Đồ án Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất NPV (Nucleo polyhedrosis virus) trên ký chủ sâu khoang Spodoptera litura

Nội dung text: Đồ án Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất NPV (Nucleo polyhedrosis virus) trên ký chủ sâu khoang Spodoptera litura

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP.HCM VIỆN KHOA HỌC ỨNG DỤNG HUTECH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SẢN XUẤT CHẾ PHẨM NPV (NUCLEO POLYHEDROSIS VIRUS) TRÊN KÝ CHỦ SÂU KHOANG (SPODOPTERA LITURA) Ngành : CƠNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CƠNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : T.S NGUYỄN THỊ HAI Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HIỀN LONG MSSV: 1411100061 Lớp: 14DSH01 Thành phố Hồ Chí Minh, 2018
2. LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp này là cơng trình nghiên cứu của chúng tơi dưới sự hướng dẫn của Tiến sĩ Nguyễn Thị Hai Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH của trường Đại học Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Những kết quả này hồn tồn khơng sao chép từ các nghiên cứu khoa học khác dưới bất kỳ hình thức nào. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 07 năm 2018 Sinh viên thực hiện Nguyễn Hiền Long
3. LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, chúng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình chúng em. Cảm ơn bố mẹ đã nuơi nấng và tạo điều kiện cho chúng em học tập để chúng em cĩ thành quả như ngày hơm nay. Trong suốt khoảng thời gian học tại trường Đại Học Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, chúng em đã được các Thầy Cơ trong Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH hết lịng hướng dẫn, giúp đỡ chúng em trong quá trình học tập tại trường, cũng như trong quá trình thực hiện đồ án. Chúng em xin chân thành cám ơn đến Thầy Cơ, nhờ cĩ Thầy Cơ đã trang bị kiến thức cho chúng em để cĩ thể thực hiện đồ án này. Chúng em cũng xin cảm ơn Thầy Cơ trong phịng thí nghiệm và các bạn cùng khĩa đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện để chúng em hồn thành đồ án tốt nghiệp. Đặc biệt, chúng em xin chân thành cảm ơn Tiến sĩ Nguyễn Thị Hai đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo chúng em trong suốt quá trình thực hiện đồ án. Cuối cùng, chúng em xin cảm ơn các Thầy Cơ trong hội đồng Phản Biện đã dành thời gian đọc và nhận xét đồ án tốt nghiệp này. Chúng em xin gửi đến Thầy Cơ lời chúc sức khỏe trân trọng nhất. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 07 năm 2018 Sinh viên thực hiện Nguyễn Hiền Long
4. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Mục đích nghiên cứu 1 3. Mục tiêu nghiên cứu 1 4. Nội dung nghiên cứu 2 CHƯƠNG I 3 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Giới thiệu về sâu khoang Spodoptera litura 3 1.1.1 Đặc điểm hình thái của sâu khoang 3 1.1.2 Tập tính sống và quy luật phát sinh gây hại 4 1.1.3 Mức độ gây hại 6 1.2 Các biện pháp phịng trừ sâu khoang 6 1.2.1 Biện pháp canh tác, kỹ thuật 6 1.2.2 Biện pháp sinh học 6 1.3. Giới thiệu về Nucleo Polyhedrosis Virus 7 1.3.1 Giới thiệu chung 7 1.3.2 Đặc điểm hình thái của NPV 9 1.3.3 Cơ chế diệt sâu của NPV 11 1.3.4 Hiệu lực diệt sâu của NPV 113 1.3.5 Ưu điểm và nhược điểm của NPV 14 1.3.5.1 Ưu điểm của chế phẩm NPV 14 1.3.5.1 Nhược điểm của chế phẩm NPV 15 1.4 Các nghiên cứu sử dụng NPV để trừ sâu khoang 135 1.4.1 Các nghiên cứu ngồi nước 15 1.4.2 Các nghiên cứu trong nước 17
5. 1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất chế phẩm NPV 18 1.5.1 Nồng độ lây nhiễm 18 1.5.2 Tuổi sâu 19 1.5.3 Thời gian thu hoạch sâu chết 19 1.6 Quy trình sản xuất chế phẩm NPV 20 1.7 Các sản phẩm NPV trên thị trường 22 CHƯƠNG II 23 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu 23 2.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 23 2.1.2 Vật liệu 23 2.1.3 Dụng cụ và hĩa chất thí nghiệm 23 2.1.3.1 Hĩa chất 23 2.1.3.2 Dụng cụ 23 2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Ảnh hưởng của tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm đến sản lượng NPV 24 2.2.1.1 Chuẩn bị dịch huyền phù NPV 25 2.2.1.2 Chuẩn bị nguồn sâu ký chủ 26 2.2.1.3 Các nghiệm thức bố trí 28 2.2.2 Ảnh hưởng của dịch thơ và dịch ly tâm sử dụng lây nhiễm đến sự nhân lên của virus trong cơ thể sâu 30 2.2.2.1 Chuẩn bị nguồn sâu ký chủ 31 2.2.2.2 Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí 33 2.2.3 Ảnh hướng của thời gian lây nhiễm sâu đến sản lượng NPV 35 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 36 CHƯƠNG III 37 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37
6. 3.1 Ảnh hưởng của tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm đến sản lượng NPV 37 3.1.1 Đánh giá hiệu lực diệt sâu (%) của các nồng độ trên sâu 7 ngày tuổi, 9 ngày tuổi và 11 ngày tuổi 37 3.1.2 Đánh giá sản lượng NPV thu được trên tổng số sâu chết ở các độ tuổi và các nồng độ lây nhiễm 39 3.2 Ảnh hưởng của dịch thơ và dịch ly tâm sử dụng lây nhiễm đến sự nhân lên của virus trong cơ thể sâu 41 3.2.1 Đánh giá hiệu lực diệt sâu (%) của dịch thơ và dịch ly tâm 41 3.2.2 Khối lượng sâu chết (g/sâu) ở cơng thức dịch thơ và dịch ly tâm 42 3.2.3 Tổng vi sinh vật hiếu khí cĩ trong thức ăn sau khi nhiễm 01 ngày 43 3.2.4 Đánh giá sản lượng virus cĩ trong mỗi sâu chết (PIB/sâu chết) giữa cơng thức dịch thơ và dịch ly tâm 44 3.3 Ảnh hướng của thời gian lây nhiễm sâu đến sản lượng NPV 44 3.3.1 Đánh giá hiệu lực diệt sâu (%) của các cơng thức sau 6h, 12h, 24h, 48h, 96h lây nhiễm 44 3.3.2 Khối lượng sâu chết (g) và sản lượng virus (PIB/sâu chết) ở các cơng thức sau 6h, 12h, 24h, 48h, 96h lây nhiễm 46 CHƯƠNG IV 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 4.1 Kết luận 48 4.2 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 Tài liệu Tiếng Việt 49 Tài liệu Tiếng Anh 49 Tài liệu Internet 56 PHỤ LỤC 1 57 DANH MỤC HÌNH ẢNH 57
7. Cơng thức 1 – Dịch thơ 57 Cơng thức 2 – Dịch ly tâm 58 Cơng thức 3 – Đối chứng 58 Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí 59 Sâu chết ở cơng thức ảnh hưởng về thời gian 62 PHỤ LỤC 2 63 SỐ LIỆU THƠ 63 1. Ảnh hưởng của tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm 63 1.1 Hiệu lực diệt sâu . . 63 1.2 Sản lượng virus thu được trên tổng số sâu chết .67 2. Ảnh hưởng của dịch thời gian lây nhiễm 68 2.1 Số sâu chết 68 2.2 Khối lượng sâu ở các cơng thức 701 2.3 Sản lượng virus ở các cơng thức 73 3. Ảnh hưởng của dịch ly tâm và dịch thơ 75 3.1 Số sâu chết ở cơng thức dịch thơ và dịch ly tâm 75 3.2 Khối lượng sâu chết ở cơng thức dịch thơ và dịch ly tâm 76 3.3 Sản lượng virus ở cơng thức dịch thơ và dịch ly tâm 77 3.4 Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí ở cơng thức dịch thơ và dịch ly tâm 77 PHỤ LỤC 3 78 XỬ LÝ SỐ LIỆU 78 1. Hiệu lực diệt sâu sau 8 ngày lây nhiễm của các nồng độ ở sâu 7, 9, 11 ngày tuổi . 78 2. Sản lượng NPV thu được trên tổng số sâu chết ở các độ tuổi và các nồng độ lây nhiễm 79 3. Hiệu lực diệt sâu (%) của dịch thơ và dịch ly tâm 80 4. Khối lượng (g) sâu chết ở cơng thức dịch thơ và dịch ly tâm 86 5. Sản lượng virus (PIB/sâu chết) ở cơng thức dịch thơ và dịch ly tâm 86
8. 6. Tổng vi sinh vật hiếu khí sau khi nhiễm 1 ngày 87 7. Hiệu lực diệt sâu ở cơng thức sau 6h, 12h, 24h, 48h, 96h 88 8. Khối lượng (g) sâu chết ở cơng thức sau 6h, 12h, 24h, 48h, 96h 91 9. Sản lượng virus (PIB/sâu chết) ở cơng thức sau 6h, 12h, 24h, 48h, 96h 92
9. DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT NPV: Nucleopolyhedrosis virus PIB: Polyhedral inclusion body SL: Spodoptera litura CT: Cơng thức ĐC: Đối chứng LT: Ly tâm CLT: Chưa ly tâm
10. DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Spodoptera litura 3 Hình 1.2 Vịng đời sâu khoang 4 Hình 1.3 Cấu tạo của Nucleo Polyhedrosis Virus 8 Hình 1.4 Cơ chế diệt sâu của virus NPV vào cơn trùng 12 Hình 1.5 Chu trình sống của virus cơn trùng 12 Hình 1.6 Biểu hiện của sâu chết do NPV. 13 Hình 1.7 Quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm virus trừ sâu 20 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm đến sản lượng NPV 24 Hình 2.2 Sơ đồ các bước tinh sạch dịch NPV 25 Hình 2.3 Nguồn sâu làm thí nghiệm 26 Hình 2.4 Thức ăn nhân tạo 27 Hình 2.5 Quy trình nuơi sâu phịng thí nghiệm 27 Hình 2.6 Bố trí thí nghiệm 28 Hình 2.7 Quy trình tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của dịch thơ và dịch ly tâm sử dụng lây nhiễm đến sự nhân lên của virus 30 Hình 2.8 Quy trình nuơi sâu phịng thí nghiệm 31 Hình 2.9 Sâu tuổi 4 32 Hình 2.10 (A) CT1-Dịch thơ; (B) CT2-Dịch ly tâm; (C) CT3-Đối chứng 33 Hình 2.11 Quy trình định lượng vi sinh vật hiếu khí 34 Hình 2.12 Sơ đồ quy trình tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm sâu đến sản lượng NPV 35 Hình 3.1 Biểu đồ thể hiện hiệu lực diệt sâu (%) ở cơng thức dịch thơ, dịch ly tâm 42 Hình 3.2 Biểu đồ thể hiện hiệu lực diệt sâu (%) ở cơng thức 6h, 12h, 24h, 48h, 96h 45
11. DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm 29 Bảng 3.1 Hiệu lực diệt sâu (%) của các nồng độ NPV trên sâu 7 ngày tuổi, 9 ngày tuổi, 11 ngày tuổi 37 Bảng 3.2 Sản lượng NPV thu được ở các độ tuổi và nồng độ nhiễm 39 Bảng 3.3 Hiệu lực diệt sâu (%) của dịch thơ và dịch ly tâm 41 Bảng 3.4 Khối lượng sâu chết nhiễm NPV của dịch thơ và dịch ly tâm 42 Bảng 3.5 Kết quả định lượng vi sinh vật hiếu khí sau 01 ngày nhiễm giữa các cơng thức dịch thơ và dịch ly tâm 43 Bảng 3.6 Sản lượng virus cĩ trong mỗi sâu ở cơng thức dịch thơ và dịch ly tâm 44 Bảng 3.7 Hiệu lực diệt sâu (%) ở các cơng thức sau 6h, 12h, 24h, 48h, 96h lây nhiễm 44 Bảng 3.8 Khối lượng sâu chết (g) và sản lượng virus PIB/sâu chết ơ các cơng thức sau 6h, 12h, 24h, 48h, 96h lây nhiễm 46
12. MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Sâu khoang S.litura là lồi sâu ăn tạp, gây hại trên nhiều lồi cây trồng (Matsuura and Naito 1997; Sahayaraj and Paulraj 1998). Các nghiên cứu cho biết, sâu khoang đã kháng lại với nhiều loại thuốc trừ sâu hĩa học dẫn đến sự bùng phát thành dịch và sự thất bại của biện pháp quản lý lồi sâu hại này (Ahmad et al. 2007, Hong Tong et al, 2013). Biện pháp sinh học đã được quan tâm và sử dụng để quản lý sâu khoang ăn tạp, trong đĩ cĩ virus cơn trùng thuộc họ Baculovirus. Nucleopolyhedrosis thuộc họ Baculovirus đã được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu do khả năng gây chết sâu cao nhưng lại an tồn đối với thiên địch và và các sinh vật khác bao gồm động vật cĩ vú và thực vật (Tohnishi et al., 2005; Shaurub et al., 2014; Nasution et. al., 2015). Vì vậy, NPV (Nucleo Polyhedrosis Virus), được khuyến cáo sử dụng trong hệ thống phịng trừ tổng hợp. Tại trường đại học Cơng Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, SLNPV (NPV Spodoptera litura) đã được phân lập và đã được chứng minh cĩ hiệu quả cao đối với sâu khoang ăn tạp (Nguyễn Thị Hai và Nguyễn Hồi Hương, 2015). Việc sản xuất NPV trên sâu ký chủ bước đầu đã được thực hiện nhưng vẫn cịn nhiều vấn đề tồn tại (Nguyễn Thị Hai và cộng sự, 2014). Trên cơ sở đĩ, nhĩm sinh viên tiến hành đề tài “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất NPV (Nucleo polyhedrosis virus) trên ký chủ sâu khoang Spodoptera litura”. 2. Mục đích nghiên cứu Xác định tuổi sâu, nồng độ lây nhiễm và thời gian lây nhiễm, loại dịch gốc lây nhiễm để sản xuất SLNPV. 3. Mục tiêu nghiên cứu Đưa ra được tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm phù hợp để sản xuất NPV Đưa ra được thời gian phơi nhiễm sâu đạt tỷ lệ chết cao. Xác định được loại dịch giống để nhân virus. 1
13. 4. Nội dung nghiên cứu Khảo sát ảnh hưởng của tuổi sâu và liều lượng nhiễm đến sản lượng NPV. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm sâu đến hiệu lực gây chết và sản lượng NPV. Khảo sát ảnh hưởng của dịch thơ và dịch ly tâm sử dụng lây nhiễm đến sự nhân lên của virus trong cơ thể sâu. 2
14. CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về sâu khoang Spodoptera litura Tên khoa học: Spodoptera litura Tên thường gọi: Sâu khoang, Sâu bơng, Sâu thuốc lá, Sâu bơng Ai Cập, Họ: Noctuidae Bộ: Lepidoptera Hình 1.1 Spodoptera litura (Ahmad cheraghian, 2014) 1.1.1 Đặc điểm hình thái của sâu khoang Trứng cĩ hình cầu, kích thước khoảng 0,35-0,45mm. Trứng được đẻ thành ổ, từ 20-350 trứng mỗi ổ. Thơng thường mỗi ổ trứng được bao phủ bằng lơng tơ từ bụng con cái, cĩ màu trắng kem tới nâu nhạt; lớp lơng tơ này thường rất rõ ràng, nhưng đơi khi chỉ cĩ một ít xuất hiện trên ổ trứng. Bề mặt trứng cĩ những đường khía dọc từ đỉnh trứng xuống đến đáy và bị cắt ngang bởi những đường khía ngang tạo thành những ơ nhỏ (Pearson, 1958; CABI, 2009). Sâu non mới nở cĩ màu xanh sáng, dài khoảng 1mm, đầu to đen bĩng. Sâu non đẫy sức cĩ màu xám tro đến nâu đen, vạch lưng màu vàng ở đốt bụng thứ nhất cĩ khoang đen to nên được gọi là sâu khoang. Sâu cĩ 5- 6 tuổi, đẫy sức trước khi hĩa nhộng dài 38-50 mm. Sâu làm nhộng trong đất (Hill, 1975; USDA, 1982; CABI,2009). Nhộng dài từ 15-22mm, cĩ màu xanh nõn chuối, rất mềm ngay khi mới được 3
15. hình thành, sau đĩ chuyển dần sang màu vàng xanh, cuối cùng cĩ màu nâu, thân cứng dần và cĩ màu nâu đỏ. Khi sắp vũ hố, nhộng cĩ màu nâu đen, các đốt cuối của nhộng cĩ thể cử động được. Mép trước đốt bụng thứ 4 và vịng quanh mép trước đốt bụng thứ 5-7 cĩ nhiều chấm lõm, cuối bụng cĩ một đơi gai ngắn (USDA, 1982; CABI, 2009). Trưởng thành cĩ chiều dài thân khoảng 14-18 mm, sải cánh rộng từ 35-45mm. Cánh trước màu nâu vàng, giữa cánh cĩ vân trắng, cánh sau màu trắng ĩng ánh. Ngực và bụng màu màu nâu nhạt với những chùm lơng trên bề mặt lưng (Hill, 1975; USDA, 1982). 1.1.2 Tập tính sống và quy luật phát sinh gây hại Vịng đời của sâu khoang được ghi nhận như sau: Thời gian trứng: 2-6 ngày; Sâu non cĩ 6 tuổi: 12-37 ngày; Tiền nhộng: 1-4 ngày; Nhộng: 4-14 ngày; Trưởng thành: 5-8 ngày; Vịng đời trung bình của sâu khoang từ 25-48 ngày Hình 1.2 Vịng đời sâu khoang ( 4
16. Hai đến năm ngày sau khi vũ hĩa, trưởng thành cái bắt đầu đẻ trứng, một trưởng thành cái đẻ từ 50 đến 300 trứng theo từng ổ ở mặt dưới của lá (ký chủ). Trứng nở trong ba đến bốn ngày (Chari và Patel, 1983). Một trưởng thành cái cĩ thể đẻ là 1.500 đến 2.500 trứng trong khoảng sáu đến tám ngày. Cây thầu dầu là loại vật chủ được ưa chuộng nhất cho các con cái đẻ trứng (Chari và Patel, 1983). Các cánh đồng mới được tưới nước cũng rất hấp dẫn đối với những con cái đẻ trứng. Sâu khoang thường trải qua 6 tuổi. Sâu tuổi 1 đến tuổi 3 khơng lẩn trốn ánh sáng. Sâu từ tuổi 4 đến tuổi 6 chui xuống đất, cĩ hiện tượng lẫn trốn ánh sáng nên ban ngày thường ẩn nấp ở những chỗ kín trên mặt đất, hoặc chui xuống những khe nhỏ ở dưới mặt đất và đến tối thì chui lên để gây hại. Khi sâu đủ sức thì chui xuống đất hố nhộng, trước khi hố nhộng nĩ làm một cái kén bằng đất cĩ hình bầu dục rồi chui vào đĩ hố nhộng. (Chari và Patel, 1983). Nhộng thường vũ hố vào buổi chiều mát và vào lúc chập tối, sau khi vũ hố vài giờ, trưởng thành cĩ thể bắt đầu giao phối và vào đêm hơm sau thì bắt đầu đẻ trứng. Tuổi thọ trung bình của trưởng thành cái là 8,3 ngày và cĩ thể đẻ được 2.673 trứng. Tuổi thọ trung bình của trưởng thành đực là 10,4 ngày (Yamanaka và cộng sự, 1975; Ahmed và cộng sự, 1979). Theo Yamanaka và cộng sự. (1975), trung bình một trưởng thành cái cĩ thể đẻ được 2000 – 2600 quả, thời gian đẻ trong trong khoảng 5 ngày ở 25°C (77°C). Sâu khoang phá nhiều loại cây nên cĩ mặt quanh năm trên đồng ruộng. Sâu cắn phá mạnh vào lúc sáng sớm nhưng khi cĩ ánh nắng, sâu chui xuống dưới tán lá để ẩn nắp. Chiều mát sâu bắt đầu hoạt động trở lại và phá hại suốt đêm. Sâu vừa nở sẽ gặm vỏ trứng và sống tập trung 1-2 ngày, nếu bị động sâu sẽ bị ra phân tán nhiều chỗ hoặc nhả tơ buơng mình xuống đất. Sâu tuổi 1-2 chỉ ăn gặm phần diệp lục của lá và chừa lại lớp biểu bì trắng, từ tuổi 3 trở đi sâu ăn phá mạnh cắn thủng lá và gân lá. Ở tuổi lớn khi thiếu thức ăn, sâu cịn tập tính ăn thịt lẫn nhau và khơng những ăn phá lá cây mà cịn ăn trụi cả thân, cành, trái non. Sâu non phát triển thích hợp ở nhiệt độ và ẩm độ cao. Khi làm nhộng, sâu chui 5
17. xuống đất làm thành một khoang và nằm yên trong đĩ hĩa nhộng (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004) 1.1.3 Mức độ gây hại Sâu khoang ăn tạp (Spodoptera litura) là lồi sâu hại nguy hiểm cho nền nơng nghiệp của nhiều nước ở châu Á, châu Phi và vùng Thái Bình Dương. Lồi sâu này ăn tạp và gây hại cho hơn 150 lồi cây trồng khác nhau và là lồi sâu hại chính trên các lồi cây trồng cĩ giá trị kinh tế như bơng, đậu nành, cà chua, thuốc lá, bắp, khoai tây và các lồi cây rau ăn lá (Hill, 1993 ; Rao et al, 1993). Sâu khoang phân bố khắp nơi trên thế giới và gây hại nặng cho nhiều nước nhiệt đới như: Ấn Độ, Pakistans, Banglades, Srilanca, Indonesia, Philippin, Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Úc, Hawaii, các nước Đơng Nam Á (Hill, 1993; Singh and Jalali, 1997). Các biện pháp phịng trừ sâu khoang Biện pháp canh tác, kỹ thuật Vệ sinh đồng ruộng trước và sau khi trồng, cày ải phơi đất, phơi và xử lý thuốc trừ sâu hoặc cho ruộng ngập nước 2-3 ngày để diệt nhộng, sâu non cĩ trong đất. Phải thường xuyên đi thăm ruộng để kịp thời phát hiện sâu, ngắt bỏ ổ trứng hoặc tiêu diệt sâu non mới nở khi chưa phân tán đi xa. 1.2.2 Biện pháp sinh học Hạn chế phun thuốc để bảo tồn các lồi thiên địch thường xuất hiện trên ruộng. Nhiều tác nhân sinh học đã được sử dụng để trừ sâu khoang ăn tạp như: các loại nấm cơn trùng Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Paecilomyces fumosorosea (Asi et al, 2013), vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Agsaoay, 1998). Ngài sâu khoang cĩ khuynh hướng thích mùi chua ngọt và ánh sáng đèn, do đĩ cĩ thể dùng bẫy bả chua ngọt để thu hút bướm khi chúng phát triển rộ. Bả chua ngọt gồm 4 phần giấm + 1 phần mật + 1 phần rượu + 1 phần nước. Sau đĩ đem bả mồi vào chậu rồi đặt ở ngồi ruộng vào buổi tối nơi thống giĩ cĩ độ cao 1m so với mặt đất. Dùng bẫy pheromone để dự báo trước sự đẻ trứng của sâu ăn tạp. Hàng ngày theo dõi dự báo sự 6
18. phát triển của sâu qua bẫy pheromone, thường xuyên ngắt bỏ ổ trứng và diệt ấu trùng trên những ruộng dẫn dụ. Dùng hoa hướng dương hay các lồi cây cĩ thể dẫn dụ sâu ăn tạp trồng xung quanh ruộng canh tác để dễ dàng tiêu diệt. Dùng sản phẩm sinh học cĩ nguồn gốc nấm, vi khuẩn khi cĩ những dấu hiệu cắn phá lá đầu tiên. Thơng thường 10 ngày sau phải phun thuốc lại. Các loại chế phẩm vi sinh: thuốc cĩ nguồn gốc từ Bt như V-BT; Biocin 8000 SC, Dipel 32 WP hoặc thuốc thảo mộc như Rotenone hoặc Neem. Cĩ thể dùng thuốc gốc Cúc tổng hợp như Karate 2.5 EC, SecSaigon 5 EC /. các loại thuốc cĩ hoạt chất Emamectin; Lufenuron hay hỗn hợp (Chlorantraniliprole + Abamectin) Giới thiệu về Nucleo Polyhedrosis Virus Giới thiệu chung Nucleo Polyhedrosis Virus (NPV) thuộc nhĩm Baculovirus, là virus ký sinh trong nhân tế bào chủ và cĩ thể vùi hình đa diện. Nucleo Polyhedrosis Virus (NPV) là virus cĩ thể bao hàm (một tập hợp các hạt virus hay cịn gọi là virion và được bao bọc bởi một lớp vỏ protein) hình đa diện cịn gọi là PIB (Polyhedral inclusion body). Virus nhân lên và tạo các thể bọc trong nhân của tế bào vật chủ. Thể bao hàm của NPV cĩ kích thước từ 0,15 - 15µm bên trong chứa nhiều hạt virus (virion) cĩ vỏ bọc. Loại virus này cĩ thể gây hại trên 400 lồi cơn trùng và lây bệnh rất mạnh với nhiều loại cơn trùng thuộc bộ cánh vảy Lepidoptera, tập trung ở 2 họ chủ yếu ngài đêm Noctuidae, ngài sáng Pyralidae. Ngồi ra chúng cịn gây chết trên các bộ khác như bộ cánh màng (31 lồi), bộ 2 cánh (27 lồi) (Grzywacz et al, 2005). 7
19. Hình 1.3 Cấu tạo của Nucleo Polyhedrosis Virus (Jean Adams, 2012) (A) Các hạt Baculovirus, hay được gọi là thể vùi (PIBs). (B) Mặt cắt ngang của PIB. (C) Sơ đồ mặt cắt đa diện hoặc mặt cắt PIB hiển thị nhiều nucleocapsids bên trong mỗi virion, các virion được bao bọc bởi lớp vỏ protein. NPV cĩ tính chuyên hĩa rất cao. Thơng thường, NPV của lồi sâu nào chỉ ký sinh và gây chết lồi sâu đĩ (chuyên tính cho từng lồi, theo FAO, 2003). Chỉ cĩ một số cĩ phổ ký chủ tương đối rộng như AcMNPVgây nhiễm hơn 30 lồi thuộc 10 họ của bộ cánh vảy, Anagrapha falcifera NPV gây nhiễm 31 lồi thuộc 10 họ của cánh vảy Lepidoptera và MbMNPV gây nhiễm 32 lồi thuộc bộ cánh vảy (Grưner, 1986; Doyle et al., 1990, Hostetter and Puttler, 1991). NPV của sâu thuộc chi Helicoverpa cĩ thể gây chết 5 lồi sâu thuộc chi này Khả năng phịng trừ sâu khoang của chế phẩm NPV: Kinh nghiệm của các nước trên thế giới cho thấy, việc sử dụng bừa bãi thuốc hĩa học đã khơng thể quản lý được sự bùng phát và gây hại của các lồi sâu bộ cánh vảy nĩi chung và sâu khoang nĩi riêng. Các nghiên cứu cho thấy, sâu khoang ăn tạp đã kháng lại với nhiều loại thuốc trừ sâu hĩa học thuộc nhĩm Carbamate, lân hữu cơ và Pyrethroid (Venkateswarlu và cộng sự, 2005). Nhiều biện pháp thay thế mang tính thân thiện với mơi trường đã được sử dụng. Trong số đĩ, NPV được coi là tác nhân hứa hẹn nhất và cho kết quả tương đương với 8
20. thuốc hĩa học (Rober et al, 1991; Ravishanka and Venkatesha, 2010; Hochberg, 1991; Gitanjali et al, 1994; Vinay, 1997). Virus cơn trùng đặc biệt là NPV cĩ hiệu quả cao đối với các lồi sâu bộ cánh vảy như sâu xanh Helicoverpa armigera, sâu khoang Spodoptera litura, sâu xanh da láng Spodoptera exigua (Vinod Kumari and Singh, 2009). Các nghiên cứu chỉ ra rằng, sâu khoang ăn tạp rất mẫn cảm với NPV và NPV này đã được sử dụng rộng rãi như một loại thuốc trừ sâu khoang ở nhiều quốc gia trên thế giới (Jayaraj et al, 1980, Ravishanka and Venkatesha, 2010). 1.3.2 Đặc điểm hình thái của NPV NPV cĩ cấu trúc hình học, 5 - 6 đến 20 cạnh với nhiều nhĩm virus khác nhau. Các axit nucleic (ADN, ARN) gồm dạng sợi đơn và sợi đơi. Theo Nguyễn Thị Như Quỳnh (2014), NPV cĩ cấu tạo gồm: vỏ ngồi, vỏ capsid, và lõi acid nucleic. Vỏ ngồi: là một lớp màng nhầy ngồi cùng cĩ tính chất là protein và gọi là protein ngồi. Protein ngồi mang trính kháng nguyên và cĩ tác dụng kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể vật chủ. Vỏ capsid: Vỏ capsid nằm kế tiếp bên trong lớp vỏ ngồi và được ngăn cách với lớp vỏ ngồi bởi một lớp keo dính. Protein cấu tạo nên vỏ Capsid được gọi là protein trong. Protein trong mang tính kháng nguyên làm tăng khả năng gây bệnh của virus. Genom: Genom của virus NPV là một phân tử DNA gồm 2 mạch xoắn kép (DNAds). Khi nhiễm vào tế bào vật chủ virus tuồn lõi DNA vào tế bào vật chủ, DNA của virus sử dụng năng lượng, nguyên liệu và riboxom của tế bào vật chủ để tổng hợp nên protein và quá trình nhân lên của DNA. Mặt khác khi tế bào bị nhiễm virus, DNA của vi rút sinh ra men azenaza ức chế DNA của tế bào chủ và phân giải tạo thành các nucleotit tự do. Sau khi tổng hợp đủ các thành phần như vỏ, DNA (lõi ), virus tiến hành lắp ráp để tạo thành thể virus mới. 9
21. Theo Phạm Thị Thùy (2004), virus thuộc nhĩm này cĩ dạng hình que, kích thước từ 40 - 70 nm x 250 - 400 nm, bên ngồi là một lớp vỏ cĩ cấu tạo từ lipoprotein bao quanh một lớp protein nằm trong lõi DNA (Nucleocapsid), trong cĩ chứa các virion, các virion bao gồm 11 - 25 polypeptide. Trong số polypeptide đĩ thì cĩ khoảng 4 - 11 polypeptide được kết hợp với nucleocapsid và số polypeptide cịn lại kết hợp với capside. DNA ở dạng 6 sợi vịng gồm hai sợi, với trọng lượng phân tử từ 50 - 10 x 10 các virion được bao quanh bởi một tinh thể protein và được gọi là thể vùi. Kelly (1985) cho rằng, virus cĩ dạng hình que cĩ một hoặc nhiều nucleocapsid được bao bọc bởi một lớp vỏ, nucleocapsid là một phức hợp gồm DNA và protein (gọi tắt là Deoxyribo Nucleo Protein - DNP) và chúng cũng được bao quanh bởi một lớp vỏ capsid (bên trong lớp vỏ capsid này chỉ cĩ một hoặc nhiều nucleocapsid), nếu là một nucleocapsid thì gọi là NPVs Nucleocapsid đơn, nếu cĩ nhiều nucleocapsid trong vỏ capsid thì gọi là NPVs Nucleocapsid – Multiple Cấu tạo của nucleocapsid: nucleocapsid cĩ dạng hình que, dáng hơi cong, đường kính 40 nm, dài 350 nm, cĩ màng bọc bên ngồi (capsid). Nucleocapsid bao gồm hai loại protein, đĩ là một lõi DNP protein và màng capsid protein và từ 3 - 8 polypeptid nhỏ (Summer, M.D et al, 1978). Cấu tạo của thể virus: thể virus hình gậy gồm các nucleocapsid được bao bọc, mỗi vỏ bao cĩ thể cĩ một hoặc nhiều nucleocapsid, cĩ loại cĩ tới 30 nucleocapsid. Lớp vỏ bao gồm cĩ lipid, trong vỏ cịn cĩ 8 - 10 polypeptid (Harrap, K.A., 1972., Kelly, D.C., 1982, 1985). Cấu tạo của khối đa diện (Polyhedra): Theo Crook, N.E. et al (1982) thì polyhedra là những khối kết tinh lớn, kích thước từ 1 - 4 µm, cĩ dạng hình vuơng hoặc gần như hình cầu, bên trong cĩ chứa nhiều hạt virus, cĩ khi lên tới 100 hạt, bao quanh các virus đĩ là mạng lưới kết tinh hình mắt cáo. Polyhedra cịn bao gồm nhiều polypeptide. Protein polyhedron cĩ trọng lượng phân tử thay đổi từ 27.000 - 34.000 million , phụ thuộc vào loại virus (Bergold, G.H., 1963 Harrap, K.A., 1972). Polyhedral cĩ đặc điểm là ổn định 10
22. ở pH trung tính. pH kiềm 9,5 trở lên sẽ làm nĩ bị hịa tan (Faust, R.M. et al , 1966). Minon, F. et al (1979) cịn cho biết polyhedra hồn thiện được một lớp vỏ cĩ hình thái riêng biệt vây quanh, chức năng của lớp vỏ này chưa được xác định. 1.3.3 Cơ chế diệt sâu của NPV Khi sâu non ăn thức ăn vào ruột cĩ chứa virus (NPV) lẫn với thức ăn, các thể bao hàm (PIB) của virus sẽ đi vào ruột giữa của cơn trùng và sẽ bị phân giải dưới tác động của điều kiện mơi trường kiềm (pH 9 – 11). Các thể bao hàm sẽ bị hịa tan để giải phĩng ra các virion. Các virion này đi vào các tế bào ruột giữa. Ở đây, chúng sử dụng bộ máy của tế bào vật chủ thực hiện quá trình sao chép, phiên mã và tạo ra các virion mới. Từ đĩ, các virion mới này sẽ tiếp tục tấn cơng sang các tế bào khác của cơ thể như huyết tương, ống tiêu hĩa, biểu bì. Trong các tế bào này, xảy ra quá trình hình thành lớp vỏ protein, bao bọc các virion để tạo thành hàng triệu các thể bao hàm (PIB) và cũng là lúc tồn bộ cơ thể sau đã bị phá hủy và sâu non bị chết. Các thể bao hàm giải phĩng ra bên ngồi để lây nhiễm cho các tế bào khác (Kalmakoff và Ward, 2003). Những cơn trùng cịn sống sĩt vẫn tiếp tục bị ảnh hưởng trong giai đoạn nhộng (nhộng bị thối, ngài vũ hĩa bị biến dạng). Nếu ngài vũ hĩa được thì ở giai đoạn trưởng thành (khả năng đẻ trứng sẽ giảm) và ảnh hưởng tới các thế hệ sau. Nguồn virus tồn động trong tự nhiên lại lây nhiễm cho các thế hệ mới. Trên cơ sở khoa học này, virus gây bệnh cho cơn trùng ngày càng được chú ý nghiên cứu và được coi là một trong những nhân tố cĩ triển vọng trong phương pháp sinh học để phịng chống sâu hại cho cây trồng (Nguyễn Thị Như Quỳnh, 2014). 11
23. Hình 1.4 Cơ chế diệt sâu của virus NPV vào cơn trùng (Kalmakoff và Ward, 2003). Hình 1.5 Chu trình sống của virus cơn trùng (Jim McNeil. 2010) 12
24. Sâu non khơng cĩ biểu hiện gì rõ rệt và khơng thay đổi về thức ăn. Sau 5-7 ngày các đốt thân sưng phồng lên, căng mộng nước. Cơ thể sâu chuyển sang màu trắng đục, da bở, dễ bị vỡ. Trước khi chết sâu thường leo lên ngọn cây, bám chân vào cành cây, trút đầu xuống đất. Dịch chiết trắng chảy ra ngồi và sâu chết (hiện tượng sâu chết treo). Dịch trắng tiếp tục chảy (Phạm Thị Thùy, 2010). Hình 1.6 Biểu hiện của sâu chết do NPV. (Nguồn: tien-a5088.html). 1.3.4 Hiệu lực diệt sâu của NPV Phụ thuộc vào điều kiện bảo quản chế phẩm. Mẫu NPV được lưu trữ trong điều kiện lạnh, cĩ thể duy trì hiệu quả của nĩ lên đến 8 tháng (100%), và đến tháng thứ mười, cĩ một sự suy giảm nhẹ (97,50%) nhưng nĩ khơng đáng kể, trong khi mẫu NPV được lưu trữ trong nồi đất và ở nhiệt độ phịng (cả trong chai màu hổ phách và chai thủy tinh) hiệu quả được duy trì lên đến 4 tháng và sau đĩ độc lực bắt đầu giảm do tăng hoạt tính của vi khuẩn. Sự thay đổi trong pH của huyền phù virus được lưu trữ trong điều kiện lạnh là rất chậm từ axit đến bình thường (5-7) pH như chống lại kiềm ở điều kiện mơi trường xung quanh. Chủ yếu là do sự tăng trưởng của các vi khuẩn khác và điều kiện ấm, dẫn đến giảm độc lực của các cơ quan virus. Nhiều nhà khoa học đã báo cáo rằng virus cĩ thể 13
25. 0 được bảo quản trong hơn 10 năm ở mức 4 C mà khơng bị mất độc lực. Độc lực hiệu quả nhất khi pH trung tính và giảm khi pH cao. Độc lực của virus phụ thuộc vào chất lượng của virus, điều kiện bảo quản và thời gian lưu trữ, nhiệt độ và độ pH của sản phẩm. Các nghiên cứu đều chỉ ra rằng NPV cĩ hiệu lực gây chết rất cao trên sâu khoang. Sâu càng nhỏ mức độ mẫn cảm càng cao (Boucias et al, 1980; Bucher and Turnck, 1983; Smith and Vlak, 1988; Mohammad et al, 2002). Giá trị LC50 NPV trên 6 7 sâu khoang từ tuổi 1 đến tuổi 4 được ghi nhận tương ứng là 3,2 x 10 ; 1,1 x 10 ; 1,3 x 7 7 10 và 4,7 x 10 PIB/ml (Mahammad et al, 2002). 1.3.5 Ưu điểm và nhược điểm của NPV 1.3.5.1 Ưu điểm của chế phẩm NPV Hiệu lực diệt sâu của NPV tương đương như thuốc hĩa học. Ngồi chỉ tiêu về hiệu lực diệt sâu, nuclear polyhedrosis được sử dụng rộng rãi là do chúng rất an tồn với mơi trường. Theo Szewczyk và cộng sự (2009), Baculovirus nĩi chung và NPV nĩi riêng chỉ gây bệnh cho duy nhất ngành chân đốt mà khơng làm ảnh hưởng đến động vật cĩ xương sống, cây trồng và các vi sinh vật khác. Vì tính chuyên hĩa cao nên NPV khơng gây độc cho các lồi thiên địch, các động vật máu nĩng và con người (Ignoffo, 1997; Monobrullah et al, 2000). Mặt khác, các lồi thiên địch khơng những khơng bị hại bởi NPV mà chúng cịn cĩ vai trị phát tán NPV trong quần thể sâu hại, gĩp phần quan trọng trong việc phát triển dịch bệnh cho sâu hại trên đồng (Trang và cộng sự, 2003) Do NPV khơng độc đối với các lồi cơn trùng cĩ ích và các sinh vật khác, bao gồm động vật cĩ vú và cây trồng (Groner, 1986; Payne,1986; Carbonell, 1987) nên chúng được sử dụng trong chương trình phịng trừ tổng hợp sâu hại cây trồng (Monobrullah và Nagata, 2000). Mặt khác, việc sử dụng NPV để trừ sâu trên các loại cây trồng khơng để lại dư lượng độc hại (toxic residue) trong nơng sản, cho phép nơng dân cĩ thể xử lý sâu hại bằng NPV trước khi thu hoạch một thời gian ngắn (Monobrullah và Nagata, 2000). 14
26. Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành (2007) cho biết BaculoNPV rất thuận lợi khi sản xuất chế phẩm thương mại vì thường cĩ thể đạt nồng độ cao trong mơ của ấu trùng. Chế phẩm cĩ thể duy trì hoạt tính trong thời gian rất dài (10-15 năm) ngồi cơ thể cơn trùng. 1.3.5.1 Nhược điểm của chế phẩm NPV Chế phẩm NPV rất khĩ bảo quản. Ngồi ra, so với thuốc hĩa học thì hiệu lực trừ sâu của NPV chậm hơn nhiều. Do NPV rất đặc hiệu đối với ký chủ, mà thường trên cùng một mùa vụ cĩ nhiều lồi dịch hại cùng xuất hiện, sẽ rất tốn kém nếu phải dùng mỗi loại thuốc cho một lồi dịch hại riêng biệt. Hơn nữa việc sản xuất chế phẩm NPV cũng khĩ khăn hơn thuốc hĩa học vì NPV phải được nuơi từ cơ thể sống, chúng khơng thể phát triển trong mơi trường nhân tạo do đĩ giá thành sản phẩm sẽ tăng lên. Vì là tác nhân sinh học nên NPV dễ bị mất tác dụng khi điều kiện ngồi đồng khơng thích hợp (nhiệt độ, độ ẩm, ) do đĩ việc sử dụng chúng khơng thuận lợi bằng thuốc hĩa học (Phạm Thị Thùy, 2004). NPV cĩ thể sản xuất bằng phương pháp invivo và invitro. Tuy nhiên, NPV được thương mại hĩa hiện nay trên thế giới chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp invivo vì tính hiệu quả kinh tế (Tuan S.J. W.L. Chen, và S.S. Kao. 1998; Monobrullah M et al, 2000; FAO, 2011). Trong đĩ, NPV của các lồi thuộc chi Spodoptera được sử dụng nhiều nhất trên phạm vi tồn thế giới (Monobrullah, M.; Nagata, M., 2000). Nhiều chế phẩm đã được thương mại hĩa để trừ sâu khoang ăn tạp là SOMSTAR TM–SL, SpodopterinTM, Spodoptera litura NPV, sử dụng trên rau, cà chua, bắp, bơng vải (Giupta và cộng sự, 2005). 1.4 Các nghiên cứu sử dụng NPV để trừ sâu khoang 1.4.1 Các nghiên cứu ngồi nước Hiệu lực diệt sâu khoang ăn tạp của các chủng NPV: Các nghiên cứu đều chỉ ra rằng NPV cĩ hiệu lực gây chết rất cao trên sâu khoang. Sâu càng nhỏ mức độ mẫn 15
27. cảm càng cao (Boucias et al, 1980; Bucher và Turnck, 1983; Smith và Vlak, 1988; Mohammad et al, 2002). Giá trị LC50 của NPV trên sâu khoang từ tuổi 1 đến tuổi 4 6 7 7 7 được ghi nhận tương ứng là 3,2x10 ; 1,1x10 ; 1,3x10 và 4,7x10 PIB/ml (Mahammad et al, 2002). Nghiên cứu, sản xuất Nucleopolyhedrosis NPV: So sánh sản lượng NPV đạt được khi dùng sâu 7, 8, 9 và 10 ngày tuổi để sản xuất NPV, Monobrullah và Nagata (2000) cho biết, sản lượng NPV cao nhất khi sử dụng sâu 9 ngày tuổi (trọng lượng 125 9 – 155mg) để nhiễm NPV. Sản lượng NPV cao nhất được cho biết là 3,91x10 PIB/sâu 6 với lượng nhiễm là 4,8 x 10 PIB/sâu. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sản xuất NPV: Các tác giả cho rằng, NPV bị ảnh hưởng rất rõ bởi yếu tố nhiệt độ. Mohammad (2002), Sajap et al (2007) cho biết, tỷ lệ sâu chết tăng khi tăng nhiệt độ nuơi ủ sâu và giá trị LT50 thì ngược lại. Giá trị 0 0 LT50 khi nhiễm sâu ở 20 C tăng 4 lần so với khi nuơi ở nhiệt độ 30 C (Mohammad, 2002). Cũng theo tác giả này, điều kiện thích hợp tối thiểu để sản xuất invitro NPV trên 0 sâu khoang là 30 C. Nghiên cứu tăng cường hiệu lực diệt sâu của NPV: Tiêu chí để tạo chế phẩm NPV trừ sâu là kéo dài hoạt lực cũng như sự bền vững của NPV trên đồng (Jones et al , 1997). Việc tạo chế phẩm cĩ thể cải thiện đáng kể hiệu quả của NPV. Các chất phụ gia cho vào NPV nhằm kích thích sự ăn của sâu ký chủ hoặc tăng cường hiệu lực gây chết của NPV ( Bell và Kanavel , 1975; Burges và Jones , 1998). Để tăng hiệu lực trừ sâu và rút ngắn thời gian ủ bệnh do NPV, các tác giả đã phối trộn NPV với nhiều sản phẩm khác như: thuốc trừ sâu, chế phẩm Neem, acid boric, rỉ 5 đường . Rabindra và cộng sự (1997) cho biết phối hợp NPV (liều lượng 5 x 10 PIB/ml) + mật đường (1%) + dịch chiết neem (0,1%) cho hiệu quả diệt sâu khoang tăng hơn so với khơng trộn. Tuy nhiên, tác giả cho biết, nếu khơng bổ sung rỉ đường thì sự phối hợp này khơng cĩ hiệu quả. Tương tự như vậy, Baskaran và cộng sự (1999) cho biết, phối 4 trộn NPV (2 X 10 PIB/ml) với dầu neem 1% và dịch chiết bánh dầu neem 5% 16
28. cũng làm tăng hiệu quả diệt sâu của NPV. Các tác giả thống nhất rằng, việc bổ sung dịch chiết neem vào chế phẩm NPV làm cho sâu khoang chết nhanh hơn so với khơng bổ sung và quan trọng hơn cả là làm giảm được tác động của neem đối với các lồi thiên 8 địch. Seon-Gon Kim và ctv (2001) cho biết, phối trộn nồng độ 1x10 PIB/ml với NeemAZA-T/S nồng độ 200 ppm cĩ giá trị LT50 và LT90 là 1,94 ngày và 8,33 ngày. Hiệu 8 lực diệt sâu của Spodoptera litura NPV (SLNPV) nồng độ 1x10 PIB/ml với NeemAZA- T/S nồng độ 75–200 ppm cho kết quả diệt sâu chết 100% sau 9 ngày thí nghiệm. 1.4.2 Các nghiên cứu trong nước NPV được ghi nhận là một trong những lồi thiên địch xuất hiện khá phổ biến trên đồng ruộng ở Việt Nam (Nguyễn Văn Cảm và cộng sự, 1992; Nguyễn Thị Hai, 1996). Sâu khoang trên lạc cĩ tỷ lệ chết NPV khá cao, cĩ khi lên tới 50 – 60% (Phạm Văn Lầm, 2004). Nghiên cứu NPV cĩ hiệu lực trừ sâu tương đương hoặc cao hơn so với thuốc hĩa học (Phạm Hữu Nhượng và CTV, 2005; Hồng Thị Việt và cộng sự,1999, 2000; Ngơ Trung Sơn, 2001; Nguyễn Thị Hai, 2004; Phạm Văn Lầm, 2004; Nguyễn Văn Tuất, 2004). Bằng phương pháp thu thập, tuyển chọn và khai thác khả năng phịng trừ sinh học của các chủng Nucleopolyhedrosis NPV (NPV), nhĩm tác giả Nguyễn Thị Hai, Nguyễn Hồi Hương (2016) đã phân lập được 2 chủng NPV phịng trừ sâu khoang ăn tạp (Spodoptera litura) hại rau, đậu tại TP.HCM. Nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV-Spl (Nucleo Polyhedrosis Virus) từ tế bào gốc sâu khoang để phịng trừ sâu hại cây trồng nơng nghiệp (Nguyễn Thị Như Quỳnh, 2014). Một số NPV đã được thương mại hĩa để trừ sâu ở Việt Nam (Lê Quang Quyến et al, 2002; Nguyễn Văn Tuất, 2004). NPV trừ sâu khoang đã được tiến hành tại Viện Bảo vệ Thực vật (Nguyễn Văn Tuất, 2004). Thử nghiệm trên đồng ruộng cho biết, Sử dụng chế phẩm NPV, V-Bt trừ sâu xanh, sâu khoang hại lạc cho hiệu quả 76-77%. 17
29. Tại các tỉnh phía Nam, gần đây các chủng NPV sâu khoang cũng được trường được phân lập tại trường Đại học Cần Thơ. Kết quả cho biết, độ hữu hiệu của 2 dịng NPV thu thập tại Trà Vinh và An Giang đối với sâu khoang ăn tạp cho hiệu quả trên 90% sau 9 ngày xử lý (Trần Văn Hai, 2010). Đánh giá hoạt lực trừ sâu của NPV trên sâu khoang, Tran Thi Kieu Trang et al (2002) cho biết, sâu 2 ngày tuổi mẫn cảm gấp 1.500.000 lần so với sâu 8 ngày tuổi. Nghiên cứu sử dụng các chất lọc tia cực tím trên HaNPV, Ngơ Trung Sơn (2001) cho biết, sữa lọc béo, than hoạt tính và rỉ đường cĩ khả năng giảm được tác hại của tia cực tím. Theo tác giả, nếu phơi HaNPV ngồi nắng 1 giờ, hiệu lực diệt sâu xanh của chúng chỉ cịn 37%, song nếu dịch HaNPV cĩ trộn 3% sữa lọc béo thì hiệu lực diệt sâu vẫn cịn 81%, cịn trộn 3% than hiệu tính thì hiệu lực của HaNPV cũng cịn 50%. 1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất chế phẩm NPV 1.5.1 Nồng độ lây nhiễm Sản lượng tối đa của virus cĩ liên quan chặt chẽ đến tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm virus. Tổng số virus được sinh ra tương quan thuận với trọng lượng sâu đem đi nhiễm (Jones, 2000). Mối tương quan giữa nồng độ nhiễm và sản lượng virus đã được nhiều tác giả nghiên cứu (Shapiro, 1986) với nhiều phương pháp khác nhau. Nếu nhiễm với nồng độ thể vùi cao, virus sẽ gây hại cho các cơ quan nội tạng và gây chết sâu trước khi virus nhân lên đủ nhiều. Trái lại, nếu nhiễm với nồng độ quá thấp, thì sản lượng virus sẽ khơng tối ưu bởi vì sâu vào nhộng. Để xác định nồng độ lây nhiễm thích hợp cho từng lồi sâu, người ta phải xác định giá trị LC50, LC90 cho từng tuổi sâu. Giá trị LC50 và LC90 sẽ giúp xác định được nồng độ lây nhiễm thích hợp cho từng tuổi sâu. Giá trị LC50, LC90 thay đổi tùy thuộc vào từng tuổi sâu, từng lồi sâu và từng chủng NPV tương ứng. Bên cạnh đĩ, độ sạch của dịch nhiễm ban đầu đĩng vai trị rất quan trọng trong quy trình sản xuất virus. Theo FAO 2011, sử dụng dịch khơng ly tâm khi nhiễm cho sâu, chỉ cĩ 10% sâu chết do NPV và 90% sâu chết do các tác nhân lây nhiễm khác. Vì 18
30. vậy, các tác giả khuyến cáo nên sử dụng dịch ly tâm để nhiễm virus (Grzywacz et al. 2011) 1.5.2 Tuổi sâu Thơng thường nếu nhiễm sâu tuổi quá nhỏ chúng sẽ chết nhanh trước khi cơ thể đạt sinh khối tối đa nhưng nếu nhiễm sâu càng lớn thì khả năng kháng với virus càng cao (Briese, 1986) và cả hai trường hợp đều đạt sản lượng khơng cao. Thơng thường, người ta thường nhiễm sâu vào thời điểm trước khi lột xác sang tuổi cuối 2 ngày (O‘Reilly et al., 1994). Xác định tuổi sâu xanh (Helicoverpa armigera) thích hợp nhất để nhiễm H.armigera NPV (HearNPV), Gupta et al. (2007) đã làm thí nghiệm nhiễm 4 sâu với nồng độ 1 x 10 PIB/sâu cho sâu 5,7,8,9,10 và 11 ngày tuổi. Sản lượng virus đạt cao nhất khi ở cơng thức nhiễm sâu 7 và 8 ngày tuổi. Sâu càng nhỏ lượng virus/sâu càng thấp hơn cĩ ý nghĩa so với sâu tuổi lớn. Sâu càng lớn tỷ lệ vào nhộng càng cao. Sản lượng virus đạt cao nhất của HearNPV đạt được khi nhiễm trên sâu tuổi 5 với nồng 5 độ nhiễm là 5 x 10 OB/sâu (Mehrvar et al., 2007). Trong khi đĩ, (Ziemnicka, 2008) lại cho rằng, tuổi 4 là tuổi tối ưu để nhiễm Leucorma salicis NPV đối với sâu Leucoma salicis. Nhiều tác giả khác lại cho rằng, nhiễm sâu tuổi 3 cho sản lượng virus cao nhất (Li và Skinner, 2005). Vì vậy, để đạt hiệu suất tối đa, cần phải xác định tuổi sâu tương ứng với từng nồng độ nhiễm cho từng lồi sâu hại. 1.5.3 Thời gian thu hoạch sâu chết Các kết quả nghiên cứu cho thấy rằng, trong điều kiện invivo, sản lượng virus đạt cao nhất khi thu sâu chết (Gupta, 2007; Mehrvar et al., 2007). Thời gian thu hoạch đĩng vài trị quan trọng trong quy trình sản xuất Spodoptera littoralis NPV trong sâu khoang S.littoralis (Grzywacz et al., 1998). Nếu thu hoạch quá sớm, hoạt tính sinh học của virus sẽ giảm. Trái lại, nếu để các mơ vỡ ra trước khi thu hoạch thì virus sẽ phát tán ra thức ăn rất khĩ thu hoạch. Tốt nhất là nên thu hoạch sớm ngay sau khi sâu chết. Các nghiên cứu cho thấy, đối với NPV gây chết sâu khoang ăn tạp, sâu vừa mới chết cho sản lượng virus cao nhất. Ở sâu sống vào thời điểm 8 ngày sau khi sâu chết, lượng virus cũng cịn đạt 19
31. khá cao nhưng virus chưa thành thục nên hoạt tính diệt sâu khơng cao. Trái lại nếu để quá muộn, da sâu vỡ ra thì lượng virus sẽ giảm đi hơn 1/2 ( Nguyễn Thị Hai, 2014). Vì vậy, thường trong sản xuất, người ta phải thu sâu chết hàng ngày, thậm chí 2 lần/ngày. 1.6 Quy trình sản xuất chế phẩm NPV Điểm đặc trưng của virus NPV là chỉ nhân lên ở tế bào sống của ký chủ nên việc sản xuất virus ở quy mơ cơng nghiệp cũng khá là khĩ khăn. Cĩ 2 phương pháp sản xuất virus NPV: Sản xuất invitro trên tế bào ký chủ và Sản xuất in vivo trên sâu ký chủ. Trong đồ án này, chỉ đề cập đến quy trình sản xuất in vivo trên sâu ký chủ. Hình 1.7 Quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm virus trừ sâu (Nguồn: san-xuat-che-pham-bao-ve-thuc-vat-l6549.html) Quy trình sản xuất chế phẩm NPV in vivo trên sâu ký chủ gồm 2 bước chính: nhân nuơi số lượng lớn sâu ký chủ và nhiễm virus cho sâu ký chủ. 20
32. Nhân nuơi số lượng lớn sâu ký chủ: Nguồn sâu giống đầu tiên được bắt từ ngồi đồng trên những cánh đồng khơng phun thuốc và được nhân nuơi trong phịng. Sâu non sau khi hĩa nhộng sẽ được thu nhận, xử lý rồi cho vào trong những hộp chứa cĩ bơng ẩm. Tách riêng nhộng đực và nhộng cái để khi nhộng vũ hĩa dễ thu nhận và ghép cặp. Sau khi nhộng vũ hĩa phải được ghép cặp ngay. Sau khi trưởng thành cái đẻ trứng, trứng phải được thu nhận ngay và để riêng từng ngày. Trứng sâu thường nở vào ban đêm. Để sâu nở ra cĩ thức ăn ngay, người ta thường cho trứng vào hộp thức ăn trước khi sâu nở vài giờ. Sâu ký chủ được nuơi bằng thức ăn nhân tạo, bảo đảm cho chúng sinh trưởng và phát triển bình thường. Nuơi sâu bằng thức ăn nhân tạo sẽ hạn chế được sự lây nhiễm, tấn cơng của các yếu tố tự nhiên cĩ thể gây chết sâu thơng qua nguồn thức ăn tự nhiên. Mặt khác, việc sử dụng thức ăn nhân tạo để nuơi sâu sẽ khơng phải thay thức ăn hằng ngày, tiết kiệm được cơng lao động và chi phí khác trong quá trình sản xuất. Nhiễm virus cho sâu ký chủ: Sau khi sâu ký chủ đạt đến tuổi 3 hoặc 4 là tuổi thích hợp để sản xuất virus. Quá trình sản xuất virus trong sâu ký chủ được bắt đầu từ việc cho sâu ăn thức ăn đã bị phơi nhiễm virus (tạm gọi là nhiễm virus cho sâu ký chủ). Cĩ thể tĩm tắt quá trình này như sau: Cho dịch virus lên bề mặt thức ăn và dùng chổi lơng đã khử trùng trãi đều dịch lên bề mặt thức ăn. o Cho sâu ăn thức ăn đã nhiễm virus trong vịng 24h-48h ở điều kiện nhiệt độ 26 C. o Chuyển sâu sang thức ăn mới khơng nhiễm virus và ủ ở nhiệt độ 26 C, theo dõi hàng ngày cho đến khi sâu bị chết. o Thu sâu chết trước khi cơ thể sâu bị vỡ và cất đơng lạnh ở nhiệt độ -20 C cho đến khi đồng nhất và lọc. Sau khi lọc ta li tâm, thêm chất phụ gia và đem đi sấy. Kiểm tra lượng virus sau khi sấy và đĩng gĩi sản phẩm. 21
33. 1.7 Các sản phẩm NPV trên thị trường Trên thế giới các nước cĩ các nghiên cứu tạo ra các chế phẩm. Cụ thể như ở Nga cĩ chế phẩm NPV dạng bột: VIRIN Ha; VIRIN Dp, trừ sâu xanh, sâu rĩm thơng, Cịn ở Trung Quốc cĩ chế phẩm sinh học kết hợp virus và vi khuẩn với hiệu quả trừ sâu hại trên hàng vạn ha bơng, cà chua, Cũng như ở Mỹ, Úc, dùng cơng nghệ tế bào nhân nuơi virus cơn trùng để sản xuất chế phẩm virus dùng trong nơng-lâm nghiệp. Cịn ở Việt Nam cĩ chế phẩm dạng dịch thể trừ sâu xanh, sâu khoang, từ đề tài KC.08-14 (giai đoạn 1990-1995) của Viện Bảo vệ thực vật. Đề tài KHCN.02-07 (giai đoạn 1996 – 2000) do Viện Bảo vệ thực vật nghiên cứu sử dụng chế phẩm virus đơn lẻ hoặc phối hợp trong phịng trừ dịch hại cây trồng. Sản xuất được chế phẩm Vi-Bt dạng bột đa chức năng so với giai đoạn trước (Chu Thị Thơm, 2006) 22
34. CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu và dụng cụ nghiên cứu Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài được tiến hành 15 tuần (03/2018-07/2018) tại Viện Khoa Học Ứng Dụng trường ĐH Cơng Nghệ Tp.HCM 2.1.2 Vật liệu Sâu khoang được bắt ngồi đồng ruộng rau muống tại đường Bùi Cơng Trừng, Xã Nhị Bình, Huyện Hĩc Mơn về nuơi trong điều kiện phịng thí nghiệm, cho ăn thức ăn nhân tạo đến khi sâu hĩa nhộng, vũ hĩa, đẻ trứng và nở sâu đến độ tuổi thích hợp thì tiến hành thí nghiệm. Nguồn NPV (Nuclear polyhedrosis virus) do phịng thí nghiệm của Viện Khoa Học Ứng Dụng, Đại học Cơng Nghệ Tp.HCM cung cấp Dụng cụ và hĩa chất thí nghiệm Hĩa chất BPW (Buffered Peptone Water) Men bánh mì 0 PCA (Plate Count Agar) Cồn 70 0 Agar Cồn 90 Ascorbic acid Nước cất Methyl paraben Nước muối sinh lý Sorbic acid 2.1.3.2 Dụng cụ Hộp nhựa nhỏ (18x10x6) Ống đong Giấy báo Chén nhựa cĩ nắp (d=5cm) Ống effendorf Kẹp inox Đĩa petri Ống falcon Kéo Đèn cồn Cân điện tử Cọ quét, Cốc thủy tinh Máy xay sinh tố 23
35. 2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Ảnh hưởng của tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm đến sản lượng NPV Sâu chết NPV Nghiền, lọc, ly tâm Ly tâm lần 1: 500v/10p Ly tâm lần 2: 5000/15p Định lượng Pha lỗng ra các nồng độ 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109PIB/ml 102, 2 Sâu 7 ngày tuổi Sâu10 9 ngày, tuổi Sâu 11 ngày tuổi Hiệu lực gây chết Sản lượng NPV Hình 2.1 Sơ đồ quy trình tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm đến sản lượng NPV 24
36. 2.2.1.1 Chuẩn bị dịch huyền phù NPV Lấy 50 sâu chết do NPV, bổ sung 50ml nước cất để ở nhiệt độ phịng 01 ngày cho sâu rã ra rồi lọc bỏ xác sâu để lấy dịch huyền phù virus. Sau đĩ hút 5ml đem đi ly tâm theo phương pháp của Karma et al. (2012). Cụ thể như sau: Ly tâm lần đầu với 500 vịng trong 10 phút để lấy phần dịch nổi Ly tâm lần thứ hai 5000 vịng trong 15 phút lấy phần cặn lắng Sử dụng buồng đếm hồng cầu để đếm hàm lượng thể vùi, tính lượng virus cĩ trong dịch huyền phù. Sâu chết NPV Nghiền, lọc Lây phần dịch nổi Lấy phần cặn lắng Hình 2.2 Sơ đồ các bước tinh sạch dịch NPV Phương pháp xác định hàm lượng thể vùi: Tiến hành dùng micropipet lấy 1ml dịch đã ly tâm + 9ml nước muối sinh lý rồi pha lỗng 2-3 lần. Kiểm tra mật độ thể vùi trên buồng đếm hồng cầu dưới kính hiển vi. Đếm số lượng thể vùi cĩ trong 5 ơ nhỏ rồi tính trung bình. 3 -3 3 -4 Thể tích 25 ơ lớn = 1/10 mm =1/10 x 10 cm = 1/10 4 ml => 1ml = 25 x 10 Sau đĩ tính hàm lượng tế bào theo cơng thức như sau: 25
37. 4 4 Hàm lượng thể vùi (PIB/ml) = A/5 x N x 25x10 = 5 x A x N x 10 Trong đĩ: A: tổng số thể vùi (PIB/ml) đếm lượng trong 5 ơ nhỏ hệ số pha lỗng Chuẩn bị nguồn sâu ký chủ Sâu khoang S.litura được thu thập trên các cây trồng và đem về phịng thí nghiệm nuơi bằng thức ăn nhân tạo để lấy sâu thế hệ F1. Sâu tuổi 7, 9, 11 ngày tuổi được thu nhận và tiến hành thí nghiệm trong cùng một ngày. A B C Hình 2.3 Nguồn sâu làm thí nghiệm (A) Sâu 7 ngày tuổi; (B) Sâu 9 ngày tuổi; (C) Sâu 11 ngày tuổi Thức ăn nhân tạo bao gồm: 200g bột đậu xanh, 30g men bánh mì, 3,5g ascorbic acid, 2,0g methyl-paraben, 1,0g sorbic acid, 2,5ml formaldehyde, 10g agar, 750ml nước cất và 1% vitamin E. Cách chế biến thức ăn: Đậu đã được làm sạch với nước rồi phơi ráo cho vào máy xay sinh tố xay thành bột rồi cho nước cất và các thành phần nguyên liệu: Men bánh mì, Methyl-paraben, Sorbic acid vào máy xay sinh tố xay chung với nhau. Đun agar với nước cho sơi rồi cho vào máy xay sinh tố xay đều rồi cho các nguyên liệu cịn lại vào xay đều. Sau đĩ đổ thức ăn vào hộp nhựa 18x10x6 (cm) để nguội rồi cho sâu vào nuơi đến khi sâu hĩa nhộng, vũ hĩa, đẻ trứng và nở sâu đến khi sâu đủ 7, 9, 11 ngày tuổi thì tiến hành thí nghiệm. Chọn sâu ở mỗi độ tuổi cĩ cùng kích thước, khối lượng, tốt nhất là nên lấy sâu trong cùng một ổ trứng. 26
38. Hình 2.4 Thức ăn nhân tạo Sâu thu ở ngồi đồng Nuơi trên mơi trường thức ăn nhân tạo theo cơng thức cải tiến của Ahmad et al.(2015) Nhộng Trưởng thành Trứng Sâu 7, 9, 11 ngày tuổi Tiến hành thí nghiệm Hình 2.5 Quy trình nuơi sâu phịng thí nghiệm 27
39. 2.2.1.3 Các nghiệm thức bố trí Thức ăn để nhiễm virus được chế biến theo cơng thức của Ahmad et al. (2015) khơng bổ sung Formaldehyde: Đậu xanh 200g, men bánh mì 30g, Ascorbic acid 3,5g, Methyl-paraben 2,0g, Sorbic acid 1,0g, Agar 10g, Nước cất 750ml, 1% vitamin E Lây nhiễm sâu: Lây nhiễm bề mặt bằng cách phun đều dịch trên thức ăn nhân tạo theo phương pháp của FAO (2011) và Lawrenceet et al (2007). Cắt thức ăn thành 40 miếng đều nhau với kích thước 2,25x2 (cm) rồi dùng kẹp gắp thức ăn cho vào chén nhỏ 2 3 4 5 6 7 8 (d=5cm). Sâu được nhiễm với nồng độ 1x10 ; 1x10 ; 1x10 ; 1x10 ; 1x10 ; 1x10 ; 1x10 PIB/sâu. Thức ăn sau khi nhiễm để khơ bề mặt trong 15 phút (Karma et al. 2012) rồi sau đĩ dùng kẹp gắp sâu nhẹ nhàng hạn chế gây tổn thương đến sâu. Số lượng sâu: 30 sâu/cơng thức, lặp lại 3 lần Hình 2.6 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm bố trí gồm 2 yếu tố, cụ thể như sau: Yếu tố 1: Tuổi sâu: Sâu 7, 9, 11 ngày tuổi 2 3 4 5 6 7 8 Yếu tố 2: Nồng độ dịch nhiễm: 1x10 ; 1x10 ; 1x10 ; 1x10 ; 1x10 ; 1x10 ; 1x10 PIB/sâu và cơng thức đối chứng phun nước cất. 28
40. Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm Nồng độ nhiễm Ngày tuổi (PIB/sâu) 7 9 11 2 1x10 x x x 3 1x10 x x x 4 1x10 x x x 5 1x10 x x x 6 1x10 x x x 7 1x10 x x x 8 1x10 x x Nước cất x x x Sâu được lây nhiễm để trong điều kiện phịng thí nghiệm và theo dõi sâu chết mỗi ngày. Sau khi sâu chết, tiến hành đem sâu đi cân và cho vào ống effendorf rồi chuyển vào tủ đá. Sau 4-5 ngày, đem sâu ra nghiền, lọc, ly tâm theo phương pháp của Karma et al. (2012) rồi đếm thể vùi và tính sản lượng virus thu nhận được. Tính tốn hiệu lực diệt sâu theo cơng thức Abbott (1925). Hiệu lực (%)= Sản lượng virus trên sâu nhiễm được tính theo cơng thức của Mehrvar et al. (2007) Sản lượng NPV (PIB/sâu chết) = Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ sâu chết (%) Sản lượng PIB thu được 29
41. 2.2.2 Ảnh hưởng của dịch thơ và dịch ly tâm sử dụng lây nhiễm đến sự nhân lên của virus trong cơ thể sâu Sâu chết NPV Nước Ly tâm lần 1: 500v/10p Nghiền, lọc, ly tâm Ly tâm lần 2: 5000/15p Định lượng 8 Pha lỗng dịch ra nồng độ 10 PIB/ml Dịch thơ Dịch ly tâm 7 Sâu được nhiễm nồng độ 10 PIB/sâu Lây nhiễm trên sâu tuổi 4 Hiệu lực gây chết Sản lượng NPV Hình 2.7 Quy trình tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của dịch thơ và dịch ly tâm sử dụng lây nhiễm đến sự nhân lên của virus 30
42. 2.2.2.1 Chuẩn bị nguồn sâu ký chủ Sâu khoang S.litura được thu thập trên các cây trồng và đem về phịng thí nghiệm nuơi bằng thức ăn nhân tạo để lấy sâu thế hệ F1. Sâu tuổi 4 được thu nhận và tiến hành thí nghiệm trong cùng một ngày. Sâu thu ở ngồi dồng Nuơi trên mơi trường thức ăn nhân tạo theo cơng thức cải tiến của Ahmad et al.(2015) Nhộng Trưởng thành Trứng Sâu tuổi 1 Sâu tuổi 4 Tiến hành thí nghiệm Hình 2.8 Quy trình nuơi sâu phịng thí nghiệm 31
43. Hình 2.9 Sâu tuổi 4 Cắt thức ăn thành những miếng vuơng cĩ kích thước 2,25x2 (cm) rồi dùng kẹp gắp từng miếng thức ăn vào chén nhựa cĩ nắp, đường kính 5cm. Pha lỗng 1ml dịch ly tâm với 9ml nước muối sinh lý, 1ml dịch thơ với 9ml nước muối sinh lý. Dùng 8 micropipet hút 0,1ml dịch đã pha lỗng với nồng độ 10 PIB/ml, phun đều dịch lên thức ăn cho mỗi cơng thức. Thức ăn sau khi nhiễm để khơ bề mặt trong 15 phút (Karma et al. 2012), dùng kẹp gắp sâu nhẹ nhàng hạn chế gây tổn thương đến sâu rồi cho vào từng chén của mỗi cơng thức. Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên gồm các cơng thức, mỗi cơng thức nhiễm 10 sâu, lặp lại 06 lần CT1: Dịch virus huyền phù thơ CT2: Dịch virus đã ly tâm CT3: Đối chứng nhiễm sâu với nước cất 32
44. A B C Hình 2.10 (A) CT1-Dịch thơ; (B) CT2-Dịch ly tâm; (C) CT3-Đối chứng Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ sâu chết (%) Khối lượng sâu chết (%) Sản lượng PIB/sâu chết Tổng vi sinh vật hiếu khí cĩ trong thức ăn sau 01 ngày lây nhiễm 2.2.2.2 Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí Mẫu: Cân 10g thức ăn nhân tạo + 90ml BPW rồi đồng nhất mẫu ta được nồng độ 10-1, dùng micropipette hút 1ml mẫu đã đồng nhất pha lỗng với 9ml nước muối sinh lý đã được hấp khử trùng được nồng độ 10-2, tiếp tục pha lỗng ra nồng độ 10-3 Tiến hành thí nghiệm: Với các nồng độ pha lỗng 10-1, 10-2 , 10-3, mỗi nồng độ cấy 02 đĩa. Hút 1ml mẫu của mỗi nồng độ pha lỗng cho vào đĩa petri rồi tiến hành đổ 15-20ml mơi trường PCA vào mỗi đĩa lắc đều để yên úp ngược đĩa và đem ủ 300C Quan sát và định lượng vi sinh vật hiếu khí sau 03 ngày. 33
45. Hình 2.1 Quy trình định lượng vi sinh vật hiếu khí Định lượng vi sinh vật hiếu khí theo cơng thức: A (cfu/ml hoặc cfu/g) = Trong đĩ: A là số tế bào (CFU) vi khuẩn trong 1ml hay 1g mẫu C là tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn (cĩ số khuẩn lạc nằm trong khoảng từ 25-250 khuẩn lạc đĩa) ni là số lượng đĩa cấy tại độ pha lỗng thứ i V là thể tích mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa fi là độ pha lỗng tương ứng 34
46. 2.2.3 Ảnh hướng của thời gian lây nhiễm sâu đến sản lượng NPV Sâu chết NPV Nước Ly tâm lần 1: 500v/10p Nghiền, lọc, ly tâm Ly tâm lần 2: 5000/15p Định lượng Lây nhiễm trên sâu tuổi 4 7 Sâu được nhiễm nồng độ 10 PIB/sâu Sau 6h Sau 12h Sau 24h Sau 48h Sau 96h lây nhiễm lây nhiễm lây nhiễm lây nhiễm lây nhiễm chuyển chuyển chuyển chuyển chuyển sang thức sang thức sang thức sang thức sang thức ăn sạch ăn sạch ăn sạch ăn sạch ăn sạch Hiệu lực gây chết Sản lượng NPV Hình 2.12 Sơ đồ quy trình tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm sâu đến sản lượng NPV 35
47. Chuẩn bị sâu khoang để thí nghiệm: Sâu khoang S. litura được thu thập trên các cây trồng và đem về phịng thí nghiệm nuơi bằng thức ăn nhân tạo để lấy sâu thế hệ F1. Sâu tuổi 4 được thu nhận và tiến hành thí nghiệm. (Hình 2.8) Tiến hành thí nghiệm: Thức ăn được đựng trong chén nhỏ (d=5cm). Sâu được 7 nhiễm với nồng độ 10 PIB/sâu, phun đều dịch lên thức ăn cho mỗi cơng thức, ở mỗi cơng thức, lượng thức ăn cho sâu ăn chỉ vừa đủ trong thời gian thí nghiệm. Thức ăn sau khi nhiễm để khơ bề mặt trong 15 phút (Karma et al. 2012), rồi dùng kẹp gắp sâu nhẹ nhàng hạn chế gây tổn thương đến sâu rồi cho vào từng chén của mỗi cơng thức. Thí nghiệm được tiến hành dựa theo phương pháp của Bhutia et al (2012). Thí nghiệm gồm 7 cơng thức Số lượng sâu: 15 sâu/cơng thức, lặp lại 03 lần. CT1: Đối chứng khơng nghiễm virus CT2: Sau 6h lây nhiễm virus, chuyển sâu sang thức ăn sạch CT3: Sau 12h lây nhiễm virus, chuyển sâu sang thức ăn sạch CT4: Sau 24h lây nhiễm virus, chuyển sâu sang thức ăn sạch CT5: Sau 48h lây nhiễm virus, chuyển sâu sang thức ăn sạch CT6: Sau 96h lây nhiễm virus, chuyển sâu sang thức ăn sạch Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ sâu chết (%) Khối lượng sâu chết (g) Sản lượng PIB/sâu chết 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu Tính tốn hiệu lực diệt sâu theo cơng thức Abbott (1925). Sản lượng virus trên sâu nhiễm được tính theo cơng thức của Mehrvar et al. (2007) Xử lý thống kê số liệu thu thập được bằng phần mềm Excel, SAS (Statistical Analysis Systems) 9.1.3. 36
48. CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Ảnh hưởng của tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm đến sản lượng NPV 3.1.1. Đánh giá hiệu lực diệt sâu (%) của các nồng độ ở sâu 7 ngày tuổi, 9 ngày tuổi, 11 ngày tuổi Cũng như sản xuất các tác nhân vi sinh vật khác, việc sản xuất NPV cũng bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như: tuổi sâu nhiễm, nồng độ dịch nhiễm ban đầu, yếu tố mơi trường Trong đĩ, tuổi sâu ký chủ dùng để nhiễm và nồng độ nhiễm tương ứng cĩ ảnh hưởng rất lớn đến sản lượng NPV (Mahesh Kumar et al, 2012). Trên cơ sở của các giả (Monobrullah and Masao, 2000; Mohammad, 2001; Mahesh Kumar et al, 2012) chúng tơi tiến hành thử nghiệm trên sâu 7, 9, 11 ngày tuổi 2 3 4 5 6 7 với nồng độ lây nhiễm biến động từ 1x10 ; 1x10 ; 1x10 ; 1x10 ; 1x10 ; 1x10 ; 8 1x10 PIB/sâu. Hiệu lực diệt sâu của các nồng độ được trình bày như sau Bảng 3.1 Hiệu lực diệt sâu (%) của các nồng độ NPV trên sâu 7 ngày tuổi, 9 ngày tuổi, 11 ngày tuổi Tuổi sâu Lượng NPV lây nhiễm ban đầu trên mỗi sâu Hiệu lực diệt sâu (%) (PIB/sâu) 2 7 ngày tuổi 1x10 13,79 ijk 3 1x10 21,84 hi 4 1x10 36,78 fg 5 1x10 64,37 d 6 1x10 95,40 b 7 1x10 98,85 a 2 9 ngày tuổi 1x10 13,33 jk 3 1x10 18,89 ij 37
49. 4 1x10 34,44 fg 5 1x10 47,78 e 6 1x10 74,44 c 7 1x10 100 a 8 1x10 100 a 2 11 ngày 1x10 10,34 k 3 tuổi 1x10 19,54 ij 4 1x10 28,74 gh 5 1x10 43,68 ef 6 1x10 57,47 d 7 1x10 59,77 d 8 1x10 79,31 c CV (%) 7,024 Chú thích: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại trong cùng một hàng cĩ cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% Đối với sâu 7 ngày tuổi: Với nồng độ lây nhiễm thử nghiệm, tỷ lệ sâu chết biến 2 động từ 13,79% đến 98,85%. Trong đĩ nồng độ nhiễm 1x10 PIB/sâu cĩ tỷ lệ chết thấp nhất (13,79%) và thấp hơn cĩ ý nghĩa so với các nồng độ cịn lại. Tỷ lệ gây chết tăng 3 dần lên 21,84% đến 98,85% khi tăng nồng độ nhiễm từ 1x10 PIB/sâu đến 7 7 1x10 PIB/sâu. Ở nồng độ 1x10 PIB/sâu tỷ lệ sâu chết đạt 98,85% (Bảng 3.1) Đối với sâu 9 ngày tuổi: Với nồng độ lây nhiễm thử nghiệm, tỷ lệ sâu chết chỉ đạt 2 13,33% ở nồng độ lây nhiễm 1x10 PIB/sâu. Cũng tăng dần lên 18,89% đến 100% ứng với 3 7 nồng độ nhiễm 1x10 PIB/sâu đến 1x10 PIB/sâu. Tỷ lệ sâu chết sai khác khơng cĩ ý nghĩa 7 8 thống kê của hai nồng độ nhiễm 1x10 PIB/sâu và 1x10 PIB/sâu đều đạt 100%. 7 Như vậy, nồng độ gây chết tối ưu nhất đối lứa tuổi này là 1x10 PIB/sâu 38
50. Đối với sâu 11 ngày tuổi: Tỷ lệ chết ở sâu 11 ngày tuổi tương đối thấp so với 2 sâu 7 ngày tuổi và 9 ngày tuổi, chỉ đạt 10,34% với nồng độ nhiễm 1x10 PIB/sâu. Tỷ lệ 8 sâu chết đạt cao nhất (79,31%) ở nồng độ nhiễm 1x10 PIB/sâu. Và cĩ sự sai khác rõ so 7 với tỷ lệ chết ở nồng độ 1x10 PIB/sâu. Ở sâu 11 ngày tuổi, sâu chết ít vì chỉ cịn 4-6 ngày nữa là sâu vào nhộng. Khi lượng virus trong cơ thể sâu chưa đủ để gây chết thì sâu đã vào nhộng. Xét về tương tác giữa 2 yếu tố tuổi sâu và hiệu lực gây chết thì sâu 7 ngày tuổi với 7 7 nồng độ lây nhiễm là 1x10 /sâu, sâu 9 ngày tuổi với nồng độ lây nhiễm 1x10 PIB/sâu và 8 1x10 PIB/sâu cho hiệu lực diệt sâu cao nhất và tương đương nhau. Như vậy, xét trên chỉ tiêu hiệu lực diệt sâu cĩ thể chọn sâu 7 ngày tuổi hoặc 9 ngày tuổi để nhiễm NPV với nồng 7 độ lây nhiễm 1x10 PIB/sâu. Giải thích điều này, James D.Harper (1973), nồng độ lây nhiễm càng cao thì hiệu lực gây chết càng cao. Tuy nhiên, trong sản xuất sinh khối NPV, tỷ lệ sâu chết chưa nĩi lên hết hiệu quả của việc nhân sinh khối mà phải tính đến lượng NPV nhân lên trong sâu chết. 3.1.2 Đánh giá sản lượng NPV thu được trên tổng số sâu chết ở các độ tuổi và các nồng độ lây nhiễm Bảng 3.2 Sản lượng NPV thu được ở các độ tuổi và nồng độ nhiễm Lượng NPV lây Số sâu thí Số sâu chết Sản lượng NPV thu Tuổi sâu nhiễm ban đầu trên nghiệm trung bình giữa được (PIB/tổng sơ sâu mỗi sâu (PIB/sâu) 3 lần lặp chết thu được) 5 10 1 x 10 30 19,67 2,63 x 10 cd 7 ngày 6 10 1 x 10 30 28,67 3,52 x 10 b tuổi 7 10 1 x 10 30 29,67 3,28 x 10 b 6 10 1 x 10 30 22,33 2,83 x 10 bc 9 ngày 7 10 tuổi 1 x 10 30 30 6,14 x 10 a 8 10 1 x 10 30 30 2,50 x 10 cd 39
51. 6 10 1 x 10 30 16,67 1,24 x 10 f 11 ngày 7 10 1 x 10 30 18,33 1,59 x 10 e tuổi 8 10 1 x 10 30 24 2,14 x 10 d CV(%) 0,526 Chú thích: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại trong cùng một cột cĩ cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê, độ tin cậy 95% Thơng thường nếu nhiễm sâu tuổi quá nhỏ chúng sẽ chết nhanh trước khi cơ thể đạt sinh khối tối đa nhưng nếu nhiễm sâu càng lớn thì khả năng kháng với virus càng cao (Briese, 1986) và cả hai trường hợp đều đạt sản lượng khơng cao. Xét trong cùng tuổi sâu, sản lượng NPV cịn tùy thuộc vào nồng độ dịch nhiễm. 6 Đối với sâu 7 ngày tuổi, sản lượng NPV đạt cao nhất ở nồng độ nhiễm 1x10 PIB/sâu và 7 sai khác khơng cĩ ý nghĩa với nồng độ nhiễm 1x10 PIB/sâu, thấp nhất ở nồng độ nhiễm 5 1x10 PIB/sâu. Trong khi đĩ, số liệu này ở sâu 9 ngày tuổi đạt cao nhất ở nồng độ nhiễm 7 8 1x10 PIB/sâu và sâu 11 ngày tuổi đạt cao nhất ở nồng độ 1x10 PIB/sâu (Bảng 3.2). Xét về tương tác giữa nồng độ nhiễm và tuổi sâu, sản lượng NPV thu được trên 10 tổng số sâu chết đạt cao nhất là 6,14x10 PIB khi nhiễm ở sâu 9 ngày tuổi với nồng độ 7 8 nhiễm 1x10 PIB/sâu. Mặc dù số sâu chết ở nồng độ 1x10 PIB/sâu tương đương với 7 số sâu chết ở nồng độ 1x10 PIB/sâu của sâu tuổi 9 nhưng sản lượng NPV thu được lại 10 thấp hơn 2.5x10 PIB/sâu cĩ thể do sâu S.litura giai đoạn 9 ngày tuổi thì nồng độ 8 nhiễm 1x10 PIB/sâu là quá cao khiến sâu chết nhỏ hơn dẫn đến sản lượng NPV thu 7 nhận cũng nhỏ hơn so với khi nhiễm ở nồng độ 1x10 PIB/ml. Như vậy, xét trên chỉ tiêu hiệu lực diệt sâu và sản lượng virus thu nhận được, sâu 9 7 ngày tuổi với nồng độ 1x10 PIB/sâu là thích hợp để sản xuất chế phẩm NPV. Kết quả này cũng trùng với nghiên cứu của Monobrullah and Masao, 2000 nghiên cứu trên sâu khoang (Spodoptera litura) và sâu xanh đục quả (Helicoverpa armigera) của Gupta et al, 2007. 40
52. Các tác giả cũng đồng ý rằng tuổi sâu thích hợp nhất để nhân nhiễm NPV là sâu 9 ngày tuổi. 3.2 Ảnh hưởng của dịch thơ và dịch ly tâm sử dụng lây nhiễm đến sự nhân lên của virus trong cơ thể sâu 3.2.1 Đánh giá hiệu lực diệt sâu (%) của dịch thơ và dịch ly tâm Độ sạch của dịch nhiễm ban đầu đĩng vai trị rất quan trọng trong quy trình sản xuất virus. Tuy nhiên sản xuất ở quy mơ lớn, việc ly tâm sẽ tốn kém thời gian và chi phí. Vậy liệu cĩ thể sử dụng dịch thơ để sản xuất virus khơng? Kết quả của thí nghiệm này sẽ giải thích được câu hỏi trên. Số liệu ở bảng 3.3 cho thấy hiệu lực gây chết của NPV khơng cĩ sự sai khác giữa dịch thơ và dịch ly tâm sau 04 đến 09 ngày nhiễm. Bảng 3.3 Hiệu lực diệt sâu (%) của dịch thơ và dịch ly tâm Thời gian sâu chết sau Hiệu lực diệt sâu (%) nhiễm Dịch thơ Dịch ly tâm 4 ngày 25,00 ns 16,67 ns 5 ngày 71,67 ns 73,33 ns 6 ngày 80,00 ns 88,33 ns 7 ngày 91,67 ns 93,33 ns 8 ngày 91,67 ns 95,00 ns 9 ngày 100,00 ns 100,00 ns Chú thích: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại trong cùng một hàng cĩ cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%. Ns: khơng khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê 41
53. Như vậy, khơng cĩ sự khác biệt về hiệu lực gây chết sâu giữa dịch thơ và dịch ly tâm ở cùng một nồng độ. Kết quả này cĩ thể làm cơ sở chop việc sử dụng dịch thơ để trừ sâu trên đồng ruộng. Tuy nhiên, đối với việc sản xuất virus để làm chế phẩm thì phải đánh giá được sản lượng virus thu được. Hình 3.1 Biểu đồ thể hiện hiệu lực diệt sâu (%) ở cơng thức dịch thơ, dịch ly tâm 3.2.2 Khối lượng sâu chết (g/sâu) ở cơng thức dịch thơ và dịch ly tâm Bảng 3.4 Khối lượng sâu chết nhiễm NPV của dịch thơ và dịch ly tâm Cơng thức Trọng lượng sâu chết (g) Dịch thơ 0,60 ± 0,14 b Dịch ly tâm 0,72 ± 0,11 a Chú thích: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại trong cùng một cột cĩ cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%. Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy trọng lượng sâu chết khi bị nhiễm bệnh ở cơng thức nhiễm dịch virus cĩ ly tâm là 0,72 ± 0,11 (g) cao hơn ở cơng thức nhiễm với dịch virus thơ 0,60 ± 0,14 (g). Trong dịch thơ, thể mỡ và các thành phần khác của cơ thể sâu chưa 42
54. được loại bỏ, làm ảnh hưởng đến chất lượng thức ăn. Do vậy, ở cơng thức dịch thơ, sâu ăn ít hơn so với cơng thức dịch ly tâm dẫn đến trọng lượng sâu thấp hơn hẳn. 3.2.3 Tổng vi sinh vật hiếu khí cĩ trong thức ăn sau khi nhiễm 01 ngày Bảng 3.5 Kết quả định lượng vi sinh vật hiếu khí sau 01 ngày nhiễm giữa các cơng thức dịch thơ và dịch ly tâm Cơng thức Tổng vi sinh vật hiếu khí (CFU/ml) 4 CT1 – Dịch thơ 7,20x10 a 4 CT2 – Dịch ly tâm 3,25x10 b CT3 – Đối chứng 0 c CV(%) 2,472 Chú thích: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại trong cùng một cột cĩ cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% Kết quả bảng 3.5 cho thấy, tổng lượng vi sinh vật hiếu khí cao nhất ở dịch thơ đạt 4 7,20x10 cfu/ml, sai khác cĩ ý nghĩa so với cơng thức dịch ly tâm và cơng thức đối chứng 4 tương ứng với tổng lượng vi sinh vật hiếu khí 3,25x10 cfu/ml và 0 cfu/ml. Chính vì vậy, khi nhiễm loại dịch này lên thức ăn làm cho thức ăn mau bị hư, sâu ít ăn và phát triên kém. Kết quả này, cũng trùng với kết luận của FAO. (2012) khi cho biết, nếu sử dụng dịch gốc khơng tinh sạch để nhiễm sâu thì sâu chết khơng chỉ do NPV mà cịn do các tác nhân khác, ảnh hưởng đến sản lượng và chất lượng của virus trong sản xuất. Vì vậy, các tác giả khuyến cáo nên sử dụng dịch ly tâm để nhiễm virus (D.Grzywacz et al. 2011). 3.2.4 Đánh giá sản lượng virus cĩ trong mỗi sâu chết (PIB/sâu chết) giữa cơng thức dịch thơ và dịch ly tâm 43
55. Bảng 3.6 Sản lượng virus cĩ trong mỗi sâu ở cơng thức dịch thơ và dịch ly tâm Cơng thức Sản lượng NPV (PIB/sâu chết) 9 Dịch thơ 2,60 x 10 b 9 Dịch ly tâm 3,03 x 10 a Chú thích: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại trong cùng một cột cĩ cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99% Từ kết quả định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí giữa dịch thơ và dịch ly tâm ở bảng 3.5 đã cho thấy các thành phần trong dịch thơ ngồi virus NPV thì cịn các yếu tố khác cĩ thể gây ảnh hưởng sức sống của sâu làm sâu suy yếu dẫn đến giảm sản lượng của virus NPV trong cơ thể sâu. Do đĩ số liệu ở bảng 3.6 thể hiện sản lượng virus ở 9 cơng thức dịch ly tâm đạt 3,03x10 (PIB/sâu chết) cao hơn ở cơng thức dịch thơ cĩ sản 9 lượng virus chỉ đạt 2,60x10 (PIB/sâu chết) là phù hợp với kết quả nghiên cứu trên. 3.3. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm sâu đến sản lượng NPV 3.3.1. Đánh giá hiệu lực diệt sâu (%) của các cơng thức sau 6h, 12h, 24h, 48h, 96h lây nhiễm Bảng 3.7 Hiệu lực diệt sâu (%) ở các cơng thức sau 6h, 12h, 24h, 48h, 96h lây nhiễm Thời gian lây Hiệu lực diệt sâu qua các ngày (%) nhiễm 5 Ngày 7 Ngày 6h 84,44 ns 87,70 b 12h 84,44 ns 95,40 ab 24h 91,11 ns 97,44 ab 48h 86,67 ns 100,00 a 96h 73,33 ns 93,08 ab CV(%) 15,042 10,487 44
56. Chú thích: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại trong cùng một cột cĩ cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%. Ns: khơng khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê Hình 3.2 Biểu đồ thể hiện hiệu lực diệt sâu (%) ở cơng thức sau 6h, 12h, 24h, 48h, 96h Kết quả ở bảng 3.7 cho thấy, hiệu lực diệt sâu sau 3 ngày và 5 ngày nhiễm virus giữa các cơng thức 6h, 12h, 24h, 48h, 96h lây nhiễm khơng cĩ sự khác biệt, đến ngày thứ 7 cho thấy hiệu lực diệt sâu ở cơng thức 48h cho kết quả tốt nhất đạt 100%, nhưng khơng cĩ sự sai khác rõ với cơng thức 12h, 24h, 96h với tỷ lệ chết đạt 95,40%, 97,44%, 93,08% , thấp nhất là 6h với hiệu lực đạt 87,70%. Điều này cho thấy khi nhiễm sâu với cùng một nồng độ 1x107 PIB/sâu nhưng khác nhau về khoảng thời gian để sâu nhiễm hết lượng NPV đĩ (1x107 PIB/sâu) vào cơ thể thì các cơng thức nhiễm 12h, 24h, 48h, 96h, đều cĩ khả năng gây chết tốt. Tuy nhiên, cịn phải xét đến trọng lượng sâu và sản lượng NPV thu được mới xác định được khoảng thời gian tối ưu để nhiễm sâu 45
57. 3.3.2 Khối lượng sâu chết (g) và sản lượng virus (PIB/sâu chết) ở các cơng thức sau 6h, 12h, 24h, 48h, 96h lây nhiễm Bảng 3.8 Khối lượng sâu chết (g) và sản lượng virus PIB/sâu chết ơ các cơng thức sau 6h, 12h, 24h, 48h, 96h lây nhiễm Thời gian lây Trọng lượng sâu (g) Sản lượng NPV (PIB/sâu nhiễm chết) 9 6h 0,322 ± 0,023 b 2,038 x 10 bc 9 12h 0,417 ± 0,115 ab 2,788 x 10 abc 9 24h 0,477 ± 0,044 a 3,288 x 10 ab 9 48h 0,525 ± 0,104 a 3,761 x 10 a 9 96h 0,314 ± 0,01 b 1,917 x 10 c CV(%) 17,709 1,258 Chú thích: Số liệu được tính giá trị trung bình của các lần lặp lại ± SD trong cùng một cột cĩ cùng chữ cái theo sau giống nhau thì khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% Kết quả ở bảng 3.8 cho thấy, trọng lượng sâu ở cơng thức 6h và 96h cĩ giá trị thấp nhất 0,322 ± 0,023 (g) , 0,314 ± 0,01 (g) và thấp hơn cĩ ý nghĩa so với các thời gian cịn lại. Cơng thức 24h, 48h cho kết quả cao nhất ứng với khối lượng 0,477 ± 0,044 (g), 0,525± 0,104 (g) nhưng cũng khơng cĩ sai khác rõ với cơng thức 12h với trọng lượng sâu 0,477 ± 0,044 (g). Ở cơng thức 48h cĩ sản lượng virus PIB/sâu chết cao nhất 3,761 x 109 PIB/sâu chết. Sản lượng virus tăng dần từ 2,038 x 109 PIB/sâu chết đến 3,761 x 109PIB/sâu chết tương ứng với tăng thời gian lây nhiễm từ 6h đến 48h. Nhưng khi nhiễm sâu đến 96h sản lượng virus thấp nhất chỉ đạt 1,917 x 109 PIB/sâu chết . 46
58. Ở các cơng thức thời gian, đều phun với nồng độ như nhau, tuy nhiên lượng thức ăn cho sâu nhiễm chỉ cho vừa đủ để sâu ăn hết trong 6h, 12h, 24h, 48h, 96h. Với thời gian 6h lây nhiễm thì lượng virus sâu ăn vào nhanh hơn, ở thời điểm này sâu cịn quá nhỏ, mà virus tấn cơng vào cơ thể sâu tối đa làm cho sâu vào giai đoạn ăn yếu sớm hơn cơng thức 12h, 24h, 48h, 96h làm cho khối lượng và sản lượng virus thấp hơn cơng thức 12h, 24h, 48h. Cịn ở cơng thức 96h mới chuyển sang thức ăn sạch, do lượng phân sâu thải ra trong 4 ngày quá nhiều dẫn đến chất lượng thức ăn bị ảnh hưởng, sâu ăn ít nên sản lượng virus và khối lượng thấp. Như vậy, để sản xuất chế phẩm NPV, ta nên chọn thời gian lây nhiễm là 24h vì ở cơng thức này, hiệu lực diệt sâu cũng như là khối lượng, sản lượng NPV cho kết quả khơng sai khác nhiều đối với cơng thức đạt kết quả tốt nhất là cơng thức 48h. Nhưng cơng thức 24h lại cĩ thể tiết kiệm được chi phí, lượng thức ăn lây nhiễm hơn cơng thức 48h nên sẽ mang lại hiệu quả kinh tế cao hơn. 47
59. CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận 7 Sâu 9 ngày tuổi với nồng độ nhiễm 1x10 PIB/sâu cho sản lượng cao nhất. Chọn thời gian lây nhiễm là 24h để sản xuất chế phẩm NPV. Sử dụng dịch ly tâm để lây nhiễm NPV cho sản lượng virus cao hơn nhiễm bằng dịch thơ. 4.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm NPV số lượng lớn và ứng dụng trên diện rộng. Nghiên cứu tạo chế phẩm NPV phù hợp trên các loại cây trồng. Nghiên cứu dụng cụ và mật độ phù hợp để lây nhiễm SLNPV. 48
60. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Thị Hai và Nguyễn Hồi Hương, 2015. Phân lập, định danh virus gây chết sâu khoang Spodoptera litura (Fabr.) và hiệu lực của chúng. Tạp chí Bảo vệ thực vật số 1 năm 2015 trang 16-23. 2. Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004, Giáo trình Cơn trùng Nơng nghiệp, phần B: Cơn trùng gây hại cây trồng chính ở Đồng bằng sơng Cửu Long, Tủ sách Đại Học Cần Thơ. 3. Nguyễn Thị Như Quỳnh và Lê Văn Trịnh, Nguyễn Thị Nga, Hà Thị Thu Thủy (2014). Phát triển chế phẩm sinh học npv-spl bằng cơng nghệ tế bào để phịng trừ sâu khoang 4. Nguyễn Thị Như Quỳnh, 2014, Nghiên cứu sản xuất chế phẩm NPV-Spl (Nucle Polyhedrosis Virus) từ tế bào gốc sâu khoang để phịng trừ sâu hại cây trồng nơng nghiệp. Luận văn thạc sĩ., Học viện nơng nghiệp Việt Nam. 5. Phạm Thị Thùy, 2004, Cơng nghệ sinh học trong bảo vệ thực vật, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội. 6. Phạm Văn Ty (2007), Virut học – NXB giáo dục 7. Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành (2006), Cơng nghệ sinh học tập 5 – NXB giáo dục TÀI LIỆU TIẾNG ANH 8. Abbott W. S., (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide.- Journal of Economic Entomology, 18: 265-267. 9. Agsaoay, M.V., (1998). Management of the common cutworm, Spodoptera litura (Fabr.) on peanut, Arachis hypogaea L. using Bacillus thuringiensis Berliner and nuclear polyhedrosis virus.FAO.
61. 10. Ahmad cheraghian, (2014). Tobacco budworm, Spodoptera litura (Fabricius) Lepidoptera:Noctuidae. Bureau of Plant Pest Surveillance and Pest Risk Analysis Iran. 11. Ahmad, M., Arif, M.I. and Ahmad, M. (2007). Occurrence of insecticide resistance in field populations of Spodoptera litura (Lepidoptera : Noctuidae) in Pakistan. Crop Protec., 26 (6) : 809- 817. 12. Ahmed, A. M., M. Etman, and G. H. S. Hooper. 1979. Developmental and reproductive biology of Spodoptera litura (F.) (Lepidoptera: Noctuidae). J. Aust. Ent. Soc. 18: 363–372. 13. Asi, M. R. ; Bashir, M. H. ; Afzal, M. ; Zia, K. ; Akram, M., (2013). Potential of entomopathogenic fungi for biocontrol of Spodoptera litura Fabricius (Lepidoptera: Noctuidae). : Journal of Animal and Plant Sciences 2013 Vol.23 No.3 pp.913-918. 14. Bergold gh. (1963).The molecular structure of some insect virus inclusion bodies. 15. Biji et al. (2006) Quantitative estimation of Hyblaea puera NPV production in three larval stages of the teak defoliator, Hyblaea puera(Cramer). Journal of Virological Methods 136(1-2):78-82. 16. Boucias, D. W. Johnson, G. E. Allen, (1980). Effects of Host Age, Virus Dosage, and Temperature on the Infectivity of a Nucleopolyhedrosis Virus Against Velvetbean Caterpillar, Anticarsia gemmatalis, Larvae. 17. Briese, D. T. 1986. Insect resistance to baculovirus. In : The Biology of Baculoviruses, Vol.2. R.R. Granados and B.A. Federici (eds.). CRC Press, Boca Raton, Florida, pp. 237-263. 18. CABI. 2009. Crop protection compendium: global module. Commonwealth Agricultural Bureau International, Wallingford, UK. 19. Chari, M. S. andS. N. Patel. 1983. Cotton leaf worm Spodoptera litura Fabricius its biology and integrated control measures. Cotton Dev 13: 465-482. 20. Crook N. E. (eds.), Hunter-Fujita, F. R., P. F. Entwistle and H. F. Evans (1998) Insect Viruses and Pest Management. Wiley, New York.
62. 21. Divya, D. (2016). Management of Spodoptera Litura: Imperial Journal of Interdisciplinary Research (IJIR) Vol-2, Issue-5, 2016. 22. Doyle JJ, Doyle JL (1990) Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12:13–15. 23. Faust, R. M. (1966). Content of nucleic acid in intact nuclear polyhedral bodies isolated from virus-infected beet armyworms, Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae). J. Invertebr. Pathol. 8: 273-274. 24. Gupta G.P, S. Rani, A. Birah and M. Raghuraman (2005). Improved artificial diet for mass rearing of the tobacco caterpillar, Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae). 25. Gitanjali J. Chaudhari S. and Ramaskrishnan N. (1994). Age-related responsed of Spodoptera litura (Fab.) to nuclear polyhedrosis virus. J. Ent. Res., 23(3): 247- 260. 26. Groner A 1986. Specifity and safety of baculoviruses. Pp. 177-202. In: The biology of Baculoviruses, Vol. I, Biological Properties and Molecular Biology, (RR Granados, BA Federici, Eds.) CRC Press, Boca Raton. 27. Grzywacz (2011). The helicoverpa armigera npv production manual. 28. Grzywacz D, Richards A, Rabindra RJ, Saxena H, Rupela OP (2005). Efficacy of biopesticides and natural plant products for H. armigera control. In Heliothis/Helicoverpa management- Emerging Trends and Strategies for Future research (Sharma HC Ed.), New Delhi: Oxford &IBH, pp 371-389. 29. Grzywacz et al., 1998.The in vivo production of Spodoptera littoralis nuclear polyhedrosis virus. 30. Gupta S.C. et al. (2007). Management of insect pests of okra with biopesticides and chemicals. Ann. Pl. Protec. Sci. 31. Harrap K.A. (1972), The structure of nuclear polyhedrosis viruses: III. Virus assembly. 32. Hill, D. S. (1993). Agricultural insect pests of the tropics andtheir control. Cambridge, UK: Cambridge UniversityPress.
63. 33. Hill, D. S. 1975. Agricultural insect pests of the tropics and their control. Cambridge Univ. Press, London. 34. Hochberg ME (1991). Extra-host interactions between a braconid endoparasitoid Apanteles glomeratus and a baculovirus for larvae of Pieris brassicae. Journal of Animal Ecology. 35. Hong Tong, Su Qi, Xiaomao Zhou and Bai Lianyang (2013). Field resistance of Spodoptera litura (Fabricius) (Lepidoptera: Noctuidae) to organophosphates, pyrethroids, carbamates and four new chemistry insecticides in Hunan, China. J. Pest. Sci., 50(1) : 201-211. 36. Hostetter D L and Puttler B 1991. Anew broad host spectrum Nuclear polyhedrosis virus isolated from a celery looper, Anagrapha falcifera (Kirby), (Lepidoptera: Noctuidae). Environmental Entomology 20 : 1480-1488. 37. Ignoffo CM (1981) The fungus Nomuraea rileyi as a microbial insecticide: fungi. In: Microbial Control of Pests and Plant Diseases 1970-1980 1st ed. (Edited by Burges HD), pp 513-38 Academic Press, London. 38. James D.Harper, (1973) Food consumption by cabbage loopers infected with nuclear polyhedrosis virus. Journal of Invertebrate Pathology Volume 21, Issue 2, March 1973, Pages 191-197. 39. Jayaraj, S. and Rabindra, R. J. 1990. Microbial control and integrated pest management. Proceedings of indo USSR joint workshop on problems and potentials of Biocontrol of pests and Diseases, Bangalore, 263-387 P. 40. Jones, W. J. and Poprawski, T. J. 2000. Host plant effects on activity of the mitosporic fungi Beauveria bassiana and Paecilomyces fumosoroseus against two populations of Bemisia whiteflies (Homoptera: Aleyrodidae). 41. Kalmakoff, J. V. Ward, 2003. Baculoviruses. University of Otago, Department of Microbiology. 42. Karma et al. (2012), Evaluation and production of improved formulation of nucleopolyhedrosis virus of Spodoptera litura. Bulletin of Insectology 65 (2): 247- 256, 2012 ISSN 1721-8861.
64. 43. Kelly D.C. and Tinsley, T.W. 1985. Taxonomy and nomenclature of insect pathogenic viruses. In K. Maramorosch and K.E. Sherman (eds.), Viral Insecticides for Biological Control. Academic Press, London, pp. 3-26. 44. Matsuura H, Naito A (1997) Studies on the cold-hardiness and overwintering of Spodoptera litura F. ( Lepidoptera: Noctuidae): VI. Possible overwintering areas predicted from meteorological data in Japan. Appl Entomo Zool 32:167_177. 45. Matsuura H, Naito A (1997) Studies on the cold-hardiness and overwintering of Spodoptera litura F. (Lepidoptera: Noctuidae): VI. Possible overwintering areas predicted from meteorological data in Japan. Appl Entomol Zool 32:167– 177. 46. Mehrvar A., R.J. Rabindra , K. Veenakumari and G.B. Narabenchi (2007) Standardization of Mass Production in Three Isolates of Nucleopolyhedrovirus of Helicoverpa armigera (Hübner). Pakistan Journal of Biological Sciences, 10: 3992-3999. 47. Minion, F.C., Coons, L.B. and Brown, J.R. 1979. Characterization of the Polyhedral Envelope of the Nuclear Polyhedrosis Virus of Heliothis virescens. J. Invertebr. Pathol., 34: 303. 48. Mohammad Monobrullah and Uma Shankar. 2008. Sublethal effects of SpltNPV infection on developmental stages of Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae). Bio-control Science and Technology. 49. Monobrullah, M., & Nagata, M. (2000). Optimisation of Spodoptera litura Fab. Nucleopolyhedrovirus Production in Homologous Host Larvae. Insect Science and Its Application, 20(2), 157-165. 50. Monobrullah. Md. and Nagata. M. 2000. Developmental resistance in orally inoculated mature larvae of Spodoptera lilura (Fab.) to its nuclear polyhedrosis virus (NPV). Journal of Entomological Research. 24: 1-8. 51. Nasution, D.E.A., Miranti, M. and Melanie, M., (2015). Biological Test of Formulation of Subculture Helicovepa armigera Nuclear Polyhedrosis Virus (HaNPV) on Mortality of Spodoptera litura Larvae infested to cabbage (Brassica oleracea Var. capitata Linn.) Plantation. Knowl. Publ. Serv., 2: 646-648.
65. 52. O'Reilly DR, Miller LK, Luckow VA (1994) The baculovirus expression vectors: a laboratory manual. Oxford: Oxford University Press. 53. Pearson, E. O. 1958. The insect pests of cotton in tropical Africa. Commonwealth Inst. Entomol., London. 54. Rao, G. V. R., Wightman, J. A., & Ranga Rao, D. V. (1993). World review of the natural enemies and diseases of podoptera litura (F.) (Lepidoptera: Noctuidae). Insect Science Application, 14, 273–284. 55. Ranga Rao G.V., Ch. Sridhar Kumar, K. Sireesha, and P. Lava Kumar (2015) Role of Nucleopolyhedroviruses (NPVs) in the Management of Lepidopteran Pests in Asia. 56. Ravishankar B. S. and M. G . Venkatesha* (2010). Effectiveness of SINPV of Spodoptera litura (Fab.) (Lepidoptera: Noctuidae) on different host plants. 57. Roberts, D. W., Fuxa, J. R., Gaugler, R., Goettel, M, Jaques R. and Maddox. J.(1991). Use of pathogens in insect control, In: (Pimentel, D. ed.). CRC Handbook of Pest Management in Agriculture, second edition, Boca. 58. Sahayaraj, K. and Paulraj, M. G. (1998). Relative toxicity of some plant extracts to groundnut leaf miner Aproaerema modicella Dev. International Arachis Newsletters, 15: 62-63. 59. Shapiro, M., 1986. In vivo production of baculoviruses. In: Granados, R.R., Federici, B.A. (Eds.), The Biology of Baculoviruses, vol. II. CRC Press, Boca Raton, FL, pp. 31–61. 60. Shaurub, E.H., Meguid, A.A. and Aziz, N.M.A., (2014). Effect of individual and combined treatment with Azadirachtin and Spodoptera littoralis multicapsid nucleopolyhedro virus (SpliMNPV, Baculoviridae) on the Egyptian cotton leafworm Spodoptera littoralis (Boisduval) (Lepidoptera: Noctuidae). Ecol. Balkanica, 6: 93-100. 61. SINGH, S.P AND JALALI, S.K., 1997. Management of Spodoptera litura (Fabricius) (Lepidoptera: Noctuidae). Shashpa, 2: 203-206.
66. 62. Smits, P. H., & Vlak, J. M. (1988). Biological activity of Spodoptera exigua nuclear polyhedrosis virus against S. exigua larvae. Journal of Invertebrate Pathology. 63. SUMMERS, M. D. & SMITH, G. E. (1978). Analysis of baculovirus genomes with restriction endonucleases. Virology 89, 517-527. 64. Szewczyk B, Rabalski L, Krol E, Sihler W, Souza ML (2009). Baculovirus biopesticides-a safe alternative to chemical protection of plants. J. Biopestic., 2:209–216. 65. Tohnishi M. Flubendiamide, a novel insecticide highly active against lepidopterous insect pests. J. Pestic. Sci. 2005;30:354–360. 66. Tran Thi Kieu Trang and S. Chaudhari, Bioassay of nuclear polyhedrosis virus (npv) and in combination with insecticide on Spodoptera litura (Fab). 67. Tuan, S. J., Chen, W. L. and Kao, S. S. 1998. In vivo mass production and control efficacy of Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae) nucleopolyhedrosis virus. Chinese Journal of Entomology, 18: 101-116. 68. USDA. 1982. Pests not known to occur in the United States or of limited distribution: Rice cutworm. USDA-APHIS-PPQ. 69. Venkateswarlu, U., Madhumathi, T. and Rao, P.A. 2005. Relative toxicity of novel insecticides against insecticide resistant Guntur strain of Spodoptera litura (Fab.) on cotton in Andhra Pradesh. Pesticide Research Journal, 17(1):33-35. 70. Vinay K (1997). Studies on enhancement of Baculovirus activity on Helicoverpa armigera (Hubner). Ph.D. Thesis, IARI, New Delhi, India, 107p. 71. Vinod Kumari, and Singh, N.P. 2009. Spodoptera litura nuclear polyhedrosis virus (NPV-S) as a component in Integrated Pest Management (IPM) of Spodoptera litura (Fab.) on cabbage. J. Biopesticides, 2(1) 84-86. 72. Yamanaka, H., F. Nakasuji, and K. Kiritani, 1975, Development of the tobacco cutworm Spodoptera litura in special reference to the density of larvae. Bull. Koch. Inst. Agric. For Sci. 7: 1–7. (English summary).
67. TÀI LIỆU INTERNET 73. Merry Youle, 2012. It’s Raining Viruses! 74. Phạm Thị Anh Thơ Trần Thị Thơm, 2014. Một số sâu hại cây trồng chủ yếu và biện pháp phịng trừ sâu ăn rau. 75. Sâu khoang (Sâu ăn tạp) hại rau, đậu (Spodoptera litura). 76. Virus gây bệnh và ứng dụng của virus trong thực tiễn. a5088.html
68. PHỤ LỤC 1 DANH MỤC HÌNH ẢNH CƠNG THỨC 1 – DỊCH THƠ (A) Sâu được nhiễm với dịch virus thơ (B) Sâu chết ở cơng thức nhiễm dịch virus thơ
69. CƠNG THỨC 2 – DỊCH LY TÂM (C) Sâu được nhiễm với dịch ly tâm (D) Sâu chết ở cơng thức dịch ly tâm CƠNG THỨC 3 – ĐỐI CHỨNG
70. ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ (A)(B) Khuẩn lạc ở lần lặp I cơng thức dịch thơ (C)(D) Khuẩn lạc ở lần lặp II cơng thức dịch thơ (E)(F) Khuẩn lạc ở lần lặp III cơng thức dịch thơ
71. a) Khuẩn lạc ở lần lặp I cơng thức dịch ly tâm (b) (c) Khuẩn lạc ở lần lặp II cơng thức dịch ly tâm (d) (e) Khuẩn lạc ở lần lặp II cơng thức dịch ly tâm
72. Khuẩn lạc ở cơng thức đối chứng
73. SÂU CHẾT Ở CƠNG THỨC ẢNH HƯỞNG VỀ THỜI GIAN
74. PHỤ LỤC 2 SỐ LIỆU THƠ 3. Ảnh hưởng của tuổi sâu và nồng độ lây nhiễm 1.1 Hiệu lực diệt sâu Sâu 7 ngày tuổi Lần 1 Ngày sau khi nhiễm 102 103 104 105 106 107 ĐC 4 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 1 3 0 6 2 2 5 8 11 11 0 7 2 3 6 10 12 13 1 8 0 0 0 2 5 3 0 Tổng số sâu chết sau 8 4 5 11 20 29 30 1 ngày HIỆU LỰC DIỆT SÂU 10,34 13,79 34,48 65,52 96,55 100,00 ACRSIN 18,76 21,80 35,96 54,04 79,30 90,00 Sâu 7 ngày tuổi Lần 2 Ngày sau khi nhiễm 102 103 104 105 106 107 ĐC 4 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 1 0 0 6 2 3 3 10 6 13 0 7 4 4 7 9 10 13 1 8 0 2 2 0 11 4 0 Tổng số sâu chết sau 8 6 9 12 19 28 30 1 ngày HIỆU LỰC DIỆT SÂU 17,24 27,59 37,93 62,07 93,10 100,00 ACRSIN 24,53 31,68 38,02 51,98 74,77 90,00
75. Sâu 7 ngày tuổi Lần 3 Ngày sau khi nhiễm 102 103 104 105 106 107 ĐC 4 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 1 1 0 6 1 5 3 10 12 13 0 7 4 3 5 8 11 14 1 8 0 0 4 2 5 1 0 Tổng số sâu chết sau 8 5 8 12 20 29 29 1 ngày HIỆU LỰC DIỆT SÂU 13,79 24,14 37,93 65,52 96,55 96,55 ACRSIN 21,80 29,43 38,02 54,04 79,30 79,30 Sâu 9 ngày tuổi Lần 1 Ngày sau khi nhiễm 102 103 104 105 106 107 108 ĐC 4 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 2 7 0 6 1 1 2 4 10 11 20 0 7 1 2 6 9 10 15 3 0 8 1 2 3 2 2 2 0 0 Tổng số sâu chết sau 8 0 3 5 11 15 22 30 30 ngày HIỆU LỰC DIỆT SÂU 10,00 16,67 36,67 50 73,33 100,00 100,00 ACRSIN 18,43 24,09 37,27 45 58,91 90,00 90,00 Sâu 9 ngày tuổi Lần 2 Ngày sau khi nhiễm 102 103 104 105 106 107 108 ĐC 4 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 1 2 9 0 6 0 1 3 4 8 10 12 0 7 2 4 4 6 10 12 9 0 8 2 1 3 2 3 6 0 0 Tổng số sâu chết sau 8 0 4 6 10 12 22 30 30 ngày HIỆU LỰC DIỆT SÂU 13,33 20,00 33,33 40,00 73,33 100,00 100,00 ACRSIN 21,42 26,57 35,26 39,23 58,91 90,00 90,00
76. Sâu 9 ngày tuổi Lần 3 Ngày sau khi nhiễm 102 103 104 105 106 107 108 ĐC 4 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 8 0 6 2 2 4 5 9 12 12 0 7 2 3 5 9 9 10 10 0 8 1 1 1 2 5 8 0 0 Tổng số sâu chết sau 8 0 5 6 10 16 23 30 30 ngày HIỆU LỰC DIỆT SÂU 16,67 20,00 33,33 53,33 76,67 100,00 100,00 ACRSIN 24,09 26,57 35,26 46,91 61,12 90,00 90,00 Sâu 11 ngày tuổi Lần 1 Ngày sau khi nhiễm 102 103 104 105 106 107 108 ĐC 4 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 1 1 0 0 6 0 3 5 6 6 6 6 1 7 2 3 4 6 9 10 9 0 8 1 0 0 0 0 2 9 0 Tổng số sâu chết sau 8 1 3 6 9 12 16 19 24 ngày HIỆU LỰC DIỆT SÂU 6,90 17,24 27,59 37,93 51,72 62,07 79,31 ACRSIN 15,23 24,53 31,68 38,02 45,99 51,98 62,94 Sâu 11 ngày tuổi Lần 2 Ngày sau khi nhiễm 102 103 104 105 106 107 108 ĐC 4 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 6 2 3 0 3 8 8 7 1 7 2 2 3 7 7 8 9 0 8 0 0 4 4 4 2 10 0 Tổng số sâu chết sau 8 1 4 5 7 14 19 18 26 ngày HIỆU LỰC DIỆT SÂU 10,34 13,79 20,69 44,83 62,07 58,62 86,21 ACRSIN 18,76 21,80 27,06 42,03 51,98 49,96 68,20
77. Sâu 11 ngày tuổi Lần 3 Ngày sau khi nhiễm 102 103 104 105 106 107 108 ĐC 4 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 3 3 6 6 7 8 1 7 3 4 5 7 8 8 8 0 8 2 2 4 2 4 3 6 0 Tổng số sâu chết sau 8 1 5 9 12 15 18 18 22 ngày HIỆU LỰC DIỆT SÂU 13,79 27,59 37,93 48,28 58,62 58,62 72,41 ACRSIN 21,80 31,68 38,02 44,01 49,96 49,96 58,32 1.2 Sản lượng virus thu được trên tổng số sâu chết Sâu 7 ngày tuổi Lần nhắc 105 106 107 I 2,64 x1010 3,17 x1010 3,44 x1010 II 2,98 x1010 3,86 x1010 3,25 x1010 III 2,26 x1010 3,52 x1010 3,16 x1010 PIB Trung bình 2,63 x1010 3,52 x1010 3,28 x1010 Log(x+1) 10,42 10,55 10,52 Sâu 9 ngày tuổi Lần nhắc 106 107 108 I 2,87 x1010 5,85 x1010 2,51 x1010 II 2,46 x1010 6,21 x1010 2,84 x1010 III 3,15 x1010 6,37 x1010 2,16 x1010 PIB Trung bình 2,83 x1010 6,14 x1010 2,50 x1010 Log(x+1) 10,45 10,79 10,40 Sâu 11 ngày tuổi Lần nhắc 106 107 108 I 1,15 x1010 1,89 x1010 2,44 x1010 II 1,26 x1010 1,65 x1010 1,86 x1010 III 1,32 x1010 1,23 x1010 2,12 x1010 PIB Trung bình 1,24 x1010 1,59 x1010 2,14 x1010 Log(x+1) 10,09 10,20 10,33
78. 4. Ảnh hưởng của dịch thời gian lây nhiễm 2.1 Số sâu chết SÂU CHẾT CT1- ĐỐI CHỨNG Lần nhắc I II III Sau 1 ngày nhiễm 0 0 0 Sau 2 ngày nhiễm 0 0 0 Sau 3 ngày nhiễm 0 0 0 Sau 4 ngày nhiễm 0 0 0 Sau 5 ngày nhiễm 0 0 0 Sau 6 ngày nhiễm 0 1 2 Sau 7 ngày nhiễm 0 0 0 Sau 8 ngày nhiễm 0 0 0 SÂU CHẾT CT2-6h Lần nhắc I II III Sau 1 ngày nhiễm 0 0 0 Sau 2 ngày nhiễm 0 0 0 Sau 3 ngày nhiễm 0 2 1 Sau 4 ngày nhiễm 9 5 8 Sau 5 ngày nhiễm 5 6 2 Sau 6 ngày nhiễm 0 1 1 Sau 7 ngày nhiễm 0 0 0 Sau 8 ngày nhiễm 0 0 1 SÂU CHẾT CT2-12h Lần nhắc I II III Sau 1 ngày nhiễm 0 0 0 Sau 2 ngày nhiễm 0 1 0 Sau 3 ngày nhiễm 0 0 0 Sau 4 ngày nhiễm 9 6 6 Sau 5 ngày nhiễm 4 5 7 Sau 6 ngày nhiễm 1 0 1 Sau 7 ngày nhiễm 0 2 1 Sau 8 ngày nhiễm 0 0
79. SÂU CHẾT CT2-48h Lần nhắc I II III Sau 1 ngày nhiễm 1 0 0 Sau 2 ngày nhiễm 0 0 0 Sau 3 ngày nhiễm 1 0 1 Sau 4 ngày nhiễm 3 6 7 Sau 5 ngày nhiễm 6 9 5 Sau 6 ngày nhiễm 3 2 Sau 7 ngày nhiễm 1 Sau 8 ngày nhiễm SÂU CHẾT CT2-96h Lần nhắc I II III Sau 1 ngày nhiễm 0 0 1 Sau 2 ngày nhiễm 0 0 0 Sau 3 ngày nhiễm 2 1 1 Sau 4 ngày nhiễm 2 3 4 Sau 5 ngày nhiễm 4 7 4 Sau 6 ngày nhiễm 2 2 3 Sau 7 ngày nhiễm 3 2 2 Sau 8 ngày nhiễm 2 0 1 SÂU CHẾT CT2-24h Lần nhắc I II III Sau 1 ngày nhiễm 0 0 1 Sau 2 ngày nhiễm 0 0 0 Sau 3 ngày nhiễm 2 1 1 Sau 4 ngày nhiễm 8 10 5 Sau 5 ngày nhiễm 4 4 5 Sau 6 ngày nhiễm 1 1 Sau 7 ngày nhiễm 1 Sau 8 ngày nhiễm 1
80. 2.2 Khối lượng sâu ở các cơng thức I II III I II III 0,315 0,058 0,6 0,115 0,087 0,100 0,364 0,036 0,429 KHỐI 0,080 0,179 0,212 LƯỢNG KHỐI 0,674 0,301 0,285 SÂU 0,595 0,316 0,511 LƯỢNG 0,511 0,262 0,259 CHẾT SÂU 0,340 0,376 0,243 0,262 0,365 0,366 CT-6h CHẾT 0,469 0,217 0,483 CT-12h 0,272 0,164 0,369 0,281 0,230 0,215 0,578 0,242 0,752 0,361 0,699 0,338 0,382 0,353 1,239 m(g) TB 0,320 0,301 0,346 0,504 0,374 0,468 0,314 I II III 0,491 0,476 0,054 0,419 0,585 KHỐI 0,206 0,405 0,425 LƯỢNG m(g) TB 0,433 0,295 0,537 SÂU 0,387 0,366 0,231 CHẾT 0,174 0,592 0,543 CT-24h 0,825 0,526 0,250 0,294 0,217 1,002 0,652 0,356 0,791 0,768 0,360 0,736 0,744 m(g) TB 0,473 0,436 0,523
81. I II III I II III 0,110 0,356 0,101 0,45 0,22 0,105 KHỐI 0,492 0,262 0,467 KHỐI 0,28 0,06 0,36 LƯỢNG 0,2 0,39 0,36 LƯỢNG 0,372 0,414 0,258 SÂU 0,598 0,303 0,849 SÂU 0,15 0,16 0,2 CHẾT 0,779 0,226 0,482 CHẾT 0,35 0,42 0,44 CT-48h 0,673 0,353 0,565 CT-96h 0,42 0,37 0,15 0,41 0,46 0,57 0,715 0,211 0,858 0,716 0,909 0,883 0,11 0,23 0,48 0,45 0,49 0,12 1,029 0,643 0,21 0,51 m(g) TB 0,609 0,409 0,558 0,42 0,19 0,46 0,18 0,41 0,21 m(g) TB 0,326 0,307 0,309
82. 2.3 Sản lượng virus ở các cơng thức 6h SẢN LƯỢNG VIRUS CT 6h 10^-2 311 263 325 305 266 340 315 278 330 TB 310,33 269 331,67 9 9 9 PIB/ml 1,55 x10 1,35 x10 1,66 x10 9 9 9 PIB/sâu 2,05 x10 1,75 x10 2,23 x10 10^-3 30 33 32 29 29 35 29 25 39 TB 29.33 29 35.33 PIB/ml 1,47 x109 1,45 x109 1,77 x109 PIB/sâu 1,94 x109 1,89 x109 2,38 x109 Virus TB 1,99 x109 1,82 x109 2,31 x109 12h SẢN LƯỢNG VIRUS CT 12h 10^-2 354 243 475 365 243 509 353 264 494 TB 357,33 250 492,67 PIB/ml 1,79 x109 1,25 x109 2.46 x109 PIB/sâu 2,56 x109 1,62 x109 3.79 x109 10^-3 34 24 53 38 26 57 39 29 62 TB 37 26,33 57,33 PIB/ml 1,85 x109 1,32 x109 2,87 x109 PIB/sâu 2,65 x109 1,71 x109 4,41 x109 Virus TB 2,61 x109 1,66 x109 4,10 x109
83. 24h SẢN LƯỢNG VIRUS CT 24h 10^-2 498 360 495 397 369 475 409 378 510 TB 434,67 369 493.33 PIB/ml 2,17 x109 1,85 x109 2.47 x109 9 9 9 PIB/sâu 3,20 x10 2,65 x10 3.76 x10 10^-3 43 37 53 46 40 55 47 39 50 TB 45,33 38,67 52,67 9 9 9 PIB/ml 2,27 x10 1,93 x10 2,63 x10 PIB/sâu 3,34 x109 2,78 x109 4,01 x109 Virus TB 3,27 x109 2,71 x109 3,88 x109 48h SẢN LƯỢNG VIRUS CT 48h 10^-2 559 350 485 585 363 508 579 349 496 TB 574,33 354 496,33 PIB/ml 2,87 x109 1,77 x109 2,48E+09 9 9 PIB/sâu 4,62 x10 2,49 x10 3,87E+09 10^-3 62 35 53 59 39 49 63 40 51 TB 61,33 38 51 9 9 9 PIB/ml 3,07 x10 1,90 x10 2,55 x10 9 9 9 PIB/sâu 4,94 x10 2,68 x10 3,97 x10 Virus TB 4,78 x109 2,59 x109 3,92 x109 SẢN LƯỢNG VIRUS CT 96h I II III 9 9 9 1,36 x10 1,39 x10 1,56 x10 1,74 x109 9,50 x108 1,46 x109 1,39 x109 1,44 x109 1,49 x109 1,70 x109 9,50 x108 1,75 x109 9 9 9 1,35 x10 1,40 x10 1,40 x10 1,85 x109 1,10 x109 1,10 x109 VIRUS TB 1,56 x109 1,20 x109 1,46 x109
84. 5. Ảnh hưởng của dịch ly tâm và dịch thơ 3.1 Số sâu chết ở cơng thức dịch thơ và dịch ly tâm SÂU CHẾT DỊCH LY TÂM I II III IV V VI Sau 4 ngày nhiễm 2 3 1 1 1 2 Sau 5 ngày nhiễm 4 4 6 7 8 5 Sau 6 ngày nhiễm 2 1 2 1 1 2 Sau 7 ngày nhiễm 2 1 0 0 0 0 Sau 8 ngày nhiễm 0 0 1 0 0 0 Sau 9 ngày nhiễm 0 1 0 1 0 1 SÂU CHẾT DỊCH THƠ I II III IV V VI Sau 4 ngày nhiễm 8 7 9 9 9 8 Sau 5 ngày nhiễm 4 3 3 2 1 3 Sau 6 ngày nhiễm 2 2 1 1 0 1 Sau 7 ngày nhiễm 0 1 1 1 0 1 Sau 8 ngày nhiễm 0 1 0 1 0 1 Sau 9 ngày nhiễm 0 0 0 0 0 0
85. 3.2 Khối lượng sâu chết ở cơng thức dịch thơ và dịch ly tâm KHỐI LƯỢNG SÂU CHẾT Ở CT DỊCH THƠ m(g) 0,87 0,72 0,68 0,76 0,83 0,52 0,45 0,77 0,76 0,83 0,92 0,78 0,38 0,74 0,84 0,52 0,84 0,79 0,78 0,78 0,74 0,38 0,59 0,35 0,53 0,43 0,62 0,58 0,63 0,57 0,76 0,8 0,51 0,58 0,66 0,76 0,78 0,67 0,57 0,79 0,43 0,66 0,58 0,71 0,71 0,54 0,75 KHỐI LƯỢNG SÂU CHẾT Ở CT DỊCH LY TÂM m(g) 0,69 0,67 0,9 0,61 0,68 0,66 0,59 0,76 0,65 0,56 0,58 0,6 0,76 0,75 0,76 0,64 0,75 0,67 0,76 0,6 0,85 0,67 0,57 0,6 0,78 0,68 0,6 0,81 0,78 0,6 0,83 0,7 0,61 0,78 0,83 0,69 0,76 0,8 0,73 0,79 0,64 0,89 0,73 0,79 1,18 0,73 0,66
86. 3.3 Sản lượng virus ở cơng thức dịch thơ và dịch ly tâm SẢN LƯỢNG VIRUS Ở DỊCH LY TÂM 4,78 x109 2,56 x109 2,56 x109 2,36 x109 2,87 x109 2,68 x109 3,63 x109 3,32 x109 3,41 x109 3,40 x109 2,34 x109 3,45 x109 2,38 x109 2,52 x109 3,09 x109 2,68 x109 3,28 x109 3,18 x109 2,80 x109 2,85 x109 3,57 x109 2,86 x109 SẢN LƯỢNG VIRUS Ở DỊCH THƠ 3,02 x109 2,12 x109 3,00 x109 2,87 x109 2,95 x109 2,66 x109 2,83 x109 1,84 x109 1,85 x109 2,39 x109 3,00 x109 3,16 x109 1,91 x109 2,98 x109 3,16 x109 2,81 x109 1,66 x109 2,21 x109 2,91 x109 2,91 x109 3,06 x109 2,00 x109 3.4 Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí ở cơng thức dịch thơ và dịch ly tâm CT1 – Dịch thơ CT2 – Dịch ly tâm CT3 – Đối chứng I II III I II III I II III 10-3 62 54 69 42 27 25 0 1 4 83 113 52 34 25 1 0 2
87. PHỤ LỤC 3 XỬ LÝ SỐ LIỆU Hiệu lực diệt sâu đã được quy đổi sang ASIN Sản lượng NPV thu được quy đổi sang log(x+1); 1. Hiệu lực diệt sâu sau 8 ngày lây nhiễm của các nồng độ ở sâu 7, 9, 11 ngày tuổi ‘HIEU LUC DIET SAU, SAU 8 NGAY NHIEM’ Duncan's Multiple Range Test for Y Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 40 Error Mean Square 11.17636 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N AB A 90.000 3 9N10^7 A 90.000 3 9N10^8 A 86.433 3 7N10^7 B 77.790 3 7N10^6 C 63.153 3 11N10^8 C 59.647 3 9N10^6 D 53.353 3 7N10^5 D 50.633 3 11N10^7 D 49.310 3 11N10^6 E 43.713 3 9N10^5 F E 41.353 3 11N10^5 F G 37.333 3 7N10^4 F G 35.930 3 9N10^4
88. HIEU LUC DIET SAU, SAU 8 NGAY NHIEM’ The GLM Procedure Duncan's Multiple Range Test for Y Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N AB H G 32.253 3 11N10^4 H I 27.637 3 7N10^3 J I 26.003 3 11N10^3 J I 25.743 3 9N10^3 J I K 21.697 3 7N10^2 J K 21.313 3 9N10^2 K 18.597 3 11N10^2 2. Đánh giá sản lượng NPV thu được trên tổng số sâu chết ở các độ tuổi và các nồng độ lây nhiễm ‘SAN LUONG’ The GLM Procedure Duncan's Multiple Range Test for Y Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 18 Error Mean Square 0.003004 Means with the same letter are not significantly different. Duncan Grouping Mean N AB A 10.78667 3 9N10^7 B 10.54667 3 7N10^6 B 10.51667 3 7N10^7 C B 10.45000 3 9N10^6 C D 10.41333 3 7N10^5 C D 10.39333 3 9N10^8 D 10.33000 3 11N10^8
89. E 10.19667 3 11N10^7 F 10.09333 3 11N10^6 3. Hiệu lực diệt sâu (%) của dịch thơ và dịch ly tâm Hiệu lực diệt sâu (%) sau 4 ngày nhiễm TB CT1 10 CT1 30 CT1 40 CT1 20 CT1 10 CT1 40 25.00 CT2 20 CT2 30 CT2 10 CT2 10 CT2 10 CT2 20 16.67 ACRSIN TB CT1 18.43 CT1 33.21 CT1 39.23 CT1 26.57 CT1 18.43 CT1 39.23 29.18 CT2 26.57 CT2 33.21 CT2 18.43 CT2 18.43 CT2 18.43 CT2 26.57 23.61 ‘HIEU LUC DIET SAU, 4 NGAY NHIEM’ The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 64.63633 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 10.342 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 29.183 6 CT1 A 23.607 6 CT2
90. Hiệu lực diệt sâu (%) sau 5 ngày nhiễm TB CT1 70 CT1 80 CT1 70 CT1 70 CT1 70 CT1 70 71.67 CT2 60 CT2 70 CT2 70 CT2 80 CT2 90 CT2 70 73.33 ACRSIN TB CT1 56.79 CT1 63.43 CT1 56.79 CT1 56.79 CT1 56.79 CT1 56.79 57.90 CT2 50.77 CT2 56.79 CT2 56.79 CT2 63.43 CT2 71.57 CT2 56.79 59.36 ‘HIEU LUC DIET SAU, 5 NGAY NHIEM’ The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 29.59931 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 6.9988 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 59.357 6 CT2 A 57.897 6 CT1
91. Hiệu lực diệt sâu (%) sau 6 ngày nhiễm TB CT1 90 CT1 80 CT1 70 CT1 90 CT1 70 CT1 80 80.00 CT2 80 CT2 80 CT2 90 CT2 90 CT2 100 CT2 90 88.33 ACRSIN TB CT1 71.57 CT1 63.43 CT1 56.79 CT1 71.57 CT1 56.79 CT1 63.43 63.93 CT2 63.43 CT2 63.43 CT2 71.57 CT2 71.57 CT2 90.00 CT2 71.57 71.93 ‘HIEU LUC DIET SAU, 6 NGAY NHIEM’ The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 69.06121 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 10.691 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 71.928 6 CT2 A 63.930 6 CT1
92. Hiệu lực diệt sâu (%) sau 7 ngày nhiễm TB CT1 100 CT1 90 CT1 100 CT1 100 CT1 80 CT1 80 91.67 CT2 100 CT2 90 CT2 90 CT2 90 CT2 100 CT2 90 93.33 ACRSIN TB CT1 90.00 CT1 71.57 CT1 90.00 CT1 90.00 CT1 63.43 CT1 63.43 78.07 CT2 90.00 CT2 71.57 CT2 71.57 CT2 71.57 CT2 90.00 CT2 71.57 77.71 ‘HIEU LUC DIET SAU, 7 NGAY NHIEM’ The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 135.077 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 14.951 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 78.072 6 CT1 A 77.713 6 CT2
93. Hiệu lực diệt sâu (%) sau 8 ngày nhiễm TB CT1 100 CT1 90 CT1 100 CT1 100 CT1 80 CT1 80 91.67 CT2 100 CT2 90 CT2 100 CT2 90 CT2 100 CT2 90 95.00 ACRSIN TB CT1 90.00 CT1 71.57 CT1 90.00 CT1 90.00 CT1 63.43 CT1 63.43 78.07 CT2 90.00 CT2 71.57 CT2 90.00 CT2 71.57 CT2 90.00 CT2 71.57 80.78 ‘HIEU LUC DIET SAU, 8 NGAY NHIEM’ The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 140.7381 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 15.261 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 80.785 6 CT2 A 78.072 6 CT1
94. Hiệu lực diệt sâu (%) sau 9 ngày nhiễm TB CT1 100 CT1 100 CT1 100 CT1 100 CT1 100 CT1 100 100.00 CT2 100 CT2 100 CT2 100 CT2 100 CT2 100 CT2 100 100.00 ACRSIN TB CT1 90.00 CT1 90.00 CT1 90.00 CT1 90.00 CT1 90.00 CT1 90.00 90.00 CT2 90.00 CT2 90.00 CT2 90.00 CT2 90.00 CT2 90.00 CT2 90.00 90.00 ‘HIEU LUC DIET SAU, 9 NGAY NHIEM’ The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 0 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 90.00 6 CT1 A 90.00 6 CT2
95. 4. Khối lượng (g) sâu chết ở cơng thức dịch thơ và dịch ly tâm Khối lượng (g) Dịch ly tâm Dịch thơ sâu chết 0.717447 0.664681 The TTEST Procedure Statistics Lower CL Upper CL Lower CL Upper CL Variable N Mean Mean Mean Std Dev Std Dev Std Dev Std Err Minimum Maximum D 47 -0.105 -0.053 -54E-5 0.1478 0.1779 0.2234 0.0259 -0.51 0.32 T-Tests Variable DF t Value Pr > |t| D 46 -2.03 0.0478 5. Sản lượng PIB/sâu chết ở cơng thức dịch thơ và dịch ly tâm Dịch ly tâm Dịch thơ Sản lượng virus 3.03 x109 2.60 x109 Log(x+1) 9.480916762 9.415724362 The TTEST Procedure Statistics Lower CL Upper CL Lower CL Upper CL Variable N Mean Mean Mean Std Dev Std Dev Std Dev Std Err Minimum Maximum D 22 0.0228 0.0677 0.1127 0.078 0.1014 0.1449 0.0216 -0.09 0.28 T-Tests Variable DF t Value Pr > |t| D 21 3.13 0.0050
96. 6. Tổng vi sinh vật hiếu khí sau khi nhiễm 1 ngày Tổng vsv hiếu khí sau khi nhiễm 1 ngày ở các cơng thức TB CLT 7.20x104 CLT 8.35x104 CLT 6.05x104 7.20x104 LT 4.20x104 LT 3.05x104 LT 2.50x104 3.25x104 DC 0 DC 0 DC 0 0 Log(x+1) TB CLT 4.857339 CLT 4.921692 CLT 4.781763 4.853598 LT 4.62326 LT 4.484314 LT 4.397957 4.501844 ĐC 0 ĐC 0 ĐC 0 0 ‘TONG VSV HIEU KHI, TPC’ The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for N Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 6 Error Mean Square 0.005942 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 0.154 Means with the same letter are not significantly different. t Grouping Mean N T A 4.85360 3 CLT B 4.50184 3 LT C 0.00000 3 DC