Đồ án Khảo sát sự hiện diện của các vi khuẩn có lợi tại một số vùng đất nông nghiệp huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh

Nội dung text: Đồ án Khảo sát sự hiện diện của các vi khuẩn có lợi tại một số vùng đất nông nghiệp huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC VI KHUẨN CÓ LỢI TẠI MỘT SỐ VÙNG ĐẤT NÔNG NGHIỆP HUYỆN GÒ DẦU, TỈNH TÂY NINH Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS. Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện : Lê Thị Mỹ Hạnh MSSV: 1051110011 Lớp: 10DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2014
2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là đồ án nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện trên cơ sở lý thuyết, tiến hành nghiên cứu thực tiễn dưới sự hướng dẫn của ThS. Phạm Minh Nhựt. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2014 Sinh viên Lê Thị Mỹ Hạnh ii
3. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, quý thầy cô giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng tất cả các thầy cô đã truyền dạy những kiến thức quý báu cho em trong suốt những năm học vừa qua. Qua đây em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Phạm Minh Nhựt, người đã định hướng nghiên cứu, quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian làm khoá luận tốt nghiệp. Bên cạnh đó em xin cảm ơn các thầy cô ở Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cùng các anh chị, bạn bè đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề tài của mình. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn bên cạnh, động viên con những lúc khó khăn, nản lòng trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu cũng như trong cuộc sống. Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2014 Sinh viên Lê Thị Mỹ Hạnh iii
4. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC Trang Trang bìa i Lời cam đoan ii Lời cảm ơn iii Mục lục iv Danh sách các chữ viết tắt vii Danh sách các bảng viii Danh sách các hình ix Mở đầu 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 4. Phạm vi nghiên cứu 2 Chương 1. Tổng quan 3 1.1. Vi sinh vật hữu ích và sự phân bố trong môi trường đất nông nghiệp 3 1.1.1. Vai trò của vi sinh vật trong đất 3 1.1.2. Sự phân bố của vi sinh vật trong đất 3 1.1.3. Một số nhóm vi sinh vật hữu ích trong đất 5 1.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi sinh vật 9 1.2.1. Khái niệm enzyme ngoại bào 9 1.2.2. Phân loại enzyme ngoại bào 9 1.2.3. Đặc điểm – tính chất 10 1.2.4. Một số enzyme ngoại bào từ vi sinh vật 13 1.3. Tình hình nghiên cứu hệ vi sinh vật đất hiện nay 23 Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 24 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 24 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu 24 2.1.2. Thời gian nghiên cứu 24 iv
5. Đồ án tốt nghiệp 2.2. Vật liệu nghiên cứu 24 2.2.1. Nguồn mẫu phân lập 24 2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị 24 2.2.3. Hoá chất, dụng cụ và thiết bị 25 2.3. Phương pháp nghiên cứu 25 2.3.1. Phương pháp thu và chuẩn bị mẫu 25 2.3.2. Phương pháp pha loãng mẫu 26 2.3.3. Phương pháp tăng sinh 27 2.3.4. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 27 2.3.5. Phương pháp định danh vi sinh vật 28 2.3.6. Phương pháp định tính khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn 30 2.3.7. Phương pháp xác định mật độ tế bào 31 2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu 31 2.4. Bố trí thí nghiệm 31 2.4.1. Thí nghiệm 1: Phân lập và định danh sơ bộ vi khuẩn 32 2.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn phân lập 33 2.4.3. Thí nghiệm 3: Đánh giá mức độ đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập với vi khuẩn gây bệnh 36 Chương 3. Kết quả và thảo luận 38 3.1. Kết quả đánh giá nguồn mẫu đất sử dụng trong nghiên cứu 38 3.2. Kết quả phân lập và định danh sơ bộ 40 3.2.1. Kết quả phân lập 40 3.2.2. Kết quả định danh sơ bộ 41 3.3. Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào 43 3.2.1. Đánh giá khả năng sinh enzyme amylase 43 3.2.2. Đánh giá khả năng sinh enzyme cellulase 44 3.3.3. Đánh giá khả năng sinh enzyme protease 46 3.3.4. Đánh giá khả năng sinh enzyme lipase 47 v
6. Đồ án tốt nghiệp 3.3.5. Đánh giá khả năng sinh enzyme catalase 49 3.3.6. Đánh giá khả năng sinh enzyme oxidase 49 3.4. Đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với vi khuẩn gây bệnh 51 3.4.1. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Salmonella sp. 52 3.4.2. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn E. Coli 53 3.4.3. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Shigella 55 3.4.4. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Vibrio 57 3.4.5. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với các vi khuẩn L. monocytogenes, L. innocua, E. feacalis, S. aureus 59 3.5. Tổng hợp kết quả đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào và đối kháng vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập 63 Chương 4. Kết luận và đề nghị 68 4.1. Kết luận 68 4.2. Đề nghị 68 Tài liệu tham khảo 69 vi
7. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT CMC: carboxymethyl cellulose HEC: hydroxyethyl cellulose EG: endoglucanase CBH: exoglucanase CBD: cellulose binding domain Ser: Serine His: Histidine Asp: Acid aspartic TSB: Trypton Soya Broth TSA: Trypticase Soya Agar vii
8. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Danh sách mẫu phân lập 24 Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập 40 Bảng 3.2. Kết quả định danh sơ bộ của các chủng vi khuẩn phân lập 41 Bảng 3.3. Khả năng sinh enzyme amylase của các chủng vi khuẩn phân lập 43 Bảng 3.4. Khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập 45 Bảng 3.5. Khả năng phân huỷ gelatin và casein của các chủng vi khuẩn phân lập 46 Bảng 3.6. Khả năng sinh enzyme lipase của các chủng vi khuẩn phân lập 48 Bảng 3.7. Khả năng sinh enzyme catalase của các chủng vi khuẩn phân lập 49 Bảng 3.8. Khả năng sinh enzyme oxidase của các chủng vi khuẩn phân lập 50 Bảng 3.9. Khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Salmonella sp. 52 Bảng 3.10. Khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn E. Coli 54 Bảng 3.11. Khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Shigella 56 Bảng 3.12. Khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Vibrio 58 Bảng 3.13. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với các vi khuẩn L. monocytogenes, L. innocua, E. feacalis, S. aureus 60 Bảng 3.14. Kết quả tổng hợp đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn phân lập 64 Bảng 3.15.A. Kết quả tổng hợp đánh giá khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập 65 Bảng 3.15.B. Kết quả tổng hợp đánh giá khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập 66 viii
9. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Sơ đồ biểu diễn quan hệ sinh thái giữa ba nhóm sinh vật 3 Hình 1.2. Hình thái một số nhóm vi khuẩn 6 Hình 1.3. Hình thái của xạ khuẩn 7 Hình 1.4. Cấu trúc không gian của các loại enzyme amylase 14 Hình 1.5. Mô hình enzyme protease xúc tác quá trình thuỷ phân protein 15 Hình 1.6. Cấu trúc không gian của enzyme protease 17 Hình 1.7. Cấu trúc không gian của enzyme cellulase 19 Hình 1.8. Cấu trúc không gian của enzyme lipase từ Candida rugosa 21 Hình 1.9. Mô hình hoạt động của lipase trên cơ chất hoà tan và không tan trong nước 22 Hình 2.1. Phương pháp pha loãng mẫu 26 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 31 Hình 2.3. Quy trình phân lập vi khuẩn từ nguồn mẫu đất nông nghiệp 32 Hình 2.4. Vòng phân giải tinh bột của vi khuẩn trên môi trường Starch Agar 34 Hình 2.5. Vòng phân giải casein của vi khuẩn trên môi trường Skim Milk Agar 34 Hình 2.6. Vòng phân giải Tween của vi khuẩn trên môi trường Tween Peptone Agar 35 Hình 2.7. Vòng phân giải cellulose của vi khuẩn trên môi trường CMC Agar 35 Hình 2.8. Kết quả âm tính và dương tính của thử nghiệm gelatinase 36 Hình 3.1. Các nguồn mẫu đất sử dụng trong nghiên cứu 39 Hình 3.2. Kết quả nhuộm gram của các chủng vi khuẩn phân lập 42 Hình 3.3. Vòng phân giải tinh bột của các chủng ĐTL101, ĐTL102, ĐTT112 trên môi trường Starch Agar 44 Hình 3.4. Vòng phân giải cellulose của các chủng ĐMT701, ĐRD801, ĐTQ901 và ĐTT111 trên môi trường CMC Agar 46 ix
10. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.5. Kết quả dương tính của cáic chủng vi khuẩn phân lập so với mẫu đối chứng trong thử nghiệm gelatinase 47 Hình 3.6. Kết qảu kiểm tra khả năng sinh enzyme lipase của các chủng ĐTL201, ĐTL301, ĐTL502 và ĐTB601 trên môi trường Tween Peptone Agar 48 Hình 3.7. Vòng kháng khuẩn của sinh khối các chủng ĐTL501, ĐRD801 và ĐTT111 đối với vi khuẩn S. dublin 53 Hình 3.8. Vòng kháng khuẩn của sinh khối các chủng ĐTL301, ĐTL401 và ĐTL501 đối với nhóm vi khuẩn E. Coli 55 Hình 3.9. Vòng kháng khuẩn của sinh khối các chủng ĐTL301, ĐTL501, ĐRD801 đối với vi khuẩn Shi. sonnei 57 Hình 3.10. Vòng kháng khuẩn của sinh khối chủng ĐTT112 đối với các vi khuẩn chỉ thị nhóm Vibrio 59 Hình 3.11. Vòng kháng khuẩn của các chủng ĐTL501, ĐTT112, ĐRD801 đối với các vi khuẩn chỉ thị L. monocytogenes, L. innocua 61 x
11. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Trong giai đoạn hiện nay, nước ta đang trên đà phát triển theo hướng công nghiệp hóa - hiện đại hóa nhưng nông nghiệp vẫn đóng vai trò quan trọng, trong đó ngành trồng trọt vẫn là nền tảng với diện tích đất canh tác chiếm 17% tổng diện tích đất. Theo báo cáo Tổng điều tra đất đai năm 2010, tổng diện tích nhóm đất nông nghiệp của nước ta năm 2010 là 26.100.160 ha, tăng 5.179.385 ha (gấp 1,25 lần) so với năm 2000. Trong canh tác nông nghiệp, ngoài trồng lúa nước, người dân còn sử dụng để trồng trọt các loại hoa màu để tăng thêm thu nhập. Do đó, để có được mùa vụ trồng trọt tốt thì chất lượng đất đóng vai trò quyết định, trong đó có sự đóng góp quan trọng của các vi sinh vật. Đất là nơi diễn ra hàng loạt các quá trình chuyển hoá vật chất, trao đổi dinh dưỡng và năng lượng để hình thành và phát triển độ phì nhiêu của đất mà trong đó vi sinh vật đất đóng vai trò quan trọng. Ngoài chức năng tham gia vào các quá trình chuyển hoá vật chất, vi sinh vật đất sau chu kỳ sống còn để lại cho đất sinh khối rất lớn tạo nên độ phì nhiêu của đất. Vì thế vi sinh vật đất là một trong các chỉ tiêu quan trọng trong việc đánh giá độ phì nhiêu và chất lượng của đất. Với sự hiện diện thường xuyên của các vi sinh vật có lợi trong đất ngoài việc giúp cho đất tăng độ phì nhiêu, giúp người dân hạn chế việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học thì đây cũng chính là nguồn cung cấp các nhóm vi sinh vật có lợi như có khả năng sinh enzyme ngoại bào cũng như có khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh. Do đó, việc xác định sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi trong đất, nhất là trong các vùng đất nông nghiệp như đất trồng lúa, đất trồng hoa mùa sẽ phục vụ cho mục tiêu này. Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài "Khảo sát sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi tại một số vùng đất nông nghiệp huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh”. Đề tài này được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh. 1
12. Đồ án tốt nghiệp 2. Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi - sản sinh enzyme ngoại bào và đặc tính đối kháng, trong đất nông nghiệp tại huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh. 3. Nội dung nghiên cứu - Phân lập và định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn hiện diện trong một số vùng đất trồng lúa và đất trồng hoa màu. - Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn phân lập. - Đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh. 4. Phạm vi nghiên cứu Chỉ khảo sát vùng đất canh tác nông nghiệp của ông Nguyễn Văn Hoàng, ngụ tại ấp Rạch Sơn, huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh. 2
13. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Vi sinh vật hữu ích và sự phân bố trong môi trường đất nông nghiệp 1.1.1. Vai trò của vi sinh vật trong đất Hầu hết vi sinh vật là sinh vật dị dưỡng, chỉ một số ít vi sinh vật là vi sinh vật tự dưỡng. Quan hệ sinh thái được biểu diễn bằng sơ đồ Hình 1.1. Ánh sáng Chất vô cơ SV sản xuất Chất hữu cơ SV tiêu thụ Chất hữu cơ SV phân huỷ Hình 1.1. Sơ đồ biểu diễn quan hệ sinh thái giữa ba nhóm sinh vật Vai trò của vi sinh vật là khép kín vòng tuần hoàn trong hệ sinh thái, tái tạo thức ăn cho động vật, thực vật bằng cách phân huỷ để lấy lại chất dinh dưỡng cung cấp cho nhiều cơ thể dạng sống. Nó đem lại hai hiệu quả: - Tăng độ phì của đất. - Giải quyết nạn ứ đọng chất thải trong đất. Như vậy, vi sinh vật khép kín vòng tuần hoàn các nguyên tố C, N, P, S, K thông qua các quá trình phân huỷ các nguyên tố này trong đất. 1.1.2. Sự phân bố của vi sinh vật trong đất Trong hệ vi sinh vật đất, vi khuẩn chiếm khoảng 90% tổng số, xạ khuẩn chiếm khoảng 8%, vi nấm 1%, còn lại 1% là tảo và nguyên sinh động vật. Tỉ lệ này thay đổi tuỳ theo các loại đất khác nhau cũng như khu vực địa lý, tầng đất, thời vụ, chế độ canh tác Ở những đất có đầy đủ chất dinh dưỡng, độ thoáng khí tốt, nhiệt độ, độ ẩm và pH thích hợp thì vi sinh vật phát triển nhiều về số lượng và thành phần. Sự phát triển của vi sinh vật lại chính là nhân tố làm cho đất thêm phì nhiêu, màu mỡ. 3
14. Đồ án tốt nghiệp Sự phân bố của vi sinh vật trong đất có thể chia ra như sau: • Phân bố theo chiều sâu Quần thể vi sinh vật thường tập trung nhiều nhất ở tầng canh tác. Đó là nơi tập trung rễ cây, chất dinh dưỡng, có cường độ chiếu sáng, nhiệt độ, độ ẩm thích hợp nhất. Số lượng vi sinh vật giảm dần theo tầng đất, càng xuống sâu càng ít vi sinh vật. Riêng đối với các đất bạc màu, do hiện tượng rửa trôi, tầng 0 - 20 cm ít chất hữu cơ hơn tầng 20 - 40 cm nên ở tầng này số lượng vi sinh vật nhiều hơn ở tầng trên, sau đó giảm dần ở các tầng dưới. Thành phần vi sinh vật cũng thay đổi theo tầng đất: vi khuẩn hiếu khí, vi nấm, xạ khuẩn thường tập trung ở tầng mặt vì tầng này có nhiều oxy. Càng xuống sâu, các nhóm vi sinh vật hiếu khí càng giảm mạnh. Ngược lại, các nhóm vi khuẩn kỵ khí như vi khuẩn phản nitrate hoá phát triển mạnh ở độ sâu 20 - 40 cm. Ở vùng khí hậu nhiêt đới nóng ẩm thường có quá trình rửa trôi, xói mòn nên tầng 0 - 20 cm dễ biến động, tầng 20 - 40 cm ổn định hơn. • Phân bố theo các loại đất Các loại đất khác nhau có điều kiện dinh dưỡng, độ ẩm, độ thoáng khí, pH khác nhau dẫn đến sự phân bố của vi sinh vật cũng khác nhau. Ở đất lúa nước, tình trạng ngập nước lâu ngày làm ảnh hưởng đến độ thông khí, chế độ nhiệt, chất dinh dưỡng, Chỉ có một lớp mỏng ở trên khoảng 0 - 3 cm là có quá trình oxy hoá, ở tầng đất dưới quá trình khử oxy hoá chiếm ưu thế. Do đó trong đất lúa nước các loại vi sinh vật kỵ khí phát triển mạnh. Ví dụ như vi khuẩn amon hoá, vi khuẩn phản nitrate hoá. Ngược lại, các loại vi sinh vật hiếu khí như vi khuẩn nitrate hoá, vi khuẩn cố định nitrogen, vi nấm và xạ khuẩn đều rất ít. Tỷ lệ giữa vi khuẩn hiếu khí và yếm khí luôn nhỏ hơn 1. Ở đất trồng hoa màu, không khí lưu thông tốt, quá trình oxy hoá chiếm ưu thế, bởi vậy các loài vi sinh vật hiếu khí phát triển mạnh, vi sinh vật yếm khí phát triển yếu. Tỷ lệ gữa vi khuẩn hiếu khí và yếm khí thường lớn hơn 1, có trường hợp 4
15. Đồ án tốt nghiệp đạt tới 4 – 5. Ở đất giàu dinh dưỡng như đất phù sa sông Hồng, số lượng vi sinh vật tổng số rất cao. Ngược lại, vùng đất bạc màu Hà Bắc có số lượng vi sinh vật rất ít. • Phân bố theo cây trồng Đối với tất cả các loại cây trồng, vùng rễ cây là vùng vi sinh vật phát triển mạnh hơn so với vùng không có rễ do rễ cây cung cấp một lượng lớn chất hữu cơ khi nó chết đi. Khi còn sống, bản thân rễ cây cũng thường xuyên tiết ra các chất hữu cơ làm nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật. Rễ cây còn làm cho đất thoáng khí, giữ được độ ẩm. Tất cả những nhân tố đó làm cho số lượng vi sinh vật ở vùng rễ phát triển mạnh hơn vùng ngoài rễ. Tuy nhiên, mỗi loại cây trồng trong quá trình sống của nó thường tiết qua bộ rễ những chất khác nhau. Bộ rễ khi chết đi cũng có thành phần khác nhau. Thành phần và số lượng các chất hữu cơ tiết ra từ bộ rễ quyết định thành phần và số lượng vi khuẩn cố định nitrogen cộng sinh còn ở vùng rễ lúa là nơi cư trú của các nhóm cố định nitrogen tự do hoặc hội sinh Số lượng và thành phần vi sinh vật cũng thay đổi theo các giai đoạn phát triển của cây trồng. Đất vùng phù sa sông Hồng, số lượng vi sinh vật đạt cực đại ở giai đoạn lúa chồi nhanh, đẻ nhánh, giai đoạn này là cây lúa sinh trưởng mạnh. Bởi vậy thành phần và số lượng chất hữu cơ tiết qua bộ rễ càng lớn – đó là nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật vùng rễ. Số lượng vi sinh vật đạt cực tiểu ở thời kỳ lúa chín. Thành phần vi sinh vật cũng biến động theo các giai đoạn phát triển của cây, phù hợp với hàm lượng các chất tiết qua bộ rễ. 1.1.3. Một số nhóm vi sinh vật hữu ích trong đất Theo nhiều công trình nghiên cứu đã được công bố, hệ vi sinh vật trong đất rất phong phú với rất nhiều nhóm gồm: vi khuẩn, vi nấm, xạ khuẩn, virus, tảo và nguyên sinh động vật (protozoa) (Lê Quốc Tuấn, 2009). 1.1.3.1. Vi khuẩn Vi khuẩn là một nhóm sinh vật đơn bào, có kích thước hiển vi, có cấu trúc tế bào đơn giản gồm màng tế bào, tế bào chất và nhân (không có màng nhân) (prokaryote). Kích thước của vi khuẩn từ 0,1- 1,2 x 0,2- 6,0 µm. Peptidoglycan là chất đặc biệt ở vách tế bào prokaryote, dựa vào khả năng bắt màu của crystal violet 5
16. Đồ án tốt nghiệp vi khuẩn được phân biệt hai loại là vi khuẩn gram dương và vi khuẩn gram âm. Một số vi khuẩn di chuyển bằng tiên mao. Vi khuẩn sinh sản bằng con đường vô tính. Hình thái vi khuẩn rất đa dạng, có thể chia thành 3 nhóm hình dạng chính: hình cầu, hình que và hình xoắn (Hình 1.1). a) b) c) Hình 1.2. Hình thái một số nhóm vi khuẩn (WCB.McGraW-Hill, 1998) Staphylococcus aureus (a); Bacillus subtilis (b); Spirillum (c). Các nhóm vi khuẩn rất đa dạng và giữ những vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hoá vật chất để khép kín vòng tuần hoàn các chất trong đất và trong tự nhiên. Vi khuẩn tham gia hình thành và cải tạo đất trồng trọt, phân huỷ, chuyển hoá hợp chất khó tan trong đất thành các chất dễ tiêu cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng. Một số vi khuẩn có khả năng đồng hoá nitơ trong không khí để làm giàu nitơ cho đất và cung cấp nitơ cho cây trồng. Ngoài ra, vi khuẩn còn có khả năng tiết ra các enzyme, các chất kích thích sinh trưởng, các acid hữu cơ trong đất Một số vi khuẩn quan trọng thường gặp trong đất: Bacillus subtilis, Chostridium, Lactobacillus, Rhizobium, 1.1.3.2. Vi nấm Vi nấm là nhóm nấm có kích thước hiển vi. Vi nấm khác với vi khuẩn và xạ khuẩn, chúng có cấu tạo nhân điển hình, vì vậy chúng được xếp vào nhóm Eukaryote. Vi nấm gồm 2 nhóm lớn là nấm men (yeast) và nấm sợi (filamentous fungi). Trong đó, nấm men có cấu trúc đơn bào còn nấm sợi có cấu trúc đa bào. Nấm men (yeast) có khả năng sinh sản bằng vô tính theo hình thức nẩy chồi, một vài loài sinh bào tử và cũng có thể sinh sản hữu tính như chi Saccharomyces. Nấm sợi có quá trình sinh sản phức tạp hơn nấm men. Sinh sản vô tính có nhiều 6
17. Đồ án tốt nghiệp cách: bào tử trần, bào tử kín. Sinh sản hữu tính của nấm sợi cũng có vài hình thức khác nhau. Thường gặp là các chi Penicillium, Aspergillus, Trichoderma, Chaetomium, Alternaria, Rhizoctonia, Verticillium, Có vai trò quan trọng trong quá trình mùn hoá và phân giải xác hữu cơ cho đất (phân giải cellulose, tinh bột, nhựa, lignin, ). 1.1.3.3. Xạ khuẩn Xạ khuẩn là những vi sinh vật đơn bào thuộc nhóm prokaryote, hình sợi, phân bố rộng rãi trong đất, trong nước và trong các cơ chất hữu cơ. Kích thước của xạ khuẩn nằm trong khoảng 0,2 – 0,5 x 0,4 – 100 µm. Hình 1.3. Hình thái của xạ khuẩn (WCB.McGraW-Hill, 1998) Xạ khuẩn có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành đất và tạo độ phì nhiêu của đất. Tham gia vào các quá trình chuyển hoá và phân giải nhiều hợp chất 7
18. Đồ án tốt nghiệp hữu cơ phức tạp (cellulose, mùn, kitin, lignin, ). Hầu hết các xạ khuẩn thuộc giống Actinomyces có khả năng hình thành chất kháng sinh. Đây là đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn. Trong quá trình trao đổi chất, xạ khuẩn còn có thể sinh ra các chất hữu cơ như các loại vitamin nhóm B (B1, B2, B6, B12), một số acid hữu cơ như acid lactic, acid acetic và nhiều acid amin như acid glutamic, tryptophan, Một số xạ khuẩn có khả năng sinh ra nhiều loại enzyme như: protease, amylase, chitinase, cellulase Tuy nhiên, bên cạnh những xạ khuẩn có ích, một số xạ khuẩn lại sinh ra các chất độc kìm hãm sự sinh trưởng của thực vật. Một số khác lại là nguyên nhân gây ra một số bệnh khó chữa ở người và gia súc. Các bệnh này gọi chung là Actynomycose. Một số giống xạ khuẩn quan trọng trong đất: Actinomyces, Bacterionema, Pseudonocardia, Streptomyces 1.1.3.4. Tảo Tảo là sinh vật tự dưỡng không bắt buộc (nhờ quá trình quang hợp), phát triển mạnh ở lớp đất mặt. Tảo có tác dụng làm tăng khả năng hoà tan của khoáng vật đặc biệt là carbonate, làm tăng tốc độ phong hoá, cung cấp một lượng lớn chất hữu cơ cho đất. Một số tảo lục, lam có khả năng cố định nitơ tự do. Bên cạnh đó tảo còn giúp hạn chế xói mòn đất do gió. 1.1.3.5. Nguyên sinh động vật (protozoa) Nguyên sinh động vật có kích thước hiển vi, cấu tạo và hoạt động của tế bào nguyên sinh động vật giống tế bào của sinh vật đa bào. Nhưng chính tế bào này là tế bào biệt hoá đa năng, đảm nhận mọi chức năng sống của một cơ thể độc lập. Nguyên sinh động vật có vai trò quan trọng ở mức sản xuất sơ cấp và phân huỷ, chúng có thể làm nguồn thức ăn chủ yếu cho nhiều loài không xương sống và gián tiếp cho nhiều loài động vật có xương sống. Một số nguyên sinh động vật thường gặp là: trùng chân giả (Amoeba), trùng roi (Flagellata), 8
19. Đồ án tốt nghiệp 1.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi sinh vật 1.2.1. Khái niệm enzyme ngoại bào Enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme được vi sinh vật sinh tổng hợp sau đó tiết ra ngoài tế bào và tham gia vào quá trình thủy phân (dị hóa) các hợp chất hữu cơ bên ngoài môi trường xung quanh (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Các quá trình dị hóa bên ngoài tế bào chủ yếu là cung cấp nguyên liệu cho quá trình sinh tổng hợp của tế bào vi khuẩn. Vì các hợp chất làm nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật là các hợp chất cao phân tử nên vi sinh vật không thể vận chuyển qua màng tế bào, cần có các enzyme để xúc tác các phản ứng thuỷ phân các hợp chất cao phân tử này thành các hợp chất có trọng lượng thấp hơn để vi sinh vật có thể vận chuyển qua màng tế bào. Các enzyme được tổng hợp và tham gia các phản ứng bên ngoài tế bào có những đặc điểm rất riêng chỉ có ở vi sinh vật. 1.2.2. Phân loại enzyme ngoại bào Từ năm 1961, Hội Hóa Sinh quốc tế lần thứ 5 đã thống nhất phân loại các enzyme thành 6 nhóm chính, trong mỗi nhóm còn có các nhóm phụ, phân nhóm phụ: - Nhóm 1: Oxidoreductase là nhóm các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử. - Nhóm 2: Transferase là nhóm các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị. - Nhóm 3: Hydrolase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân (sự phân giải có mặt của H2O tham gia). - Nhóm 4: Lyase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng cắt đứt liên kết tạo thành 2 phân tử nhưng không cần H2O tham gia; hoặc loại H2O tạo thành nối đôi hoặc kết hợp phân tử H2O vào nối đôi. - Nhóm 5: Isomerase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa. - Nhóm 6: Ligase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng kết hợp hai phân tử kèm theo cắt đứt liên kết giàu năng lượng của ATP hoặc các nucleoside triphosphate khác. 9
20. Đồ án tốt nghiệp Trong đó, các enzyme ngoại bào của vi sinh vật phần lớn là các enzyme thuộc nhóm enzyme thủy phân hydrolase. Phương trình phản ứng: R1 – R2 +H2O R1OH + R2H α-amylase Tinh bột + H2O Dextrin + Maltose + Glucose Các enzyme ngoại bào của vi sinh vật gồm các loại phổ biến như enzyme: amylase, cellulase, protease và lipase 1.2.3. Đặc điểm – tính chất Enzyme ngoại bào của vi sinh vật có những đặc điểm và tính chất của một enzyme xúc tác các phản ứng sinh hóa: - Về bản chất, enzyme là một protein nên có đầy đủ các tính chất của một protein, có trọng lượng phân tử từ 20.000 đến vài trăm ngàn dalton (Da). Do có trọng lượng phân tử lớn nên chúng không thể đi qua màng tế bào. - Vì có bản chất là protein nên enzyme cũng có tính lưỡng tính (do có nhóm -COOH và -NH2 trong cấu tạo phân tử). Trong môi trường kiềm và acid chúng sẽ bị phân ly như sau: Kiềm Protein - COOH Protein - COO- + H+ Acid Acid + + Protein - NH2 Protein - NH + H Kiềm - Enzyme tan được trong nước tạo thành dung dịch dạng keo và chúng cũng tan trong dung dịch muối loãng, glycerin và các dung môi hữu cơ hữu cực khác. - Enzyme không bền và dễ dàng bị biến tính dưới tác dụng của nhiệt độ cao. Kiềm, acid mạnh và kim loại nặng cũng làm cho enzyme biến tính. Tuy nhiên, có nhiều loại enzyme có thể chịu được nhiệt độ cao đến 1100C như: α-amylase từ vi khuẩn ưa nhiệt Bacillus amyloliquefaciens và Bacillus licheniformis có thể chịu được nhiệt độ 110oC. Enzyme ngoại bào từ vi sinh vật ngoài khả năng chịu nhiệt tốt 10
21. Đồ án tốt nghiệp còn có khả năng chịu được các ngưỡng pH khác nhau như pH acid, pH trung tính và pH kiềm. Ví dụ: protease acid, protease kiềm và protease trung tính thu nhận từ vi khuẩn Bacillus; Aspergillus niger sinh tổng hợp α-amylase chịu được pH acid 2,1 - Enzyme có trung tâm hoạt động chỉ chiếm một tỷ lệ thể tích tương đối nhỏ trong phân tử, nằm trong túi hoặc khe, ở gần hoặc trên phân tử enzyme. Trong trung tâm hoạt động của enzyme ngoại bào hầu như không có coenzyme (trừ enzyme lipase là enzyme hai cấu tử) như enzyme amylase, protease, cellulase, pectinase và hemicellulase nhưng chúng cũng cần có các ion kim loại để ổn định khả năng xúc tác như α-amylase có chứa ion Ca2+. - Quá trình tổng hợp và phân hủy của các enzyme này tuân theo quy luật cảm ứng cơ chất. Khi có mặt cơ chất trong môi trường, tế bào vi sinh vật sẽ sinh tổng hợp một lượng enzyme lớn hơn gấp nhiều lần so với mức bình thường khi không có cơ chất để phân hủy cơ chất đó. Enzyme được sinh tổng hợp trong trường hợp này gọi là enzyme cảm ứng. Những chất được đưa vào môi trường, kích thích và thúc đẩy nhanh quá trình sinh tổng hợp ra enzyme cảm ứng để phân hủy chúng được gọi là cơ chất cảm ứng. Khi cho cơ chất với lượng tăng dần thì khả năng tổng hợp enzyme cảm ứng cũng tăng dần. Nếu tiếp tục tăng dần lượng cơ chất thì đến một mức độ nào đó quá trình này sẽ chậm lại và thậm chí sẽ giảm do hiện tượng tăng áp suất thẩm thấu cơ chất gây ra. - Enzyme có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ trong các hợp chất hóa học. Quá trình này được thực hiện theo chuỗi phản ứng, mỗi chuỗi phản ứng được xúc tác bởi một loại enzyme và cuối cùng tạo thành CO2, H2O, một số chất khác và giải phóng năng lượng. Trong mỗi chuỗi phản ứng, sản phẩm của phản ứng trước là cơ chất cho phản ứng sau. - Phản ứng enzyme là phản ứng tiêu hao năng lượng rất ít. Trong khi đó, các phản ứng hóa học được xúc tác bởi các chất xúc tác hóa học thường đòi hỏi năng lượng rất lớn. Ví dụ: Trong quá trình thủy phân saccharose thành fructose và glucose: 11
22. Đồ án tốt nghiệp + Khi không có xúc tác: năng lượng hoạt hóa là 32.000 cal/phân tử gam. + Khi xúc tác là acid: năng lượng hoạt hóa là 25.000 cal/phân tử gam. Acid Phương trình phản ứng: Saccharose Fructose + Glucose + Khi xúc tác là enzyme saccharase: năng lượng hoạt hóa là 9.000 cal/phân tử gam. Saccharase Phương trình phản ứng: Saccharose Fructose + Glucose - Enzyme chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng. Gen quyết định việc tổng hợp ra một loại enzyme. Mỗi một enzyme quyết định một hoặc một số phản ứng sinh hóa. - Enzyme không tham gia vào thành phần của sản phẩm sau phản ứng. Chỉ làm tăng nhanh phản ứng mà các phản ứng này có thể xảy ra ở điều kiện không có enzyme. - Enzyme vi sinh vật có nhiều ưu điểm hơn so với các enzyme thu nhận từ tế bào động vật và thực vật như: sản xuất và thu nhận dễ dàng, môi trường lên men rẻ tiền, năng suất sinh học cao, cải biến bằng công nghệ gen dễ, thành phần enzyme dễ dàng dự đoán và kiểm soát, không chứa các chất độc gây hại cho người như chất phenolic từ thực vật và các chất nội sinh gây ức chế protease ở động vật, giá thành các chế phẩm enzyme ngoại bào từ vi sinh vật rẻ hơn nhiều so với các chế phẩm enzyme của động vật và thực vật. Đặc điểm rất dễ nhận thấy ở giới động vật hay thực vật là mỗi loài chỉ có thể cung cấp một loại enzyme nào đó, ví dụ như từ malt có thể thu nhận enzyme amylase, dứa (khóm, thơm) thu nhận enzyme bromelin, đu đủ thu nhận enzyme papain, trong khi enzyme ngoại bào từ vi sinh vật thì ngược lại; từ một loài vi sinh vật có thể thu nhận nhiều enzyme vì số lượng enzyme vi sinh vật rất phong phú và đa dạng. Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất mạnh do đó chỉ trong thời gian ngắn có thể thu nhận một khối lượng enzyme rất lớn. Chúng có hoạt tính rất cao và có khả năng chuyển hóa một khối lượng vật chất rất lớn. Nuôi cấy vi sinh 12
23. Đồ án tốt nghiệp vật không phụ thuộc vào điều kiện địa lý, thời tiết như nuôi, trồng động vật và thực vật. Có thể sản xuất theo qui mô công nghiệp và kiểm soát được quá trình sản xuất. 1.2.4. Một số enzyme ngoại bào từ vi sinh vật Nguồn enzyme ngoại bào của vi sinh vật vô cùng phong phú và đa dạng. Sau đây là một số loại enzyme quan trọng của vi sinh vật được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong đời sống và sản xuất công nghiệp. 1.2.4.1. Enzyme amylase a) Đặc điểm Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thuỷ phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước: RR’ + H-OH → RH + R’OH Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen. b) Phân loại Hiện nay, có sáu loại enzyme amylase được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase (amylase nội bào) và Exoamylase (amylase ngoại bào). - Endoamylase: gồm có α-Amylase (EC 3.2.1.1) và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzyme khử nhánh này được chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase (hay α-dextrin 6-glucosidase) (EC 3.2.1.41); khử gián tiếp là oligo-1,6- glucosidase hay còn gọi là dextrinase tới hạn (EC 3.2.1.10) và amylo-1,6- glucosidase (EC 3.2.1.20). Các enzyme này thuỷ phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide. - Exoamylase: gồm có β-Amylase (EC 3.2.1.2) và Amyloglucosidase (glucoamylase hay 훾-Amylase) (EC 3.2.1.3). Đây là những enzyme thuỷ phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide. c) Cấu trúc Enzyme amylase thuộc loại hydrolase chỉ là những phân tử protein thuần, trung tâm hoạt động thường là những nhóm chức như: -NH2, -COOH, -SH 13
24. Đồ án tốt nghiệp α-Amylase (EC 3.2.1.1) β-Amylase (EC 3.2.1.2) oligo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.10) Amyloglucosidase (EC 3.2.1.3) amylo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.20) Hình 1.4. Cấu trúc không gian của các loại enzyme amylase d) Cơ chế tác dụng Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thuỷ phân do các liên kết glucoside bị phân cắt. Sự thuỷ phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra theo 2 mức 14
25. Đồ án tốt nghiệp độ: dịch hoá và đường hoá. Kết quả của sự dịch hoá là tạo ra sản phẩm trung gian dextrin và khi dextrin tiếp tục bị đường hoá thì sản phẩm là maltose và glucose. - α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glycoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. Thông thường α-amylase chỉ thuỷ phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine và một ít maltose. - β-amylase phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nhưng khi gặp liên kết α-1,4-glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6-glucoside thì nó sẽ ngừng tác dụng. - R-enzyme còn gọi là α-1,6-glucosidase cắt các liên kết α-1,6-glycoside tại điểm xuất phát mạch nhánh. - Ngoài ra enzyme amyloglucosidase lại có khả năng cắt từng đơn vị đường đơn (glucose) từ đầu của mạch carbohydrate. e) Một số vi sinh vật sinh enzyme amylase hiện diện trong đất Bacillus subtilis, Bacillus cereus và Bacillus megaterium là một trong số những sinh vật hiện diện trong đất có khả năng sinh enzyme amylase cao (Verma và ctv, 2011). 1.2.4.2. Enzyme protease a) Đặc điểm Nhóm enzyme protease (peptide – hydrolase, EC 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết peptide (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là các amino acid. Hình 1.5. Mô hình enzyme protease xúc tác quá trình thuỷ phân protein 15
26. Đồ án tốt nghiệp Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết ester và vận chuyển acid amin. b) Phân loại Protease được chia thành 2 loại: endopeptidase và exopeptidase. Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành 2 loại: - Aminopeptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một acid amin, một dipeptide hoặc tripeptide. - Carboxypeptide: xúc tác thuỷ phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một acid amin hoặc một dipeptide. Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành 4 nhóm: - Serine protease: là những protease chứa nhóm -OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Các serine protease thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. - Cysteine protease: là những protease có chứa nhóm -SH trong trung tâm hoạt động. Các cysteine protease thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. - Aspartic protease: hầu hết các aspartic protease thuộc nhóm pepsin. Các aspartic protease có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động ở vùng pH trung tính. - Metalloprotease: là những protease trong trung tâm hoạt động của chúng có các ion kim loại. Các metallo protease thường hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA. c) Cấu trúc Trung tâm hoạt động của protease vi sinh vật ngoài gốc amin acid đặc trưng cho từng nhóm còn có một số gốc amino acid khác. 16
27. Đồ án tốt nghiệp - Serine protease: chứa nhóm -OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động giữ vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. - Cysteine protease: chứa nhóm -SH trong trung tâm hoạt động. - Aspartic protease: chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động. Trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật bao gồm một số gốc amino acid và trong một số trường hợp còn có cả cofactor kim loại. Đối với các protease không chứa cystein, trung tâm hoạt động của chúng có tính mềm dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các cầu nối disulphide. Hình 1.6. Cấu trúc không gian của enzyme protease d) Cơ chế tác dụng Mặc dù trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung như sau: * E + S E – S E – S + P1 E + P2 Trong đó: E: enzyme. S: cơ chất (substance). E – S: phức chất enzyme - cơ chất. E – S*: phức chất trung gian enzyme - cơ chất hóa (axilenzyme). P1: là sản phẩm đầu tiên của phản ứng (với nhóm amino tự do mới được tạo thành). 17
28. Đồ án tốt nghiệp P2: là sản phẩm thứ hai của phản ứng (với nhóm carboxyl tự do được tạo thành). e) Các vi sinh vật sản sinh enzyme protease hiện diện trong đất Trong số các vi sinh vật hiện diện trong đất, Bacillus sp. là một trong những nhóm vi khuẩn điển hình sản sinh ra enzyme protease ngoại bào. Theo kết quả nghiên cứu của Sethi và ctv (2012), vi khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh enzyme protease là Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilus, E. Coli và Serratia marscens. Kết quả nghiên cứu khả năng sinh enzyme protease của các vi sinh vật hiện diện trong đất của Nadrendra và ctv (2012) cũng cho thấy rằng đó chính là Bacillus sp. 1.2.4.3. Enzyme cellulase a) Đặc điểm Cellulase thuỷ phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất như carboxymethyl cellulose (CMC) hoặc hydroxyethyl cellulose (HEC). Cellulase cắt liên kết β-1,4-glucoside trong cellulose, lichenin và các β-D-glucan của ngũ cốc. Cơ chất của enzyme cellulase là cellulose. b) Phân loại Dựa vào đặc điểm của cơ chất (cellulose) và cơ chế phân cắt, enzyme cellulase được chia thành ba loại: - 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase hay còn gọi là exoglucanase (EC 3.2.1.91). - 1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase hay còn gọi là endoglucanase (EC 3.2.1.4). - β-D-glucoside glucohydrolase hay còn gọi là β-glucosidase (EC 3.2.1.21). Các enzyme này được tìm thấy trong vi khuẩn sống trong dạ dày cỏ bò, mối và trong một số nấm như Trichoderma, Aspergillus, c) Cấu trúc Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị là acid amin, các acid amin được nối với nhau bởi liên kết peptide -CO-NH-. Ngoài ra, trong cấu trúc 18
29. Đồ án tốt nghiệp còn có những phần phụ khác, cấu trúc hoàn chỉnh của các loại enzyme nhóm endoglucanase (EG) và exoglucanase (CBH) giống nhau trong hệ cellulase của nấm sợi, gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi tận cùng, phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xúc tác và được gắn thêm vùng glycosil hoá, cuối đuôi là vùng gắn kết với cellulose (CBD: cellulose binding domain). Vùng này có vai trò tạo liên kết với cellulose tinh thể. Trong quá trình phân huỷ cellulose có sự tương quan mạnh giữa khả năng xúc tác phân giải cellulose của các enzyme và ái lực của enzyme này đối với cellulose. Hơn nữa, hoạt tính của cellulase dựa vào tinh thể cellulose và khả năng kết hợp của CBD với cellulose. Điều này chứng tỏ CBD làm gia tăng hoạt tính cellulase đối với tinh thể cellulose. Sự có mặt của CBD sẽ hỗ trợ cho enzyme cellulase thực hiện việc cắt đứt nhiều liên kết trong cellulose tinh thể. Vùng gắn kết với cellulose có cấu tạo khác với liên kết thông thường của protein và việc thay đổi chiều dài của vùng glycosyl hoá có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme. Hình 1.7. Cấu trúc không gian của enzyme cellulase d) Cơ chế tác dụng Sự thuỷ phân cellulose nhờ hệ enzyme cellulase gồm 4 enzyme, gồm: - Cellobiose dehydrolase: cắt các liên kết hydro biến cellulose có cấu trúc không gian thành cellulose vô định hình. - Endoglucanase: cắt các liên kết β - 1, 4 - glucoside tạo thành các chuỗi dài. - Exoglucanase: Cắt các chuỗi thành cellobiose. - β – glucosidase: thuỷ phân cellobiose thành glucose. e) Vi sinh vật sản sinh enzyme cellulase hiện diện trong đất Theo kết quả nghiên cứu của Sethi và ctv (2012), vi khuẩn được phân lập từ đất và có khả năng sinh enzyme cellulase là Pseudomonas fluorescens, Bacillus 19
30. Đồ án tốt nghiệp subtilis, E. Coli và Serratia marescens. Nghiên cứu của Pandey và ctv (2005) cho thấy nhiều loài nấm cũng có khả năng sinh enzyme cellulase cao, điển hình là Trichoderma reesei, Humicola, Penicillium, Aspergillus. 1.2.4.4. Enzyme lipase a) Đặc điểm Lipase (triacylglycerol acylhydrolase, EC 3.1.1.3) là enzyme xúc tác cho phản ứng thuỷ phân triacylglycerol (dầu thực vật, mỡ động vật) tạo thành glyceryl và acid béo tương ứng. Lipase tan trong nước và các dung môi phân cực khác, không tan trong ete và các dung môi không phân cực. Lipase rất cần thiết cho việc tiêu hoá, vận chuyển và xử lý các chất béo như triglyceride, dầu, mỡ trong hầu hết các sinh vật sống. b) Phân loại Theo nguồn gốc, enzyme lipase được chia làm 3 loại: - Lipase từ động vật: thu nhận thường khó và hiệu quả kinh tế không cao. - Lipase từ thực vật. - Lipase từ vi sinh vật: vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với quy mô công nghiệp lớn, đồng thời việc thu chế phẩm cũng dễ dàng và có thể thoả mãn trong 1 mức độ lớn về nhu cầu của các ngành công nghiệp khác nhau. Theo tính chất: - Lipase có tính đặc hiệu vị trí. - Lipase có tính đặc hiệu cơ chất: cơ chất có khả năng kết hợp vào trung tâm hoạt động của enzyme và bị chuyển hoá dưới tác dụng của enzyme. c) Cấu trúc Lipase là enzyme lưỡng cấu tử, trong thành phần có 2 phần: Protein (apoenzyme) và không phải protein (coenzyme). Tham gia vào thành phần nhóm ngoại gồm có: coenzyme, vitamin, ion kim loại. 20
31. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.8. Cấu trúc không gian của enzyme lipase từ Candida rugosa Nhóm quan trọng nhất tạo thành trung tâm hoạt động của lipase là bộ ba aspartic, histidine và serine. Lipase tham gia vào vị trí xúc tác với proteinase và esterase. Đối lập với proteinase, trung tâm xúc tác của nó không phân bố ở bề mặt ngoài mà nằm dưới chuỗi xoắn bề mặt. Vị trí hoạt động của mọi lipase đều có Ser, His và Asp (hoặc Glu) và hoàn toàn bị che khuất bởi một đoạn nắp cấu tạo bởi một hoặc hai chuỗi xoắn. Bề mặt mang Trypsin hoàn toàn không phân cực và tác động qua lại với đầu kỵ nước bao quanh trung tâm hoạt động. Trong hầu hết cấu trúc lipase, đầu serine hoạt động trong chuỗi pentapeptide có trình tự Gly-X1-Ser-X2- Gly cấu trúc đó cũng được tìm thấy ở protease serine (Boel và ctv, 1998). d) Cơ chế động học xúc tác của lipase Lipase xúc tác cho phản ứng thuỷ phân triacylglycerol (dầu thực vật, mỡ động vật) tạo thành glyceryl và acid béo tương ứng. Chúng xúc tác phản ứng thuỷ phân lần lượt từng liên kết chứ không cắt đứt cả 3 liên kết ester cùng một lúc. Quá trình xúc tác của lipase thường chậm hơn so với quá trình xúc tác của các enzyme khác như protease hay amylase. Với các cơ chất không tan trong nước, hoạt tính của lipase đạt cực đại chỉ khi nó được phân tán vào giữa bề mặt phân pha dầu nước. Quá trình đó được gọi là quá trình hoạt hoá phân pha. 21
32. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.9. Mô hình hoạt động của lipase trên cơ chất hoà tan và không tan trong nước. Sự thay đổi hình thể của lipase trong quá trình hoạt động xúc tác. Mô hình này do Verger đề xuất (1980) Trong đó: E: Lipase hoà tan không hoạt động. E*: Lipase hoà tan dạng hoạt động. Es*: Lipase hoạt động có hấp phụ. Eis*: Lipase không hoạt động được hấp phụ. Sw: Cơ chất tan trong nước. S: Cơ chất không tan trong nước. E*Sw và Es*S: Phức hợp lipase - cơ chất. Khi không có mặt nước hoặc khi có nước với lượng nhỏ, phản ứng este hoá và phản ứng este được ưu tiên. Trong trường hợp này, những đặc tính như tốc độ xúc tác và tính đặc hiệu phụ thuộc nhiều vào điều kiện phản ứng và bản chất cơ chất (Woolley & Petersen, 1992). e) Vi sinh vật sản sinh enzyme lipase hiện diện trong đất Nhiều sinh vật như thực vật, nấm và vi khuẩn có khả năng sản sinh enzyme lipase. Theo nghiên cứu của Prasad (2014) về việc cô lập enzyme lipase của các vi sinh vật hiện diện trong các mẫu đất khác nhau gần các nhà máy sản xuất dầu giàu hàm lượng lipid đã xác định được đó chính là Pseudomonas aeruginosa. Kết quả nghiên cứu của Veerapagu và ctv (2013) cũng cho thấy rằng Pseudomonas gessardii được phân lập từ đất ở những vùng bị tràn dầu từ các nhà máy chế biến dầu thực vật là vi khuẩn lý tưởng cho việc sản sinh enzyme lipase ngoại bào ở mức độ công nghiệp. 22
33. Đồ án tốt nghiệp 1.3. Tình hình nghiên cứu hệ vi sinh vật đất hiện nay Tất cả các sinh vật trong sinh quyển đều phụ thuộc vào hoạt động của vi sinh vật (Pace, 1997). Vi sinh vật hiện diện trong đất đóng vai trò quan trọng trong các chu trình chuyển hóa chất dinh dưỡng và trong hệ sinh thái trên mặt đất. Do đó vi sinh vật đất đã sớm được các nhà khoa học chú ý nghiên cứu. Điều quan trọng để nghiên cứu sự đa dạng vi sinh vật không chỉ để nghiên cứu khoa học cơ bản, mà còn để hiểu mối liên hệ giữa sự đa dạng, cấu trúc và chức năng của quần thể vi sinh vật cũng như sự tiến hoá của chúng. Những tác động của con người như sự ô nhiễm, hoạt động nông nghiệp và việc sử dụng hoá chất có thể ảnh hưởng bất lợi đến sự đa dạng vi sinh vật, ảnh hưởng đến hệ sinh thái trên và dưới mặt đất. Theo nghiên cứu của Buckley và Schmidt (2001) đã tìm thấy một lượng 16S rRNA cao ở tất cả các nhóm vi sinh vật trong các cánh đồng chưa được canh tác so với các cánh đồng đã được canh tác. Điều này cho thấy hoạt động canh tác của con người có tác động đến vi sinh vật hiện diện trong đất. Trevors và ctv (2003) đã ước tính trong 1 g đất có 4000 đơn vị gen vi khuẩn khác nhau dựa trên DNA-DNA ghép đôi. Ước tính có khoảng 5000 loài vi khuẩn đã được mô tả. Khoảng 1 % quần thể vi khuẩn đất có thể được nuôi cấy invitro nhưng không thể biết được 1 % quần thể vi khuẩn này có là đại diện của quần thể vi khuẩn hay không. Ước tính có khoảng 1,500,000 loài nấm tồn tại trong thế giới (Giller và ctv, 1997). Không giống như vi khuẩn, nhiều loại nấm không thể được nuôi cấy invitro. Mặc dù phương pháp phân tử đã được sử dụng để nghiên cứu các cộng đồng vi khuẩn đất nhưng rất ít nghiên cứu về nấm đất được thực hiện (Van Elsas và ctv, 2000). Dựa vào kết quả của các nghiên cứu đã đạt được, các chuyên gia sẽ đưa ra các biện pháp khai thác đầy đủ theo hướng có lợi các loài sinh vật hữu ích và ngăn chặn những tác hại của các loài sinh vật có hại nhằm nâng cao độ phì của đất, tăng năng suất và chất lượng nông phẩm của các loại cây trồng. 23
34. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.1.1. Địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí Nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM. 2.1.2. Thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ 02/2014 đến 07/2014. 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Nguồn mẫu phân lập Nguồn mẫu phân lập được thu tại vùng đất canh tác của ông Nguyễn Văn Hoàng gồm có đất trồng lúa và đất trồng hoa màu tại ấp Rạch Sơn, huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh. Bảng 2.1. Danh sách mẫu phân lập Nguồn phân lập Địa điểm thu mẫu Đất trồng lúa Huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh Đất trồng bông Huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh Đất trồng mồng tơi Huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh Đất trồng rau dền Huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh Đất trồng quế Huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh Đất trồng tía tô Huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh 2.2.2. Vi khuẩn chỉ thị Vi khuẩn chỉ thị được sử dụng trong nghiên cứu là 19 chủng vi khuẩn được cung cấp bởi Viện Vệ sinh Y tế công cộng (V), Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh (K) và Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II, bao gồm: - Nhóm vi khuẩn Salmonella: S. enteritidis, S. typhii (K), S.ntyphii (V), S. typhimurium, S. dublin. - Nhóm vi khuẩn E. Coli: E. Coli (K), E. Coli (V), TEC, EC. 02. 08. - Nhóm vi khuẩn Shigella: Shi. sonnei, Shi. boydii, Shi. flexneri. 24
35. Đồ án tốt nghiệp - Nhóm vi khuẩn Vibrio: V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. harveyi. - Các vi khuẩn: L. monocytogenes, L. innocua, E. feacalis, S. aureus. 2.2.3. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 2.2.3.1. Môi trường nuôi cấy và phân lập - Môi trường TSB (Trypton Soya Broth) (HiMedia - Ấn Độ). - Môi trường TSA (Trypticase Soya Agar) (HiMedia - Ấn Độ). 2.2.3.2. Dụng cụ và thiết bị a) Dụng cụ - Đĩa petri - Dụng cụ đục lỗ - Ống nghiệm - Thước đo - Becher 100 ml, 250 ml, 500 ml - Bông thấm và bông không thấm nước - Ống đong 100 ml - Đũa thuỷ tinh - Pipet 1ml, 10 ml - Các loại đầu típ - Ống ly tâm ependoff 2 ml - Micropipette 100 µl, 1000 µl - Bình môi trường 250 ml, 500 ml, - Các loại dụng cụ khác như: bao chịu 1000 ml nhiệt, kéo, giấy giói, kẹp gấp, muỗng, - Dây cấy ria, que cấy trang dao, thun, - Đèn cồn b) Thiết bị - Autoclave (Huxky Đài Loan) - Máy đo UV – VIS (Hach) - Tủ ấm 300C, 370C (Memmert - Cân phân tích (Orbital mermany) Germany) - Máy ly tâm (Tuttligen Germany) - Bếp từ (Billy – England) - Máy đo pH (Hach – Germany) - Máy nước cất (Branstead USA) 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp thu và chuẩn bị mẫu Đối với đất trồng lúa: Sử dụng muỗng lấy đất ở lớp đất mặt cho vào túi nylon (khối lượng mẫu lấy tối thiểu là 200 gam). 25
36. Đồ án tốt nghiệp Đối với đất trồng hoa màu: Sử dụng muỗng gạt bỏ lớp đất mặt khoảng 2 - 3 cm, lấy lớp đất ở dưới cho vào túi nylon (khối lượng mẫu lấy tối thiểu là 200 gam). Các mẫu đất được bảo quản trong túi nylon vận chuyển về phòng thí nghiệm. Cân 10 gam mẫu (sai số ± 0,1) cho vào erlen có chứa 90 ml nước muối sinh lý vô trùng và lắc đều, khi đó sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1. 2.3.2. Phương pháp pha loãng mẫu Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng có vai trò rất quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều cho quá trình định lượng cũng như phân tích vi sinh vật. Phương pháp pha loãng mẫu (mẫu lỏng và mẫu rắn) chỉ được sử dụng trong trường hợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh vật trong mẫu. Đối với mẫu lỏng: Dùng micropipette hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-2. Tiếp tục tiến hành như vậy cho đến khi được nồng độ cần thiết. Đối với mẫu rắn: Cân chính xác 10 gram mẫu cho vào 90 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-1. Sau đó tiến hành đồng nhất mẫu rồi hút 1ml dịch pha loãng ở nồng độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng ta được nồng độ pha loãng 10-2. Và tiếp tục pha loãng tương tự như mẫu lỏng. (Phạm Minh Nhựt, 2013). Hình 2.1. Phương pháp pha loãng mẫu 26
37. Đồ án tốt nghiệp 2.3.3. Phương pháp tăng sinh Mục đích: Hoạt hoá các vi khuẩn có sẵn trong mẫu phát triển lại bình thường vì chúng có thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản. Đây cũng là bước đầu giúp thu sinh khối vi khuẩn nhằm phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Nguyên tắc: Sử dụng phương pháp nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng thích hợp. Môi trường dinh dưỡng không những chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng (đa lượng và vi lượng) cần thiết đối với hoạt động sống của từng loại vi sinh vật mà còn phải đảm bảo có đủ các điều kiện hoá lý thích hợp đối với sự trao đổi chất giữa vi sinh vật và môi trường. Đối với các giống vi khuẩn đang khảo sát và các giống vi khuẩn chỉ thị được giữ trên môi trường TSA hay trong glycerol, tiến hành tăng sinh bằng cách lấy sinh khối vi khuẩn cho vào erlen chứa 10 ml môi trường TSB. Sau đó tiến hành lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Sinh khối vi khuẩn tăng lên làm đục môi trường nuôi cấy (Lê Ngọc Thuỳ Trang, 2013). 2.3.4. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật 2.3.4.1. Phương pháp cấy truyền vi sinh vật Nguyên tắc: Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thạch nghiêng và ủ trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển. Sau đó các chủng này được chuyển vào tủ mát (3 – 50C) để bảo quản. Quá trình này được lặp đi lặp lại trong một thời gian nhất định, đảm bảo vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết. Tuỳ từng nhóm vi sinh vật khác nhau mà thời gian định kỳ cấy chuyển khác nhau, tuy nhiên giới hạn tối đa là 3 tháng cấy chuyển một lần. Đối với giống vi sinh vật đang khảo sát và các giống vi sinh vật chỉ thị: Cấy chuyển định kỳ 1 tháng/lần trong ống thạch nghiêng chứa môi trường TSA và bảo quản trong tủ mát ở nhiệt độ 40C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.3.4.2. Phương pháp bảo quản lạnh sâu Nguyên tắc: Ngoài phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng, có thể giữ giống trong điều kiện lạnh sâu. Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ 27
38. Đồ án tốt nghiệp trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol. Vi khuẩn được tăng sinh trong môi trường dinh dưỡng thích hợp rồi hút 1 ml dịch tăng sinh cho vào eppendorf và đem ly tâm, loại bỏ dịch và thu cặn có chứa sinh khối vi khuẩn. Hút glycerol 40 % cho vào và tiến hành giữ giống ở nhiệt độ lạnh -150C (Nguyễn Lân Dũng và Dương Văn Hợp, 2007). 2.3.5. Phương pháp định danh vi sinh vật 2.3.5.1. Phương pháp nhuộn gram Nguyên tắc: Dựa trên khả năng bắt màu của lớp peptidoglycan với thuốc nhuộm tím kết tinh và iod, vi khuẩn được phân làm hai loại là vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm. Vi khuẩn Gram dương có lớp peptidoglycan dày bắt màu thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi khi tẩy cồn nên bắt màu tím khi nhuộm. Vi khuẩn Gram âm có lớp peptidoglycan mỏng không bắt màu thuốc nhuộm nên mất màu khi tẩy cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung. Vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng khi nhuộm (Prescott và ctv, 2005). Các bước tiến hành: - Dùng que cấy lấy nước vô trùng để làm vết bôi trên lame. - Các chủng vi khuẩn khảo sát được nuôi cấy trong erlen chứa 10ml môi trường TSB ủ ở 300C trong 24 giờ. Dùng que cấy lấy sinh khối hòa vào giọt nước để làm vết bôi. - Cố định vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn. Nhuộm tiêu bản: - Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm tím kết tinh (Gentian violet) trong 45 giây, rửa nước và để khô. - Nhuộm lugol trong 1 phút, rửa nước. - Tẩy cồn trong 20 giây, rửa nước. 28
39. Đồ án tốt nghiệp - Nhuộm bổ sung bằng dung dịch fuchsin hoặc safranin từ 10 – 30 giây, rửa lại bằng nước cất, để khô và soi tiêu bản với vật kính dầu 100X. 2.3.5.2. Phương pháp thử nghiệm catalase Nguyên tắc: Phương pháp này nhằm xác định vi sinh vật có enzyme catalase hay không. Các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy nghi chứa chuỗi chuyển điện tử có cytochrome đều có enzyme catalase (trừ các Streptococcus spp.). Enzyme catalase có vai trò bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi các dẫn xuất độc tính cao của phân tử oxy trong tế bào vi sinh vật. Các vi sinh vật này có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp với oxi là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi truyền điện tử tạo H2O2. Enzyme catalase thủy phân H2O2 thành H2O và O2, sự thủy phân H2O2 sẽ giải phóng O2 được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí.Vi sinh vật có enzyme catalase sẽ có hiện tượng sủi bọt khí (Trần Linh Thước, 2010). Cách tiến hành: - Dùng que cấy lấy một ít sinh khối làm vết bôi trên lame. - Nhỏ một giọt H2O2 30% lên vết bôi và quan sát hiện tượng sủi bọt. Kết quả: - Có hiện tượng sủi bọt → vi sinh vật có khả năng phân huỷ H2O2 → có enzyme catalase. - Không có hiện tượng sủi bọt → vi sinh vật không có khả năng phân huỷ H2O2 → không có enzyme catalase. 2.3.5.3. Phương pháp thử nghiệm oxidase Nguyên tắc: Thử nghiệm nhằm xác định sự hiện diện của hệ enzyme oxidase ở vi sinh vật. Thành phần quan trọng nhất là cytochrome oxidase trong chuỗi truyền điện tử của hô hấp hiếu khí với O2 là chất nhận điện tử sau cùng nên chỉ hiện diện trong các loài vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tuỳ ý. Hoạt tính cytochrome oxidase được phát hiện nhờ thuốc thử p-phenylenediamine. Nếu có sự hiện diện của cytochrome trong tế bào thì thuốc thử sẽ bị oxy hoá thành hợp chất indolphenol có màu xanh dương. 29
40. Đồ án tốt nghiệp Cách tiến hành: Dùng que cấy lấy 1 ít sinh khối vi khuẩn bôi lên miếng giấy thử chứa thuốc thử p -phenylenediamine và quan sát hiện tượng đổi màu trong vòng vài phút. Kết quả: Thử nghiệm oxidase là (+) khi giấy thử xuất hiện màu xanh dương đậm, nếu không có xuất hiện màu xanh dương đậm thì phản ứng là âm tính (-) (Trần Linh Thước, 2010). 2.3.5.4. Phương pháp thử nghiệm gelatinase Nguyên tắc: Một số vi sinh vật có thể tổng hợp nhóm enzyme gelatinase ngoại bào xúc tác sự thuỷ phân của gelatin thành polypeptide và acid amin. Để nhận biết khả năng làm tan gelatin của vi sinh vật, cơ chất này được bổ sung làm đông đặc môi trường nuôi cấy. Sau khi cấy chủng, chủng vi sinh vật có khả năng tiết gelatinase sẽ làm môi trường tan chảy thành dạng lỏng. Tiến hành: Môi trường sử dụng là môi trường Nutrient Gelatin được chứa trong ống nghiệm. Tiến hành cấy đâm sâu một lượng sinh khối của vi khuẩn khảo sát vào trong ống môi trường Nutrient Gelatin, ủ ở nhiệt độ phòng trong 14 ngày. Thực hiện ủ song song một ống đối chứng không cấy vi sinh vật. Kết quả: Trong ống thạch sâu, thử nghiệm là (+) khi môi trường ở ống có cấy vi khuẩn bị tan chảy trong khi ở ống đối chứng môi trường vẫn ở trạng thái đông đặc. Thử nghiệm (-) là khi môi trường trong ống có cấy vi khuẩn vẫn ở trạng thái đông đặc giống ống đối chứng (Trần Linh Thước, 2010) 2.3.6. Phương pháp định tính khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn Nguyên tắc: Thuốc thử phản ứng với cơ chất tạo màu đặc trưng, còn phần cơ chất bị vi khuẩn phân huỷ sẽ không tạo màu mà tạo vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc (Phan Thanh Phương, 2007). 30
41. Đồ án tốt nghiệp Cách tiến hành: Vi khuẩn được tăng sinh và cấy trang trên môi trường TSA và ủ ở 300C trong 24 giờ. Chuẩn bị các đĩa môi trường tương ứng với từng loại enzyme cần khảo sát. Dùng khuyên đục lỗ (đường kính 7 mm) tiến hành đục lỗ, gắp thạch chứa sinh khối vi khuẩn sang lỗ thạch đã đục trên đĩa môi trường đã được chuẩn bị, ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Nhuộm màu bằng thuốc nhuộm tương ứng và đo đường kính vòng phân giải xung quanh khuẩn lạc. 2.3.7. Phương pháp xác định mật độ tế bào Công thức tính toán xác định mật độ tế bào (công thức McFahrland): 9 Mật độ = OD600 x 1,02 x 10 (cfu/ml) 2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2007 và phần mềm Statgraphics Centurion XV version 15.1.02 với trắc nghiệm Tukey. 2.4. Bố trí thí nghiệm Nguồn mẫu Phân lập Định danh sơ bộ Xác định các đặc điểm có lợi của vi sinh vật Khả năng sinh một số Đối kháng vi khuẩn enzyme ngoại bào gây bệnh Tổng hợp kết quả Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 31
42. Đồ án tốt nghiệp 2.4.1. Thí nghiệm 1: Phân lập và định danh sơ bộ vi khuẩn 2.4.1.1. Phân lập vi khuẩn từ nguồn mẫu đất nông nghiệp Nguồn mẫu 10 gam mẫu + 90 ml nước muối sinh lý → đồng nhất mẫu → độ pha loãng 10-1 Đun ở 600C trong 60 phút Pha loãng bằng nước muối sinh lý đến độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 Hút 0,1 ml ở mỗi nồng độ pha loãng 10-4, 10-5, 10-6 cấy trang trên đĩa chứa môi trường TSA Chọn những khuẩn lạc đặc trưng cấy sang môi trường TSA làm thuần Giữ giống trong ống thạch nghiêng và trong glycerol 40%. Hình 2.3. Quy trình phân lập vi khuẩn từ nguồn mẫu đất nông nghiệp Các mẫu sau khi được thu về tiến hành cân 10 gam mẫu cho vào erlen chứa 90 ml nước muối sinh lý vô trùng khi đó được nồng độ pha loãng là 10-1. Sau đó, tiến hành đồng nhất mẫu trong 2 phút rồi đun ở 600C trong 60 phút và tiến hành pha loãng đến độ pha loãng 10-6. Mẫu sau khi được pha loãng, tiến hành hút 0,1 ml dịch sau pha loãng ở mỗi nồng độ pha loãng 10-4, 10-5,10-6 rồi cấy trang trên môi trường TSA. Ủ ở 300C trong 24 giờ. 32
43. Đồ án tốt nghiệp Chọn các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường TSA và cấy làm thuần. Sau đó bảo quản các chủng này trong ống thạch nghiêng chứa môi trường TSA và trong glycerol 40% để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 2.4.1.2. Định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn phân lập Các chủng vi khuẩn sau khi được phân lập, tiến hành định danh sơ bộ thông qua các phương pháp: nhuộm gram, thử nghiệm catalase, thử nghiệm oxidase. 2.4.2. Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn phân lập Các chủng vi khuẩn sau khi được phân lập và định danh sơ bộ được tiến hành đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào. Trong thí nghiệm này, tiến hành đánh giá khả năng sinh các enzyme amylase trên môi trường Starch Agar, caseinase trên môi trường Skim Milk Agar, lipase trên môi trường Tween Peptone Agar, cellulase trên môi trường CMC Agar bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch và đánh giá khả năng sinh enzyme gelatinase trên môi trường Nutrient Gelatin. 2.4.2.1. Đánh giá khả năng sinh enzyme amylase, caseinase, lipase và cellulase trên các môi trường khảo sát bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch Đầu tiên, tiến hành tăng sinh các chủng vi khuẩn phân lập trong môi trường TSB trong 24 giờ ở 300C. Sau đó, hút 100µl dịch nuôi cấy cho vào môi trường TSA và cấy trang rồi đem ủ ở 300C trong 24 giờ. Trên các đĩa môi trường khảo sát khả năng sinh enzyme, tiến hành đục các lỗ có đường kính 7mm. Sau đó, chuyển các khối thạch chứa sinh khối vi khuẩn cần xác định khả năng sinh enzyme vào các lỗ trên đĩa môi trường khảo sát. Đem ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Tiến hành đọc kết quả như sau: - Trên môi trường Starch Agar: cho thuốc thử lugol vào → nếu xung quanh giếng thạch không xuất hiện màu xanh đen → vi khuẩn phân giải tinh bột → vi khuẩn có sinh enzyme amylase. 33
44. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.4. Vòng phân giải tinh bột của vi khuẩn trên môi trường Starch Agar - Trên môi trường Skim Milk Agar: nếu xung quanh giếng thạch xuất hiện vòng phân giải trong suốt → vi khuẩn phân giải casein trong Skim Milk → vi khuẩn có sinh enzyme caseinase. Hình 2.5. Vòng phân giải casein của vi khuẩn trên môi trường Skim Milk Agar - Trên môi trường Tween Peptone Agar: nếu xung quanh giếng thạch xuất hiện quầng sáng màu hồng → vi khuẩn phân giải dầu → vi khuẩn có sinh enzyme lipase. 34
45. Đồ án tốt nghiệp Hình 2.6. Vòng phân giải Tween của vi khuẩn trên môi trường Tween Peptone Agar - Trên môi trường CMC: cho thuốc thử lugol vào → nếu xung quanh giếng thạch không bắt màu của thuốc thử → vi khuẩn phân giải cellulose → vi khuẩn có sinh enzyme cellulase. Hình 2.7. Vòng phân giải cellulose của vi khuẩn trên môi trường CMC 35
46. Đồ án tốt nghiệp 2.4.2.2. Đánh giá khả năng sinh gelatinase bằng thử nghiệm gelatinase Tăng sinh các chủng vi khuẩn phân lập trong môi trường TSB và ủ ở 300C trong 24 giờ. Sau đó, tiến hành cấy đâm sâu một lượng sinh khối của vi khuẩn khảo sát vào trong ống môi trường Nutrient Gelatin, ủ ở nhiệt độ phòng trong 14 ngày. Thực hiện ủ song song một ống đối chứng không cấy vi sinh vật. Tiến hành đọc kết quả như sau: Trong ống thạch sâu, thử nghiệm là (+) khi môi trường ở ống có cấy vi khuẩn bị tan chảy trong khi ở ống đối chứng môi trường vẫn ở trạng thái đông đặc. Thử nghiệm (-) là khi môi trường trong ống có cấy vi khuẩn vẫn ở trạng thái đông đặc giống ống đối chứng (Trần Linh Thước, 2010) Hình 2.8. Kết quả âm tính và dương tính của thử nghiệm gelatinase 2.4.3. Thí nghiệm 3: Đánh giá mức độ đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập với vi khuẩn gây bệnh Các chủng vi khuẩn phân lập được tăng sinh trong erlen chứa 10 ml môi trường TSB rồi đem đi lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Tiến hành cấy trang trên các đĩa chứa môi trường TSA ủ ở 300C trong 24 giờ. Chờ dịch mẫu khô rồi đục lỗ thạch (đường kính 7 mm) trên các đĩa TSA vừa được trang. Đối với 19 chủng vi khuẩn chỉ thị gây bệnh đường ruột, chúng được tăng sinh trong erlen chứa 10 ml môi trường TSB, riêng với các chủng Vibrio spp. có bổ sung thêm 1,5 % NaCl rồi đem đi lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt 36
47. Đồ án tốt nghiệp độ phòng. Sau đó, dịch nuôi cấy vi khuẩn chỉ thị được đo OD600nm để xác định mật độ. Tiến hành pha loãng để đạt được mật độ 106 cfu/ml rồi cấy trang trên các đĩa chứa môi trường TSA (riêng các chủng Vibrio spp. tiến hành cấy trang trên môi trường TSA có bổ sung 1,5 % NaCl). Chờ dịch mẫu khô rồi đục lỗ thạch (đường kính 7 mm) trên các đĩa TSA vừa được trang. Đối với các đĩa thạch được cấy trang các chủng vi khuẩn phân lập được sau khi ủ 24 giờ, chọn những vùng vi khuẩn phát triển dày đặc, tiến hành đục lỗ thạch chứa sinh khối vi khuẩn. Sau đó, dùng kẹp vô trùng gắp khối thạch đặt vào trong các giếng thạch trên đĩa TSA đã cấy trang các chủng vi khuẩn chỉ thị và ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Chủng vi khuẩn phân lập được từ các mẫu đất nông nghiệp có hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn chỉ thị có sự xuất hiện của quầng trong bao quanh các lỗ thạch chứa sinh khối của chủng vi khuẩn phân lập được. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. 37
48. Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả đánh giá nguồn mẫu đất sử dụng trong nghiên cứu Nguồn đất được sử dụng trong nghiên cứu được thu từ vùng đất canh tác nông nghiệp của ông Nguyễn Văn Hoàng, ngụ tại ấp Rạch Sơn, huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh. Nguồn đất này được thu từ 5 vùng đất ruộng trồng lúa và 5 vùng đất gò trồng hoa màu. Các nguồn mẫu được trình bày ở Hình 3.1. Ruộng lúa 1 Ruộng lúa 2 Ruộng lúa 3 Ruộng lúa 4 Ruộng lúa 5 Đất trồng bông 38
49. Đồ án tốt nghiệp Đất trồng mồng tơi Đất trồng rau dền Đất trồng quế Đất trồng tía tô Hình 3.1. Các nguồn mẫu đất sử dụng trong nghiên cứu Đối với các ruộng trồng lúa, các ruộng này được trồng lúa thâm canh, tức là các ruộng này chỉ được sử dụng để canh tác lúa nước. Mỗi năm ruộng được canh tác 2 vụ, mỗi vụ kéo dài 3 tháng. Sau khi sạ giống, tiến hành bón phân thành 3 đợt: 15 ngày sau khi sạ, 25 ngày sau khi sạ và bón trước khi lúa lên đòng. Phân được sử dụng khi bón thành phần chủ yếu là N, P, K. Do đó, các loại phân này chủ yếu là phân vô cơ nên vai trò của các vi sinh vật trong đất đóng vai trò hết sức quan trọng giúp chuyển hóa các hợp chất nitơ vô cơ, phospho, kali thành dạng dễ hấp thu giúp cây lúa phát triển tốt hơn. Do đó, trong các vùng đất trồng lúa có sự hiện diện rất phong phú của loại vi sinh vật có khả năng sinh các enzyme ngoại bào. Tuy nhiên, đặc trưng của các vùng đất trồng lúa là đất luôn trong tình trạng ngập nước nên các vi sinh vật sinh enzyme ngoại bào hiện diện trong lớp đất khoảng 0 – 3 mm và các chủng này phần lớn là các chủng vi khuẩn kỵ khí tùy nghi (Lê Quốc Tuấn, 2009). 39
50. Đồ án tốt nghiệp Đối với đất trồng hoa màu được sử dụng trong thí nghiệm bao gồm đất trồng hoa vạn thọ, đất trồng rau dền, đất trồng tía tô, đất trồng mồng tơi. Đặc điểm của đất trồng hoa màu là vùng đất khô ráo, đồng thời, trước mỗi vụ trồng hoa màu, lượng tro, phân được sử dụng để bón lót khá nhiều. Chính điều này là nơi tập trung rất nhiều nhóm vi sinh vật hiếu khí có khả năng sản sinh các enzyme ngoại bào giúp phân hủy cơ chất giúp cho quá trình hấp thu của hoa màu tốt hơn. Do đó, việc đánh giá sự hiện diện của các vi sinh vật có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào trong các vùng đất nông nghiệp có ý nghĩa to lớn. Sự hiện diện của các vi sinh vật có lợi trong đất nông nghiệp ngoài việc giúp cho việc chuyển hóa phân bón thành những dạng dễ hấp thu đối với cây trồng còn chứng minh sự màu mỡ của vùng đất đó. Đây cũng chính là mục tiêu của nghiên cứu. 3.2. Kết quả phân lập và định danh sơ bộ 3.2.1. Kết quả phân lập Từ 10 mẫu đất nông nghiệp gồm: 5 mẫu đất trồng lúa, 1 mẫu đất trồng bông, 1 mẫu đất trồng mồng tơi, 1 mẫu đất trồng rau dền, 1 mẫu đất trồng quế và 1 mẫu đất trồng tía tô đã phân lập được các chủng vi khuẩn trên môi trường TSA. Kết quả phân lập được trình bày ở Bảng 3.1. Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập Nguồn mẫu Ký hiệu Hình dạng khuẩn lạc Đất trồng lúa 1 ĐTL101 Tròn, lồi, bờ đều, vàng, d = 2mm ĐTL102 Tròn, dẹt, bờ đều, vàng, d= 3mm Đất trồng lúa 2 ĐTL201 Tròn, lồi, nhăn, bờ răng cưa, trắng đục Đất trồng lúa 3 ĐTL301 Tròn, lồi, ướt, bờ đều, trong suốt, d 2mm Đất trồng lúa 4 ĐTL401 Tròn, lồi, bờ đều, trong suốt, d= 1mm ĐTL402 Tròn, lồi, bóng, bờ đều, vàng Đất trồng lúa 5 ĐTL501 Tròn, lồi, nhăn, nhớt, bờ răng cưa, trắng đục ĐTL502 Tròn, lồi, bờ đều, trong suốt, d> 1mm Đất trồng bông ĐTB601 Tròn, lồi, bóng, ướt, bờ đều, vàng, d= 1mm Đất trồng mồng tơi ĐMT701 Tròn, lồi, nhăn, bờ răng cưa, vàng Đất trồng rau dền ĐRD801 Tròn, lồi, nhăn, nhớt, bờ răng cưa, trắng đục, d= 2mm Đất trồng quế ĐTQ901 Tròn, lồi, bóng, bờ răng cưa, tâm vàng, d= 2mm Đất trồng tía tô ĐTT111 Tròn, lồi, bờ đều, lõm ở giữa, nhăn, trắng đục ĐTT112 Tròn, lồi, bóng, bờ đều, trong suốt, d< 1mm 40
51. Đồ án tốt nghiệp Các khuẩn lạc từ các nguồn mẫu được cấy làm thuần và bảo quản giống ở nhiệt độ -40C để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.2. Kết quả định danh sơ bộ Từ 15 chủng vi khuẩn phân lập, tiến hành nhuộm Gram và quan sát hình dạng tế bào. Kết quả định danh sơ bộ được trình bày ở Bảng 3.2. Bảng 3.2. Kết quả định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn phân lập Nguồn phân lập Ký hiệu mẫu Gram Hình dạng tế bào Đất trồng lúa 1 ĐTL101 + Que ngắn ĐTL102 + Que ngắn Đất trồng lúa 2 ĐTL201 + Que dài Đất trồng lúa 3 ĐTL301 - Que ngắn ĐTL302 + Que dài Đất trồng lúa 4 ĐTL401 + Que dài ĐTL402 - Que dài Đất trồng lúa 5 ĐTL501 - Que ngắn ĐTL502 + Que ngắn Đất trồng bông ĐTB601 - Que ngắn Đất trồng mồng tơi ĐMT701 + Hình cầu Đất trồng rau dền ĐRD801 - Hình cầu Đất trồng quế ĐTQ901 + Que ngắn Đất trồng tía tô ĐTT111 - Hình cầu ĐTT112 + Hình cầu Từ 10 mẫu đất, đã phân lập được 15 chủng vi khuẩn, trong đó có 9 chủng phân lập từ đất trồng lúa và 6 chủng phân lập từ đất trồng hoa màu. Khi quan sát đặc điểm tế bào, trong 15 chủng vi khuẩn phân lập có 9 chủng thuộc nhóm vi khuẩn Gram (+) và 6 chủng thuộc nhóm vi khuẩn Gram (-). Về hình dạng, có 11 chủng thuộc nhóm trực khuẩn và 4 chủng thuộc nhóm cầu khuẩn (Hình 3.2). 41
52. Đồ án tốt nghiệp a) b) c) Hình 3.2. Kết quả nhuộm Gram của các chủng vi khuẩn phân lập a) ĐTL201, b) ĐTL402, c) ĐTB601 Kết quả phân lập cho thấy ở đất trồng lúa, mỗi mẫu phân lập được một đến hai chủng vi khuẩn trong khi ở đất trồng hoa màu mỗi mẫu chỉ phân lập được một chủng vi khuẩn. Kết quả này cho thấy sự phân bố của vi khuẩn trong đất trồng lúa đa dạng hơn về số lượng so với trong đất trồng hoa màu. Trong số 15 chủng vi khuẩn phân lập, 9 chủng vi khuẩn phân lập từ đất trồng lúa đều thuộc nhóm trực khuẩn trong khi 6 chủng vi khuẩn phân lập từ đất trồng hoa màu có 4 chủng thuộc nhóm cầu khuẩn và 2 chủng là trực khuẩn. Kết quả này cho thấy, ở các vùng đất trồng lúa có sự phân bố chủ yếu của các chủng vi khuẩn thuộc nhóm trực khuẩn, còn trong các vùng đất trồng hoa màu thì có sự phân bố của nhiều dạng vi khuẩn hơn. Theo nghiên cứu của Ntabo và ctv (2010) khi tiến hành phân lập và nghiên cứu đặc điểm chung của các chủng vi khuẩn phân lập từ gò mối và một số vùng đất, sau khi giải trình tự rRNA 16S, đã xác định trong các chủng vi khuẩn phân lập có sự hiện diện của vi khuẩn Gram (+) là Bacillus sp. và Brachybacterium sp.; vi khuẩn Gram (-) là Pseudomonas sp Còn kết quả nghiên cứu của Aslim và ctv (2002) khi tiến hành xác định một số tính chất của các chủng vi khuẩn phân lập từ đất cũng cho thấy hầu hết các chủng vi khuẩn phân lập được là Bacillus. Các vi khuẩn này đều thuộc nhóm trực khuẩn. Kết quả này có sự tương đồng với nghiên cứu hiện tại đối với nhóm vi khuẩn phân lập từ đất. Từ các kết quả này có thể thấy rằng trong các vùng đất, đặc biệt là các vùng đất nông nghiệp có sự hiện diện chủ yếu các nhóm vi khuẩn Gram (+). 42
53. Đồ án tốt nghiệp Với mục tiêu nghiên cứu là phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có lợi từ một số vùng đất nông nghiệp, tiến hành đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào và đối kháng với vi khuẩn chỉ thị của 15 chủng vi khuẩn phân lập. 3.3. Đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào Các chủng vi khuẩn phân lập sau khi định danh sơ bộ được tiến hành đánh giá khả năng sinh các enzyme ngoại bào, đó là enzyme amylase, cellulase, protease, lipase và một số enzyme khác (catalase, oxidase). Từ đó, đánh giá chung về khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn hiện diện trong đất canh tác nông nghiệp tại huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh. 3.3.1. Đánh giá khả năng sinh enzyme amylase Khả năng sinh enzyme amylase của vi khuẩn được đánh giá dựa trên sự phân hủy tinh bột trong môi trường Starch Agar. Kết quả đánh giá khả năng sinh enzyme amylase của 15 chủng vi khuẩn phân lập được trình bày ở Bảng 3.3. Bảng 3.3. Khả năng sinh enzyme amylase của các chủng vi khuẩn phân lập Hoạt tính Hoạt tính STT Chủng vi khuẩn STT Chủng vi khuẩn amylase Amylase 1 ĐTL101 + 8 ĐTL501 ++ 2 ĐTL102 +++ 9 ĐTL502 + 3 ĐTL201 - 10 ĐTB601 ++ 4 ĐTL301 ++ 11 ĐMT701 ++ 5 ĐTL302 - 12 ĐRD801 ++ 6 ĐTL401 - 13 ĐTQ901 ++ 7 ĐTL402 - 14 ĐTT111 ++ 15 ĐTT112 ++ (-): không có khả năng phân giải hoặc đường kính vòng phân giải < 8 mm. (+): Đường kính vòng phân giải từ 8 mm đến 14 mm. (++): Đường kính vòng phân giải từ 15 mm đến 25 mm. (+++): Đường kính vòng phân giải ≥ 25 mm. Kết quả đánh giá khả năng sinh enzyme amylase của các chủng vi khuẩn phân lập được trình bày ở Bảng 3.3. Dựa vào kết quả này có thể nhận thấy rằng, trong 15 chủng vi khuẩn phân lập, 11 chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme 43
54. Đồ án tốt nghiệp amylase thuỷ phân cơ chất là tinh bột trong môi trường tạo vòng phân giải xung quanh giếng thạch (Hình 3.3). Trong 11 chủng này, có 5 chủng vi khuẩn phân lập từ đất trồng lúa (55,55%) và 6 chủng vi khuẩn phân lập từ đất trồng hoa màu (100%). Các chủng vi khuẩn ĐTL201, ĐTL302, ĐTL401, ĐTL402 không có khả năng phân giải tinh bột. Trong số 11 chủng vi khuẩn phân hủy tinh bột, chủng ĐTL102 có khả năng phân giải tinh bột mạnh nhất so với các chủng vi khuẩn phân lập còn lại. Chủng ĐTL101 và ĐTL502 có khả năng phân giải tinh bột ở mức trung bình (đường kính vòng phân giải từ 8 – 14 mm). Các chủng còn lại có khả năng phân hủy tinh bột mạnh (cho kết quả vòng phân giải từ 15 mm đến 25 mm). Đặc biệt trong 11 chủng này, 6 chủng phân lập từ đất trồng hoa màu đều thể hiện khả năng phân hủy tinh bột mạnh thông qua sản xuất enzyme amylase. Kết quả trên cho thấy rằng, các chủng vi khuẩn hiện diện trong đất trồng lúa và đất trồng hoa màu đều có khả năng sinh enzyme amylase nhưng mức độ phân bố của các vi khuẩn có khả năng sinh enzyme amylase trong đất trồng hoa màu lại phong phú hơn so với trong đất trồng lúa. Hình 3.3. Vòng phân giải tinh bột của các chủng ĐTL101, ĐTL102 và ĐTT112 trên môi trường Starch Agar 3.3.2. Đánh giá khả năng sinh enzyme cellulase Tiến hành đánh giá khả năng sinh enzyme cellulase dựa vào sự thuỷ phân cellulose trong môi trường CMC Agar. Kết quả đánh giá khả năng sinh enzyme cellulase được trình bày ở Bảng 3.4. 44
55. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.4. Khả năng sinh enzyme cellulase của các chủng vi khuẩn phân lập STT Chủng vi khuẩn Cellulase STT Chủng vi khuẩn Cellulase 1 ĐTL101 + 8 ĐTL501 ++ 2 ĐTL102 +++ 9 ĐTL502 ++ 3 ĐTL201 - 10 ĐTB601 ++ 4 ĐTL301 ++ 11 ĐMT701 ++ 5 ĐTL302 - 12 ĐRD801 ++ 6 ĐTL401 + 13 ĐTQ901 ++ 7 ĐTL402 ++ 14 ĐTT111 ++ 15 ĐTT112 ++ (-): không có khả năng phân giải hoặc đường kính vòng phân giải < 8 mm. (+): Đường kính vòng phân giải từ 8 mm đến 14 mm. (++): Đường kính vòng phân giải từ 15 mm đến 25 mm. (+++): Đường kính vòng phân giải ≥ 25 mm. Kết quả đánh giá khả năng sinh enzyme cellulase của 15 chủng vi khuẩn phân lập được trình bày ở Bảng 3.4. Kết quả này cho thấy trong số 15 chủng khảo sát, 13 chủng vi khuẩn có khả năng sản sinh enzyme phân giải cellulose, trong đó có 77,78% các chủng vi khuẩn phân lập từ đất trồng lúa và 100% các chủng phân lập từ đất trồng hoa màu có khả năng sản sinh enzyme phân giải cellulose. Hai chủng ĐTL201 và ĐTL302 không thể hiện sự phân giải. Khả năng phân giải cellulose trên môi trường CMC Agar của các chủng vi khuẩn phân lập được biểu hiện ở Hình 3.4. Trong số các chủng có khả năng phân giải tinh bột, chủng ĐTL102 thể hiện sự phân giải mạnh nhất với đường kính vòng phân giải lớn hơn 25 mm. Các chủng ĐTL101 và ĐTL401 thể hiện sự phân giải ở mức trung bình (đường kính vòng phân giải từ 8 -14 mm). Các chủng vi khuẩn phân lập còn lại cho thấy khả năng sinh enzyme cellulase mạnh (đường kính vòng phân giải từ 15 - 25 mm). 45
56. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.4. Vòng phân giải cellulose của các chủng ĐMT701, ĐRD801, ĐTQ901 và ĐTT111 trên môi trường CMC Agar 3.3.3. Đánh giá khả năng sinh enzyme protease Trong thí nghiệm đánh giá khả năng sinh enzyme protease, tiến hành khảo sát thông qua khả năng phân hủy gelatin và casein. Kết quả đánh giá khả năng phân hủy gelatin và casein được trình bày ở Bảng 3.5. Bảng 3.5. Khả năng phân hủy gelatin và casein của các chủng vi khuẩn phân lập STT Chủng Phân Phân STT Chủng Phân Phân huỷ vi huỷ huỷ vi huỷ casein khuẩn gelatin casein khuẩn gelatin 1 ĐTL101 + + 8 ĐTL501 + + 2 ĐTL102 + + 9 ĐTL502 + + 3 ĐTL201 + + 10 ĐTB601 - + 4 ĐTL301 - + 11 ĐMT701 - + 5 ĐTL302 + + 12 ĐRD801 + + 6 ĐTL401 - + 13 ĐTQ901 - + 7 ĐTL402 + + 14 ĐTT111 + + 15 ĐTT112 - + (+): Vi khuẩn có phân huỷ gelatin/ casein. (-): Vi khuẩn không phân huỷ gelatin/ casein. 46
57. Đồ án tốt nghiệp Gelatin là thành phần có nguồn gốc từ collagen trong da lợn và xương gia súc trong khi đó casein là thành phần protein trong sữa. Đây là 2 nguồn protein đặc trưng được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu về khả năng sinh enzyme protease. Trong thí nghiệm này, khi đánh giá khả năng phân huỷ gelatin, 9 chủng vi khuẩn có khả năng phân huỷ gelatin (Hình 3.5), trong đó có 77,78% chủng vi khuẩn phân lập từ đất trồng lúa nhưng chỉ có 33,33% các chủng phân lập từ đất trồng hoa màu thể hiện khả năng phân giải gelatin. Về khả năng phân huỷ casein, cả 15 chủng vi khuẩn phân lập đều có khả năng sinh caseinase thuỷ phân casein trên môi trường Skim Milk Agar (tỷ lệ 100%). Kết quả này chứng tỏ các chủng vi khuẩn phân lập có khả năng sản sinh enzyme phân giải protein thuộc nhóm protein động vật cả nhóm protein trong sữa. Hình 3.5. Kết quả dương tính của các chủng vi khuẩn phân lập so với mẫu đối chứng trong thử nghiệm gelatinase 3.3.4. Đánh giá khả năng sinh enzyme lipase Khả năng sinh enzyme lipase được đánh giá thông qua sự phân huỷ Tween 80 trong môi trường Tween Peptone Agar. Kết quả đánh giá được trình bày ở Bảng 3.6. Kết quả kiểm tra khả năng sinh enzyme lipase ở Bảng 3.6 cho thấy, trong số 15 chủng vi khuẩn phân lập chỉ có 5 chủng cho kết quả lipase dương tính, trong đó có 4 chủng phân lập từ đất trồng lúa (44,44%) và 1 chủng phân lập từ đất trồng hoa màu (16,67%), biểu hiện thông qua quầng sáng màu hồng xung quanh lỗ thạch trên 47
58. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.6. Khả năng sinh enzyme lipase của các chủng vi khuẩn phân lập STT Chủng vi khuẩn Lipase STT Chủng vi khuẩn Lipase 1 ĐTL101 - 8 ĐTL501 - 2 ĐTL102 - 9 ĐTL502 - 3 ĐTL201 + 10 ĐTB601 + 4 ĐTL301 - 11 ĐMT701 - 5 ĐTL302 + 12 ĐRD801 - 6 ĐTL401 + 13 ĐTQ901 - 7 ĐTL402 + 14 ĐTT111 - 15 ĐTT112 - (+): Vi khuẩn có phân huỷ Tween 80 (-): Vi khuẩn không phân huỷ Tween 80 môi trường Tween Peptone Agar (Hình 3.6). Kết quả này cho thấy các vi khuẩn có khả năng sinh enzyme lipase phân bố ít trong đất nông nghiệp. Trong các vùng đất đặc biệt là đất nông nghiệp do sự hiện diện hạn chế của các nguồn lipid nên sự hiện diện của các vi khuẩn phân giải lipid trong các nguồn đất rất hạn chế. Điều này có thể là một dự báo các nguồn đất này không bị ô nhiễm các nguồn lipid, từ đó có thể ảnh hưởng đến hoạt động canh tác trên các vùng đất này. Hình 3.6. Kết quả kiểm tra khả năng sinh enzyme lipase của các chủng ĐTL201, ĐTL301, ĐTL502 và ĐTB601 trên môi trường Tween Peptone Agar 48
59. Đồ án tốt nghiệp 3.3.5. Đánh giá khả năng sinh enzyme catalase Enzyme catalase có vai trò bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi các dẫn xuất độc tính cao của phân tử oxy trong tế bào vi sinh vật. Kết quả đánh giá khả năng sinh enzyme catalase được trình bày ở Bảng 3.7. Bảng 3.7. Khả năng sinh enzyme catalase của các chủng vi khuẩn phân lập Chủng Chủng STT Catalase STT Catalase vi khuẩn vi khuẩn 1 ĐTL101 + 8 ĐTL501 + 2 ĐTL102 + 9 ĐTL502 + 3 ĐTL201 + 10 ĐTB601 + 4 ĐTL301 - 11 ĐMT701 + 5 ĐTL302 + 12 ĐRD801 + 6 ĐTL401 + 13 ĐTQ901 + 7 ĐTL402 + 14 ĐTT111 + 15 ĐTT112 + (+): Vi khuẩn có sinh enzyme catalase (-): Vi khuẩn không sinh enzyme catalase Kết quả nghiên cứu về khả năng sinh catalase trình bày ở Bảng 3.7 cho thấy chỉ có chủng ĐTL301 là cho kết quả catalase âm tính, 14 chủng còn lại đều cho kết quả dương tính. Theo Trần Linh Thước (2010), Các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy nghi chứa chuỗi chuyển điện tử có cytochrome đều có enzyme catalase (trừ các Streptococcus spp.). Điều này chứng tỏ, các chủng vi khuẩn phân lập (ngoại trừ chủng vi khuẩn ĐTL301) đều thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi. 3.3.6. Đánh giá khả năng sinh enzyme oxidase Các chủng vi khuẩn phân lập được tiến hành thử nghiệm oxidase. Kết quả đánh giá khả năng sinh enzyme oxidase được trình bày ở Bảng 3.8. 49
60. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.8. Khả năng sinh enzyme oxidase của các chủng vi khuẩn phân lập STT Chủng vi khuẩn Oxidase STT Chủng vi khuẩn Oxidase 1 ĐTL101 + 8 ĐTL501 + 2 ĐTL102 - 9 ĐTL502 + 3 ĐTL201 + 10 ĐTB601 + 4 ĐTL301 + 11 ĐMT701 + 5 ĐTL302 + 12 ĐRD801 + 6 ĐTL401 + 13 ĐTQ901 + 7 ĐTL402 + 14 ĐTT111 + 15 ĐTT112 + (+): Vi khuẩn có sinh enzyme oxidase (-): Vi khuẩn không sinh enzyme oxidase Theo Trần Linh Thước (2010), thành phần quan trọng nhất là cytochrome oxidase trong chuỗi truyền điện tử của hô hấp hiếu khí với O2 là chất nhận điện tử sau cùng nên chỉ hiện diện trong các loài vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tuỳ nghi. Đối với các chủng vi khuẩn phân lập trong nghiên cứu này đều cho kết quả thử nghiệm oxidase dương tính, ngoại trừ chủng ĐTL102 là cho kết quả âm tính. Kết quả này cho thấy các chủng vi khuẩn phân lập (trừ chủng ĐTL102) có khả năng là vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tuỳ nghi. Từ kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn phân lập cho thấy các chủng vi khuẩn này có khả năng sinh các enzyme ngoại bào có hoạt tính khá mạnh. Theo nghiên cứu của Ntabo và ctv (2010) khi tiến hành phân lập và nghiên cứu khả năng sinh enzyme của các chủng vi khuẩn phân lập từ gò mối và một số vùng đất, kết quả cho thấy rằng có 65 % trong tổng số vi khuẩn phân lập có khả năng phân giải tinh bột, 11 % trong tổng số vi khuẩn phân lập có khả năng phân giải cellulose, 54 % vi khuẩn có khả năng phân giải casein và 68 % vi khuẩn có khả năng làm tan gelatin. Nghiên cứu của Willerding và ctv (2011) về hoạt động của enzyme lipase của các vi khuẩn được phân lập từ đất ở vùng Amazonian cho thấy có 41 % trong tổng số vi khuẩn phân lập được thử nghiệm có khả năng sinh 50
61. Đồ án tốt nghiệp enzyme lipase. Từ các nghiên cứu này cho thấy rằng trong các vùng đất nông nghiệp và đất rừng có sự phân bố vi sinh vật rất phong phú và có khả năng sinh nhiều loại enzyme ngoại bào, đó là enzyme amylase, protease, cellulase và lipase. Trong nghiên cứu về sự hiện diện của các vi sinh vật trong đất nông nghiệp thu thập từ một số ruộng đất trồng lúa và đất trồng hoa màu của ông Nguyễn Văn Hoàng tại Huyện Gò Dầu, tỉnh Tây Ninh, kết quả đã thể hiện tính tương đồng với các nghiên cứu đã khảo sát. Các chủng vi khuẩn phân lập có khả năng sinh nhiều loại enzyme ngoại bào và tỷ lệ các chủng sinh enzyme cũng rất cao, trong đó có một số chủng có khả năng sinh 6 loại enzyme, đó là chủng ĐTL101, ĐTL402, ĐTL501, ĐTL502, ĐTB601, ĐRD801và ĐTT111. Như vậy, các chủng này có tiềm năng trong việc ứng dụng trong các lĩnh vực khác như xử lý nước thải, tách chiết các enzyme cũng như lĩnh vực sản xuất thực phẩm. Kết quả này đã cho thấy các vùng đất nông nghiệp, đặc biệt là các vùng đất canh tác hoa màu như đất trồng hoa, quế, tía tô có sự phân bố rất nhiều các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme ngoại bào. Điều này do các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme ngoại bào chủ yếu thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí bắt buộc và kỵ khí tùy nghi mà vùng đất trồng hoa màu là vùng đất gò, không ngập nước như đất trồng lúa, do đó, điều kiện thoáng khí rất cao, nên có sự phân bố nhiều các chủng vi khuẩn này (Lê Quốc Tuấn, 2009). 3.4. Đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với vi khuẩn gây bệnh Với mục tiêu của nghiên cứu là chọn ra chủng vi khuẩn có lợi nên ngoài việc đánh giá khả năng sinh các enzyme ngoại bào, chúng tôi cũng tiến hành đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn phân lập đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh. Kết quả kiểm tra tính kháng khuẩn của 15 chủng vi khuẩn phân lập từ đất nông nghiệp đối với 19 chủng vi gây bệnh bằng phương pháp đục lỗ thạch, sau 24 giờ xuất hiện vòng kháng khuẩn với kích thước khác nhau được trình bày ở các Bảng 3.9, Bảng 3.10, Bảng 3.11, Bảng 3.12 và Bảng 3.13. 51
62. Đồ án tốt nghiệp 3.4.1. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Salmonella sp. Salmonella là một trong những loại vi khuẩn quan trọng nhất thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae. Salmonella sản sinh hai loại độc tố: độc tố ruột gây xung huyết, mụn loét và độc tố thần kinh gây ra các triệu chứng thần kinh. Ngộ độc do Salmonella là loại ngộ độc thường gặp và có thể gây tử vong. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Salmonella sp. được trình bày ở Bảng 3.9. Bảng 3.9. Khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Salmonella sp. Chủng S. S. S. S. S. vi khuẩn enteritidis dublin typhimurium typhii (K) typhii (V) ĐTL101 - - - - - ĐTL102 - - - - - ĐTL201 - - - - - ĐTL301 - - - - - ĐTL302 - - - - - ĐTL401 - - - - - ĐTL402 - - - - - ĐTL501 - + - - - ĐTL502 - - - - - ĐTB601 - - - - - ĐMT701 - - - - - ĐRD801 - ++ - - - ĐTQ901 - - - - - ĐTT111 - ++ - - - ĐTT112 + ++ ++ - - (-): Vi khuẩn không thể hiện sự đối kháng với vi khuẩn chỉ thị. (+): Vòng kháng khuẩn từ 8 mm đến 15 mm. (++): Vòng kháng khuẩn ≥ 15 mm. 52
63. Đồ án tốt nghiệp Qua kết quả đánh giá ở Bảng 3.9 nhận thấy rằng, khi khảo sát khả năng đối kháng của 15 chủng vi khuẩn phân lập đối với 5 chủng vi khuẩn Salmonella sp. thì chỉ có 4 chủng vi khuẩn thể hiện tính đối kháng với vi khuẩn S. dublin, trong đó chỉ có 1 chủng phân lập từ đất trồng lúa (ĐTL501) và 3 chủng phân lập từ đất trồng hoa màu (ĐRD801, ĐTT111 và ĐTT112) và 3 chủng này thể hiện tính đối kháng rất mạnh (đường kính vòng kháng khuẩn ≥ 15 mm). Đối với các vi khuẩn S. enteritidis, S. typhimurium, chỉ có chủng ĐTT112 thể hiện tính kháng và đối kháng ở mức độ mạnh. Cả 15 chủng vi khuẩn phân lập đều không có khả năng đối kháng đối với vi khuẩn S. typhii (K) và S. typhii (V). Sự đối kháng của các chủng vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Salmonella sp. được biểu hiện thông qua vòng kháng khuẩn (Hình 3.7). Hình 3.7. Vòng kháng khuẩn của sinh khối các chủng ĐTL501, ĐRD801và ĐTT111 đối với vi khuẩn S. dublin 3.4.2. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn E. Coli E. Coli là vi khuẩn hiện diện nhiều nhất trong đường tiêu hoá. Bản thân E. Coli là tác nhân gây bệnh cơ hội, tức là bình thường E. Coli sống trong ruột người không gây bệnh nhưng khi cơ thể suy yếu thì một số chủng E. Coli gây ra một số bệnh. Vi khuẩn E. Coli gây nên các bệnh rối loạn đường tiêu hoá, tiết niệu, sinh dục, đường mật, đường hô hấp và nhiễm khuẩn, nhưng nhiễm khuẩn quan trọng nhất là viêm dạ dày ruột ở trẻ em. 53
64. Đồ án tốt nghiệp Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập trong nghiên cứu này đối với nhóm vi khuẩn E. Coli được trình bày ở Bảng 3.10. Bảng 3.10. Khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn E. Coli Chủng vi khuẩn E. Coli (K) E. Coli (V) TEC EC.02.08 ĐTL101 - - - - ĐTL102 - - - - ĐTL201 - - - - ĐTL301 ++ + ++ + ĐTL302 - - - - ĐTL401 - + ++ + ĐTL402 - - - - ĐTL501 ++ + ++ + ĐTL502 - - - - ĐTB601 - - - - ĐMT701 - - - - ĐRD801 ++ + + + ĐTQ901 + + + - ĐTT111 + + ++ - ĐTT112 - - - - (-): Vi khuẩn không thể hiện sự đối kháng với vi khuẩn chỉ thị. (+): Vòng kháng khuẩn từ 8 mm đến 15 mm. (++): Vòng kháng khuẩn ≥ 15 mm. Khi tiến hành đánh giá mức độ đối kháng của 15 chủng vi khuẩn phân lập đối với 4 chủng vi khuẩn chỉ thị nhóm E. Coli cho thấy, có 6 chủng vi khuẩn phân lập có khả năng đối kháng với nhóm vi khuẩn E. Coli và thể hiện tính kháng mạnh với nhóm vi khuẩn này. Trong đó, có 3 chủng phân lập từ đất trồng lúa là ĐTL301, ĐTL501, ĐTL401 (33,33%) và 3 chủng phân lập từ đất trồng hoa màu là ĐRD801, ĐTQ901, ĐTT111 (50%). Điều này cho thấy trong đất canh tác nông nghiệp cũng có sự hiện diện các chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng mạnh với nhóm vi khuẩn 54
65. Đồ án tốt nghiệp E. Coli. Một điểm đặc biệt trong thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng với vi khuẩn E. Coli là 6 chủng vi khuẩn có khả năng đối kháng với cả 4 chủng E. Coli khảo sát (ngoại trừ chủng ĐTL401, ĐTQ901 và ĐTT111 chỉ đối kháng với ¾ chủng E. Coli khảo sát). Điều này chứng tỏ các chủng vi khuẩn này có hiệu quả ức chế khá cao với các chủng thuộc nhóm vi khuẩn E. Coli. Hình 3.8. Vòng kháng khuẩn của sinh khối các chủng ĐTL301, ĐTL401 và ĐTL501 đối với nhóm vi khuẩn E. Coli 3.4.3. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Shigella Shigella là giống vi khuẩn phổ biến ở người và các loài linh trưởng. Shigella là tác nhân gây viêm dạ dày, ruột và bệnh lỵ trực khuẩn. Liều lượng gây ngộ độc thực phẩm do Shigella rất thấp, có thể ở mức 10 tế bào/gam sản phẩm. Do vậy, Shigella cần được kiểm soát nghiêm ngặt trong thực phẩm. 55
66. Đồ án tốt nghiệp Đối với nghiên cứu này, kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối 15 chủng vi khuẩn phân lập đối với các vi khuẩn chỉ thị nhóm Shigella sp. được trình bày ở Bảng 3.11. Bảng 3.11. Khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Shigella Chủng vi khuẩn Shi. sonnei Shi. boydii Shi. flexneri ĐTL101 – – – ĐTL102 – – – ĐTL201 – – – ĐTL301 ++ – – ĐTL302 – – – ĐTL401 ++ – – ĐTL402 – – – ĐTL501 ++ – – ĐTL502 – – – ĐTB601 – – – ĐMT701 – – – ĐRD801 + – – ĐTQ901 – – – ĐTT111 + – – ĐTT112 – – – (-): Vi khuẩn không thể hiện sự đối kháng với vi khuẩn chỉ thị. (+): Vòng kháng khuẩn từ 8 mm đến 15 mm. (++): Vòng kháng khuẩn ≥ 15 mm. Kết quả đánh giá tính đối kháng của 15 chủng vi khuẩn phân lập đối với 3 chủng vi khuẩn Shigella cho thấy, các chủng vi khuẩn này chỉ thể hiện tính đối kháng với Shi. sonnei. Tuy nhiên, chỉ có 5 chủng có khả năng đối kháng với vi khuẩn này (Hình 3.9). Trong đó có 3 chủng được phân lập từ đất trồng lúa (các chủng ĐTL301, ĐTL401, ĐTL501) có khả năng đối kháng mạnh hơn so với 2 chủng phân lập từ đất trồng hoa màu (ĐRD801 và ĐTT111). Điều này cho thấy các 56
67. Đồ án tốt nghiệp chủng vi khuẩn phân lập từ đất trồng lúa có khả năng đối kháng với Shi. sonnei mạnh hơn so với các chủng vi khuẩn phân lập từ đất trồng hoa màu. Cả 15 chủng vi khuẩn phân lập đều không có khả năng đối kháng với Shi. boydii và Shi. flexneri. Hình 3.9. Vòng kháng khuẩn của sinh khối các chủng ĐTL301, ĐTL501, ĐRD801 đối với vi khuẩn Shi. sonnei 3.4.4. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Vibrio Vibrio spp. là nhóm vi sinh vật ưa mặn, hiện diện thường xuyên trong các môi trường nước biển và các động vật thủy hải sản. Chúng chẳng những gây bệnh cho động vật thủy hải sản mà còn có khả năng gây bệnh cho người. Một số loài có khả năng gây bệnh cho người như V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với các vi khuẩn chỉ thị nhóm Vibrio được trình bày ở Bảng 3.12. Trong thí nghiệm này, sinh khối của 15 chủng vi khuẩn phân lập không có khả năng đối kháng với vi khuẩn V. parahaemolyticus. Đối với vi khuẩn V. alginolyticus, có 3 chủng vi khuẩn phân lập thể hiện sự đối kháng, các chủng này là ĐTL501, ĐRD801 và ĐTT112. Trong đó, chủng ĐTL501 phân lập từ đất trồng lúa thể hiện tính kháng yếu hơn so với các chủng ĐRD801 và ĐTT112 phân lập từ đất trồng hoa màu (33,33%). Đối với vi khuẩn V. harveyi là vi khuẩn gây bệnh phát sáng trên tôm, trong 15 chủng vi khuẩn phân lập, 5 chủng vi khuẩn thể hiện tính kháng đối với vi khuẩn này và thể hiện cường độ kháng rất mạnh (đường kính vòng 57
68. Đồ án tốt nghiệp Bảng 3.12. Khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với nhóm vi khuẩn Vibrio V. parahaemolyticus V. alginolyticus V. harveyi ĐTL101 - - - ĐTL102 - - - ĐTL201 - - - ĐTL301 - - ++ ĐTL302 - - - ĐTL401 - - ++ ĐTL402 - - - ĐTL501 - + - ĐTL502 - - - ĐTB601 - - - ĐMT701 - - - ĐRD801 - ++ - ĐTQ901 - - ++ ĐTT111 - - ++ ĐTT112 - ++ ++ (-): Vi khuẩn không thể hiện sự đối kháng với vi khuẩn chỉ thị. (+): Vòng kháng khuẩn từ 8 mm đến 15 mm. (++): Vòng kháng khuẩn ≥ 15 mm. kháng khuẩn từ 15 mm trở lên), trong đó có 2 chủng phân lập từ đất trồng lúa (22,22%) là ĐTL301, ĐTL401 và 3 chủng phân lập từ đất trồng hoa màu (50%) là ĐTQ901, ĐTT111và ĐTT112. Chủng ĐTT112 thể hiện tính kháng rất mạnh đối với cả V. alginolyticus và V. harveyi (Hình 3.10). 58
69. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.10. Vòng kháng khuẩn của sinh khối chủng ĐTT112 đối với các vi khuẩn chỉ thị nhóm Vibrio spp. 3.4.5. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối vi khuẩn phân lập đối với các vi khuẩn L. monocytogenes, L. innocua, E. feacalis, S. aureus L. monocytogenes là tác nhân gây bệnh mà chỉ cần hiện diện với số lượng nhỏ trong thực phẩm, cũng có thể gây ra những tác hại rất lớn. Trong khi đó, L. innocua lại vô hại đối với các sinh vật khác. Đối tượng bị nhiễm bệnh do L. monocytogenes thường là trẻ em, trẻ sơ sinh, người già, thai phụ và người có hệ miễn dịch kém. L. monocytogenes gây ra bệnh nhiễm trùng máu, viêm màng não hoặc sốt viêm dạ dày ruột, đồng thời cũng là nguyên nhân gây ra trẻ chết sau khi sinh, đẻ non và sẩy thai ở phụ nữ. E. feacalis là chỉ tiêu để xác định mức độ nhiễm phân của thực phẩm. E. feacalis thường gây bệnh viêm họng, viêm hạch mủ, viêm khớp, viêm thận cấp tính, viêm các van tim, gây đau dạ dày và mùi hôi ở cổ họng. Sự hiện diện của S. aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến. Nguyên nhân gây bệnh do S. aureus là do vi khuẩn này tiết ra các độc tố vào thực phẩm. Khi các ngoại độc tố này vào dạ dày sẽ nhanh chóng thấm vào niêm mạc dạ dày, ruột và vào máu sau đó tác động lên hệ thần kinh thực vật làm cường phó giao cảm gây tảng nhu mô động ruột làm dạ dày co bóp dẫn đến triệu chứng ngộ độc. 59
70. Đồ án tốt nghiệp Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của 15 chủng vi khuẩn phân lập đối với các vi khuẩn L. monocytogenes, L. innocua, E. feacalis, S. aureus được trình bày ở Bảng 3.13. Bảng 3.13. Kết quả đánh giá khả năng đối kháng của sinh khối các chủng vi khuẩn phân lập đối với các vi khuẩn L. monocytogenes, L. innocua, E. feacalis, S. aureus L. monocytogenes L. innocua E. feacalis S. aureus ĐTL101 - - - - ĐTL102 - - - - ĐTL201 - - - - ĐTL301 - - - - ĐTL302 - - - - ĐTL401 - - - - ĐTL402 - - - - ĐTL501 ++ - - - ĐTL502 - - - - ĐTB601 - - - - ĐMT701 - - - - ĐRD801 - ++ - - ĐTQ901 - - - - ĐTT111 - - - - ĐTT112 + - - - (-): Vi khuẩn không thể hiện sự đối kháng với vi khuẩn chỉ thị. (+): Vòng kháng khuẩn từ 8 mm đến 15 mm. (++): Vòng kháng khuẩn ≥ 15 mm. Kết quả ở Bảng 3.13 cho thấy, sinh khối của 15 chủng vi khuẩn phân lập không có khả năng đối kháng với vi khuẩn E. feacalis và S. aureus. Chỉ có chủng ĐRD801 có khả năng đối kháng với vi khuẩn L. innocua nhưng thể hiện tính kháng rất mạnh (đường kính vòng kháng khuẩn là 18 mm). Riêng sinh khối của 2 chủng ĐTL501 và ĐTT112 có khả năng đối kháng với vi khuẩn L. monocytogenes, trong đó chủng ĐTL501 thể hiện tính kháng mạnh hơn so với chủng ĐTT112. Sự đối 60
71. Đồ án tốt nghiệp kháng của các chủng vi khuẩn phân lập đối với các chủng L. innocua và L. monocytogenes được biểu hiện ở Hình 3.11. Hình 3.11. Vòng kháng khuẩn của các chủng ĐTL501, ĐTT112, ĐRD801 đối với các vi khuẩn chỉ thị L. monocytogenes, L. innocua Qua kết quả đối kháng của sinh khối 15 chủng vi khuẩn phân lập đối với 19 chủng vi khuẩn chỉ thị nhận thấy rằng trong 9 chủng vi khuẩn phân lập từ đất trồng lúa, chỉ có 3 chủng ĐTL301, ĐTL401 và ĐTL501 có khả năng đối kháng và thể hiện tính kháng rất mạnh đối với nhóm vi khuẩn E. coli và V. harveyi; trong số 6 chủng vi khuẩn phân lập từ đất trồng hoa màu, có 4 chủng là ĐRD801, ĐTQ901, ĐTT111 và ĐTT112 có khả năng đối kháng với các chủng vi khuẩn chỉ thị, các chủng này đối kháng mạnh với các vi khuẩn chỉ thị nhóm Salmonella, E. coli, Vibrio và Listeria. Từ kết quả đánh giá khả năng đối kháng của 15 chủng vi khuẩn phân lập từ đất nông nghiệp đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị, nhận thấy rằng một số chủng vi khuẩn thể hiện khả năng đối kháng với các chủng vi khuẩn. Đối với nhóm vi khuẩn gây bệnh đường ruột là Salmonella sp., Shigella sp. và E. Coli, có 7 chủng có khả năng đối kháng với các chủng này (46,67%) trong đó có 3 chủng phân lập từ đất trồng lúa (33,33%) và 4 chủng phân lập từ đất trồng hoa màu (66,67%). Trong số này, các chủng ĐTL501, ĐRD801, ĐTT111 có khả năng đối kháng với cả 3 chủng vi khuẩn thuộc 3 nhóm này. Sự hiện diện của các chủng vi khuẩn có khả năng ức 61
72. Đồ án tốt nghiệp chế vi khuẩn trong đất có vai trò hạn chế sự sinh sôi của các vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt đối với đất nông nghiệp khi trong quá trình trồng trọt có sử dụng phân bón, nhất là các dạng phân từ động vật, có sự hiện diện rất nhiều các vi khuẩn gây bệnh đường ruột. Theo nghiên cứu của Aslim và ctv (2002) về một số đặc tính của các chủng Bacillus sp. được phân lập từ đất cho thấy, chỉ có 13,33% trong tổng số vi khuẩn phân lập có khả năng đối kháng với E. Coli. Kết quả nghiên cứu của Ntabo và ctv (2010) đối với các chủng vi khuẩn phân lập từ gò mối và một số vùng đất cho thấy có 51% vi khuẩn trong tổng số các chủng phân lập có khả năng đối kháng với vi khuẩn E. Coli. Theo nghiên cứu của Sorokulova và ctv (2013) về hoạt động đối kháng của Bacillus spp. đối với các tác nhân gây bệnh cho thấy rằng 100% vi khuẩn khảo sát có khả năng đối kháng mạnh đối với chủng Shi. sonnei và Shi. flexneri (đối kháng mạnh nhất cho đường kính vòng kháng khuẩn là 24,3 mm và yếu nhất là 11,0 mm). Nghiên cứu của Rashid và ctv (2014) về hoạt động kháng khuẩn của các vi khuẩn phân lập từ đất cũng cho thấy khả năng đối kháng mạnh đối với Shi. flexneri. Các nghiên cứu này cũng cho thấy các chủng vi khuẩn phân lập từ đất có khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh đường ruột. Tuy nhiên, các nghiên cứu này chỉ tập trung nghiên cứu đặc tính đối kháng trên một chủng vi khuẩn gây bệnh do đó chưa phản ảnh hết đặc tính đối kháng với các nhóm vi khuẩn gây bệnh đường ruột khác. Đối với nhóm vi khuẩn Vibrio sp., các chủng vi khuẩn khảo sát chỉ thể hiện tính đối kháng với V. alginolyticus và V. harveyi. Theo nghiên cứu của Domrongpokkaphan và Wanchaitanawong (2006) về hoạt động kháng khuẩn của Bacillus sp. đối với vi khuẩn Vibrio spp. cho thấy các chủng này thể hiện tính kháng mạnh đối với các vi khuẩn V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. harveyi. Trong đó, có 16% vi khuẩn trong tổng số các chủng vi khuẩn phân lập có khả năng đối kháng với V. harveyi, 16% có khả năng đối kháng với V. alginolyticus và 32% có khả năng đối kháng với vi khuẩn V. parahaemolyticus. Kết quả của nghiên cứu hiện tại cho thấy có 20% tổng số vi khuẩn phân lập có khả năng đối kháng với V. alginolyticus, có 33,33% tổng số vi khuẩn phân lập có khả năng đối kháng với V. 62
73. Đồ án tốt nghiệp harveyi và khả năng đối kháng của 15 chủng vi khuẩn phân lập đối với V. parahaemolyticus là 0%. So với kết quả nghiên cứu của Domrongpokkaphan và Wanchaitanawong (2006) Kết quả này có sự tương đồng về khả năng đối kháng với V. alginolyticus và V. harveyi nhưng có sự khác biệt về khả năng đối kháng với V. parahaemolyticus. Những chủng thể hiện khả năng đối kháng với nhóm Vibrio có tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản nhằm phòng bệnh cho động vật thủy sản. Đối với nhóm vi khuẩn Gram dương khảo sát là L. monocytogenes, L. innocua, E. feacalis và S. aureus, chỉ có các chủng ĐTL501 và ĐTT112 thể hiện tính kháng với L. monocytogenes và chỉ có chủng ĐRD801 thể hiện tính kháng với L. innocua. Tất cả vi khuẩn phân lập đều không có khả năng đối kháng với E. feacalis và S. aureus. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu của Aslim và ctv (2002), nghiên cứu của Sheikh (2010) về hoạt động kháng khuẩn của các vi khuẩn phân lập từ đất lại cho thấy các chủng vi khuẩn phân lập từ đất có khả năng đối kháng mạnh đối với S. aureus. Tóm lại, từ kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn cho thấy sự hiện diện của các vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn trong đất khá phong phú và có khả năng kháng lại nhiều loại vi khuẩn gây bệnh khác nhau. Khả năng kháng khuẩn của các chủng này do chúng có khả năng tiết ra một số thành phần như lyzozyme, phosphalipase Với sự hiện diện của các chủng vi khuẩn này trong đất, sẽ góp phần hạn chế vi khuẩn gây bệnh trong đất để tạo ra nông sản sạch hơn đồng thời có thể ứng dụng các chủng vi khuẩn này trong các lĩnh vực khác như sản xuất chế phẩm vi sinh phòng bệnh. 3.5. Tổng hợp kết quả đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào và đối kháng vi khuẩn gây bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập Kết quả tổng hợp khả năng sinh enzyme ngoại bào của 15 chủng vi khuẩn phân lập được trình bày ở Bảng 3.14, Bảng 3.15.A và Bảng 3.15.B. 63