›

Đồ án Nghiên cứu tạo chế phẩm Nucleopolyhedrosis virus (NPV) để phòng trừ sâu khoang Spodoptera litura

pdf 80 trang thiennha21 13/04/2022 6120
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Nghiên cứu tạo chế phẩm Nucleopolyhedrosis virus (NPV) để phòng trừ sâu khoang Spodoptera litura", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_nghien_cuu_tao_che_pham_nucleopolyhedrosis_virus_npv_d.pdf

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu tạo chế phẩm Nucleopolyhedrosis virus (NPV) để phòng trừ sâu khoang Spodoptera litura

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH VIỆN KHOA HỌC ỨNG DỤNG HUTECH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM Nucleopolyhedrosis virus (NPV) ĐỂ PHÒNG TRỪ SÂU KHOANG Spodoptera litura Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN THỊ HAI Sinh viên thực hiện: HUỲNH THỊ NGỌC DIỆU MSSV: 1411100016 Lớp: 14DSH01 TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2018.
  2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của chúng em dưới sự hướng dẫn của tiến sĩ Nguyễn Thị Hai Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH của trường Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Những kết quả này hoàn toàn không sao chép từ các nghiên cứu khoa học khác dưới bất kỳ hình thức nào. Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm Sinh viên thực hiện Huỳnh Thị Ngọc Diệu
  3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, chúng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình chúng em đã tạo điều kiện cho chúng em học tập để chúng em có thành quả như ngày hôm nay. Trong suốt khoảng thời gian học tại trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, chúng em đã được các thầy cô trong Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH đã hết lòng hướng dẫn và giúp đỡ chúng em trong quá trình học tập tại trường, cũng như trong quá trình thực hiện đồ án. Chúng em xin chân thành cám ơn đến Thầy Cô, nhờ có Thầy Cô đã trang bị kiến thức cho chúng em để có thể thực hiện đồ án này. Chúng em cũng xin cảm ơn Thầy Cô trong phòng thí nghiệm và các bạn cùng khóa đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện để chúng em hoàn thành đồ án tốt nghiệp. Đặc biệt, chúng em xin chân thành cảm ơn Tiến sĩ Nguyễn Thị Hai đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo chúng em trong suốt quá trình thực hiện đồ án. Cuối cùng, chúng em xin cảm ơn các Thầy Cô trong hội đồng Phản Biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án tốt nghiệp này. Chúng em xin gửi đến Thầy Cô lời chúc sức khỏe trân trọng nhất. Trong quá trình làm đồ án, do kinh nghiệm còn thiếu và kiến thức chưa đầy đủ, nên có nhiều thiếu sót, mong các thầy cô bỏ qua. Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm Sinh viên thực hiện Huỳnh Thị Ngọc Diệu
  4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Giới thiệu về sâu khoang Spodoptera litura 3 1.1.1 Đặc điểm hình thái 3 1.1.2 Đặc điểm sinh học và sinh thái 4 1.1.3 Mức độ gây hại 6 1.1.4 Biện pháp phòng trừ 6 1.2. Các nghiên cứu về phòng trừ sâu khoang 7 1.2.1 Ngoài nước 7 1.2.2 Trong nước 8 1.3. Giới thiệu về Nucleopolyhedrosis virus (NPV) 8 1.3.1 Giới thiệu chung 8 1.3.1.1 Đặc điểm hình thái 10 1.3.1.2 Cơ chế tác động của virus lên côn trùng 11 1.3.1.3 Hiệu lực diệt sâu 14 1.3.1.4 Ưu nhược của NPV 15 1.3.2. Nghiên cứu sử dụng NPV để trừ sâu hại cây trồng 16 1.3.2.1 Ngoài nước 16 1.3.2.2 Trong nước 19 1.3.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sản xuất NPV 20 1.3.3.1 Nồng độ lây nhiễm 20 1.3.3.2 Tuổi sâu 20 1.3.3.3 Thời gian thu hoạch sâu chết 21 1.3.4 Ảnh hưởng của các chất phụ gia đến hiệu lực diệt sâu của NPV 21 1.3.5 Ảnh hưởng của các chất phụ gia và chất mang đến hiệu lực diệt sâu của NPV 24 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 26
  5. Đồ án tốt nghiệp 2.2. Vật liệu 26 2.2.1 Nguyên liệu 26 2.2.2 Dụng cụ 26 2.2.3 Hóa chất 26 2.3 Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Ảnh hƣởng của Acid boric đến hiệu lực diệt sâu của NPV 27 2.3.1.1 Chuẩn bị 27 2.3.1.2 Tiến hành thí nghiệm 30 2.3.2 Ảnh hƣởng của rỉ đƣờng đến hiệu lực diệt sâu của NPV 32 2.3.2.1 Chuẩn bị 32 2.3.2.2 Tiến hành thí nghiệm 34 2.3.3 Ảnh hƣởng của chất mang và chất phụ gia trong việc tạo chế phẩm 35 2.3.3.1 Chuẩn bị 36 2.3.3.2 Tiến hành thí nghiệm 38 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Ảnh hưởng của acid boric đến hiệu lực trừ sâu của NPV 40 3.2 Ảnh hưởng của rỉ đường đến hiệu lực diệt sâu của NPV 41 3.3 Ảnh hưởng của chất mang đến hiệu lực diệt sâu của NPV 44 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 4.1 Kết luận 47 4.2 Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 A. TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI 48 B. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 52 C. TÀI LIỆU INTERNET 52 PHỤ LỤC 1 53 I. Ảnh hƣởng của acid boric đến hiệu lực diệt diệt sâu của NPV 53
  6. Đồ án tốt nghiệp II. Ảnh hƣởng của rỉ đƣờng đến hiệu lực diệt diệt sâu của NPV 54 III. Ảnh hƣởng của chất phụ gia và chất mang đến hiệu lực diệt sâu của NPV 57 PHỤ LỤC 2 61 I. Ảnh hƣởng của acid boric đến hiệu lực diệt diệt sâu của NPV 61 II. Ảnh hƣởng của rỉ đƣờng đến hiệu lực diệt diệt sâu của NPV 62 III. Ảnh hƣởng của chất phụ gia và chất mang đến hiệu lực diệt sâu của NPV 63 PHỤ LỤC 3 68 HÌNH ẢNH 68 Hình 1. Dịch ly tâm. 68 Hình 2. Dịch đem đi ly tâm. 68 Hình 3. Pha dịch. 68 Hình 4. Hộp thức ăn nhân tạo 68 Hình 5. Cắt thức ăn thành 40 miếng 69 Hình 6. Hộp nuôi sâu có thức ăn nhân tạo. 69 Hình 7. Sâu tuổi 4. 69 Hình 8. Phun dịch vào thức ăn nhân tạo. 69 Hình 9. Gắp sâu vào thức ăn 70 Hình 10. Các hộp sâu 70 Hình 12. Thể vùi virus. 70 Hình 11. Buồng đếm. 70 Hình 13. Sâu ở các công thức. 71 Hình 14. Sâu chết do NPV. 72
  7. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các chế phẩm NPV đã đăng ký kiểm soát dịch hại ở nhiều nơi trên thế giới. 9 Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của acid boric bổ sung đến hiệu lực diệt sâu (%) của NPV. 40 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng của rỉ đƣờng bổ sung đến hiệu lực diệt sâu (%) của NPV. 42 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng của chất mang bổ sung đến số sâu chết do NPV 44 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng của chất mang bổ sung đến hiệu lực sâu của NPV sau 8 ngày . 45
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Sâu khoang Spodoptera litura 3 Hình 1.2 Ngài 3 Hình 1.3. Vòng đời sâu khoang 5 Hình 1.4. Cơ chế tác động của Baculovirus 11 Hình 1.5. Biểu hiện của sâu chết do NPV. 12 Hình 1.6. Sự lây nhiễm của NPV lên sâu ký chủ 13 Hình 1.7 Chu trình sống của virus côn trùng 14 Hình 1.8. Rỉ đƣờng 24 Hình 2.1. Quy trình thử nghiệm ảnh hƣởng của acid boric đến hiệu lực diệt sâu của NPV. 27 Hình 2.2. Lấy sâu chết do NPV nghiền cùng với nƣớc cất, lọc và thu dịch thô. 28 Hình 2.3. Quy trình nuôi sâu phòng thí nghiệm. 29 Hình 2.4. Thức ăn nhân tạo. 30 Hình 2.5. Phun dịch và gắp sâu. 31 Hình 2.6 Quy trình thử nghiệm ảnh hƣởng của rỉ đƣờng đến hiệu lực diệt sâu của NPV. 32 Hình 2.7 Các hộp thức ăn đƣợc phun dịch và gắp sâu. 35 Hình 2.8. Quy trình thử nghiệm ảnh hƣởng của rỉ đƣờng đến hiệu lực diệt sâu của NPV. 36 Hình 3.1. Ảnh hƣởng của acid boric bổ sung đến hiệu lực diệt sâu (%) của NPV 41 Hình 3.2 Ảnh hƣởng của rỉ đƣờng bổ sung đến hiệu lực diệt sâu (%) của NPV. 43
  9. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết của đề tài Việt Nam là một nước sản xuất nông nghiệp, khí hậu nhiệt đới nóng ẩm của Việt Nam thuận lợi cho sự phát triển của cây trồng nhưng cũng rất thuận lợi cho sự phát sinh, phát triển của sâu bệnh, cỏ dại gây hại mùa màng. Do vậy việc sử dụng thuốc BVTV để phòng trừ sâu hại, dịch bệnh bảo vệ môi trường, giữ vững an ninh lương thực quốc gia là một biện pháp quan trọng và chủ yếu. Từ thập niên 70 đến thế kỷ 20, cùng với sự phát triển nhanh chóng của các ngành khoa học, lĩnh vực hóa học và kỹ thuật sử dụng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) đã có sự thay đổi rất mạnh mẽ: sự hiểu biết sâu hơn về phương thức tác động của thuốc BVTV đã cho phép phát hiện ra nhiều hoạt chất mới có phương thức tác động của BVTV đã cho phép phát hiện ra nhiều hoạt chất mới có phương thức tác động khác trước, được sử dụng một cách hiệu quả và an toàn trong ngành sản xuất nông nghiệp. Việc sử dụng thuốc trừ sâu quá mức và bừa bãi trong thời gian dài dẫn đến một loạt vấn đề như: ô nhiễm môi trường, mất đa dạng sinh học, phát triển quần thể sâu bệnh kháng thuốc, bùng phát dịch hại thứ cấp, tăng đầu vào hóa chất và nguy hiểm độc hại do tích tụ dư lượng thuốc trừ sâu trong chuỗi thức ăn (Armes et al. 1992; Kranthi et al. 2002). Sâu khoang S. litura là loài sâu ăn tạp, gây hại trên nhiều loài cây trồng (Matsuura and Naito 1997; Sahayaraj and Paulraj 1998). Các nghiên cứu cho biết, sâu khoang đã kháng lại với nhiều loại thuốc trừ sâu hóa học dẫn đến sự bùng phát thành dịch và sự thất bại của biện pháp quản lý loài sâu hại này (Ahmad et al. 2007, Hong Tong et al, 2013). Để khắc phục tình trạng kháng thuốc của sâu khoang, Nucleopolyhedrosis đã được sử dụng do khả năng gây chết sâu cao nhưng lại an toàn đối với thiên địch và môi trường (Tohnishi et al., 2005; Shaurub et al., 2014; Nasution et. al., 2015). SLNPV được chứng 1
  10. Đồ án tốt nghiệp minh có hiệu quả gây chết rất cao (Trang and Chaudhari, 2002; Kumari and Sing, 2009; Nguyễn Thị Hai, Nguyễn Hoài Hương, 2015). Tuy nhiên tác nhân sinh học nên NPV bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường. Vì vậy, việc nghiên cứu để bảo quản virus, duy trì hiệu lực diệt sâu của virus là rất cần thiết. Xuất phát từ yêu cầu trên, nhóm sinh viên tiến hành đề tài “Nghiên cứu tạo chế phẩm Nucleopolyhedrosis virus NPV phù hợp để phòng trừ sâu khoang Spodoptera litura”. 2.Mục đích nghiên cứu Tìm ra chất bổ sung thích hợp để tạo chế phẩm NPV trừ sâu khoang Spodoptera litura. 3.Mục tiêu nghiên cứu Xác định ảnh hưởng của acid boric đến hiệu lực diệt sâu khoang của NPV. Xác định ảnh hưởng của rỉ đường đến hiệu lực diệt sâu khoang của NPV. Tìm ra loại chất mang và phụ gia phù hợp để tạo chế phẩm. 4.Nội dung nghiên cứu Khảo sát ảnh hưởng cả acid boric đến hiệu lực diệt sâu của NPV. Khảo sát ảnh hưởng của rỉ đường đến hiệu lực diệt sâu của NPV. Khảo sát khả năng diệt sâu của các dạng chế phẩm. 2
  11. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về sâu khoang Spodoptera litura Tên khoa học: Spodoptera litura Họ: Noctuidae Bộ: Lepidoptera 1.1.1 Đặc điểm hình thái Sâu khoang trưởng thành là loại ngài có màu xám hoặc nâu xám, cánh trước có màu nâu vàng, có các vân ngang bạc trắng óng ánh, cánh sau màu hơi trắng. Trứng hình bán cầu, mới đẻ màu vàng, sau màu tro tối xếp với nhau thành ổ, có phủ một lớp lông màu vàng rơm. Hình 1.1. Sâu khoang Spodoptera litura ( Hình 1.2 Ngài (Nguồn: Trần Văn Hai, 2009). 3
  12. Đồ án tốt nghiệp Sâu non mới nở có màu xanh sáng, dài khoảng 1mm, đầu to đen bóng. Sâu non đẫy sức có màu xám tro đến nâu đen, vạch lưng màu vàng ở đốt bụng thứ nhất có khoang đen to nên được gọi là sâu khoang. Sâu có 5- 6 tuổi, đẫy sức trước khi hóa nhộng dài 38-50 mm. Sâu làm nhộng trong đất (Hill, 1975; USDA, 1982; CABI, 2009). Nhộng dài từ 15-22mm, có màu xanh nõn chuối, rất mềm ngay khi mới được hình thành, sau đó chuyển dần sang màu vàng xanh, cuối cùng có màu nâu, thân cứng dần và có màu nâu đỏ. Khi sắp vũ hoá, nhộng có màu nâu đen, các đốt cuối của nhộng có thể cử động được. Mép trước đốt bụng thứ 4 và vòng quanh mép trước đốt bụng thứ 5-7 có nhiều chấm lõm, cuối bụng có một đôi gai ngắn (USDA, 1982; CABI, 2009). 1.1.2 Đặc điểm sinh học và sinh thái Thời gian trứng: 2-6 ngày. Sâu non có 6 tuổi: 12-37 ngày. Tiền nhộng: 1-4 ngày. Nhộng: 4-14 ngày. Trưởng thành: 5-8 ngày. Vòng đời trung bình của sâu khoang từ 25-48 ngày. Hai đến năm ngày sau khi xuất hiện, trưởng thành cái cái đẻ 50 đến 300 trứng theo từng ổ ở mặt dưới của lá (ưa thích). Trứng nở trong ba đến bốn ngày (Chari và Patel, 1983). Một trưởng thành cái có thể đẻ là 1.500 đến 2.500 trứng trong khoảng sáu đến tám ngày. Cây thầu dầu là loại vật chủ được ưa chuộng nhất cho các con cái đẻ trứng (Chari và Patel, 1983). Các cánh đồng mới được tưới nước cũng rất hấp dẫn đối với những con cái đẻ trứng. 4
  13. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3. Vòng đời sâu khoang (Nguồn litura.aspx). Sâu khoang thường trải qua 6 tuổi. Sâu tuổi 1 đến tuổi 3 không lẩn trốn ánh sáng. Sâu từ tuổi 4 đến tuổi 6 chui xuống đất, có hiện tượng lẫn trốn ánh sáng nên ban ngày thường ẩn nấp ở những chỗ kín trên mặt đất, hoặc chui xuống những khe nẻ ở dưới mặt đất và đến tối thì chui lên để gây hại. Khi sâu đẫy sức thì chui xuống đất hoá nhộng, trước khi hoá nhộng nó làm một kén bằng đất có hình bầu dục rồi chui vào đó hoá nhộng. (Chari và Patel, 1983). Nhộng thường vũ hoá vào buổi chiều mát và vào lúc chập tối, sau khi vũ hoá vài giờ trưởng thành có thể bắt đầu giao phối và vào đêm hôm sau thì bắt đầu đẻ trứng. Tuổi thọ trung bình của trưởng thành cái là 8,3 ngày và có thể đẻ được 2.673 trứng. Tuổi thọ trung bình của trưởng thành đực là 10,4 ngày (Yamanaka và cộng sự, 1975; Ahmed và cộng sự, 1979). Theo Yamanaka et al. (1975), trung bình một trưởng thành cái có thể đẻ được 2000 – 2600 quả, thời gian đẻ trong trong khoảng 5 ngày ở 25 ° C (77 ° C). Sâu khoang phá nhiều loại cây nên có mặt quanh năm trên đồng ruộng. Sâu cắn phá mạnh vào lúc sáng sớm nhưng khi có ánh nắng sâu chui xuống dưới tán lá để ẩn 5
  14. Đồ án tốt nghiệp nắp. Chiều mát sâu bắt đầu hoạt động trở lại và phá hại suốt đêm. Sâu vừa nở gặm vỏ trứng và sống tập trung 1-2 ngày, nếu bị động sâu bò phân tán hoặc nhả tơ buông mình xuống đất. Sâu tuổi 1-2 chỉ ăn gặm phần diệp lục của lá và chừa lại lớp biểu bì trắng, từ tuổi 3 trở đi sâu ăn phá mạnh cắn thủng lá và gân lá. Ở tuổi lớn khi thiếu thức ăn, sâu còn tập tính ăn thịt lẫn nhau và không những ăn phá lá cây mà còn ăn trụi cả thân, cành, trái non. Sâu non phát triển thích hợp ở nhiệt độ và ẩm độ cao. Khi làm nhộng, sâu chui xuống đất làm thành một khoang và nằm yên trong có hóa nhộng (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004). 1.1.3 Mức độ gây hại Spodoptera litura là đối tượng gây hại nặng trên rau muống. Sâu non tuổi nhỏ thường gây hại nghiêm trọng nhất bởi vì hàng trăm con sâu non tập trung lại ăn lá cây và nhanh chóng làm lá cây xơ xác. Sâu non còn có thể gặm ăn vỏ quả làm giảm chất lượng. Sâu non có 6 tuổi, sâu tuổi nhỏ ăn biểu bì của lá, sâu tuổi lớn ăn cả thịt lá chỉ chừa lại gân lá. Khi mật độ sâu cao có thể làm cho lá rụng nhanh. 1.1.4 Biện pháp phòng trừ Biện pháp canh tác Vệ sinh đồng ruộng trước và sau khi trồng, cày ải phơi đất, phơi và xử lý thuốc trừ sâu hoặc cho ruộng ngập nước 2-3 ngày để diệt nhộng, sâu non có trong đất. Phải thường xuyên đi thăm ruộng để kịp thời phát hiện sâu, ngắt bỏ ổ trứng hoặc tiêu diệt sâu non mới nở khi chưa phân tán đi xa. Biện pháp cơ giới vật lý Diệt ổ trứng và sâu non bằng tay. Biện pháp sinh học Hạn chế phun thuốc để bảo tồn các loài thiên địch thường xuất hiện trên ruộng: Nhiều tác nhân sinh học đã được sử dụng để trừ sâu khoang ăn tạp như : các loại nấm côn trùng Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Paecilomyces 6
  15. Đồ án tốt nghiệp fumosorosea (Asi et al, 2013), vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Agsaoay, 1998), Nuclepolyhedrosis viru Ngài sâu khoang có khuynh hướng thích mùi chua ngọt và ánh sáng đèn, do đó có thể dùng bẫy bả chua ngọt để thu hút ngài khi chúng phát triển rộ. Bả chua ngọt gồm 4 phần giấm + 1 phần mật + 1 phần rượu + 1 phần nước. Sau đó đem bả mồi vào chậu rồi đặt ở ngoài ruộng vào buổi tối nơi thoáng gió có độ cao 1m so với mặt đất. Dùng bẫy pheromone để dự báo trước sự đẻ trứng của sâu ăn tạp. Hàng ngày theo dõi dự báo sự phát triển của sâu qua bẫy pheromone, thường xuyên ngắt bỏ ổ trứng và diệt ấu trùng trên những ruộng dẫn dụ. Dùng hoa hướng dương hay các loài cây có thể dẫn dụ sâu ăn tạp trồng xung quanh ruộng canh tác để dễ dàng tiêu diệt. Dùng sản phẩm sinh học có nguồn gốc nấm, vi khuẩn khi có những dấu hiệu cắn phá lá đầu tiên. Thông thường 10 ngày sau phải phun thuốc lại. Các loại chế phẩm vi sinh: thuốc có nguồn gốc từ Bt như V-BT; Biocin 8000 SC, Dipel 32 WP hoặc thuốc thảo mộc như Rotenone hoặc Neem. Có thể dùng thuốc gốc Cúc tổng hợp như Karate 2.5 EC, SecSaigon 5 EC , các loại thuốc có hoạt chất Emamectin; Lufenuron hay hỗn hợp (Chlorantraniliprole + Abamectin) Biện pháp hóa học Có thể dùng thuốc có gốc Pyrethroid như Sherpa, Polytrin. Dùng các loại chế phẩm vi sinh như NPV, Vi-BT. Chú ý phun khi sâu còn nhỏ tuổi (sâu tuổi 1 – 2). 1.2. Các nghiên cứu về phòng trừ sâu khoang 1.2.1 Ngoài nƣớc Sâu khoang ăn tạp (Spodoptera litura) là loài sâu hại nguy hiểm cho nền nông nghiệp của nhiều nước ở châu Á, châu Phi và vùng Thái Bình Dương. Loài sâu này ăn tạp và gây hại cho hơn 150 loài cây trồng khác nhau và là loài sâu hại chính trên các loài cây trồng có giá trị kinh tế như bông, đậu nành, cà chua, thuốc lá, bắp, khoai tây và các loài cây rau ăn lá (Hill, 1993 ; Rao et al, 1993). Sâu khoang phân bố khắp nơi trên 7
  16. Đồ án tốt nghiệp thế giới và gây hại nặng cho nhiều nước nhiệt đới như: Ấn Độ, Pakistans, Banglades, Srilanca, Indonesia, Philippin, Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Úc, Hawaii, các nước Đông Nam Á (Hill, 1993; Singh and Jalali, 1997). 1.2.2 Trong nƣớc Nghiên cứu môi trường dinh dưỡng nhân sinh khối nấm Isaria tenuipes để ứng dụng phòng trừ sâu khoang Spodoptera litura (Fab.) hại cây trồng (Trần Văn Cảnh, 2012) Nghiên cứu khả năng phòng trừ sâu khoang (Spodoptera litura fabricius) của nấm ký sinh côn trùng Isaria javanica (friedrichs & bally) samson & hywel-jones (Nguyễn Thị Bích Thảo, 2013). Bằng phương pháp thu thập, tuyển chọn và khai thác khả năng phòng trừ sinh học của các chủng Nucleopolyhedrosis NPV (NPV), nhóm tác giả Nguyễn Thị Hai, Nguyễn Hoài Hương (2016) đã phân lập được 2 chủng NPV có hiệu quả cao đối với sâu khoang ăn tạp. Nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV-Spl (Nucle Polyhedrosis Virus) từ tế bào gốc sâu khoang để phòng trừ sâu hại cây trồng nông nghiệp (Nguyễn Thị Như Quỳnh, 2014). 1.3. Giới thiệu về Nucleopolyhedrosis virus (NPV) 1.3.1 Giới thiệu chung Nuclear polyhedrosis virus (NPV) thuộc họ Baculoviridea là một trong 7 thành viên thuộc nhóm virus ký sinh côn trùng. Virus NPV có dạng hình que, kích thước 40 – 70 x 250 – 400 nm (80 – 180 kbp) (Phạm Thị Thùy, 2004). Baculovirus thuộc họ Baculoviridae chỉ có 1 chi. Chi này được chia thành các nhóm phụ là virus đa diện nhân (NPV), virus hạt (GV) và Oryctes giống virus (OV). Theo Nguyễn Thị Như Quỳnh (2014), NPV có cấu tạo gồm: vỏ ngoài, vỏ capsid, và lõi acid nucleic. 8
  17. Đồ án tốt nghiệp Vỏ ngoài: là một lớp màng nhầy ngoài cùng có tính chất là protein và gọi là protein ngoài. Protein ngoài mang trính kháng nguyên và có tác dụng kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể vật chủ. Vỏ capsid: Vỏ capsid nằm kế tiếp bên trong lớp vỏ ngoài và được ngăn cách với lớp vỏ ngoài bởi một lớp keo dính. Protein cấu tạo nên vỏ Capsid được gọi là protein trong. Protein trong mang tính kháng nguyên làm tăng khả năng gây bệnh của vi rút. Genom: Genom của virus NPV là một phân tử DNA gồm 2 mạch xoắn kép (DNA ds). Khi nhiễm vào tế bào vật chủ virus tuồn lõi DNA vào tế bào vật chủ, DNA của virus sử dụng năng lượng, nguyên liệu và riboxom của tế bào vật chủ để tổng hợp nên protein và quá trình nhân lên của DNA. Mặt khác khi tế bào bị nhiễm virus, DNA của vi rút sinh ra men azenaza ức chế DNA của tế bào chủ và phân giải tạo thành các nucleotit tự do. Sau khi tổng hợp đủ các thành phần như vỏ, DNA (lõi ), virus tiến hành lắp ráp để tạo thành thể virus mới. Bảng 1.1. Các chế phẩm NPV đã đăng ký kiểm soát dịch hại ở nhiều nơi trên thế giới. Côn trùng Tên thƣơng mại của sản phẩm Quốc gia Heliothis spp. Biotrol VHZ and Virion H Mỹ Heliothis spp. Elcar Mỹ Lymantria dispar Gypcheck Mỹ Mamestra brassicae Mamestrin Phần Lan Neodiprion lecontei Lecont-virus Mỹ/Canada Orgyia seudotsugata Biocontrol-1 and Virtuss Mỹ Nguồn: Erayya et al (2013) 9
  18. Đồ án tốt nghiệp 1.3.1.1 Đặc điểm hình thái NPV có cấu trúc hình học, 5 - 6 đến 20 cạnh với nhiều nhóm virus khác nhau. Các acid nucleic (DNA, RNA) gồm dạng sợi đơn và sợi đôi. Theo Phạm Thị Thùy (2004), virus thuộc nhóm này có dạng hình que, kích thước từ 40 - 70 nm x 250 - 400 nm, bên ngoài là một lớp vỏ có cấu tạo từ lipoprotein bao quanh một lớp protein nằm trong lõi DNA (Nucleocapsid), trong có chứa các virion, các virion bao gồm 11 - 25 polypeptide. Trong số polypeptide đó thì có khoảng 4 - 11 polypeptide được kết hợp với nucleocapsid và số polypeptide còn lại kết hợp với capsid. DNA ở dạng sợi vòng gồm hai sợi, với trọng lượng phân tử từ 50 - 10 x 106 các virion được bao quanh bởi một tinh thể protein và được gọi là thể vùi. Kelly (1985) cho rằng, virus có dạng hình que có một hoặc nhiều nucleocapsid được bao bọc bởi một lớp vỏ, nucleocapsid là một phức hợp gồm DNA và protein (gọi tắc là Deoxyribo Nucleo Protein - DNP) và chúng cũng được bao quanh bởi một lớp vỏ capsid (bên trong lớp vỏ capsid này chỉ có một hoặc nhiều nucleocapsid), nếu là một nucleocapsid thì gọi là NPVs Nucleocapsid đơn, nếu có nhiều nucleocapsid trong vỏ capsid thì gọi là NPVs Nucleocapsid – Multiple. Cấu tạo của nucleocapsid: nucleocapsid có dạng hình que, dáng hơi cong, đường kính 40 nm, dài 350 nm, có màng bọc bên ngoài (capsid). Nucleocapsid bao gồm hai loại protein, đó là một lõi DNP protein và màng capsid protein và từ 3 - 8 polypeptide nhỏ (Summer, M.D et al, 1978). Cấu tạo của thể virus: thể virus hình gậy gồm các nucleocapsid được bao bọc, mỗi vỏ bao có thể có một hoặc nhiều nucleocapsid, có loại có tới 30 nucleocapsid. Lớp vỏ bao gồm có lipid, trong vỏ còn có 8 - 10 polypeptide (Harrap, K.A., 1972., Kelly, D.C., 1982, 1985). Cấu tạo của khối đa diện (polyhedral): Theo Crook, N.E. et al (1982) thì polyhedral là những khối kết tinh lớn, kích thước từ 1 - 4 µm, có dạng hình vuông hoặc gần như hình cầu, bên trong có chứa nhiều hạt virus, có khi lên tới 100 hạt, bao quanh 10
  19. Đồ án tốt nghiệp các virus đó là mạng lưới kết tinh hình mắt cáo. Polyhedral còn bao gồm nhiều polypeptide. Protein polyhedron có trọng lượng phân tử thay đổi từ 27.000 - 34.000 million , phụ thuộc vào loại virus (Bergold, G.H., 1963 Harrap, K.A., 1972). Polyhedral có đặc điểm là ổn định ở pH trung tính. pH kiềm 9,5 trở lên sẽ làm nó bị hòa tan (Faust, R.M. et al , 1966). Minon, F. et al (1979) còn cho biết polyhedra hoàn thiện được một lớp vỏ có hình thái riêng biệt vây quanh, chức năng của lớp vỏ này chưa được xác định. 1.3.1.2 Cơ chế tác động của virus lên côn trùng Hình 1.4. Cơ chế tác động của Baculovirus ( Chế phẩm virus NPV được phun điều lên lá. Sau đó sâu ăn lá nhiễm virus NPV. Thể vùi của virus cùng thức ăn xăm nhiễm vào ruột côn trùng. Tại ruột côn trùng dưới tác động các men tiêu hóa thể vùi bị hòa tan và giải phóng các virion. Qua mô ruột giữa các virion nhân lên và đi vào tế bào nhân ruột giữa. Tại đây các thế hệ virion mới được hình thành và xâm nhập vào các cơ quan khác như hạt bạch huyết, tế bào thể mỡ, ống tiêu hóa, Sau giai đoạn cuối lây nhiễm sẽ hình thành các vỏ bọc bảo vệ các virion sau đó tạo thành các PIB. Khi côn trùng chết sẽ giải phóng các PIB và tiếp tục lây 11
  20. Đồ án tốt nghiệp nhiễm sang các con khác. Sâu chết chứa lượng virus khoảng 108 PIB, thời gian gây chết của virus đối với côn trùng từ 4 – 7 ngày. Virus NPV lây nhiễm khoảng 400 loài côn trùng (chủ yếu là bộ cánh vẩy, cánh màng, bộ hai cánh). A B Hình 1.5. Biểu hiện của sâu chết do NPV. (Nguồn: thuc-tien-a5088.html). Sâu non sau khi nhiễm NPV không có biểu hiện gì rõ rệt và không thay đổi về thức ăn. Sau 5-7 ngày các đốt thân sưng phồng lên, căng mộng nước. Cơ thể sâu chuyển sang màu trắng đục, da bở, dễ bị vỡ. Trước khi chết sâu thường leo lên ngọn cây, bám chân vào cành cây, trút đầu xuống đất. Dịch chiết trắng chảy ra ngoài và sâu chết (hiện tượng sâu chết treo). Dịch trắng tiếp tục chảy (Phạm Thị Thùy, 2004). 12
  21. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.6. Sự lây nhiễm của NPV lên sâu ký chủ ( Nguồn: Hoover K, Grove M, Gardner M, Hughes DP, McNeij, & Slavicek, 2011). Sau khi NPV vào cơ thể ký chủ côn trùng bằng đường tiêu hóa, sâu non ngừng ăn, cơ thể sâu biến đổi về màu sắc. Sau 1-2 ngày cơ thể sâu căng phòng, mọng nước. Cơ thể có màu vàng hoặc trắng. Hạ bì dễ bị nứt, chuyển động chậm, chết nhanh. Ngoài đồng ruộng sâu chết do virus thường quan sát thấy đầu trút xuống dưới, dịch trắng chảy ra ngoài (Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành, 2007). Khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng, các virus nhân lên ngay trong nhân hoặc trong chất nguyên sinh của tế bào, phá hủy các mô làm cho vật chủ chết. Những côn trùng còn sống sót vẫn tiếp tục bị ảnh hưởng trong giai đoạn nhộng (nhộng bị thối, ngoài vũ hóa bị biến dạng), trong giai đoạn trưởng thành (khả năng đẻ trứng giảm) và ảnh hưởng tới các thế hệ sau. Nguồn virus tồn động trong tự nhiên lại lây nhiễm cho các thế hệ mới. Trên cơ sở khoa học này, virus gây bệnh cho côn trùng ngày càng được chú ý nghiên cứu và được coi là một trong những nhân tố có triển vọng trong phương pháp sinh học để phòng chống sâu hại cho cây trồng (Nguyễn Thị Như Quỳnh, 2014). 13
  22. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.7 Chu trình sống của virus côn trùng (Nguồn: Jim McNeil, Department of Entomology, Penn State University, 2010). 1.3.1.3 Hiệu lực diệt sâu Phụ thuộc vào điều kiện bảo quản chế phẩm. Mẫu NPV được lưu trữ trong điều kiện lạnh, có thể duy trì hiệu quả của nó lên đến 8 tháng (100%), và đến tháng thứ mười, có một sự suy giảm nhẹ (97,50%) nhưng nó không đáng kể, trong khi mẫu NPV được lưu trữ trong nồi đất và ở nhiệt độ phòng (cả trong chai màu hổ phách và chai thủy tinh) hiệu quả được duy trì lên đến 4 tháng và sau đó độc lực bắt đầu giảm. Do tăng hoạt tính của vi khuẩn. Sự thay đổi trong pH của huyền phù virus được lưu trữ trong điều kiện lạnh là rất chậm từ axit đến bình thường (5-7) pH như chống lại kiềm ở điều kiện môi trường xung quanh. Chủ yếu là do sự tăng trưởng của các vi khuẩn khác và điều kiện ấm, dẫn đến giảm độc lực của các cơ quan virus. Nhiều nhà khoa học đã báo cáo rằng virus có 14
  23. Đồ án tốt nghiệp thể được bảo quản trong hơn 10 năm ở mức 40C mà không bị mất độc lực. Độc lực hiệu quả nhất khi pH trung tính và giảm khi pH cao. Độc lực của virus phụ thuộc vào chất lượng của vi-rút, điều kiện bảo quản và thời gian lưu trữ, nhiệt độ và độ pH của sản phẩm. Các nghiên cứu đều chỉ ra rằng NPV có hiệu lực gây chết rất cao trên sâu khoang. Sâu càng nhỏ mức độ mẫn cảm càng cao (Boucias et al, 1980; Bucher and Turnck, 1983; Smith and Vlak, 1988; Mohammad et al, 2002). Giá trị LC50 NPV trên sâu khoang từ tuổi 1 đến tuổi 4 được ghi nhận tương ứng là 3,2 x 106; 1,1 x 107; 1,3 x 107 và 4,7 x 107 PIB/ml (Mahammad et al, 2002). 1.3.1.4 Ƣu nhƣợc của NPV Ưu điểm của NPV không gây độc hại cho người cũng như gia súc. Do là chế phẩm vi sinh nên không gây ô nhiễm môi trường và không còn tồn dư lượng thuốc trên rau quả. Không ảnh hưởng đến các loài ngoài vật chủ nên sẽ không gây hại đến thiên địch cũng như các vi sinh vật có lợi với con người. Chế phẩm dễ sử dụng với các thiết bị phun thuốc thông thường. Hiệu quả cao do có độc lực cao. Bên cạnh đó chế phẩm sẽ mất hiệu quả khi có tia UV chiếu vào. Vì thế nên phun vào lúc sáng sớm hoặc chiều tối. Đối với sâu non thì chế phẩm có tác dụng mạnh hơn so với sâu trưởng thành. Vì là tác nhân sinh học nên NPV dễ bị mất tác dụng khi điều kiện ngoài đồng không thích hợp (nhiệt độ, độ ẩm, ) do đó việc sử dụng chúng không thuận lợi bằng thuốc hóa học (Phạm Thị Thùy, 2004). NPV có thể sản xuất bằng phương pháp invivo và invitro. Tuy nhiên, NPV được thương mại hóa hiện nay trên thế giới chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp invivo (Tuan S.J. W.L. Chen, and S.S. Kao. 1998; Monobrullah M et al, 2000). Trong đó, NPV của các loài thuộc chi Spodoptera được sử dụng nhiều nhất trên phạm vi toàn thế giới (Monobrullah, M.; Nagata, M., 2000). Nhiều chế phẩm đã được thương mại hóa để trừ sâu khoang ăn tạp là SOMSTAR TM–SL, SpodopterinTM, Spodoptera litura NPV, sử dụng trên rau, cà chua, bắp, bông vải (Gupta và cộng sự, 2005). 15
  24. Đồ án tốt nghiệp 1.3.2. Nghiên cứu sử dụng NPV để trừ sâu hại cây trồng 1.3.2.1 Ngoài nƣớc Hiệu lực diệt sâu khoang ăn tạp của các chủng NPV: Các nghiên cứu đều chỉ ra rằng NPV có hiệu lực gây chết rất cao trên sâu khoang. Sâu càng nhỏ mức độ mẫn cảm càng cao (Boucias et al, 1980; Bucher and Turnck, 1983; Smith and Vlak, 1988; Mohammad et al, 2002). Giá trị LC50 NPV trên sâu khoang từ tuổi 1 đến tuổi 4 được ghi nhận tương ứng là 3,2 x 106; 1,1 x 107; 1,3 x 107 và 4,7 x 107 PIB/ml (Mahammad et al, 2002). Nghiên cứu, sản xuất Nucleopolyhedrosis virus (NPV): So sánh sản lượng NPV đạt được khi dùng sâu 7, 8, 9 và 10 ngày tuổi để sản xuất NPV, Monobrullah và Nagata (2000) cho biết, sản lượng NPV cao nhất khi sử dụng sâu 9 ngày tuổi (trọng lượng 125 – 155mg) để nhiễm NPV. Sản lượng NPV cao nhất được cho biết là 3,91 x 109 PIB/ml khi nhiễm ở nồng độ là 4,8 x 106 PIB/ml. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sản xuất NPV: Các tác giả cho rằng, NPV bị ảnh hưởng rất rõ bởi yếu tố nhiệt độ. Mohammad (2002), Sajap et al (2007) cho biết, tỷ lệ sâu chết tăng khi tăng nhiệt độ nuôi sâu và giá trị LT50 thì ngược lại. Giá 0 0 trị LT50 khi nhiễm sâu ở 20 C tăng 4 lần so với khi nuôi ở nhiệt độ 30 C (Mohammad, 2002). Cũng theo tác giả này, điều kiện tối thích để sản xuất invitro NPV trên sâu khoang là 300C. Ảnh hưởng của tia cực tím đến NPV: Các nghiên cứu đã chứng minh rằng hiệu lực trừ sâu của NPV bị suy giảm do ảnh hưởng của tia UV có trong nắng mặt trời (ELnagar 1982; Jgnoffo và cộng sự, 1989; Jones và cộng sự, 1993; El Salamouny và cộng sự, 2009). Vì vậy, khi sử dụng NPV để trừ sâu trên đồng, cần thiết phải bổ sung chất chống tia cực tím, bảo vệ NPV (Shapiro et al., 2008). Từ khá lâu, Ignoffo và Garcia (1994) đã chứng minh rằng chất chống oxy hóa đóng vai trò hấp thụ tia cực tím và nhờ vậy đã bảo vệ được NPV. Nhiều cố gắng đã được thực hiện để bảo vệ NPV khỏi tác động của tia UV có trong nắng mặt trời bằng cách sử dụng các hóa chất để làm 16
  25. Đồ án tốt nghiệp phụ gia như các loại thuốc nhuộm (Shapiro,1989; Ramakrichman và Chaudhary, 1991; Reddy và Divakar, 2001) hoặc Cu(NO3)2 và CuSO4 (Arivudainambi và cộng sự, 2000). Các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên như lignin (phụ phẩm của công nghiệp giấy) cũng có khả năng bảo vệ NPV khỏi ảnh hưởng của tia UV (Jacques,1977; Tames-guera và cộng sự, 2000; El Salamouny và cộng sự, 2002; Elnagar và cộng sự, 2003). Các nghiên cứu cũng cho biết các chất chống oxy hóa có khả năng bảo vệ NPV từ nắng mặt trời như Dilodin và Inol (Zarin và Eglite, 1985), các Vitamin (Murahabaskaran và cộng sự, 2000) hoặc các chất có nguồn gốc từ thiên nhiên như: folic acid (Deotale và cộng sự, 2007); Riboflavin, Pyridoxin, dịch chiết của lá xoài và lá bạch đàn (Deotale và cộng sự, 2003), dịch chiết từ cây cacao, cà và cây cà phê (Salamouny và cộng sự, 2009). Theo A. El-Helaly và cộng sự (2008) thì có nhiều chất chống oxy hóa có nguồn gốc từ thực vật có khả năng bảo vệ NPV khỏi tác động của tia UV như trà xanh, bắp cải tím, cacao, ớt, cà phê Hai mươi bốn phenolics đã được xác định từ trà xanh (Caffin et al 2004) đều có khả năng hấp phụ được tia cực tím. Từ những thử nghiệm trên NPV của sâu xanh da láng, Martin Shapiro et al (2009) cho biết, dung dịch nước trà xanh là một chất hấp thụ tia cực tím tuyệt vời, bảo vệ Nucleopolyhedrois NPV của sâu xanh da láng (Spodoptera exigua). Nghiên cứu tăng cường hiệu lực diệt sâu của NPV: Tiêu chí để tạo chế phẩm NPV trừ sâu là kéo dài hoạt lực cũng như sự bền vững của NPV trên đồng (Jones et al , 1997). Việc tạo chế phẩm có thể cải thiện đáng kể hiệu quả của NPV. Các chất phụ gia cho vào NPV nhằm kích thích sự ăn của sâu ký chủ hoặc tăng cường hiệu lực gây chết của NPV ( Bell và Kanavel , 1975; Burges và Jones , 1998). Để tăng hiệu lực trừ sâu và rút ngắn thời gian ủ bệnh do NPV, các tác giả đã phối trộn NPV với nhiều sản phẩm khác như: thuốc trừ sâu, chế phẩm Neem, acid boric, rỉ đường . Rabindra và cộng sự (1997) cho biết phối hợp NPV (liều lượng 5 x 105 PIB/ml) + mật đường (1%) + dịch chiết neem (0,1%) cho hiệu quả diệt sâu khoang tăng hơn so với không trộn. Tác giả cho biết, nếu không bổ sung rỉ đường thì sự phối 17
  26. Đồ án tốt nghiệp hợp này không có hiệu quả. Tương tự như vậy, Baskaran và cộng sự (1999) cho biết, phối trộn NPV (2 X 104 PIB/ml) với dầu neem 1% và dịch chiết bánh dầu neem 5% cũng làm tăng hiệu quả diệt sâu của NPV. Các tác giả thống nhất rằng, việc bổ sung dịch chiết neem vào chế phẩm NPV làm cho sâu khoang chết nhanh hơn so với không bổ sung và quan trọng hơn cả là làm giảm được tác động của neem đối với các loài thiên địch. Seon-Gon Kim và ctv (2001) cho biết, phối trộn nồng độ 1x108 PIB/ml với NeemAZA-T/S nồng độ 200 ppm có giá trị LT50 và LT90 là 1,94 ngày và 8,33 ngày. Hiệu lực diệt sâu của Spodoptera litura NPV (SLNPV) nồng độ 1x108 PIB/ml với NeemAZA-T/S nồng độ 75–200 ppm cho kết quả diệt sâu chết 100% sau 9 ngày thí nghiệm. Tạo chế phẩm thương mại NPV: NPV Spodoptera litura được sản xuất dưới dạng bột thấm nước theo công thức: 50% sâu bị chết do NPV đã được đem đông lạnh + 20% hỗn hợp bao gồm silica tổng hợp (Neosyl) và chất hoạt động bề mặt (Etocas 30). Kaolin cho vào như là chất chống đóng cục (Mcking ley và cộng sự, 1989). Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất mang trong chế phẩm bột thấm nước, Claudia C. Medugno và cộng sự (1999) cho rằng, trộn kaolin sẽ làm giảm hiệu lực của chế phẩm trong thời gian bảo quản. Đối với chế phẩm dạng nước, Jin và cộng sự (2000) cho biết, thêm đường Sucrose (1-5%) làm tăng khả năng ăn của sâu. Thêm đường trắng hoặc rỉ đường và Triton X- 100 có khả năng tăng hiệu lực của chế phẩm. Tuy nhiên cơ chế tác động của rỉ đường vẫn chưa được làm rõ. Các nghiên cứu đều cho rằng, hiệu lực của NPV ảnh hưởng bởi thời gian và biện pháp bảo quản. Rodrigo Lasa và cộng sự (2008) cho biết, hiệu lực trừ sâu xanh da láng của NPV SENPV bị giảm 16,67 lần sau 18 tháng bảo quản ở nhiệt độ 250C và hiệu lực không thay đổi nếu bảo quản NPV ở điều kiện 40C và -200C. Nhóm tác giả cũng cho biết, bổ sung các chất kháng khuẩn và chất chống oxy hóa có thể duy trì hiệu lực của NPV trong vòng 18 tháng ở điều kiện bảo quản trong tủ lạnh. 18
  27. Đồ án tốt nghiệp 1.3.2.2 Trong nƣớc NPV được ghi nhận là một trong những loài thiên địch xuất hiện khá phổ biến trên đồng ruộng ở Việt Nam (Nguyễn Văn Cảm và CTV, 1992; Nguyễn Thị Hai, 1996). Sâu khoang trên lạc có tỷ lệ chết NPV khá cao, có khi lên tới 50 – 60% (Phạm Văn Lầm, 2004). NPV đã được quan tâm nghiên cứu và sử dụng ở Việt Nam từ đầu những năm 1980. Khởi đầu là việc nghiên cứu và sử dụng NPV để trừ sâu xanh hại bông của Viện nghiên cứu Bông và Viện bảo vệ Thực vật. Sau đó là SENPV trừ sâu xanh da láng, cũng được phát triển khá mạnh và sử dụng rất hiệu quả để trừ sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) hại trên bông, nho, hành tỏi. Các kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng NPV có hiệu lực trừ sâu tương đương hoặc cao hơn so với thuốc hóa học (Phạm Hữu Nhượng và CTV, 2005; Hoàng Thị Việt và ctv,1999, 2000; Ngô Trung Sơn, 2001; Nguyễn Thị Hai, 2004; Phạm Văn Lầm, 2004; Nguyễn Văn Tuất, 2004). Một số NPV đã được thương mại hóa để trừ sâu ở Việt Nam (Lê Quang Quyến et al, 2002; Nguyễn Văn Tuất, 2004). NPV trừ sâu khoang đã được tiến hành tại Viện Bảo vệ Thực vật (Nguyễn Văn Tuất, 2004). Thử nghiệm trên đồng ruộng cho biết, Sử dụng chế phẩm NPV, V-Bt trừ sâu xanh, sâu khoang hại lạc cho hiệu quả 76-77%. Tại các tỉnh phía Nam, gần đây các chủng NPV sâu khoang cũng được trường được phân lập tại trường Đại học Cần Thơ. Kết quả cho biết, độ hữu hiệu của 2 dòng NPV thu thập tại Trà Vinh và An Giang đối với sâu khoang ăn tạp cho hiệu quả trên 90% sau 9 ngày xử lý (Trần Văn Hai, 2010). Đánh giá hoạt lực trừ sâu của NPV trên sâu khoang, Tran Thi Kieu Trang et al (2002) cho biết, sâu 2 ngày tuổi mẫn cảm gấp 1.500.000 lần so với sâu 8 ngày tuổi. Nghiên cứu sử dụng các chất lọc tia cực tím trên HaNPV, Ngô Trung Sơn (2001) cho biết, sữa lọc béo, than hoạt tính và rỉ đường có khả năng giảm được tác hại của tia cực tím. Theo tác giả, nếu phơi HaNPV ngoài nắng 1 giờ, hiệu lực diệt sâu xanh của chúng 19
  28. Đồ án tốt nghiệp chỉ còn 37%, song nếu dịch HaNPV có trộn 3% sữa lọc béo thì hiệu lực diệt sâu vẫn còn 81%, còn trộn 3% than hiệu tính thì hiệu lực của HaNPV cũng còn 50%. 1.3.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sản xuất NPV 1.3.3.1 Nồng độ lây nhiễm Sản lượng tối đa của virus có liên quan chặt chẽ đến tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm virus. Tổng số virus được sinh ra tương quan thuận với trọng lượng sâu đem đi nhiễm (Jones, 2000). Mối tương quan giữa nồng độ nhiễm và sản lượng virus đã được nhiều tác giả nghiên cứu (Shapiro, 1986) với nhiều phương pháp khác nhau. Hyblaea puera Biji et al. ( 2006) cho rằng, nếu tiếp tục cho sâu ăn thức ăn bị nhiễm cho đến khi sâu bị nhiễm bệnh thì hiệu quả sẽ cao hơn so với chỉ cho ăn thức ăn bị nhiễm virus trong một thời gian ngắn. Tuy nhiên nếu nhiễm với nồng độ thể vùi cao, virus sẽ gây hại cho các cơ quan nội tạng và gây chết sâu trước khi virus nhân lên đủ nhiều. Trái lại, nếu nhiễm với nồng độ quá thấp, thì lượng virus sẽ không tối ưu bởi vì sâu vào nhộng. Để xác định nồng độ lây nhiễm thích hợp cho từng loài sâu, người ta phải xác định giá trị LC50, LC90 cho từng tuổi sâu. Giá trị LC50 và LC90 sẽ giúp xác định được nồng độ lây nhiễm thích hợp cho từng tuổi sâu. Giá trị LC50, LC90 thay đổi tùy thuộc vào từng tuổi sâu, từng loài sâu và từng chủng NPV tương ứng. 1.3.3.2 Tuổi sâu Thông thường nếu nhiễm sâu tuổi quá nhỏ chúng sẽ chết nhanh trước khi cơ thể đạt sinh khối tối đa nhưng nếu nhiễm sâu càng lớn thì khả năng kháng với virus càng cao ( Briese, 1986) và cả hai trường hợp đều đạt sản lượng không cao. Thông thường, người ta thường nhiễm sâu vào thời điểm trước khi lột xác sang tuổi cuối 2 ngày ( O „Reilly et al., 1994). Xác định tuổi sâu xanh (Helicoverpa armigera) thích hợp nhất để nhiễm H.armigera NPV ( HearNPV), Gupta et al. (2007) đã làm thí nghiệm nhiễm sâu với nồng độ 1 x 104PIB/sâu cho sâu 5,7,8,9,10 và 11 ngày tuổi. Sản lượng virus đạt cao nhất khi ở công thức nhiễm sâu 7 và 8 ngày tuổi. Sâu càng nhỏ lượng virus/sâu càng thấp hơn có ý nghĩa so với sâu tuổi lớn. Sâu càng lớn tỷ lệ vào nhộng càng cao. Sản 20
  29. Đồ án tốt nghiệp lượng virus đạt cao nhất của HearNPV đạt được khi nhiễm trên sâu tuổi 5 với nồng độ nhiễm là 5 x 105OB/sâu (Mehrvar et al., 2007). Trong khi đó, Ziemnicka (2008) lại cho rằng, tuổi 4 là tuổi tối ưu để nhiễm Leucorma salicis NPV đối với sâu Leucoma salicis. Nhiều tác giả khác lại cho rằng, nhiễm sâu tuổi 3 cho sản lượng virus cao nhất (Li & Skinner, 2005). Vì vậy, để đạt hiệu suất tối đa, cần phải xác định tuổi sâu tương ứng với từng nồng độ nhiễm cho từng loài sâu hại. 1.3.3.3 Thời gian thu hoạch sâu chết Các kết quả nghiên cứu cho thấy rằng, trong điều kiện invivo, sản lượng virus đạt cao nhất khi thu sâu chết ( Gupta, 2007; Mehrvar et al., 2007). Thời gian thu hoạch đóng vài trò quan trọng trong quy trình sản xuất Spodoptera Littoralis NPV trong sâu khoang S.Littoralis ( Grzywacz et al., 1998). Nếu thu hoạch quá sớm, hoạt tính sinh học của virus sẽ giảm. Trái lại, nếu để các mô vỡ ra trước khi thu hoạch thì virus sẽ phát tán ra thức ăn rất khó thu hoạch. Tốt nhất là nên thu hoạch sớm ngay sau khi sâu chết. Các nghiên cứu cho thấy, đối với NPV gây chết sâu khoang ăn tạp, sâu vừa mới chết cho sản lượng virus cao nhất. Ở sâu sống vào thời điểm 8 ngày sau khi sâu chết, lượng virus cũng còn đạt khá cao nhưng virus chưa thành thục nên hoạt tính diệt sâu không cao. Trái lại nếu để quá muộn, da sâu vỡ ra thì lượng virus sẽ giảm đi hơn ½ ( Nguyễn Thị Hai, 2014). Vì vậy, thường trong sản xuất, người ta phải thu sâu chết hàng ngày, thậm chí 2 lần/ngày. 1.3.4 Ảnh hƣởng của các chất phụ gia đến hiệu lực diệt sâu của NPV Hầu hết, việc phòng trừ sâu hại bằng NPV chủ yếu là phun virus hòa tan trong nước. Tuy nhiên, gần đây, việc tạo chế phẩm NPV đang được nghiên cứu nhằm tăng thêm độ bền của virus và duy trì hiệu quả của chế phẩm trên đồng ruộng. Ngoài ra, các chất phụ gia được cho vào để kích thích sự ăn của sâu ký chủ để tăng khả năng gây chết hoặc tăng cường hiệu quả diệt sâu ký chủ của NPV (Burges and Jones, 1998, Juan Cisneros et al, 2002). 21
  30. Đồ án tốt nghiệp Acid Boric: Acid Boric, còn được gọi là acid bằng toan hoặc acid orthoboric, có công thức hóa học H3BO3, là một acid yếu của Bo thường được sử dụng như một chất khử trùng, thuốc trừ sâu bọ, là một tiền chất của các hợp chất hóa học khác. Acid Boric có tính kháng sinh nhẹ chống nhiễm trùng do nấm hoặc vi khuẩn. Acid boric ảnh hưởng đến các điều kiện trong ruột của côn trùng, có thể bằng cách thay đổi tính toàn vẹn, tính thấm của các tế bào của biểu bì ruột. Độc tính của acid boric có thể gây căng thẳng sinh lý của sâu hại, làm tăng tính nhạy cảm với virus (Ya- dava, 1970; Shapiro và Bell, 1982). Acid boric (H3BO3) được sử dụng để kiểm soát kiến và gián (Hayes andLaws, 1991). Hợp chất này đã chứng minh làm tăng hoạt tính của B. thuringiensis và một số baculovirus (Shapiro và Bell, 1982, Morris và cộng sự, 1995). Hiệu quả diệt sâu của virus được tăng lên theo nồng độ acid bổ sung. Ví dụ, giá trị LC50 của NPV của Anticarsia gemmatalis (Hučbner) đã được giảm khoảng năm lần với việc bổ sung 0,045% acid boric. Thời gian gây chết (LT50) cũng giảm (Morales và cộng sự, 1997). Các kết quả tương tự đã được biết với NPV của Lymantria dispar (L.) và Spodoptera litura (F.) khi trộn với acid boric 0,5-1% (Shapiro và Bell, 1982; Chaudhari, 1992). Hiệu quả của acid boric trên các baculovirus đã được công nhận trong nhiều thập kỷ (Yadava, 1970), rất ít nghiên cứu thực địa đánh giá các công thức + acid boric của virus. Tại Ấn Độ, Bujjur et al (1991) cho biết hiệu lực diệt sâu Helicoverpa armigera (Huèbner) của NPV trên hoa hướng dương trên hướng dương tăng 4 lần khi trộn thêm 0,5% acid boric. Tương tự, Chundurwar et al(1990) cho rằng, hiệu quả phòng trừ sâu H.armigera khi bổ sung 0,5% acid boric vào NPV. Thử nghiệm hiệu quả diệt sâu Spodoptera frugiperda của NPV trong điều kiện có bổ sung acid boric 0,5 - 4%, Juan Cisneros et al (2002) cho biết, với nồng độ 0,5 - 4%, acid boric đơn độc không gây chết sâu. Cụ thể khi cho ăn với acid boric đơn độc, sâu không chết nhưng khi bổ sung acid boric vào NPV thì khả năng gây chết sâu của NPV tăng lên. Tác giả cũng cho biết, với nồng độ bổ sung từ 0,5 - 1% acid boric thì 22
  31. Đồ án tốt nghiệp hiệu lực gây chết sâu của NPV không sai khác so với không bổ sung acid boric. Nhưng khi tăng nồng độ acid boric lên trên mức này, hiệu lực diệt sâu của NPV tăng lên đáng kể. Thử nghiệm hiệu lực Spodoptera frugiperda trên đồng ruộng, Juan Cisneros et al (2002) cũng cho biết, với nồng độ 0,5-4%, acid boric không tác động đến thiên địch. Sử dụng chế phẩm virus dạng bột. Theo Cisneros et al (2001), việc bổ sung acid boric vào chế phẩm NPV không làm tăng đáng kể chi phí và không có độc tính đối với động vật máu nóng. Lê Văn Trịnh et al (2012) cho biết, chế phẩm NPV + acid boric 0,5% cho hiệu quả trừ sâu cao hơn không bổ sung acid boric là 2,29%. Acid Boric cũng làm tăng hoạt tính của B. thuringiensis ở Lepidoptera tới mức độ tương tự như các virus baculo (Doane và Wallis, 1964, Govindarajan và cộng sự, 1976, Morris và cộng sự, 1995). Ngoài ra, độc tính của acid boric có thể gây ra ảnh hưởng sinh lý của côn trùng, tăng khả năng nhiễm virus (Yadava, 1970, Shapiro and Bell, 1982). Rỉ Đường: Rỉ đường hay rỉ mật, mật rỉ, mật rỉ đường, còn được gọi ngắn gọn là mật, là chất lỏng đặc sánh còn lại sau khi đã rút đường bằng phương pháp cô đặc và kết tinh. Đây là sản phẩm phụ của công nghiệp chế biến đường (đường mía, đường nho, đường củ cải). Trong tiếng Anh, rỉ mật được gọi là molasses, xuất phát từ tiếng Bồ Đào Nha melaço, là dạng so sánh hơn nhất của mel, từ Latin (và Bồ Đào Nha) của "mật ong". Chất lượng của rỉ đường phụ thuộc vào độ chín của mía hoặc củ cải nguyên liệu, lượng đường chiết được và phương pháp chiết đường. Để tăng hiệu lực trừ sâu của NPV khi phun lên đồng bằng cách bổ sung phụ gia để tăng độ bám dính và sức ăn của sâu, Progar et al (2010) cho biết đã sử dụng 25% rỉ đường. Shapiro et al (1983) cho biết rỉ đường giữ vai trò là chất chống tia UV ở nồng độ 5%. Thuốc nhuộm Stillbebne cũng được khuyến cáo để cải thiện hiệu quả diệt sâu của baculovirus (Lasa et al, 2007). 23
  32. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.8 Rỉ đường Đánh giá hiệu lực diệt sâu của việc sử dụng các chất phụ gia để tăng hiệu lực diệt sâu xanh đục quả của HearNPV , A.Mehvar et al (1975) cho biết việc sử dụng các chất phụ gia đã làm tăng tỉ lệ chết của sâu lên đáng kể so với việc chỉ phun virus đơn độc. Công thức tạo chế phẩm bao gồm ba chất phụ gia rỉ đường (5%) + tinopal (0,2%) + thuốc nhuộm (0,1%). 1.3.5 Ảnh hƣởng của các chất phụ gia và chất mang đến hiệu lực diệt sâu của NPV Bột Talc: Talc là một magiê ngậm nước silicat khoáng sản với một thành phần hóa học của Mg3Si4O10(OH)2. Mặc dù các thành phần của bột talc thường nằm gần với công thức tổng quát này, thay thế một số chất xảy ra. Một lượng nhỏ Al hoặc Ti có thể thay thế cho Si; một lượng nhỏ Fe, Mn và Al có thể thay thế cho Mg; và, một lượng rất nhỏ của Ca có thể thay thế cho Mg. Khi số lượng lớn Fe thay thế cho Mg khoáng chất được biết đến như "minnesotaite". Khi số lượng lớn Al thay thế cho Mg khoáng chất được biết đến như pyrophyllite. Bột talc được sử dụng như một phụ gia cho thuốc trừ sâu và thuốc diệt nấm. Nó có thể dễ dàng được thổi qua một miệng vòi và dễ dàng dính vào lá và thân cây. Theo Indrayani et al (1993), Mirani (2008) thì trong giai đoạn bảo quản virus để duy trì tính ổn định hiệu quả của virus được sử dụng dưới dạng bột hay dạng lỏng. 24
  33. Đồ án tốt nghiệp Theo Arsyad (2009) vật liệu thường được sử dụng để tạo dạng bột là các chất hữu cơ và khoáng chất như bột talc và tinh bột vì nó như một chất bảo vệ, có khả năng như một chất mang (Foster, 2012). Tác giả Arifin (1993) cho biết, công thức dạng bột sử dụng dịch NPV với nồng độ đã biết trộn với bột talc và tinh bột, để ở nhiệt độ phòng suốt 24h đến khi khô, hỗn hợp được đem đi nghiền và sàng lọc cho đến khi tạo thành dạng bột virus. Glycerol: được xem như chất bảo quản để bảo quản virus. Carboxymethylcellulose (CMC): là một chất gây đậm đặc làm thay đổi độ nhớt của dịch phun, tránh tạo ra những giọt nhỏ trong quá trình phun và tránh sự bay hơi của các giọt sau khi phun. Nó cũng có tác dụng như chất chống rửa trôi, ngoài ra còn được sử dụng để tăng độ nhớt và hạn chế sự rửa trôi khỏi mặt lá. Theo Chalit (1992) cho biết, khi bổ sung bột sữa, rỉ đường, CMC và Triton CS7 vào dịch NPV thì cho tỷ lệ tử vong của sâu cao hơn so với việc chỉ sử dụng dịch virus đông lạnh mà không bổ sung thêm các chất phụ gia và chất mang. 25
  34. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài nghiên cứu được tiến hành từ tháng 3/2018 đến tháng 8/2018 tại phòng thí nghiệm Viện Khoa Học Ứng Dụng của trường Đại Học Công Nghệ TP HCM - HUTECH. 2.2. Vật liệu 2.2.1 Nguyên liệu Nguồn sâu : Sâu khoang được thu tại ruộng rau muống ở khu vực xã Nhị Bình, huyện Hóc Môn, được đem về phòng thí nghiệm nuôi trên môi trường thức ăn nhân tạo. Nguồn virus : Do phòng thí nghiệm của Viện Khoa học Ứng Dụng, Đại Học Công Nghệ Tp.Hồ Chí Minh cung cấp. 2.2.2 Dụng cụ Hộp nuôi sâu Đầu tuýp Kẹp, chổi lông bắt sâu Ống nghiệm Cân điện tử Bút lông ghi mẫu Máy xay sinh tố Bông gòn, khăn giấy Các loại cốc thủy tinh Bao nhựa, giấy báo Các loại pipette Đèn cồn Micropipette Thiết bị: Kính hiển vi Máy ly tâm Buồng đếm hồng cầu Bếp từ Tủ lạnh Tủ sấy 2.2.3 Hóa chất Agar Methyl-paraben 26
  35. Đồ án tốt nghiệp Formaldehyde Bột talc Acid sorbic Bột mì Acid ascorbic CMC Men bánh mì Glycerol Vitamin E Tween 80 NaCl Rỉ đường 2.3 Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Ảnh hƣởng của Acid boric đến hiệu lực diệt sâu của NPV Sâu chết do NPV Nghiền lọc, ly tâm Sâu bắt ngoài đồng Đ ịnh lượng dịch virus Nuôi trên thức ăn nhân tạo Acid boric Pha loãng 108 PIB/ml 1,2,3,4% Nhộng NPV 5 x 107 PIB/ml + acid boric Trưởng thành Hút 100 µL Trứng Hiệu lực gây chết Sâu tuổi 4 Hình 2.1. Quy trình thử nghiệm ảnh hưởng của acid boric đến hiệu lực diệt sâu của NPV. 2.3.1.1 Chuẩn bị Chuẩn bị virus : Sâu chết do nhiễm NPV được đem đi nghiền lọc theo tỉ lệ 1 sâu/ 1ml nước cất thu dịch thô, dịch thô được đem đi ly tâm 2 lần theo phương pháp của Karma et al (2012). Lần thứ nhất ly tâm 500 vòng/ 10 phút bỏ cặn thu dịch, lần 2 ly 27
  36. Đồ án tốt nghiệp tâm 5000 vòng/15 phút lọc lấy cặn bỏ dịch. Thu cặn định mức bằng với thể tích ban đầu thu được dịch ly tâm. Dịch được đem đi kiểm tra thể vùi bằng buồng đếm hồng cầu dưới kính hiển vi. Sau đó đem định lượng đủ 107 PIB/ml. A B C Hình 2.2. Lấy sâu chết do NPV nghiền cùng với nước cất, lọc và thu dịch thô. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng virus:: Tiến hành dùng micropipet lấy 1ml dịch + 9ml nước muối sinh lý rồi pha loãng tiếp ra nồng độ 10-2 và 10-3. Kiểm tra mật độ thể vùi trên buồng đếm hồng cầu dưới kính hiển vi. Nồng độ PIB/ml được xác định bằng công thức: Hàm lƣợng thể vùi = 5 x a x n x104 ( PIB/ml ) Với: a: số PIB đếm được n: nồng độ pha loãng Chuẩn bị sâu: Sâu khoang được thu tại ruộng rau muống ở khu vực xã Nhị Bình, huyện Hóc Môn, được đem về phòng thí nghiệm nuôi trên môi trường thức ăn nhân tạo đến khi đạt tuổi 4 thì tiến hành thí nghiệm. Thức ăn nhân tạo bao gồm: 200g 28
  37. Đồ án tốt nghiệp bột đậu xanh, 30g men bánh mì, 3,5g ascorbic acid, 2g methyl-paraben, 1g sorbic acid, 2,5ml formaldehyde, 10g agar, 750ml nước cất và 1% vitamin E. Cách chế biến thức ăn: Đậu đã được làm sạch với nước rồi phơi ráo cho vào máy xay sinh tố xay thành bột rồi cho nước cất và các thành phần nguyên liệu: Men bánh mì, Methyl-paraben, Sorbic acid vào máy xay sinh tố xay chung với nhau. Đun agar với nước cho sôi rồi cho vào máy xay sinh tố xay đều rồi cho các nguyên liệu còn lại vào xay đều. Sau đó đổ thức ăn vào hộp nhựa (18x10x6) để nguội. Sâu thu ngoài đồng Nuôi trên môi trường thức ăn nhân tạo Nhộng Trưởng thành Sâu tuổi 1 Sâu tuổi 4 Hình 2.3. Quy trình nuôi sâu phòng thí nghiệm. Chuẩn bị thức ăn : Thức ăn nhân tạo bao gồm: 200g bột đậu xanh, 30g men bánh mì, 3.5g ascorbic acid, 2g methyl-paraben, 1g sorbic acid, 10g agar, 750ml nước cất và 1% vitamin E. (Theo Ahmad et al, 2015). 29
  38. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.4. Thức ăn nhân tạo. Cách chế biến thức ăn: Đậu đã được làm sạch với nước rồi phơi ráo cho vào máy xay sinh tố xay thành bột rồi cho nước cất và các thành phần nguyên liệu: Men bánh mì, Methyl-paraben, Sorbic acid vào máy xay sinh tố xay chung với nhau. Đun agar với nước cho sôi rồi cho vào máy xay sinh tố xay đều rồi cho các nguyên liệu còn lại vào xay đều. Sau đó đổ thức ăn vào hộp nhựa (18x10x6cm) để nguội. Chú ý không được cho formaldehyde vào thức ăn nhân tạo để thử nghiệm. 2.3.1.2 Tiến hành thí nghiệm Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm có 6 công thức: CT1: dịch NPV 5 x 107 PIB/ml CT2: dịch NPV 5 x 107 PIB/ml + acid boric 0,5% CT3: dịch NPV 5 x 107 PIB/ml + acid boric 1% CT4: dịch NPV 5 x 107 PIB/ml + acid boric 1,5% CT5: dịch NPV 5 x 107 PIB/ml + acid boric 2% CT6: đối chứng nước cất. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Mỗi lần nhắc 30 sâu. 30
  39. Đồ án tốt nghiệp Phương pháp lây nhiễm: Lấy 5ml dịch virus có nồng độ 108 PIB/ml đem hòa với 5ml dung dịch acid boric có nồng 1, 2, 3, 4% ta được dịch virus có nồng độ 5 x 107 PIB/ml + acid boric 0,5; 1; 1,5 và 2%. Hình 2.5. Phun dịch và gắp sâu. Thức ăn nhân tạo (không bỏ formaldehyde) cắt làm 40 miếng 2 x 2,25cm cho vào mỗi hộp nhựa, mỗi công thức sử dụng 90 hộp với 30 hộp mỗi lần nhắc. Dùng micropipette hút 100µL dịch đã được pha phun đều vào các cạnh và bề mặt của thức ăn vừa đủ để khô 15 phút, chọn sâu cùng tuổi cùng kích thước gắp sâu (cần gắp nhẹ tay tránh sâu chết hoặc không lột xác được trong quá trình khảo sát) vào hộp và đậy nắp hộp lại. Quan sát sâu mỗi ngày cho đến khi sâu chết hết hoặc hóa nhộng. Chỉ tiêu theo dõi: hiệu lực diệt sâu (%) Hiệu lực diệt sâu đƣợc tính theo công thức Abbott (1925): T H (%) = (1- ) x 100% C Với: H%: hiệu lực diệt sâu (%) T: Số sâu sống ở công thức thí nghiệm C: Số sâu sống ở công thức đối chứng. 31
  40. Đồ án tốt nghiệp 2.3.2 Ảnh hƣởng của rỉ đƣờng đến hiệu lực diệt sâu của NPV Sâu chết do NPV Nghiền lọc, ly tâm Sâu bắt ngoài đồng Dịch virus Nuôi trên thức ăn nhân tạo Định lượng 108PIB/ml Nhộng Rỉ NPV 5 x 107 PIB/sâu + rỉ đường đường Trưởng thành Hút 100µL Trứng Hiệu lực diệt sâu Sâu tuổi 4 Hình 2.6 Quy trình thử nghiệm ảnh hưởng của rỉ đường đến hiệu lực diệt sâu của NPV. 2.3.2.1 Chuẩn bị Chuẩn bị virus : Sâu chết do nhiễm NPV được đem đi nghiền lọc theo tỉ lệ 1 sâu/ 1ml nước cất thu dịch thô, dịch thô được đem đi ly tâm 2 lần theo phương pháp của Karma et al (2012). Lần thứ nhất ly tâm 500 vòng/ 10 phút bỏ cặn thu dịch, lần 2 ly tâm 5000 vòng/15 phút lọc lấy cặn bỏ dịch. Thu cặn định mức bằng với thể tích ban đầu thu được dịch ly tâm. Dịch được đem đi kiểm tra thể vùi bằng buồng đếm hồng cầu dưới kính hiển vi. Sau đó định lượng dịch 108 PIB/ml. 32
  41. Đồ án tốt nghiệp Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng virus:: Tiến hành dùng micropipet lấy 1ml dịch + 9ml nước muối sinh lý rồi pha loãng tiếp ra nồng độ 10-2 và 10-3. Kiểm tra mật độ thể vùi trên buồng đếm hồng cầu dưới kính hiển vi. Nồng độ PIB/ml được xác định bằng công thức: Hàm lƣ ợng thể vùi = 5 x a x n x104 ( PIB/ml ) Với: a: số PIB đếm được n: nồng độ pha loãng Chuẩn bị sâu: Sâu khoang được thu tại ruộng rau muống ở khu vực xã Nhị Bình, huyện Hóc Môn, được đem về phòng thí nghiệm nuôi trên môi trường thức ăn nhân tạo đến khi đạt tuổi 4 thì tiến hành thí nghiệm. Thức ăn nhân tạo bao gồm: 200g bột đậu xanh, 30g men bánh mì, 3,5g ascorbic acid, 2g methyl-paraben, 1g sorbic acid, 2,5ml formaldehyde, 10g agar, 750ml nước cất và 1% vitamin E (Theo Ahmad et al, 2015). Cách chế biến thức ăn: Đậu đã được làm sạch với nước rồi phơi ráo cho vào máy xay sinh tố xay thành bột rồi cho nước cất và các thành phần nguyên liệu: Men bánh mì, Methyl-paraben, Sorbic acid vào máy xay sinh tố xay chung với nhau. Đun agar với nước cho sôi rồi cho vào máy xay sinh tố xay đều rồi cho các nguyên liệu còn lại vào xay đều. Sau đó đổ thức ăn vào hộp nhựa (18x10x6) để nguội. Chuẩn bị thức ăn : Thức ăn nhân tạo bao gồm: 200g bột đậu xanh, 30g men bánh mì, 3,5g ascorbic acid, 2g methyl-paraben, 1g sorbic acid, 10g agar, 750ml nước cất và 1% vitamin E. Cách chế biến thức ăn: Đậu đã được làm sạch với nước rồi phơi ráo cho vào máy xay sinh tố xay thành bột rồi cho nước cất và các thành phần nguyên liệu: Men bánh mì, Methyl-paraben, Sorbic acid vào máy xay sinh tố xay chung với nhau. Đun agar với nước cho sôi rồi cho vào máy xay sinh tố xay đều rồi cho các nguyên liệu còn 33
  42. Đồ án tốt nghiệp lại vào xay đều. Sau đó đổ thức ăn vào hộp nhựa (18x10x6) để nguội. Chú ý không được cho formaldehyde vào thức ăn nhân tạo để thử nghiệm. 2.3.2.2 Tiến hành thí nghiệm Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm có 6 công thức: CT1: dịch NPV 5 x 107 PIB/ml CT2: dịch NPV 5 x 107 PIB/ml + rỉ đường 2% CT3: dịch NPV 5 x 107 PIB/ml + rỉ đường 5% CT4: dịch NPV 5 x 107 PIB/ml + rỉ đường 10% CT5: dịch NPV 5 x 107 PIB/ml + rỉ đường 5% + acid boric 1% CT6: đối chứng nước cất. Thí nghiệm lặp lại 3 lần, mỗi lần 30 sâu. Phương pháp lây nhiễm: Lấy 5ml dịch huyền phù có nồng độ 108 PIB/ml đem hòa với 5ml dịch rỉ đường 4, 10, 20% để được dung dịch NPV 5 x 107 PIB/ml + rỉ đường 2; 5; 10% và 1% acid boric. Thức ăn nhân tạo (không bỏ formaldehyde) cắt làm 40 miếng 2 x 2,25cm cho vào mỗi hộp nhựa, mỗi công thức sử dụng 90 hộp với 30 hộp mỗi lần nhắc. Dùng micropipette hút 100µL phun đều vào các cạnh và bề mặt của thức ăn vừa đủ để khô 15 phút, chọn sâu cùng tuổi cùng kích thước gắp sâu (cần gắp nhẹ tay tránh sâu chết hoặc không lột xác được trong quá trình khảo sát) vào hộp (Karma , 2012) và đậy nắp hộp lại. Quan sát sâu mỗi ngày cho đến khi sâu chết hoặc hóa nhộng. 34
  43. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.7 Các hộp thức ăn được phun dịch và gắp sâu. Chỉ tiêu theo dõi: Hiệu lực diệt sâu (%) Hiệu lực diệt sâu đƣợc tính theo công thức: T H% = (1- ) x 100% C Với: H: hiệu lực diệt sâu (%) T: Số sâu sống ở công thức thí nghiệm C: Số sâu sống ở công thức đối chứng. 2.3.3 Ảnh hƣởng của chất mang và chất phụ gia trong việc tạo chế phẩm Sâu chết do NPV Nghiền lọc, ly tâm 35
  44. Đồ án tốt nghiệp mk Sâu thu ngoài đồng Dịch virus Nuôi trên thức ăn nhân tạo Trộn chế phẩm Nhộng 7 NPV 5 x 10 PIB/ml + phụ gia và chất mang Trưởng thành Hút 100µL Trứng Hiệu lực diệt sâu Sâu tuổi 4 Hình 2.8. Quy trình thử nghiệm ảnh hưởng của rỉ đường đến hiệu lực diệt sâu của NPV. 2.3.3.1 Chuẩn bị Chuẩn bị virus: Sâu chết do nhiễm NPV được đem đi nghiền lọc theo tỉ lệ 1 sâu/ 1ml nước cất thu dịch thô, dịch thô được đem đi ly tâm 2 lần theo phương pháp của Karma et al (2012). Lần thứ nhất ly tâm 500 vòng/ 10 phút bỏ cặn thu dịch, lần 2 ly tâm 5000 vòng/15 phút lọc lấy cặn bỏ dịch. Thu cặn định mức bằng với thể tích ban đầu thu được dịch ly tâm. Dịch được đem đi kiểm tra thể vùi bằng buồng đếm hồng cầu dưới kính hiển vi. Sau đó định lượng dịch 108 PIB/ml. Phương pháp xác định hàm lượng virus: Tiến hành dùng micropipet lấy 1ml dịch + 9ml nước muối sinh lý rồi pha loãng tiếp ra nồng độ 10-2 và 10-3. Kiểm tra mật độ thể 36
  45. Đồ án tốt nghiệp vùi trên buồng đếm hồng cầu dưới kính hiển vi. Nồng độ PIB/ml được xác định bằng công thức: Hàm lƣợng thể vùi = 5 x a x n x104 ( PIB/ml ) Với: a: số PIB đếm được n: nồng độ pha loãng Chuẩn bị sâu: Sâu khoang được thu tại ruộng rau muống ở khu vực xã Nhị Bình, huyện Hóc Môn, được đem về phòng thí nghiệm nuôi trên môi trường thức ăn nhân tạo đến khi đạt tuổi 4 thì tiến hành thí nghiệm. Thức ăn nhân tạo bao gồm: 200g bột đậu xanh, 30g men bánh mì, 3.5g ascorbic acid, 2g methyl-paraben, 1g sorbic acid, 2.5ml formaldehyde, 10g agar, 750ml nước cất và 1% vitamin E. Cách chế biến thức ăn: Đậu đã được làm sạch với nước rồi phơi ráo cho vào máy xay sinh tố xay thành bột rồi cho nước cất và các thành phần nguyên liệu: Men bánh mì, Methyl-paraben, Sorbic acid vào máy xay sinh tố xay chung với nhau. Đun agar với nước cho sôi rồi cho vào máy xay sinh tố xay đều rồi cho các nguyên liệu còn lại vào xay đều. Sau đó đổ thức ăn vào hộp nhựa (18x10x6cm) để nguội. Chuẩn bị thức ăn: Thức ăn nhân tạo bao gồm: 200g bột đậu xanh, 30g men bánh mì, 3.5g ascorbic acid, 2g methyl-paraben, 1g sorbic acid, 10g agar, 750ml nước cất và 1% vitamin E. Cách chế biến thức ăn: Đậu đã được làm sạch với nước rồi phơi ráo cho vào máy xay sinh tố xay thành bột rồi cho nước cất và các thành phần nguyên liệu: Men bánh mì, Methyl-paraben, Sorbic acid vào máy xay sinh tố xay chung với nhau. Đun agar với nước cho sôi rồi cho vào máy xay sinh tố xay đều rồi cho các nguyên liệu còn 37
  46. Đồ án tốt nghiệp lại vào xay đều. Sau đó đổ thức ăn vào hộp nhựa (18x10x6cm) để nguội. Chú ý không được cho formaldehyde vào thức ăn nhân tạo để thử nghiệm. 2.3.3.2 Tiến hành thí nghiệm Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được chia thành 6 công thức: CT1: dịch NPV 5 x 107 PIB/ml CT2: dịch NPV 5 x 107 PIB/ml + glycerol 10% CT3: dịch NPV 5 x 107 PIB/ml + glycerol 10% + bột talc CT4: dịch NPV 5 x 107 PIB/ml + glycerol 10% + CMC 5% + bột talc CT5: dịch NPV 5 x 107 PIB/ml + glycerol 10% + CMC 10% + bột talc CT6: đối chứng nước cất Thí nghiệm lặp lại 3 lần. mỗi lần nhắc 30 sâu. Phương pháp lây nhiễm: Pha loãng dịch ra nồng độ 10-1 trộn với glycerol 10%, CMC ở 5%; 10% thêm bột talc vừa đủ. Thức ăn nhân tạo (không bỏ formaldehyde) cắt làm 40 miếng 2 x 2,25cm cho vào mỗi hộp nhựa, mỗi công thức sử dụng 90 hộp với 30 hộp mỗi lần nhắc. Hòa tan 1g bột vào 1 lít nước tạo thành dịch lỏng. Dùng micropipette hút 100µL phun đều vào các cạnh và bề mặt thức ăn vừa thấm đủ để khô 15 phút, chọn sâu cùng tuổi cùng kích thước sâu (cần gắp nhẹ tay tránh sâu chết hoặc không lột xác được trong quá trình khảo sát) vào hộp (Karma, 2012) và đậy nắp hộp lại. Quan sát sâu mỗi ngày cho đến khi sâu chết hoặc hóa nhộng. Chỉ tiêu theo dõi: số sâu chết và hiệu lực diệt sâu của NPV. Hiệu lực diệt sâu đƣợc tính theo công thức: T H% = (1- ) x 100% C 38
  47. Đồ án tốt nghiệp Với: H: hiệu lực diệt sâu (%) T: Số sâu sống ở công thức thí nghiệm C: Số sâu sống ở công thức đối chứng. 39
  48. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hƣởng của acid boric đến hiệu lực trừ sâu của NPV Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của chất bổ sung acid boric đến hiệu lực diệt sâu (%) của NPV qua các ngày nhiễm ở các công thức. Hiệu lực diệt sâu (%) Công thức 5 ngày 7 ngày Dịch NPV 5x107 PIB/ml 6,67d 63,33c Dịch NPV 5x107 PIB/ml + acid boric 0,5% 15,56c 71,11bc Dịch NPV 5x107 PIB/ml + acid boric 1% 23,33bc 85,56a Dịch NPV 5x107 PIB/ml + acid boric 1,5% 25,56b 83,33ab Dịch NPV 5x107 PIB/ml + acid boric 2% 40,00a 87,78a CV (%) 12,15 8,22 Chú thích: số liệu tính được giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD trong cùng một cột có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%. Với ns là không khác biệt thống kê α= 0,05. Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy sau 5 ngày khảo sát thì ở các công thức dịch NPV có bổ sung acid boric đều đem lại hiệu quả diệt sâu cao hơn so với dịch NPV không bổ sung acid boric. Cụ thể khi bổ sung acid boric ở nồng độ 0,5%; 1%; 1,5% và 2% cho hiệu lực diệt sâu lần lượt là 15,56%; 23,33%; 25,56% và 40%. Trong khi đó bổ sung acid boric 0,5% và 1% cho hiệu lực diệt sâu không sai khác. Sau 7 ngày thử nghiệm thì hiệu lực diệt sâu ở các công thức tăng lên đáng kể. Việc bổ sung acid boric cũng làm tăng hiệu lực diệt sâu lên đáng kể so với việc không bổ sung acid boric. Tuy nhiên ở công thức NPV có bổ sung 0,5% acid boric cho hiệu lực không sai khác so với không bổ sung acid boric vào NPV. Khi bổ sung acid boric ở nồng độ 1%; 1,5% và 2% vào NPV thì cho kết quả không sai khác nhau với hiệu lực diệt sâu lần lượt là 85,56%; 83,33% và 87,78%. 40
  49. Đồ án tốt nghiệp Như vậy, khi bổ sung acid boric từ 1 – 2% thì làm tăng đáng kể hiệu lực diệt sâu của NPV. Kết quả này cũng chỉ ra việc có thể sử dụng phối hợp acid boric với NPV để làm tăng hiệu lực diệt sâu. 7 5.10 5.107 5.107 5.107 5.107 Hình 3.1. Ảnh hƣởng của chất bổ sung acid boric đến hiệu lực diệt sâu (%) của NPV qua các ngày nhiễm ở các công thức. Acid boric được sử dụng để diệt côn trùng như kiến, gián, tuy nhiên bổ sung ở nồng độ khoảng 2% thì có thể tăng khả năng diệt sâu của dịch NPV. So với kết quả của Juan Cisneros et al (2002), theo các tác giả khi bổ sung acid boric vào dịch NPV với nồng độ 0,5 – 4% làm tăng khả năng gây chết sâu của NPV. Tuy nhiên 0,5 – 1% thì cho kết quả không khác so với dịch NPV không bổ sung acid boric. Khi tăng lượng acid boric trên mức này thì hiệu lực diệt sâu tăng lên đáng kể. Trong khi ở nghiên cứu này thì khi bổ sung acid boric từ 1 – 2% cũng làm tăng hiệu lực diệt sâu so với dịch NPV không bổ sung acid boric. 41
  50. Đồ án tốt nghiệp 3.2 Ảnh hƣởng của rỉ đƣờng đến hiệu lực diệt sâu của NPV Nhiều nghiên cứu cho biết bổ sung rỉ đường đều làm tăng hiệu lực diệt sâu của NPV trên đồng ruộng (FAO, 2012; Karma et al, 2012). Tuy nhiên cơ chế làm tăng hiệu lực diệt sâu của rỉ đường vẫn còn nhiều ý kiến khác nhau. Theo Shapiro et al (1983) bổ sung rỉ đường 5% có khả năng bảo vệ NPV khỏi tác động của tia cực tím. Còn theo Burges (1998) bổ sung rỉ đường vào NPV có tác dụng làm tăng khả năng ăn của sâu và nhờ đó tăng hiệu lực diệt sâu của NPV. Bảng 3.2 Ảnh hƣởng của chất bổ sung rỉ đƣờng đến hiệu lực diệt sâu (%) của NPV qua các ngày nhiễm ở các công thức. Hiệu lực diệt sâu (%) Công thức 5 ngày 7 ngày Dịch NPV 5x107 PIB/ml 6,67b 63,33c Dịch NPV 5x107 PIB/ml + rỉ đường 2% 25,56a 70,00bc Dịch NPV 5x107 PIB/ml + rỉ đường 5% 26,67a 76,67b Dịch NPV 5x107 PIB/ml + rỉ đường 10% 27,78a 73,33bc Dịch NPV 5x107 PIB/ml + acid boric 1% + rỉ đường 5% 33,33a 94,44a CV (%) 15,62 6,32 Chú thích: số liệu tính được giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD trong cùng một cột có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% Với ns là không khác biệt thống kê α= 0,05. 42
  51. Đồ án tốt nghiệp 5.107 5.107 5.107 5.107 5.107 Hình 3.2 Ảnh hƣởng của chất bổ sung rỉ đƣờng đến hiệu lực diệt sâu (%) của NPV qua các ngày nhiễm ở các công thức. Kết quả ở bảng 3.2 cho biết, sau 5 ngày khảo sát thì hiệu lực diệt sâu ở các công thức đều tăng. Các công thức bổ sung rỉ đường 2%, 5%, 10% thì cao hơn so với dịch không bổ sung rỉ đường. Sau 7 ngày khảo sát thì hiệu lực diệt sâu ở tất cả các công thức đều tăng đáng kể. Khi bổ sung rỉ đường 2% vào dịch NPV đạt hiệu lực 70% không sai khác với khi bổ sung sung rỉ đường 10% vào dịch là 73,33%. Dịch NPV + 5% rỉ đường cho hiệu lực diệt sâu đạt 76,67% cao hơn so với khi bổ sung rỉ đường 2 và 10%. Tuy nhiên khi trộn thêm 1% acid boric với 10% rỉ đường vào dịch NPV thì đạt hiệu lực cao nhất với 94,44%. Như vậy, việc bổ sung rỉ đường 5% vào NPV cho hiệu lực diệt sâu cao hơn so với không bổ sung. Mặc khác bổ sung rỉ đường 5% kết hợp với bổ sung acid boric 1% 43
  52. Đồ án tốt nghiệp cho hiệu lực diệt sâu cao nhất. Kết quả này cũng trùng với kết quả của một số tác giả khác. Theo Shapiro et al (1983) cho biết bổ sung rỉ đường với 5 % cho hiệu quả diệt sâu tốt nhất. Đánh giá hiệu lực diệt sâu của việc sử dụng các chất phụ gia để tăng hiệu lực diệt sâu, A.Mehvar et al (1975) cho biết việc sử dụng các chất phụ gia đã làm tăng tỉ lệ chết của sâu lên đáng kể so với việc chỉ phun virus đơn độc, tác giả cũng khuyến cáo sử dụng rỉ đường ở mức 5%. 3.3 Ảnh hƣởng của chất mang đến hiệu lực diệt sâu của NPV Bảng 3.3 cho thấy, sau 4 ngày khảo sát số sâu chết ở các công thức so với đối chứng thì không sai khác nhau. Sang ngày thứ 5 thì sâu bắt ở các công thức dịch NPV bắt đầu chết. Qua ngày thứ 7 thì số liệu sâu chết tăng lên đáng kể, ở công thức dịch NPV bổ sung glycerol 10% cho kết quả sâu chết nhiều nhất với số sâu trung bình là 27,33 sâu. Tuy nhiên cũng không sai khác với dịch NPV đơn độc không bổ sung phụ gia và chất mang. Công thức dịch NPV + 10% glycerol + 10% CMC + bột Talc lần lượt là 26,67 sâu và 25,67 sâu. Kết quả sau 8 ngày nhiễm ở bảng 3.3 thì số sâu chết cũng tăng lên. Số lượng sâu chết nhiều nhất vẫn ở công thức dịch NPV +10% glycerol với 29,33 sâu và không sai khác với công thức dịch NPV đơn độc với lượng sâu chết 28,67 sâu. Dịch NPV +10% glycerol + CMC 5%; 10% + bột talc cho số lượng sâu chết lần lượt là 26,33 sâu và 26,67 sâu không sai khác so với dịch NPV +10% glycerol + bột talc không bổ sung CMC với lượng sâu chết là 26,00 sâu. Bảng 3.3 Ảnh hƣởng của chất mang bổ sung đến hiệu lực diệt sâu (%) của NPV qua các ngày nhiễm ở các công thức. Kí Số sâu chết theo từng ngày Công thức hiệu 5 ngày 6 ngày 7 ngày 8 ngày ĐC Nước cất 0,00b 0,00b 0,00d 0,00d 44
  53. Đồ án tốt nghiệp CT1 NPV 5x107 PIB/ml (dịch gốc) 8,33a 17,33a 26,67ab 28,67ab NPV 5x107 PIB/ml + Glycerol CT2 7,67a 17,33a 27,33a 29,33a 10% NPV 5x107 PIB/ml + Glycerol CT3 7,00a 15,33a 23,33c 26,00c 10% + Bột talc NPV 5x107 PIB/ml + Glycerol CT4 9,33a 16,67a 25,33b 26,33bc 10% + CMC 5%+ Bột talc NPV 5x107 PIB/ml + Glycerol CT5 8,33a 16,33a 25,67ab 26,67bc 10% + CMC 10%+ Bột talc CV (%) 29,09 10,08 4,54 6,01 Chú thích: số liệu tính được giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD trong cùng một cột có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%. Với ns là không khác biệt thống kê α= 0,05. Bảng 3.4 Ảnh hƣởng của chất mang bổ sung đến hiệu lực diệt sâu (%) của NPV qua các ngày nhiễm ở các công thức. CT Công thức Hiệu lực diệt sâu (%) sau 8 ngày 1 NPV 5x107 PIB/ml 95,56ab 2 NPV 5x107 PIB/ml + Glycerol 10% 97,78a 3 NPV 5x107 PIB/ml + Glycerol 10% + Bột talc 86,67b 4 NPV 5x107 PIB/ml + Glycerol 10% + CMC 87,78b 5%+ Bột talc 5 NPV 5x107 PIB/ml + Glycerol 10% + CMC 88,89b 10%+ Bột talc CV (%) 8,46 45
  54. Đồ án tốt nghiệp Chú thích: số liệu tính được giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD trong cùng một cột có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%. Với ns là không khác biệt thống kê α= 0,05. Theo kết quả ở bảng 3.4 cho thấy ở công thức NPV + 10% glycerol có hiệu lực diệt sâu cao nhất với 97,78%. Tuy nhiên vẫn không sai khác so với hiệu lực diệt sâu của dịch NPV đơn độc không bổ sung phụ gia hay chất mang. Ở các công thức NPV có bổ sung chất phụ gia và chất mang thì cho hiệu lực diệt sâu như nhau. Cụ thể như, dịch NPV + 10% glycerol + bột talc; dịch NPV + 10% glycerol + CMC 5% + bột talc và dịch NPV + 10% glycerol +CMC 10% + bột talc cho hiệu lực diệt sâu có kết quả lần lượt là 86,67%; 87,78% và 88,89% và không sai khác có ý nghĩa so với giữa chúng với nhau và so với đối chứng không bổ sung. Như vậy, bổ sung glycerol 10% bổ sung bột talc hoặc bổ sung glycerol + bột talc + CMC không làm giảm có ý nghĩa hiệu lực diệt sâu của NPV sau 8 ngày khảo sát. Kết quả trên cũng trùng khớp với kết quả của một vài tác giả. Theo Karma et al (2012) thì khi tác giả sử dụng chất mang để bổ sung vào dịch NPV cũng không cho hiệu quả diệt sâu cao hơn khi sử dụng dịch NPV đơn độc hoặc dịch NPV bổ sung thêm 10% glycerol. Nhưng tác giả Chalit (1992) lại cho rằng, khi bổ sung các chất phụ gia và chất mang cụ thể là CMC, bột sữa, triton CS7, dầu đậu nành vào NPV thì cho tỷ lệ sâu chết cao hơn so với việc chỉ sử dụng dịch NPV đơn độc. Kết quả này cho phép sử dụng bổ sung glycerol, CMC và bột talc để tạo chế phẩm SLNPV. 46
  55. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Bổ sung acid boric ở các nồng độ 1%; 1,5%; 2% vào dịch NPV đều cho hiệu lực diệt sâu của NPV tương ứng 85,56%; 83,33% và 87,78% - cao hơn so với việc không bổ sung acid boric. Bổ sung rỉ đường 5% làm tăng hiệu lực diệt sâu của NPV. Bổ sung rỉ đường 2% và 10% không làm tăng có ý nghĩa hiệu lực diệt sâu của NPV. Hiệu lực diệt sâu lên cao nhất là 94,44% khi bổ sung 1% acid boric + 5% rỉ đường vào dịch NPV. Có thể sử dụng dịch NPV đơn độc, dịch NPV bổ sung thêm 10% glycerol hoặc dịch NPV bổ sung 10% glycerol + 10% CMC + bột talc vừa đủ để tạo chế phẩm NPV dạng bột. 4.2 Kiến nghị Có thể sử dụng acid boric ở mức 1% với dịch NPV khi phun trên đồng để làm tăng hiệu lực diệt sâu của NPV. Thử nghiệm hiệu lực diệt sâu của NPV có bổ sung acid boric và rỉ đường trên đồng ruộng. Có thể sử dụng glycerol, CMC, bột talc để tạo chế phẩm SLNPV và thử nghiệm trên đồng ruộng. 47
  56. Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO A. TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI A. Mehrvar, R.J. Rabindra, K. Veenakumari and G.B. Narabenchi, 1975, Evaluation of Adjuvants for Increased Efficacy of HearNPV Against Helicoverpa armigera (Hubner) Using Suntest Machine, Article in Bulletin of entomological research 65(03):507 - 514 · October 1975 with 23. Ahmad-Ur-Rahman Saljoqi, Riaz ul Haq, Ehsan-ul-haq, Javed G. Khan, Ghulam Ali, Rearing of Spodoptera litura (Fabricius) on Different Artificial Diets and its Parasitization with Trichogramma chilonis (Ishii). Arsyad, M. 2009. Studi Isolasi Bakteri Rhizobium yang Diinokulasikan Ke Dalam Dolomit Sebagai Pembawa (Carrier) Serta Pemanfaatannya Sebagai Pupuk Mikroba. Thesis. University of North Sumatra. Medan Bijjur, S., K.A. Kulkarni and S.Lingappa. 1993. Evaluation of nuclearpolyhedrosis virus with certain adjuvants for the control of Helicoverpaarmigera (Hubner). Karnataka J. Agric. Sci. Bujjur, S., Kulkarni, K. A., and Lingappa, S. 1991. Evaluation of nuclear polyhedrosis with certain adjuvants for the control of Heliothis armigera (Hu¨bner). Indian J. Entomol. Burges, H. D., and Jones, K. A. 1998. Formulation of bacteria, viruses and protozoa to control insects. In “Formulation of Microbial Biopesticides: Beneficial Microorganisms, Nematodes and Seed Treatments” (H. D. Burges, Ed.),. Kluwer Academic, Dordrecht. CABI. 2009. Crop protection compendium: global module. Commonwealth Agricultural Bureau International, Wallingford, UK. Chalit Mahattana-art, 1992, Bioinsecticide formulation of nuclear polyhedrosis virus of the American bollworm, Heliothis armigera (Hubner), Kasetsart Univ, Bangkok (Thailand), Graduate shool [Corporate Author]. 48
  57. Đồ án tốt nghiệp Chari, M. S. andS. N. Patel. 1983. Cotton leaf worm Spodoptera litura Fabricius its biology and integrated control measures. Cotton Dev Chundurwar, R. M., Pawar, V. M., and More, M. R. 1990. Efficacy of nuclear polyhedrosis virus in combination with boric acid and tannic acid against Helicoverpa armigera (Hu¨b.) on chickpea. Int. Chickpea Newsl. Doane, C. C., and Wallis, R. C. 1964. Enhancement of the action of Bacillus thuringiensis var. thuringiensis Berliner on Porthetria dispar (Linnaeus) in laboratory tests. J. Insect Pathol. EPPO/CABI. 1997. Spodoptera littoralis and Spodoptera litura. In: Smith IM, McNamara DG, Scott PR, Holderness M, eds. Quarantine pests for Europe. 2nd edition. Wallingford, UK: CAB Internationa Foster, N. 2012. What Is Corn Starch. cornstarch.htm. Retrieved October 16 at 18:09 pm. G. P. Gupta; Sidra Rani; A. Birah; Mahadevan Raghuraman (2005), Improved artificial diet for mass rearing of the tobacco caterpillar, Spodoptera litura (Lepidoptera Noctuidae). Govindarajan, R., Jayaraj, S., and Narayanan, K. 1976. Mortality of the tobacco caterpillar, Spodoptera litura (F.) when treated with Bacillus thuringiensis combinations with boric acid and insecticides. Phytoparasitica. Hayes, W. J., Jr., and Laws, E. R. 1991. “Handbook of Pesticide Toxicology.” Academic Press, San Diego. Hill, D. S. 1975. Agricultural insect pests of the tropics and their control. Cambridge Univ. Press, London. Hoover K, Grove M, Gardner M, Hughes DP, McNeil, J, & Slavicek J (2011). A. Gene for an extended phenotype. Science (New York, N.Y), 333 (6048) PMID: 21903803. 49
  58. Đồ án tốt nghiệp Indrayani, I.G.A.A., D. Winarno, and Soebandrijo. 1993. Efektivitas Npv Dengan Berbagai. Bahan Pembawa Terhadap Spodoptera litura F. dan Helicoverpa armigera Hubner Pada Kapas. Juli 1995-Juni 1996. Installation Asembagus Research, Situbondo, East Java. Jones, K.A. and D.J. Mckinely. 1986. UV inactivation of Spodoptera litura nuclear polyhedrosis virus in Egypt: assessment and protection. In “Fundamentals and applied aspects of Invertebrate pathology” (eds. Samson, R. A., Vlak, J. M. and Peters, D), Proceedings IV International Colloquium on invertebrate pathology, wageningen, Netherlands. Karma Choden Bhutia et al, 2012, Evaluation and production of improved formulation of nucleopolyhedrosis virus of Spodoptera litura, Bulletin of Insectology 65 (2): 247-256. Lasa, R., C. Ruiz-Portero, M.D. Alcazar, J. E. Belda, P. Caballero and T. Williams. 2007. Efficacy of optical brightener formulations of Spodoptera exigua multiple nucleopolyhedrosis (SeMNPV) as a biological insecticide in green houses in Southern Spain. Biol. Control. Maramorosch, K. and K.E. Sherman. 1985. Viral Insecticides for Biological Control. London: Academic Press Inc. Morris, O. N., Converse, V., and Kanagaratnam, P. 1995. Chemical additive effects on the efficacy of Bacillus thuringiensis Berliner subsp. kurstaki against Mamestra configurata (Lepidoptera: Noctuidae). J. Econ. Entomol. Morris, O.N. 1971. The effect of sunlight, ultraviolet, gamma radiations and temperature on infectivity of a nulearpolyhedrosis virus. J. Invertebr. Pathol. S. Prabhu and C.A. Mahalingam, 2017, Effect of Sunlight and UV Light against DpNPV (Nuclear Polyhedrosis Virus) Formulation on Larval Mortality of Mulberry 50
  59. Đồ án tốt nghiệp Leaf Webber, Diaphania pulverulentalis Hampson, International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. S. Sachithanandam, R.J. Ranbindra and Jayaraj, 1989, Pot Culture Studies on the Efficacy of NPV Formulationsagainst theTobacco Cut Worm Spodoptera litura (F.) larvae on groundnut. Shapiro, M., and Bell, R. A. 1982. Enhanced effectiveness of Lymantria dispar (Lepidoptera: Lymantriidae) nucleopolyhedrosis virus formulated with boric acid. Ann. Entomol. Soc. Am. Shapiro, M., and Dougherty, E. M. 1994. Enhancement in activity of homologous and heterologous viruses against the gypsy moth (Lepidoptera: Lymantriidae) by an optical brightener. J. Econ. Entomol. Shapiro, M., P. P. Agnin and R. A. Bell. 1983. Ultraviolet protectants of the gypsy moth (Lepidoptera: Lymantriidae) nucleopolyhedrosis virus. Environ. Entomol. Shapiro, M., R. Robert, J. R. Farrar, J. Domek and I. Javaid. 2002. Effects of virus concentrations and ultraviolet irradiation on the activity of corn earworm and beet armyworm (Lepidoptera: Noctuidae) nucleopolyhedroviruses. J. Econ. Entomol. USDA. 1982. Pests not known to occur in the United States or of limited distribution: Rice cutworm. USDA-APHIS-PPQ. Yadava, R. L. 1970. Studien uber den Einfluss von Wasserglas und Borsaure als chemische Stressoren fur die kunstlich applizierte Kern- und die latente Cytoplasmapolyedorse der Nonne, mit einer Anmerkung uber die gegenseitige Beeinflussung beider Krankheiten. Z. Angew. Entomol. Yamanaka, H., F. Nakasuji, and K. Kiritani, 1975, Development of the tobacco cutworm Spodoptera litura in special reference to the density of larvae. Bull. Koch. Inst. Agric. For Sci. 51
  60. Đồ án tốt nghiệp B. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Thị Hai và Nguyễn Hoài Hương, 2015. Phân lập, định dạng virus gây chết sâu khoang Spodoptera litura (Fabr.) và hiệu lực diệt sâu của chúng. Tạp chí Bảo vệ thực vật số 1 năm 2015, trang 16-23. Nguyễn Thị Như Quỳnh, 2014, Luận văn thạc sĩ “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV-Spl (Nucle Polyhedrosis Virus) từ tế bào gốc sâu khoang để phòng trừ sâu hại cây trồng nông nghiệp”, Học viện nông nghiệp Việt Nam. Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004, Giáo trình Côn trùng Nông nghiệp, phần B: Côn trùng gây hại cây trồng chính ở Đồng bằng sông Cửu Long, Tủ sách Đại Học Cần Thơ. Phạm Thị Thùy, 2004, Công nghệ sinh học trong bảo vệ thực vật, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội. Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành, 2007, Công nghệ sinh học tập 5 Công nghệ vi sinh và môi trường, Nhà xuất bản giáo dục. C. TÀI LIỆU INTERNET a5088.html insect-pests 52
  61. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 1 SỐ LIỆU THÔ I. Ảnh hƣởng của acid boric đến hiệu lực diệt diệt sâu của NPV LẦN 1 Số sâu sống qua Hiệu lực diệt ARCSIN Nghiệm thức các ngày nhiễm sâu (%) 5 ngày 7 ngày 5 ngày 7 ngày 5 ngày 7 ngày 30 30 Nước cất 28 9 6,67 70,00 14,96 56,79 Dịch NPV 5.107 PIB/ml 7 Dịch NPV 5.10 PIB/ml +acid 24 10 20,00 66,67 26,57 54,74 boric 0,5% 7 Dịch NPV 5.10 PIB/ml +acid 21 4 30,00 86,67 33,21 68,58 boric 1% 7 Dịch NPV 5.10 PIB/ml + acid 21 3 30,00 90,00 33,21 71,57 boric 1,5% 7 Dịch NPV 5.10 PIB/ml + acid 19 3 36,67 90,00 37,27 71,57 boric 2% LẦN 2 Số sâu sống qua Hiệu lực diệt ARCSIN Nghiệm thức các ngày nhiễm sâu (%) 5 ngày 7 ngày 5 ngày 7 ngày 5 ngày 7 ngày 30 30 Nước cất 28 12 6,67 60,00 14,96 50,77 Dịch NPV 5.107 PIB/ml 7 Dịch NPV 5.10 PIB/ml +acid 27 9 10,00 70,00 18,43 56,79 boric 0,5% 7 Dịch NPV 5.10 PIB/ml +acid 24 7 20,00 76,67 26,57 61,12 boric 1% 7 Dịch NPV 5.10 PIB/ml + acid 24 7 20,00 76,67 26,57 61,12 boric 1,5% 7 Dịch NPV 5.10 PIB/ml + acid 19 6 36,67 80,00 37,27 63,43 boric 2% 53
  62. Đồ án tốt nghiệp LẦN 3 Số sâu sống qua Hiệu lực diệt ARCSIN Nghiệm thức các ngày nhiễm sâu (%) 5 ngày 7 ngày 5 ngày 7 ngày 5 ngày 7 ngày 30 30 Nước cất 28 12 6,67 60,00 14,96 50,77 Dịch NPV 5.107 PIB/ml 7 Dịch NPV 5.10 PIB/ml +acid 25 7 16,67 76,67 24,09 61,12 boric 0,5% 7 Dịch NPV 5.10 PIB/ml +acid 24 2 20,00 93,33 26,57 75,04 boric 1% 7 Dịch NPV 5.10 PIB/ml + acid 22 5 26,67 83,33 31,09 65,91 boric 1,5% 7 Dịch NPV 5.10 PIB/ml + acid 16 2 46,67 93,33 43,09 75,04 boric 2% II. Ảnh hƣởng của rỉ đƣờng đến hiệu lực diệt diệt sâu của NPV LẦN 1 Số sâu sống qua Hiệu lực diệt ARCSIN Nghiệm thức các ngày nhiễm sâu (%) 5 ngày 7 ngày 5 ngày 7 ngày 5 ngày 7 ngày Nước cất 30 30 Dịch NPV 5.107 PIB/ml 28 9 6,67 70,00 14,96 56,79 Dịch NPV 5.107 PIB/ml + Mật đường 2% 22 9 26,67 70,00 31,09 56,79 Dịch NPV 5.107 PIB/ml + Mật đường 5% 23 7 23,33 76,67 28,88 61,12 Dịch NPV 5.107 PIB/ml + Mật đường 10% 23 9 23,33 70,00 28,88 56,79 Dịch NPV 5.107 PIB/ml + acid boric 1% + Mật đường 10% 19 2 36,67 93,33 37,27 75,04 54
  63. Đồ án tốt nghiệp LẦN 2 Số sâu sống qua Hiệu lực diệt ARCSIN Nghiệm thức các ngày nhiễm sâu (%) 5 ngày 7 ngày 5 ngày 7 ngày 5 ngày 7 ngày Nước cất 30 30 Dịch NPV 5.107 PIB/ml 28 12 6,67 60,00 14,96 50,77 Dịch NPV 5.107 PIB/ml + Mật đường 2% 25 11 16,67 63,33 24,09 52,73 Dịch NPV 5.107 PIB/ml + Mật đường 5% 24 8 20,00 73,33 26,57 58,91 Dịch NPV 5.107 PIB/ml + Mật đường 10% 23 10 23,33 66,67 28,88 54,74 Dịch NPV 5.107 PIB/ml + acid boric 1% + Mật đường 10% 19 2 36,67 93,33 37,27 75,04 55
  64. Đồ án tốt nghiệp LẦN 3 Số sâu sống Hiệu lực diệt ARCSIN Nghiệm thức qua các ngày sâu (%) nhiễm 5 ngày 7 ngày 5 ngày 7 ngày 5 ngày 7 ngày Nước cất 30 30 Dịch NPV 5.107 PIB/ml 28 12 6,67 60,00 14,96 50,77 Dịch NPV 5.107 PIB/ml + Mật đường 2% 20 7 33,33 76,67 35,26 61,12 Dịch NPV 5.107 PIB/ml + Mật đường 5% 19 6 36,67 80,00 37,27 63,43 Dịch NPV 5.107 PIB/ml + Mật đường 10% 19 5 36,67 83,33 37,27 65,91 Dịch NPV 5.107 PIB/ml + acid boric 1% + Mật đường 10% 22 1 26,67 96,67 31,09 79,48 56
  65. Đồ án tốt nghiệp III. Ảnh hƣởng của chất phụ gia và chất mang đến hiệu lực diệt sâu của NPV LẦN 1 Số sâu chết qua các ngày Hiệu Nghiệm thức nhiễm TC TC lực diệt 1 2 3 4 5 6 7 8 chết sống sâu (%) Arcsin Nước cất 0 0 0 0 0 0 0 0 0 30 NPV 5.107 PIB/ml (dịch gốc) 0 0 0 3 4 10 9 1 27 3 90,00 71,57 NPV 5.107 PIB/ml + Glycerol 10% 0 0 0 2 6 9 11 1 29 1 96,67 79,48 NPV 5.107 PIB/ml + rỉ đường 5% + Glycerol 10% 0 0 0 5 5 10 6 2 28 2 93,33 75,04 NPV 5.107 PIB/ml + Glycerol 10% + Bột talc 0 0 0 3 7 8 7 1 26 4 86,67 68,58 NPV 5.107 PIB/ml + Glycerol 10% + CMC 5%+ Bột talc 0 0 0 3 6 7 10 0 26 4 86,67 68,58 NPV 5.107 PIB/ml + Glycerol 10% + CMC 10%+ Bột talc 0 0 0 5 5 8 8 1 27 3 90,00 71,57 57
  66. Đồ án tốt nghiệp LẦN 2 Số sâu chết qua các ngày Hiệu Nghiệm thức nhiễm TC TC lực diệt 1 2 3 4 5 6 7 8 chết sống sâu (%) Arcsin 0 0 0 0 0 0 0 0 0 30 - Nước cất 7 NPV 5.10 PIB/ml 0 0 0 0 7 9 10 3 29 1 96,67 79,48 (dịch gốc) 7 NPV 5.10 PIB/ml + 0 0 0 0 6 11 11 1 29 1 96,67 79,48 Glycerol 10% NPV 5.107 PIB/ml + rỉ đường 5% + Glycerol 0 0 0 0 8 7 10 4 29 1 96,67 79,48 10% NPV 5.107 PIB/ml + Glycerol 10% + Bột 0 0 0 2 5 7 8 2 24 6 80,00 63,43 talc NPV 5.107 PIB/ml + Glycerol 10% + CMC 0 0 0 4 7 7 7 0 25 5 83,33 65,91 5%+ Bột talc NPV 5.107 PIB/ml + Glycerol 10% + CMC 0 0 0 3 6 7 9 0 25 5 83,33 65,91 10%+ Bột talc 58
  67. Đồ án tốt nghiệp LẦN 3 Số sâu chết qua các ngày Hiệu nhiễm lực diệt Nghiệm thức sâu (%) TC TC sau 8 1 2 3 4 5 6 7 8 chết sống ngày Arcsin 0 0 0 0 0 0 0 0 0 30 - Nước cất 7 NPV 5.10 PIB/ml 0 0 0 3 8 8 9 2 30 0 100,00 90,00 (dịch gốc) 7 NPV 5.10 PIB/ml + 0 0 0 0 9 9 8 4 30 0 100,00 90,00 Glycerol 10% NPV 5.107 PIB/ml + rỉ đường 5% + Glycerol 0 0 0 0 4 12 13 1 30 0 100,00 90,00 10% NPV 5.107 PIB/ml + Glycerol 10% + Bột 0 0 0 0 4 10 9 5 28 2 93,33 75,04 talc NPV 5.107 PIB/ml + Glycerol 10% + CMC 0 0 0 0 8 8 9 3 28 2 93,33 75,04 5%+ Bột talc NPV 5.107 PIB/ml + Glycerol 10% + CMC 0 0 0 0 6 9 11 2 28 2 93,33 75,04 10%+ Bột talc 59
  68. Đồ án tốt nghiệp TB số sâu chết qua các ngày CÔNG THỨC DỊCH 4 5 6 7 8 Nước cất 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NPV 4.10^6 PIB/sâu (dịch gốc) 2,00 8,33 17,33 26,67 28,67 NPV 4X10^6 PIB/ml + Glycerol 10% 0,67 7,67 17,33 27,33 29,33 NPV 4X10^6 PIB/ml + rỉ đường 5% + Glycerol 10% 1,67 7,33 17,00 26,67 29,00 NPV 4X10^6 PIB/ml + Glycerol 10% + Bột talc 1,67 7,00 15,33 23,33 26,00 NPV 4X10^6 PIB/ml + Glycerol 10% + CMC 5%+ Bột talc 2,33 9,33 16,67 25,33 26,33 NPV 4X10^6 PIB/ml + Glycerol 10% + CMC 10%+ Bột talc 2,67 8,33 16,33 25,67 26,67 60
  69. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 2 SỐ LIỆU XỬ LÝ Hiệu lực diệt sâu đã được quy đổi sang ARCSIN I. Ảnh hƣởng của acid boric đến hiệu lực diệt diệt sâu của NPV Hiệu lực diệt sâu của NPV sau 5 ngày nhiễm HLDS 5 NGAY, ACID BORIC The ANOVA Procedur t Tests (LSD) for N Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 10.97947 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 6.0282 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 39.210 3 2AB B 30.290 3 1.5AB C B 28.783 3 1AB C 23.030 3 0.5AB D 14.960 3 0AB Hiệu lực diệt sâu của NPV sau 7 ngày nhiễm HLDS 7 NGAY, ACID BORIC The ANOVA Procedur t Tests (LSD) for N Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 26.8187 61
  70. Đồ án tốt nghiệp Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 9.4214 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 70.013 3 2AB A 68.247 3 1AB B A 66.200 3 1.5AB B C 57.550 3 0.5AB C 52.777 3 0AB II. Ảnh hƣởng của rỉ đƣờng đến hiệu lực diệt diệt sâu của NPV Hiệu lực diệt sâu của NPV sau 5 ngày nhiễm HLDS 5 NGAY, RI DUONG The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 19.9515 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 8.1261 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 35.210 3 ABRD A 31.677 3 RD10 A 30.907 3 RD5 A 30.147 3 RD2 B 14.960 3 ORD Hiệu lực diệt sâu của NPV sau 7 ngày nhiễm 62
  71. Đồ án tốt nghiệp HLDS 7 NGAY, RI DUONG The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 15.3443 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 7.1264 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 76.520 3 ABRD B 61.153 3 RD5 C B 59.147 3 RD10 C B 56.880 3 RD2 C 52.777 3 ORD III. Ảnh hƣởng của chất phụ gia và chất mang đến hiệu lực diệt sâu của NPV Số sâu chết sau 4 ngày nhiễm „SOSAUCHETCP21.7, 4NGAY‟ The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 2.888889 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 3.0237 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 2.667 3 CT5 A 2.333 3 CT4 A 2.000 3 CT1 A 1.667 3 CT3 63
  72. Đồ án tốt nghiệp A 0.667 3 CT2 „SOSAUCHETCP21.7,4NGAY‟ The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 0.000 3 DC Số sâu chết sau 5 ngày nhiễm „SOSAUCHETCP21.7,5NGAY‟ The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 3.888889 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 3.5082 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 9.333 3 CT4 A 8.333 3 CT1 A 8.333 3 CT5 A 7.667 3 CT2 A 7.000 3 CT3 SOSAUCHETCP21.7,5NGAY‟ The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T 64
  73. Đồ án tốt nghiệp B 0.000 3 DC Số sâu chết sau 6 ngày nhiễm „SOSAUCHETCP21.7,6NGAY‟ The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 1.944444 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 2.4807 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 17.333 3 CT1 A 17.333 3 CT2 A 16.667 3 CT4 A 16.333 3 CT5 A 15.333 3 CT3 „SOSAUCHETCP21.7,6NGAY‟ The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T B 0.000 3 DC Số sâu chết sau 7 ngày nhiễm SOSAUCHETCP21.7,7NGAY‟ The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 65
  74. Đồ án tốt nghiệp Error Mean Square 0.944444 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 1.7289 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 27.3333 3 CT2 B A 26.6667 3 CT1 B A 25.6667 3 CT5 B 25.3333 3 CT4 C 23.3333 3 CT3 „SOSAUCHETCP21.7,7NGAY‟ The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T D 0.0000 3 DC Số sâu chết sau 8 ngày nhiễm „SOSAUCHETCP21.8,8NGAY‟ The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 1.888889 Critical Value of t 2.17881 Least Significant Difference 2.445 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 29.333 3 CT2 66
  75. Đồ án tốt nghiệp B A 28.667 3 CT1 B C 26.667 3 CT5 B C 26.333 3 CT4 C 26.000 3 CT3 „SOSAUCHETCP21.8,8NGAY‟ The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T D 0.000 3 DC Hiệu lực diệt sâu của NPV sau 8 ngày nhiễm „HLDS21.7,CHEPHAM‟ The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 39.89804 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 11.491 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 82.987 3 CT2 B A 80.350 3 CT1 B 70.840 3 CT5 B 69.843 3 CT4 B 69.017 3 CT3 67
  76. Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC 3 HÌNH ẢNH Hình 1. Dịch ly tâm. Hình 2. Dịch đem đi ly tâm. Hình 4. Hộp thức ăn nhân tạo. Hình 3. Pha dịch 68
  77. Đồ án tốt nghiệp Hình 5. Cắt thức ăn thành 40 miếng. Hình 6. Hộp nuôi sâu có thức ăn nhân tạo. Hình 7. Sâu tuổi 4. Hình 8. Phun dịch vào thức ăn nhân tạo. 69
  78. Đồ án tốt nghiệp Hình 9. Gắp sâu vào thức ăn. Hình 10. Các hộp sâu. Hình 12. Thể vùi virus. Hình 11. Buồng đếm. 70
  79. Đồ án tốt nghiệp Hình 13. Sâu ở các công thức. 71
  80. Đồ án tốt nghiệp Hình 14. Sâu chết do NPV. 72