếng có đường kính 6 mm trên đĩa thạch và nhỏ 100 µl cao chiết vào 3 giếng và cao chiết khác vào 3 giếng còn lại, mẫu đối chứng sẽ thay thế cao chiết bằng kháng sinh, giữ yên trong vòng 1 giờ để cao chiết và kháng sinh có thể khuếch tán vào môi trường thạch. Cuối cùng, các đĩa được đem ủ trong tủ ủ 370C trong 24 giờ và tiến hành đọc kết quả thông qua việc đo đường kính vòng ức chế (mm).  Ghi nhận và xử lý số liệu Đối với thạch đục lỗ: dùng micropipet hút hết nước nếu có trong giếng thạch, dùng thước đo vòng kháng khuẩn (tính bằng mm) và chụp hình. Mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với dịch chiết được phân loại dựa theo đường kính vòng kháng khuẩn: Đường kính vòng kháng khuẩn < 8 mm: không tốt Đường kính vòng kháng khuẩn từ 9 - 14 mm: tốt 70
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Đường kính vòng kháng khuẩn 15 - 19 mm: rất tốt Đường kính vòng kháng khuẩn >20 mm: cực tốt (theo Celikel và Kavas, 2008) 71
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 72
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thu nhận cao chiết từ lá củ đậu bằng các phương pháp và dung môi khác nhau Sau quá trình tách chiết và thu hồi dung môi thu được 4 loại cao chiết, mỗi loại cao chiết thu hồi được khoảng V = 50ml. Cao chiết có màu nâu, dạng lỏng, đậm đặc do ảnh hưởng bởi một số yếu tố như nước liên kết và nước tự do, một số hàm lượng ẩm trong lá và tỉ lệ dung môi thấp. Cao chiết thu được phải được để trong chai, lọ tối màu hoặc bọc bằng vải có màu đen, đậy kín miệng, gắn nhãn, bảo quản ở nhiệt độ phòng, để trong bóng râm và tránh ánh sáng, kể cả ánh sáng trắng và màu. Kí hiệu các loại cao chiết như sau: - A: cao chiết lá củ đậu sử dụng dung môi acetone và phương pháp chiết Soxhlet. - B: cao chiết lá củ đậu sử dụng dung môi acetone và phương pháp ngâm dầm. - C: cao chiết lá củ đậu sử dụng dung môi etanol 90o và phương pháp chiết Soxhlet. - D: cao chiết lá củ đậu sử dụng dung môi etanol 90o và phương pháp ngâm dầm. Hình 3. 1. 4 loại cao chiết 73
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.2. Định tính một số hợp chất thứ cấp trong lá củ đậu 3.2.1. Định tính flavonoid  Thí nghiệm Hình 3. 2. Cao chiết chuyển từ nâu sang vàng sau khi cho 1% NaOH/etanol 96o  Kết quả và nhận xét Khi cho 1% NaOH/etanol 96o vào cao chiết, cao chiết từ màu nâu chuyển sang màu vàng. Kết luận: có sự hiện diện của flavonoid có thể là flavon, isoflavon, isoflavanon, flavanon, chalcon, leucoantocanidin trong cao chiết. Sự biến đổi màu sắc đậm nhạt tùy theo dung môi và phương pháp sử dụng đề tách chiết. Quan sát màu vàng của dung dịch có thể nhận thấy cao chiết A và B có màu vàng như nhau, cao chiết D có màu vàng nhạt hơn so với A, B và C và màu vàng đậm hiện rõ ở cao chiết C. Như vậy: Cao chiết C sử dụng dung môi là etanol 90o và chiết bằng phương pháp Soxhlet có khả năng tách chiết được nhiều flavonoid nhất so với các dung môi và phương pháp chiết thử nghiệm khác; cao chiết A và B sử dụng dung môi acetone lần lượt chiết bằng 2 phương pháp chiết Soxhlet, ngâm dầm cho hiệu quả tách chiết flavonoid tương đương nhau và thấp hơn C nhưng cao hơn D. D sử dụng dung môi etanol 90o và phương pháp ngâm dầm là thấp nhất so với các các dung môi và phương pháp khác. 74
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.2.2. Định tính rotenone  Thí nghiệm Lá củ đậu Hình 3. 3. Dịch chiết có màu tím khi nhỏ 1 giọt H2SO4đđ và thêm vài hạt natri nitrit Sau khi nhỏ H2SO4 đặc vào dịch chiết lá củ đậu với clorofrom đã được cô cạn trên kính đồng hồ, dịch chiết chuyển sang màu vàng và tiếp tục cho vài hạt natri nitrit vào, dịch chiết xuất hiện màu nâu tím. Kết luận: Có rotenone trong lá cây củ đậu. Cao chiết Hình 3. 4. Cao chiết có màu tím khi nhỏ 1 giọt H2SO4đđ và thêm vài hạt natri nitrit Sau khi nhỏ H2SO4đđ vào 4 loại cao chiết lá củ đậu đã được cô cạn trên kính đồng hồ, cao chiết chuyển sang màu vàng và tiếp tục cho vài hạt natri nitrit vào, cao chiết xuất hiện màu nâu tím. Kết luận: Có rotenone trong 4 loại cao chiết.  Kết quả Bảng 3. 1. Kết quả định tính một số hợp chất thứ cấp trong cao chiết và lá củ đậu 75
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Nhóm hợp Loại cao chiết Thuốc thử chất thứ cấp A B C D Lá Flavonoid 1% NaOH/etanol 90o ++ ++ +++ ++ +++ Rotenone H2SO4 đặc và vài hạt natri nitrit ++ ++ ++ ++ ++ Ghi chú: (-): Không có; (±): Nghi ngờ, (+): Có ít, (++): Có, (+++): Có nhiều 3.3. Định lượng một số hợp chất thứ cấp và chất khô trong các loại cao chiết 3.3.1. Hàm lượng chất khô  Hàm lượng chất khô trong cao chiết A: Hàm lượng chất khô = 32,817 – 32,791 = 0,026 (g/ml)  Hàm lượng chất khô trong cao chiết B: Hàm lượng chất khô = 48,597 – 48,569 = 0,028 (g/ml)  Hàm lượng chất khô trong cao chiết C: Hàm lượng chất khô = 37,006 – 36,895 = 0,111 (g/ml)  Hàm lượng chất khô trong cao chiết D: Hàm lượng chất khô = 34,886 – 34,847 = 0,039 (g/ml)  Kết quả Bảng 3. 2. Kết quả hàm lượng chất khô của các loại cao chiết Cao chiết A B C D Hàm lượng chất khô (g/ml) 0,026 0,028 0,111 0,039 3.3.2. Định lượng polyphenol tổng số  Thí nghiệm 76
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Xây dựng đường chuẩn Acid Gallic - Acid Gallic là chất chuẩn được sử dụng để tính toán hàm lượng polyphenol tồng số. - Sau khi ủ ở nhiệt độ 400C, dung dịch có màu xanh lam và được đo độ hấp thu ánh sáng tại bước sóng λ = 765 nm. Hình 3. 5. Dung dịch dựng đường chuẩn Acid Gallic Bảng 3. 3. Kết quả đường chuẩn Acid Gallic Nồng độ AG (µg/l) 1 2 3 4 5 OD765nm 0,126 0,215 0,297 0,393 0,483 Tiến hành trên các loại cao chiết Hình 3. 6. Màu nâu vàng sang xanh lam của cao chiết sau khi ủ ở 40oC 77
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Kết quả Hình 3. 7. Đường chuẩn Acid Gallic Từ đường chuẩn trên, ta tính được hàm lượng polyphenol tổng số của các cao chiết tách chiết từ các dung môi và phương pháp khác nhau. Bảng 3. 4. Kết quả hàm lượng polyphenol tổng trong 4 loại cao chiết lá củ đậu Loại cao chiết A B C D Hàm lượng polyphenol tổng 323,27b ± 16,72 279,53b ± 43,88 786,25a ± 59,86 293,8b ± 53,41 (mg GE/g db)  Nhận xét: 323.27 279.53 786.25 293.8 A B C D Hình 3. 8. Sự chênh lệch hàm lượng polyphenol tổng số của 4 loại cao chiết 78
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Dựa vào sơ đồ hình 3.8 nhận thấy rõ sự chênh lệch hàm lượng polyphenol tổng của 4 loại cao chiết. Cao chiết C có hàm lượng polyphenol tổng số cao nhất với 786,25 mgGE/g db và vượt hơn hẳn trong 4 loại, tiếp đến là cao chiết A có 323,27 mgGE/g db, cao chiết D là 293,8 mgGE/g db có sự giảm nhẹ so với cao chiết A và lượng polyphenol tổng số thấp nhất 279,53 mgGE/g db là cao chiết B. Cao chiết C có hàm lượng polyphenol cao và gần như gấp 3 lần các cao chiết còn lại. Có thể vì ảnh hưởng một số lí do như: - Cao chiết C sử dụng dung môi etanol 90o để tách chiết các hợp chất thứ cấp, dung môi này có độ phân cực cao hòa tan được nhiều polyphenol đều là hợp chất phân cực, có thể hòa tan tốt trong dung môi phân cực. - Phương pháp chiết Soxhlet là một phương pháp có ưu điểm là chiết kiệt được các hợp chất thứ cấp vì sự tuần hoàn trong thiết bị giúp cho lá củ đậu được chiết liên tục bằng dung môi tinh khiết và nhiệt độ tách chiết cao hơn nhiệt độ phòng. Cùng phương pháp chiết kiệt đó nhưng cao chiết A lại sử dụng dung môi tách chiết là acetone, dung môi có độ phân cực thấp, có thể hòa tan tốt một số flavonoid có độ phân cực trung bình và thấp như rotenone Vì vậy, hàm lượng polyphenol tổng số trong cao chiết A thấp hơn cao chiết C. Hai loại cao chiết còn lại là B và D sử dụng chung phương pháp ngâm dầm nên sự chênh lệch không cao nhưng cao chiết D sử dụng dung môi etanol 90o vẫn hòa tan được nhiều hợp chất polyphenol tổng số hơn và hàm lượng cao hơn cao chiết B.  So sánh với cơ sở khoa học Polyphenol tan trong etanol nóng do dung môi etanol có khả năng ức chế hoạt tính của enzyme phenolase có sẳn trong cây, kết hợp với nhiệt độ trong quá trình chiết có thể làm giảm và biến tính enzyme này, ngăn chặn sự thủy phân polyphenol trong lá. Vì vậy, Phương pháp chiết Soxhlet với dung môi etanol 90o là đạt hiệu quả tốt nhất.  So sánh với các tài liệu nghiên cứu khác 79
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP So sánh với một số kết quả nghiên cứu hàm lượng polyphenol tổng có trong lá của một số loài thực vật khác. Kết quả hàm lượng polyphenol tổng số cao nhất trong lá củ đậu là 786,25 mgGE/g db. Kết quả này so sánh với hàm lượng polyphenol trong lá Diệp hạ châu được công bố trên Tạp chí khoa học và phát triển 2014, tập số 12, số 3:412-421/J.ci. & Devel. Vol 12, No. 3:412-421, trong cùng điều kiện thí nghiệm lớn hơn rất nhiều. Trong tạp chí này, hàm lượng polyphenol tổng số cao nhất trong lá Diệp hạ châu là 217 mgGE/g db. Nhưng khi so sánh với các hàm lượng polyphenol tổng số còn lại là 323,27 mgGE/g db, 293,8 mgGE/g db, 279,53 mgGE/g db thì hàm lượng polyphenol của lá củ đậu và lá Diệp hạ châu tương đương nhau.[10] Trên cùng một tờ tạp chí, hàm lượng polyphenol của 6 loại lá cũng được công bố trên Tạp chí khoa học và phát triển 2013, tập số 11, số 3:364-372/J.ci. & Devel. Vol 11, No. 3: 364-372. Trong tạp chí này, hàm lượng polyphenol tổng số cao nhất trong là lá Trầu không với 188,19 mgGE/g db, theo sau là lá ổi và lá trà xanh với hàm lượng tương ứng là 146,5 mgGE/g db. Lá nhàu, lá lốt, lá khoai lang có hàm lượng polyphenol thấp nhất 11,7, 39,3 và 60,7 mgGE/g db. So với kết quả hàm lượng polyphenol trong lá củ đậu đều thấp hơn.[9] Polyphenol là một trong những thành phần quan trọng nhất và chiếm tỉ lệ lớn trong thực vật nói chung. Đây là chất chống oxi hóa mạnh, và có khả năng kháng khuẩn cao. Vì vậy, chỉ tiêu này khá quan trọng trong nghiên cứu đánh giá khả năng kháng khuẩn của cao chiết. Polyphenol bảo vệ thực vật khỏi sự tấn công của các loài vi sinh vật, và có một số mang độc tính với côn trùng và động vật ăn cỏ. 3.3.3. Định lượng Flavonoid tổng số  Thí nghiệm Xây dựng đường chuẩn Rutin - Dung dịch Rutin chuẩn ban đầu được pha loãng thành các nông độ thích hợp, cho phản ứng với AlCl3, phản ứng cho hỗn hợp màu vàng từ nhạt đến đậm, so màu ở bước sóng λ= 420 nm. 80
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP - Độ đậm nhạt của dịch màu tùy thuộc nồng độ Rutin. Hình 3. 9. Dung dịch Rutin chuẩn Bảng 3. 5. Bảng kết quả đường chuẩn Rutin Nồng độ Rutin (mg/ml) 0,0625 0,125 0,25 0,375 0,5 OD420nm 0,053 0,151 0,283 0,401 0,526 Mẫu thí nghiệm được pha loãng thành nồng độ 0,5mg/ml và cho phản ứng với dung dịch AlCl3, Từ phương trình đường chuẩn Rutin, ta tiến hành tính toán hàm lượng Flavonoid tổng số. Tiến hành trên các loại cao chiết Hình 3. 10. Đo hàm lượng flavonoid tổng số của cao chiết 81
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Kết quả Bảng 3. 6. Bảng kết quả hàm lượng flavonoid tổng số trong 4 loại cao chiết Loại cao chiết A B C D Hàm lượng flavonoid tổng 16,64b ± 0,26 14,93b ± 0,3 52,91a ± 2,31 16,51b ± 1,58 (mgRE/g db) Hình 3. 11. Đường chuẩn Rutin  Nhận xét: 16.64 14.93 52.91 16.51 A B C D Hình 3. 12. Sự chênh lệch hàm lượng flavonoid tổng số của 4 loại cao chiết 82