Đồ án Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon lên sự sinh trưởng, phát triển của lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight in vitro

158 trang thiennha21 12/04/2022 4880

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon lên sự sinh trưởng, phát triển của lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight in vitro", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_khao_sat_anh_huong_cua_nguon_carbon_len_su_sinh_truong.pdf

Nội dung text: Đồ án Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon lên sự sinh trưởng, phát triển của lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HCM KHOA CNSH – TP – MT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN CARBON LÊN SỰ SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN CỦA LAN VŨ NỮ ONCIDIUM KOZUMIT DELIGHT IN VITRO Ngành : Công nghệ sinh học Chuyên ngành: Công nghệ sinh học GVHD : Th.S. Trịnh Thị Lan Anh SVTH : Phan Hồng Nhung Lớp : 15HSH01 TP. HCM, 08/2016
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung trong đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu thực sự của tôi dưới sự hướng dẫn của ThS. Trịnh Thị Lan Anh – giảng viên Trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Đề tài được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và tiến hành nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học Thực Vật, khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, thuộc Trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Các số liệu và bảng trong bài là hoàn toàn trung thực. Đồ án không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào, nếu phát hiện có bất kì gian lận nào tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. TP.HCM, ngày tháng năm 2016 Sinh viên thực hiện Phan Hồng Nhung i
LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến Quý Thầy Cô ở Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường của trường Đại học Công nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình đã truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho em trong suốt thời gian học tập tại trường. Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu đồ án mà còn là hành trang quí báu để em bước vào đời một cách vững chắc và tự tin. Đặc biệt cho phép em bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS. Trịnh Thị Lan Anh – người đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu và cung cấp những tư liệu quý giá cho em thực hiện tốt bài đồ án tốt nghiệp này. Cảm ơn cô đã tiếp thêm cho em niềm tin và nghị lực để định hướng cho tương lai. Qua bài đồ án này, em cũng xin chân thành cảm ơn ban giám hiệu trường Đại học Công nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho em tiếp cận và học hỏi nhiều kinh nghiệm trong quá trình làm đồ án. giúp em nắm vững những kiến thức đã học. Bên cạnh đó, em cũng xin cảm ơn thầy Huỳnh Văn Thành và thầy Nguyễn Trung Dũng cán bộ phòng thí nghiệm đã giúp đỡ em trong suốt thời gian làm đồ án. Cảm ơn các bạn phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đã giúp đỡ, hỗ trợ mình trong suốt quá trình làm đồ án. Cuối cùng em kính chúc Quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công trong sự nghiệp trồng người. TP.Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2016 Sinh viên thực hiện đồ án Phan Hồng Nhung ii
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CÁM ƠN ii MỤC LỤC .iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ix DANH MỤC BIỂU ĐỒ xi MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục đích nghiên cứu .3 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3 4. Phương pháp nghiên cứu 3 5. Kết quả đạt được 3 6. Kết cấu của đề tài 4 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. Khái niệm nhân giống in vitro 5 1.2. Nguồn carbon 5 1.3. Giới thiệu một vài nguồn carbon .6 1.3.1. Glucose .6 1.3.2. Fructose 8 1.3.3. Lactose 9 1.3.4. Manitol 11 1.3.5. Sorbitol 12 1.4. Vai trò của nguồn carbon cho sự tăng trưởng và phát triển của cây trong nuôi cấy in vitro 14 iii
1.4.1. Giới thiệu vai trò của nguồn carbon trong nuôi cấy in vitro 13 1.4.2. Vai trò của nguồn carbon cho sự tăng trưởng và phát triển của cây trong nuôi cấy in vitro 16 1.5. Ảnh hưởng của nguồn carbon trong nuôi cấy in vitro 18 1.6. Tình hình sản xuất, giá trị kinh tế hoa lan trên thế giới và Việt Nam 20 1.6.1. Tình hình sản xuất lan trên thế giới .20 1. 6.2. Tình hình sản xuất lan ở Việt Nam 21 1.6.3. Tình hình sản xuất lan Vũ nữ 23 1.7. Giới thiệu về lan Vũ nữ 23 1.7.1. Phân loại khoa học 23 1.7.2. Nguồn gốc và sự phân bố 24 1.7.3. Đặc điểm hình thái sinh học 25 1.7.4. Điều kiện sinh thái của lan Vũ nữ 27 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 30 2.1. Địa điểm tiến hành đề tài 30 2.2. Vật liệu nghiên cứu 30 2.2.1. Vật liệu 30 2.2.2. Môi trường nuôi cấy 30 2.2.3. Điều kiện thí nghiệm 30 2.3. Phương pháp 31 2.3.1. Cách pha môi trường 31 2.3.2. Hấp khử trùng 31 2.4. Bố trí thí nghiệm .32 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) .32 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight 33 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của lactose lên khả năng sinh trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) .33 iv
2.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) 34 2.4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của sorbitol lên khả năng sinh trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) .35 2.5. Chỉ tiêu theo dõi .36 2.6. Thống kê và xử lý số liệu 36 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .37 3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) .37 3.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) .44 3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) 51 3.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) .58 3.5. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của sorbitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) .64 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .73 4.1. Kết luận 73 4.2. Kiến nghị 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO 75 v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT EU European Union Tp. HCM Thành phố Hồ Chí Minh DNA Deoxyribonucleic acid P Phường Q Quận MS Murashige và Skoog (1962) NAA Naphthyl acetic acid BA 6-benzylaminopurine 2,4-D 2,4-dichlopophenoxyacetic acid vi
DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) 32 Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) 33 Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) .34 Bảng 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) 35 Bảng 2.5. Khảo sát ảnh hưởng của sorbitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) .35 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của đường glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight sau 12 tuần nuôi cấy 38 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của đường fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight sau 12 tuần nuôi 45 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của đường lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight sau 12 tuần nuôi cấy 53 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của đường manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight sau 12 tuần nuôi cấy 59 vii
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của đường sorbitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight sau 12 tuần nuôi cấy 66 viii
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Lan Vũ nữ 24 Hình 1.2. Rễ của lan Vũ nữ 25 Hình 1.3. Thân của lan Vũ nữ 26 Hình 1.4. Hoa lan Vũ nữ 27 Hình 3.1. Ảnh hưởng của đường glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ đường glucose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 40 Hình 3.2. Ảnh hưởng của đường glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ đường glucose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 41 Hình 3.3. Ảnh hưởng của đường fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với nồng độ đường fructose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 47 Hình 3.4. Ảnh hưởng của đường fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với nồng độ đường fructose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 48 Hình 3.5. Ảnh hưởng của đường lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với ix
nồng độ đường lactose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 55 Hình 3.6. Ảnh hưởng của đường lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với nồng độ đường lactose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 56 Hình 3.7. Ảnh hưởng của đường manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (D0; D1; D2; D3; D4; D5 tương ứng với nồng độ đường manitol là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 61 Hình 3.8. Ảnh hưởng của đường manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (D0; D1; D2; D3; D4; D5 tương ứng với nồng độ đường manitol là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 62 Hình 3.9. Ảnh hưởng của đường sorbitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (E0; E1; E2; E3; E4; E5 tương ứng với nồng độ đường sorbitol là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 68 Hình 3.10. Ảnh hưởng của đường sorbitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (E0; E1; E2; E3; E4; E5 tương ứng với nồng độ đường sorbitol là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 69 x
DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của đường glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ đường glucose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 39 Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của đường fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với nồng độ đường fructose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 46 Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của đường lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với nồng độ đường lactose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 54 Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của đường manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (D0; D1; D2; D3; D4; D5 tương ứng với nồng độ đường manitol là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 60 Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của đường sorbitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (E0; E1; E2; E3; E4; E5 tương ứng với nồng độ đường sorbitol là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 67 xi
MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Tình hình kinh tế trên thế giới trong những năm gần đây biến động khá phức tạp. Nền kinh tế của Việt Nam cũng chịu nhiều ảnh hưởng. Đến năm 2015, nền kinh tế nước ta mới có sự chuyển biến. Trong đó, ngành nông nghiệp là ngành phát triển mạnh mẽ. Trong đầu năm 2015, ngành nông nghiệp đã tăng đáng kể và chiếm tỷ trọng lớn nhất (71%) trong nền kinh tế Việt Nam. Cùng với những thành tựu đạt được trong nền sản xuất nông nghiệp, ngành sản xuất hoa lan cũng có những bước tiến đáng kể. Hiện nay lan Vũ nữ nói chung và các loại lan khác nói riêng đang được xem là cây trồng mang lại hiệu quả kinh tế cao. Hoa lan là loại cây mang lại nhiều lợi nhuận cho các trung tâm, doanh nghiệp cũng như nhiều hộ gia đình nhờ việc cung cấp trong nước và xuất khẩu ra nước ngoài. Nhiều nước trên thế giới kinh doanh xuất khẩu hoa lan như: Đài Loan, Nhật Bản, Hà Lan, Mỹ, Singapore, Thái Lan, Malaysia, Philippin, Indonesia, Trong đó, Thái Lan là nước điển hình về trồng và xuất khẩu hoa lan. Diện tích trồng Lan lên đến 3,718 ha, đứng đầu bảng là 2 loại Derobium và Mokara; kế đến là Oncidium, Aranda, Arachinis, Vanda, Ascodenda, Catteya, Trong đó, Thái Lan là nước điển hình về trồng và xuất khẩu hoa lan. Diện tích trồng Lan lên đến 3,718 ha, đứng đầu bảng là 2 loại Derobium và Mokara; kế đến là Oncidium, Aranda, Arachinis, Vanda, Ascodenda, Catteya, Ở Việt Nam, các vùng trồng hoa lan phổ biến như Tây Nguyên, Đà Lạt, Yên Bái, Sa Đéc, Tp. Hồ Chí Minh, nhưng tập trung chủ yếu ở Đà Lạt (Địa Lan), Tp. Hồ Chí Minh (Denrobium, Mokara, Vanda, Oncidium, ) với diện tích khá khiêm tốn khoảng 200 ha chỉ bằng 5,4% so với Thái Lan. Thái Lan xuất khẩu đến 38 nước trên thế giới trong đó có Việt Nam, đạt giá trị 104 triệu USD (2009). Trong khi đó Tp. Hồ Chí Minh với 168 ha Lan, sản lượng hàng năm mới chỉ giải quyết được khoảng 30% nhu cầu tại chỗ. Một vài công ty cũng xuất khẩu đến Mỹ, Nhật với Mokara cắt cành, tuy chất lượng đạt yêu cầu nhưng giá thành khá cao nên khó có thể cạnh tranh với Thái Lan. Nếu phải xuất một lượng lớn trong thời gian dài theo hợp đồng thì nước ta không thể đáp ứng được. 1
Nhân giống in vitro đã được chứng minh là một công nghệ tiềm năng cho sản xuất quy mô lớn các loài thực vật (Wawrosch et al., 2001; Martin, 2003; Azad et al., 2005; Hassan và Roy, 2005; Hassan et al., 2009). Lan Vũ nữ là loại lan có hoa nhỏ mọc thành từng chùm, đẹp, bền với nhiều màu sắc và hoa văn phong phú, nhưng lại là loài sinh trưởng chậm và là loài rất khó nhân giống, thường cho hệ số nhân giống thấp trong vườn ươm và rất dễ nhiễm bệnh. Để có số lượng lớn cây giống đồng đều, chất lượng tốt đáp ứng nhu cầu thị trường còn gặp nhiều khó khăn. Trong những năm gần đây, công nghệ lai giống kết hợp gieo hạt trong ống nghiệm nhằm đem đến sự đa dạng về màu sắc, cấu trúc, kích thước hoa sau mỗi thế hệ lai. Tuy nhiên, việc nhân giống bằng phương pháp gieo hạt này mang tính ngẫu nhiên, thu được cây có tính trạng không yêu thích và gần như không thể có được cây con cho hoa đẹp như cây mẹ. Vì vậy, hiện nay các nhà nuôi cấy mô trong nước cũng như trên thế giới sử dụng phương pháp nuôi cấy mô in vitro cho tỷ lệ thành công cao mà vẫn tạo được dòng cây ổn định về mặt di truyền. Trong nuôi cấy in vitro, đường là nguồn carbon quan trọng đối với quá trình nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Mô và tế bào thực vật sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng do không quang hợp đầy đủ trong điều kiện thiếu sự trao đổi khí với bên ngoài và kích thước mô cấy nhỏ vì vậy việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn carbon hữu cơ là điều bắt buộc cho các hoạt động biến dưỡng của tế bào, để giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp các chất hữu cơ, giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối. Nó đã được chứng minh rằng nồng độ đường ban đầu có thể ảnh hưởng đến các thông số khác nhau trong quá trình nuôi cấy tế bào thực vật, như tỷ số tăng trưởng, năng suất của sự trao đổi chất thứ cấp. Mô thực vật có khả năng hấp thụ một số đường khác nhau như đường sucrose, glucose, fructose, malnose, galatose, lactose, manitol, sorbitol, thậm chí tinh bột cũng được bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy mô. Vì vậy tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon lên sự sinh trưởng, phát triển của lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight in vitro” nhằm tìm ra nguồn carbon và nồng độ thích hợp cho việc nhân chồi, tạo cây hoàn chỉnh và gia tăng chất lượng cây giống. 2
2. Mục đích nghiên cứu Khảo sát ảnh hưởng của đường đơn (glucose, fructose), đường đôi (lactose) và đường đa (manitol, sorbitol) lên sự tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) trong nhân giống in vitro. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight). Phạm vi nghiên cứu: bố trí thí nghiệm với các nồng độ khác nhau của các nguồn carbon (glucose, fructose, lactose, manitol và sorbitol) nhằm tìm ra nồng độ thích hợp nhất cho sự tăng trưởng của lan Vũ nữ. 4. Phương pháp nghiên cứu Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố. Các nghiệm thức thí nghiệm được lặp lại 3 lần, ghi nhận kết quả trung bình. Các số liệu thu thập được xử lý thống kê bằng phần mềm SAS 9.0 và chương trình Microsoft Excel 2010®. 5. Kết quả đạt được - Xác định được nồng độ đường glucose thích hợp cho khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) sau 12 tuần nuôi cấy. - Xác định được nồng độ đường fructose thích hợp cho khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) sau 12 tuần nuôi cấy. - Xác định được nồng độ đường lactose thích hợp cho khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) sau 12 tuần nuôi cấy. - Xác định được nồng độ đường manitol thích hợp cho khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) sau 12 tuần nuôi cấy. - Xác định được nồng độ đường sorbitol thích hợp cho khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) sau 12 tuần nuôi cấy. 3
6. Kết cấu của đề tài Đề tài bao gồm các chương sau: Chương 1: Tổng quan tài liệu Chương 2: Vật liệu và phương pháp Chương 3: Kết quả và thảo luận Chương 4: Kết luận và kiến nghị 4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái niệm nhân giống in vitro Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vô trùng. Nuôi cấy mô tế bào thực vật hay còn gọi là nuôi cấy in vitro là công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành công nghệ khoa học. Nhờ áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần so với tự nhiên. Do đó tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng duy truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa giống mới vào sản xuất. Hơn nữa dựa vào kỹ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản nhiều giống cây trồng quý hiếm để phục hồi giống cây trồng. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật vô trùng được đặt trong môi trường dinh dưỡng thích hợp. Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này sinh ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền để nhân giống. 1.2. Nguồn carbon Nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật thường được cung cấp dưới dạng carbonhydrate, với những loại đường phổ biến như saccharose và glucose. Chất nền carbon vừa tham gia tổng hợp các thành phần của tế bào vừa cung cấp năng lượng đòi hỏi cho quá trình sinh trưởng và tồn tại của tế bào. Nó cũng cung cấp carbon cần thiết cho sự hình thành sản phẩm thông qua trao đổi trung gian Sự chuyển hóa của carbonhydrate bởi tế bào thực vật bao gồm con đường pentose phosphate, glycolysis và chu trình acid citric, mà cuối cùng sản xuất các tiền thân của các hợp chất thứ cấp. Nguồn carbon thông dụng nhất là saccharose, nồng độ thích hợp 2 – 3%. Gautheret (1959) cho rằng đối với phần lớn các mô và tế bào nuôi cấy, đường 5
saccharose và glucose là nguồn carbon tốt nhất, ở một số trường hợp đặc biệt cũng có thể dùng fructose, galactose và maltose để thay thế. Trong nuôi cấy dịch treo tế bào dừa cạn (C. roseus), khi thay đổi hàm lượng đường sucrose cho thấy có hiệu quả kích thích tích lũy alkaloid ở các nồng độ khác nhau Nguồn carbon được xem là yếu tố quan trọng trong sự trao đổi chất của tế bào thực vật, ảnh hưởng đến sự tích lũy alkaloid ở nuôi cấy tế bào huyền phù cây mộc hoa trắng (Holarrhena antidysenterica), anthocyanin từ tế bào huyền phù cây nho (V. vinifera), và shikonin khi nuôi cấy tế bào L. erythrorhizon. Khi nuôi cấy tế bào huyền phù nhân sâm (Panax spp) để sản xuất đồng thời ginseng saponin và ginseng polysaccharide, cả hai chất này đều có khả năng chống ung thư và có hoạt tính miễn dịch, sự thay đổi saccharose trong môi trường nuôi cấy cho thấy có ảnh hưởng lớn đến việc cải thiện hiệu suất của quá trình nuôi cấy. 1.3. Giới thiệu một vài nguồn carbon 1.3.1. Glucose Glucose là một monosaccharide có nhiều trong các loại trái cây chín. Glucose được Andreas Marggraf trích ly đầu tiên từ trái nho khô vào năm 1747. Tên glucose được Jean Dumas đặt vào năm 1838, tên glucose xuất phát từ tiếng Hy Lạp Glycos có nghĩa là đường hay ngọt. Cấu tạo của glucose được Emil Fisher khám phá vào khoảng thời gian cuối thế kỉ 19 đầu thế kỉ 20. Được tạo ra nhờ quá trình quang hợp của cây xanh dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời. Là thành phần quan trọng cố định trong máu (0,1 g/l), cung cấp năng lượng. Cơ thể dự trữ ở gan dưới dạng glycogen, nếu dư còn có thể tích trữ ở da dưới dạng mỡ nhờ chuyển hóa của insulin. Khi cơ thể hoạt động, dạng dự trữ sẽ chuyển hóa ngược lại thành glucose đồng thời phóng năng lượng. ➢ Tính chất vật lý - Khả năng kết tinh khó hơn saccharose - Tỉ trọng 1,54 g/cm3 6
- Dạng nóng chảy 146 – 150 độ C - Tinh thể không màu - Cấu trúc tinh thể - Hút ẩm mạnh hất thu 15% nước - Tồn tại chủ yếu ở dạng vòng pyran do sự nối vòng xảy ra giữa nhóm CHO (C1) và OH (C6). Do sự nối vòng này làm xuất hiện 1 trung tâm chiral nên tạo thêm 2 đồng phân quang học mới. 2 đồng phân này có thể chuyển đổi qua lại với nhau và thực tế trong không gian chúng không phẳng nên Haworth đã đề nghị không gian dang ghế và dạng thuyền cho glucose, trong đó thường gặp nhất là dạng ghê. - Trong dung dịch nước, glucose có thể tồn tại và chuyển hóa qua lại giữa 3 dạng (một dạng thẳng và 2 dạng vòng). Trong đó dạng vòng chiếm nhiều hơn. ➢ Tính chất hóa học a. Phản ứng oxi hóa khử Các tác nhân oxi hóa thường gặp: HIO4 dung dịch thuốc thử fehling, dung dịch brom, acid nitric b. Tham gia phản ứng khử Glucose có khả năng tham gia phản ứng khử tạo sorbitol hay acid glucose c. Phản ứng thế Glucose có thể tác dụng với 3 phân tử phenyl hydrazine tạo osazone Dựa vào hình dạng tinh thể oaone có thể xác định có mặt của glucose d. Phản ứng tạo liên kết glycoside Nhóm OH của glucose dễ dàng tham gia tạo liên kết với nhóm OH của các rượu khác nên được gọi là nhóm OH glycoside và liên kết tạo thành được gọi là liên kết glycoside. Ngoài ra các phân tử đường đơn còn có thể tạo ra liên kết dạng S-glycoside, O-glycoside, N-glycoside. Điều này giúp tạo các chất có hoạt tính hóa học khác nhau như protein, cellulose 7
e. Phản ứng lên men f. Phản ứng caramel g. Phản ứng với nito ➢ Nguồn gốc Có trong hoa quả chín và đặc biệt là nho chính nên đặc biệt được gọi là đường nho Phổ biến ở cả động vật lẫn thực vật. 1.3.2. Fructose ➢ Giới thiệu về fructose - Có cùng công thức phân tử với glucose nhưng khác về công thức cấu tạo - Là loại đường có nhiều trong trái cây - Khi ăn nhiều fructose và không có mặt glucose, fructose sẽ gây hiện tượng thẩm thấu (hút nước qua thành ruột non), vì thế fructose có tác dụng như một loại thuốc xổ. - Fructose có thể hấp thu trực tiếp qua cơ thể mà không cần đến insulin như glucose ➢ Tính chất vật lý fructose - Kết tinh trong H2O thì fructose có hình kim, tinh thể 2C6H12O6.H2O - Dễ tan trong nước - Quay mặt phẳng ánh sáng phân cực sang trái, D-Fructose = -92 và beta D- - Fructose = -133.5 - Tỉ trọng 1.047 g/cm3 o - Tnc = 102 – 104 C - Là gluxit có độ ngọt cao nhất - Hút ẩm rất mạnh hấp thu 30% nước. ➢ Tính chất hóa học - Cũng là đường khử như glucose nên tính chất hóa học giống nhau - Fructose dễ bị caramel hóa hơn glucose 8
- Một phân tử fructose có thể kết hợp với một phân tử glucose để tạo một phân tử saccharose và loại phân tử H2O ➢ Nguồn gốc - Hình thành do sự thủy phân của saccharose dưới tác dụng của enzyme invertase - Hình thành do sự chuyển hóa glucose - Có trong mật hoa, quả 1.3.3. Lactose ➢ Giới thiệu Lactose được tìm thấy trong sữa, các sản phẩm từ sữa như phomat, sữa chua. Lactose là một dạng đường có trong sữa động vật. Lactose khi vào đến ruột sẽ chia ra thành đường glucose và galactose nhờ vào một yếu tố có tên là Lactose (tên khoa học là Beta-D-galactosidase hay Lactase-phlorizin hydrolase), yếu tố này thường có tại thành của ruột non. ➢ Cấu tạo Lactose là một disacaride bao gồm một β-D-galactose và một β-D- glucose được liên kết với nhau qua liên kết β 1-4 glicozide. Lactose chiếm khoảng 2-8% về khối lượng. Công thức phân tử: C12H22O11 Tên hệ thống của nó là β-D-galactopiranozyl-(1↔4) β-D-glucopiranose. Dạng bền nhất của lactose là : C12H22O11.H2O (α-lactose monohydrate) Lactose tồn tại ở 2 dạng α và β. Ở 20oC, α-lactose chiếm 40% và β- lactose chiếm 60%. Lactose tồn tại ở 2 dạng tự do và liên kết với các gluxit và protein khác. Tỷ lệ lactose tự do/lactose liên kết là 8/1. ➢ Tính chất vật lý • Độ hòa tan 9
Ở nhiệt độ thường, lactose hòa tan trong nước ít hơn saccarose 10 lần, nhưng ở 100oC thì độ hòa tan của nó xấp xỉ saccarose Lactose có độ hòa tan là 1/4,63 tức là 0,216 g lactose tan hoàn toàn trong 1 ml nước. Độ tan trong nước là 18,9049 ở 25oC, 25,1484 ở 40oC và 37,2149 ở 60oC trong 100 g dung dịch Độ tan của lactose trong etanol là 0,0111g ở 40oC và 0,0270 ở 60oC trong 100g dung dịch. • Nhiệt độ nóng chảy α-lactose: 201,6oC β-lactose: 252,2oC • Độ quay cực α-lactose: 89,4oC β-lactose: 35oC • Độ kết tinh Lactose kết tinh chậm, tinh thể cứng và có nhiều dạng tinh thể. Vitamin B2 có thể ức chế sự kết tinh của lactose. • Độ ngọt Độ ngọt của lactose chỉ bằng 1/6 saccarose ➢ Tính chất hóa học • Phản ứng thủy phân Khi thủy phân cho 2 phân tử đường đơn là galactose và glucose • Sự biến tính của lactose Gia nhiệt đến 100oC không làm thay đổi lactose. Ở nhiệt độ cao hơn, xảy ra sự biến màu do sự xuất hiện các melanoide tạo thành khi các acid amin của sữa tác dụng với lactose. Ngoài ra, khi ở nhiệt độ cao hơn 100oC, lactose bị phân giải một phần, tạo thành các acid lactide, acid formide, mà kết quả làm tăng độ chua của sữa lên 1 - 2o T. 10
Khi gia nhiệt trên 100oC thì lactose sẽ bị biến đổi. Đầu tiên là tạo thành lactulose, sau đó là sự phân giải đường tạo ra một loạt các sản phẩm của sự phân giải này, kết quả làm cho sữa có màu nâu. Sự biến tính này là do phản ứng giữa lactose với protein, với các acid amin tạo thành hợp chất không bền melanoit. Người ta cho rằng, đầu tiên sự tạo thành phức đường-amin. Sau đó có sự chuyển nhóm trong phân tử này, kết quả làm xuất hiện các lactulose. Các chất này không có màu. Tiếp đó phức bị phân giải tạo thành các hợp chất cacbonyl, cuối cùng là các hợp chất cacbonyl này ngưng tụ với các acid amin polypeptide và protein tạo thành hợp chất có màu nâu-melanoide. Sự tạo thành melanoide còn có thể xảy ra khi bảo quản sữa bột thời gian dài ở nơi có độ ẩm cao. Đó là do các nhóm acid amin tự do đã tác dụng với lactose. 1.3.4. Manitol Mannitol là một đồng phân của sorbitol, độ ngọt vào khoảng 50% saccharose, với một số tính chất ưu điểm tương ứng: - Hương vị thơm ngon, vị ngọt tươi mát, dịu nhẹ, dễ chịu, thường được ứng dụng để giảm thiểu vị đắng trong thực phẩm. - Chất tạo ngọt năng lượng thấp chỉ khoảng 1.6 calories/gram - Không gây sâu răng - An toàn sử dụng cho có bệnh nhân tiểu đường trong chế độ ăn của họ. Mannitol tồn tại lượng lớn trong thiên nhiên, ở các dịch tiết từ thực vật, tảo biển và nấm tươi. Nó thường được tổng hợp bởi hydro hóa syrup đường tương ứng. Trên thị trường, mannitol thường được bán ở dạng bột và hạt. Không như sorbitol, mannitol không hút ẩm, vì lý do này, nó thường dùng là bột bụi bao kẹo cao su, tránh kẹo cao su dính vào thiết bị và hàm bao trong quá trình sản xuất. Ngoài ra, mannitol còn thấy trong chocolate, chất tạo mùi cho kem. Ngoài ra, tính ổn định và mùi hương dễ chịu của mannitol thường ứng dụng trong dược phẩm và thuốc nén dạng viên. 11
1.3.5. Sorbitol Sorbitol được phát hiện bởi một nhà hóa học người Pháp trong các quả nho ở tro núi lửa vào năm 1872. Nó là thành phần tự nhiên trong một số loại trái cây. Ngày nay, sorbitol được tổng hợp bằng cách hydro hóa glucose và tồn tại ở cả hai dạng tinh thể và chất lỏng. Sorbitol được sử dụng trong thực phẩm nhằm ngăn cản sự mất độ ẩm. Sự ổn định kết cấu của sorbitol được ứng dụng nhiều trong sản xuất bánh kẹo, chocolate, các sản phẩm cần duy trì tính cứng và giòn. Đặc biệt trong các sản phẩm sấy, sorbitol góp phần duy trì sự tươi mới trong quá trình bảo quản. Sorbitol rất ổn định và khá trơ về mặt hóa học, nó có thể chịu được nhiệt độ cao mà không tham gia phản ứng Millard. Đây là một ưu điểm. Ngoài ra, sorbitol còn kết hợp tốt với các thành phần thực phẩm khác như đường, protein, gel, dầu thực vật, Nó cũng có chức năng trong nhiều sản phẩm như kẹo cao su, kẹo, món tráng miệng đông lạnh, cookies, bánh, cũng như các sản phẩm chăm sóc răng miệng, bao gồm kem đánh răng và nước súc miệng. Với độ ngọt bằng khoảng 60% so với saccharose, cung cấp chỉ bằng 1/3 năng lượng so với đường cát, sorbitol được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ chế biến thực phẩm. Sorbitol có vị ngọt mát, dễ chịu, tan mịn trong miệng. Nó là chất làm ngọt hữu ích cho những người mắc bệnh tiểu đường, đồng thời an toàn sử dụng cho các thực phẩm ăn kiêng, năng lượng thấp. Sorbitol cũng được sử dụng trong chế biến mỹ phẩm và dược phẩm. Trong y học, sorbitol được sử dụng với tác dụng nhuận tràng, loại bỏ các ion kali natri ra khỏi cơ thể. Ngoài ra, còn có một số ứng dụng khác trong việc sản xuất nhiên liệu tên lửa, lẫn nguyên liệu sinh học cho các quá trình chuyển hóa trong cơ thể. 12
1.4. Vai trò của nguồn carbon cho sự tăng trưởng và phát triển của cây trong nuôi cấy in vitro 1.4.1. Giới thiệu vai trò của nguồn carbon trong nuôi cấy in vitro Tế bào thực vật, mô và các cơ quan được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy in vitro thực vật, trong đó việc bổ sung các chất dinh dưỡng rất cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của cây con trong nuôi cấy in vitro thực vật. Quá trình phát triển của công nghệ nuôi cấy mô, nhân giống cây trồng bị ảnh hưởng rất lớn bởi thành phần của môi trường nuôi cấy. Trong điều kiện in vitro, tế bào thực vật đòi hỏi các yếu tố tăng trưởng như chất dinh dưỡng, vi chất dinh dưỡng, các chất tăng trưởng thực vật, các vitamin, acid amin và các loại đường (nguồn carbon). Đường là yêu cầu cần thiết trong việc theo dõi hiện tượng dị dưỡng trong nuôi cấy in vitro thực vật/ mixotrophy của tế bào nuôi cấy để thay thế carbon. Trong khi đó cây trồng sử dụng quang hợp từ bầu khí cho sự tăng trưởng và phát triển. Kết quả dị dưỡng từ các hoạt động quang hợp thấp được coi là một trong những yếu tố hạn chế lớn đối với việc cải thiện hiệu quả vi nhân giống. Carbon rất cần thiết cho việc hoàn thành vòng đời của cây và sự vắng mặt của carbon có thể dẫn đến các cái chết của thực vật. Trên cơ sở khoa học nguồn carbon cao sẽ gây ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và phát triển hình thái của thực vật, một phần thông qua khả năng thẩm thấu khác nhau của thực vật sẽ ảnh hưởng đến tỷ lệ phân chia tế bào hoặc mức độ hình thành của tế bào. Ngoài ra, nguồn carbon thực hiện chức năng tổng hợp nhiều hợp chất, hoạt động như xây dựng khối đại phân tử và có thể kiểm soát một số quá trình phát triển trong tế bào. Koch chứng minh rằng đường kiểm soát sự biểu hiện của nhiều gen thực vật và kết nối các quá trình phát triển và trao đổi chất ở thực vật là rõ ràng. Do đó, carbohydrates là yếu tố rất quan trọng trong in vitro hình thái, quá trình này đòi hỏi năng lượng cao. Nhu cầu về nguồn đường còn phụ thuộc vào giai đoạn của sự phát triển và sự khác biệt giữa các loài. Một số loại đường chính khác cây có khả năng sử dụng bao gồm hexoses monosaccharide (glucose, 13
fructose, galactose và mannose), pentoses (arabinose, ribose, xylose), disaccharides (maltose, lactose, cellobiose, trehalose) và trisaccharide (raffinose). Các thực vật trong nuôi cấy in vitro phát triển chủ yếu bởi các thành phần của môi trường nuôi cấy. Đường trong môi trường nuôi cấy đã được coi là nguồn carbon duy nhất cho sự tăng trưởng của tế bào, chồi, và thậm chí cả cây con. Đường đưa vào con đường trao đổi chất và chuyển hoá năng lượng là yêu cầu cần thiết cho sự tăng trưởng của tế bào. Trong nuôi cấy mô thực vật, đường phục vụ như là một nguồn cung cấp carbohydrate để nuôi cấy tối ưu cho tế bào. Các thành phần chính của hầu hết các môi trường nuôi cấy mô thực vật là các muối khoáng và đường như nguồn carbon và nước. Đường là một thành phần rất quan trọng trong môi trường nuôi cấy việc bổ sung đường là cần thiết cho sự phát triển của cây con trong nuôi cấy mô vì cây quang hợp trong nuôi cấy mô là không đủ, do sự phát triển diễn ra trong điều kiện không phù hợp với quang hợp. Các carbohydrate ngoại sinh hỗ trợ sự phát triển của môi trường dinh dưỡng và đóng vai trò là nguồn năng lượng, carbohydrate ảnh hưởng đến sinh lý và sự khác biệt của mô. Nó cũng ảnh hưởng đến sự phát triển mô, cảm ứng nội tạng và sự khác biệt. Tác động của các carbohydrate khác nhau với các thành phần khác nhau của môi trường dinh dưỡng được báo cáo trong một số nghiên cứu. Sự tăng trưởng và nhân chồi in vitro bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, một trong số đó là nồng độ và loại nguồn carbon ngoại sinh được đưa vào môi trường. Các nguồn carbon là tác nhân năng lượng và thẩm thấu để hỗ trợ sự tăng trưởng của tế bào thực vật. Trong vi nhân đường chính là nguồn cung cấp cacbon cho cây phát triển. Do đó, carbohydrate rất cần thiết cho việc chuyển hóa trong môi trường nuôi cấy mô để nhân giống in vitro. Các cây con trong nuôi cấy in vitro thực vật đòi hỏi một nguồn carbohydrate đủ lớn để đáp ứng yêu cầu về năng lượng. Trong nuôi cấy mô thực vật việc cung cấp liên tục nguồn carbohydrate là điều cần thiết, hoạt động quang hợp trong nuôi cấy mô thực vật giảm là do cường độ ánh sáng thấp, độ ẩm cao và trao đổi khí hạn chế (Kozai, 1991). Sự tăng trưởng và nhân chồi in vitro bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố (Haque et al., 2003), một trong số đó là nồng độ và loại nguồn carbon ngoại sinh được đưa vào môi trường. Các nguồn carbon chính là năng lượng và là tác nhân thẩm thấu (De Neto và Otoni, 2003) để hỗ trợ 14
sự tăng trưởng của tế bào thực vật. Các loại và nồng độ đường thích hợp là cần thiết để thúc đẩy sự nảy mầm và tái sinh của cây. Một số báo cáo đã chứng minh rằng các nguồn carbon khác nhau sẽ ảnh hưởng đến hình thái của các loài thực vật khác nhau trong nuôi cấy (Fuentes et al., 2000). Carbohydrates kiểm soát hình thái bằng cách hoạt động như là nguồn năng lượng và thay đổi khả năng thẩm thấu của môi trường nuôi cấy, do đó làm thay đổi tính chất tế bào chẳng hạn như mở rộng, làm cứng, và thay đổi hình thái (Pritchard et al., 1991). Carbohydrate rất quan trọng đối với các thông số của cây như số chồi, chiều cao chồi, và chiều dài lá. Carbohydrates là một phân tử tín hiệu và đóng vai trò tương tự như chất điều hòa sinh trưởng. Vai trò của các carbohydrate trong phân chia tế bào và biệt hóa tế bào có liên quan chặt chẽ đến việc trao đổi và phát triển của cây (Rolland et al., 2006). Môi trường không bổ sung đường không sản xuất bất kỳ chồi mới. Tầm quan trọng của đường cho sự hình thành chồi đã được thể hiện rõ ràng trong các nghiên cứu và đã được chỉ định bởi sự thiếu tăng trưởng thực vật. Dường như trong một số trường hợp số lượng carbohydrate được lưu trữ trong các chồi là không đủ để hỗ trợ cho sự tăng trưởng, phát triển của các mô. Vì vậy, mô cơ quan bắt đầu gắn liền với việc sử dụng tinh bột tích lũy và đường tự do của môi trường (Thompson và Thorpe, 1987). Các tác dụng có hại của nồng độ cao hơn hoặc thấp hơn của nguồn cacbon là do sự tích tụ của các hợp chất phenolic trong môi trường ở nồng độ siêu tối ưu (Hilae và Te-Chato, 2005) và chưa có đủ năng lượng để thực hiện ra các quá trình trao đổi chất ở nồng độ thấp (De Klerk và Calamar, 2002). Hơn nữa, các loại đường được các tế bào hiểu như các tín hiệu hóa học, với nồng độ rất cao trong nuôi cấy in vitro làm tác nhân nhấn mạnh (Steinitz, 1999; Da Silva, 2004). 15
1.4.2. Vai trò của nguồn carbon cho sự tăng trưởng và phát triển của cây trong nuôi cấy in vitro Tăng trưởng và nhân nhanh trong nuôi cấy in vitro phụ thuộc vào một số yếu tố, trong đó, một trong những yếu tố góp phần vào sự phát triển là các loại đường và nồng độ nguồn carbon ngoại sinh cung cấp trong môi trường. Mặc dù, sucrose là một carbohydrate được sử dụng rộng rãi và phổ biến trong in vitro. Tuy nhiên, một số nhà nghiên cứu cho thấy rằng các carbohydrate khác nhau có thể tác dụng trên mô hình thái khác nhau. Sucrose thường được dùng trong nuôi cấy mô tế bào, phổ biến nhất là carbohydrate được tìm thấy trong nhựa cây ở mạch libe của nhiều loài thực vật do nó có giá rẻ và tiện dụng. Tuy nhiên, sucrose không phải luôn là carbohydrate tốt nhất bởi vì một số nguồn carbon bên cạnh sucrose cũng được chuyển vào trong cây. Có một số loài có thể phát triển trên carbohydrate khác tốt hơn so với sucrose. Trong nhiều trường hợp, carbohydrate thay thế là đường rượu (còn được gọi là polyol, một dạng hydro hóa carbohydrate), chẳng hạn như sorbitol, glycerol, mannitol. Nhiều nghiên cứu trước đây cho rằng sorbitol đóng vai trò tích cực đối với sự phát triển trong nuôi cấy in vitro của Rosaceae (họ hoa Hồng). Trong một nghiên cứu trước đó, sorbitol đã được sử dụng trong táo gốc ghép M 9 và đạt được kết quả tốt nhất khi sử dụng 3% sorbitol. Trong phép nhân giai đoạn của anh đào ngọt ngào 'Lapins', 'Edabriz' gốc anh đào và 'Pyrodwarf' lê gốc ghép thì sorbitol, fructose và glucose là nguồn carbon hiệu quả hơn nhiều so với đường sucrose. Khả năng tăng nhanh trong nuôi cấy in vitro của hai loại gốc ghép táo M 9 và M 26 khi được sử dụng ở các nguồn carbon khác nhau và cả hai loại gốc ghép táo cho thấy rằng khả năng tăng nhanh khi sử dụng ở sorbitol 35 g/l. Những kết quả trên cho thấy rằng sorbitol là một nguồn carbon tối ưu cho các bộ phận của Rosaceae và khẳng định vai trò của sorbitol đến sự tăng trưởng của chồi cây trong họ Rosaceae. Ảnh hưởng tích cực của sorbitol đến sự tăng trưởng và phát triển của táo và chồi hoa hồng được xem như là một sản phẩm quang hợp lớn. Stoop và Pharr cũng đã xác nhận các hoạt động của các enzyme trong thực vật có sorbitol như một sản phẩm quang hợp lớn. 16
Trong một số trường hợp, sucrose cũng cho kết quả tốt trong việc nhân nhanh họ Rosaceae trong ống nghiệm, điều này cho thấy rằng sucrose và sorbitol đều có kết quả như nhau cho các cây hoa Hồng. Theo Bianco và Rieger tất cả các loại đường trong tỷ lệ tương đối 4 : 1 có thể sử dụng cho sự sinh trưởng và phát triển trong Rosaceae. Bianco và Rieger tiếp tục mô tả sự tăng trưởng thông qua tốc độ tăng trưởng của một số bộ phận của chồi khi kết hợp giữa nguồn sorbitol và enzyme dị hóa sucrose trong mô chìm. Hầu hết các loại cây trồng đều có hiệu quả khi sử dụng sucrose như một nguồn carbon cho sự phát triển và nhân nhanh trong nuôi cấy in vitro vì nó là carbohydrate phổ biến nhất trong tổng hợp và vận chuyển của nhiều loài thực vật. Do đó, sucrose thường được sử dụng làm nguồn carbon trong tế bào thực vật, mô và môi trường trao đổi chất. Một số nghiên cứu cho thấy các tác động tích cực của sucrose ở nồng độ 3% thì tạo ra số lượng chồi tối đa cũng như số lượng chồi dài tốt của Eclipta alba để làm dược liệu, làm thuốc, và nứa gỗ sồi (Quercus suber). Các chiều dài chồi tối đa (4,87 ± 0,41 cm) và số chồi tối đa (61,43 ± 0,l9) trong nuôi cấy in vitro Pogostemon cablin Benth đã được quan sát thấy trên môi trường MS được thay thế bằng đường mía 20%. Đối với tăng trưởng tối ưu và phép nhân, 2 – 4% sucrose là tối ưu cho hệ thống nhân giống. Chiều dài chồi tối đa (11,0 ± 0,28 cm) Solanum nigrum đã đạt được trên môi trường MS bổ sung 4% sucrose. Solanum nigrum có thể là một quan điểm sẵn có mà sucrose có thể tạo thuận lợi cho sự tăng trưởng và phát triển do tác động của Solanum nigrum đối với việc điều chỉnh thẩm thấu tế bào. Buah và cộng sự sử dụng 5 và 10% nước mía cho quá trình trao đổi in vitro của Musa sp. để so sánh đường mía với các thí nghiệm sucrose và thấy đường mía 5% cho kết quả tốt hơn sucrose. Đường mía làm giảm biến đổi đường hơn so với sucrose và gia tăng tốc độ phân chia tế bào từ đó thúc đẩy tăng trưởng. Thành phần nguyên tố của đường mía, đường trái cây cho thấy sự hiện diện của các yếu tố như sắt, phosphorus, potassium và sodium, tương đối có sẵn trong sucrose có thể tiếp tục thúc đẩy sự tăng trưởng của cây con trong ống nghiệm. 17
Khi nuôi cấy loài Stevia rebaudiana, kết quả nghiên cứu cho thấy rằng loài này ưu tiên sử dụng nguồn carbon theo thứ tự là fructose, suctose, maltose, glucose cho việc tăng trưởng chồi. Glucose là nguồn carbon thích hợp cho sự tạo chồi trực tiếp ở loài Prunus mume. Manitol mang lại kết quả thấp đối với loài Prunus mume vì manitol là nguồn carbon mà thực vật khó có thể hấp thu và khả năng thẩm thấu qua các tế bào thực vật của manitol là rất thấp. Vì vậy, thực vật khó có thể hấp thụ manitol cho quá trình sinh trưởng và phát triển. Tuy nhiên, trong một số trường hợp như ô liu (Olea europaea) manitol cùng với sucrose thì cho kết quả rất tốt cho sự sinh trưởng và phát triển của cây giống và năng suất cây trồng. Rahman và cộng sự đánh giá ảnh hưởng của sucrose, glucose và maltose cho vi nhân khoai tây (Solanum tuberosum) và thấy rằng maltose thích hợp hơn hai tỷ lệ nhân giống kia. Trong trao đổi nút hạnh nhân đắng, glucose kích thích sản xuất tối đa chồi, trọng lượng tươi và chiều dài. Theo các báo cáo của các nhà nghiên cứu thì nồng độ các loại đường cao sẽ làm ức chế khả năng tăng trưởng và phát triển của cây. Ở nồng độ sucrose cao hơn trong môi trường nuôi cấy sẽ làm hoại tử mô và giảm mạnh khả năng tái sinh chồi của ba loại cây củ cải đường. Những kết quả này cũng phù hợp với những phát hiện của Kadota và cộng sự người đã tìm thấy nồng độ sucrose cao là có hại trong quả lê (Pyruscommunis), mà với nồng độ cao có thể làm suy giảm khả năng thẩm thấu của tế bào. Đường mía (Saccharaum officinarum) có được xác định là một nguồn thực vật tiềm năng có thể được sử dụng như một nguồn carbon thay thế. Trong các nghiên cứu trước đó, cây chà là (Phoenix dactylifera L) cũng đã được sử dụng như là một nguồn cacbon tiềm năng trong nuôi cấy in vitro. 1.5. Ảnh hưởng của nguồn carbon trong nuôi cấy in vitro Mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro sống chủ yếu dựa theo phương thức dị dưỡng. Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy nguồn carbon hữu cơ là điều bắt buộc. Nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật thường được cung cấp dưới dạng carbohydrate. Carbon vừa tham gia tổng hợp các thành phần của tế bào vừa cung cấp năng lượng cho quá trình sinh trưởng và 18
tồn tại của tế bào. Ngoài ra, carbohydrate cũng là nguồn cung cấp carbon cần thiết cho sự hình thành các sản phẩm trung gian thông qua trao đổi chất. Mô thực vật có khả năng hấp thu một số đường khác như maltose, galatose, lactose, mannose, thậm chí tinh bột, nhưng các loại đường này hầu như rất ít được sử dụng trong nuôi cấy tế bào và mô thực vật. Nguồn carbon thông dụng nhất đã được kiểm chứng là sucrose, nồng độ thích hợp phổ biến là 2 – 3%, song cũng còn phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy mà thay đổi có khi giảm xuống tới 0,2% (chọn dòng tế bào) và tăng lên đến 12% (cảm ứng stress nước). Gautheret (1959) cho rằng đối với phần lớn các mô và tế bào nuôi cấy, đường sucrose và glucose là nguồn carbon tốt nhất, trong một số trường hợp khác, có thể dùng fructose, galactose và maltose (Nguyễn Đức Thành, 2000). Sucrose vừa là nguồn cung cấp năng lượng vừa là một thành phần nguyên liệu trong sinh tổng hợp các chất thứ cấp. Tốc độ tăng trưởng sinh khối của tế bào luôn luôn liên quan trực tiếp với sự tiêu thụ sucrose (Rao và Ravishankar, 2002). Theo Omar và cộng sự (2004) trên môi trường mà tất cả các nguồn dinh dưỡng ở mức dư thừa, sự gia tăng nồng độ sucrose sẽ dẫn đến tăng sinh khối khô. Một số nghiên cứu khác như nuôi cấy tế bào cây Solanum eleagnifolium (Nigra et al., 1990), tế bào cây Solanum chrysotrichum (Villarreal et al., 1997), tế bào cây Psoralea corylifolia (Shinde et al., 2009) cũng nhận thấy tế bào tăng sinh khối khô cùng với việc tăng nồng độ sucrose. Tuy nhiên, khi nồng độ sucrose quá cao sẽ dẫn đến áp suất thẩm thấu vượt giới hạn cho phép của tế bào, vì thế ảnh hưởng xấu lên sinh trưởng của chúng (Bùi Văn Lệ và cộng sự, 2006). Abdullah và cộng sự (1998) khi nuôi cấy tế bào cây (Morinda elliptica) đã cho thấy, fructose 5% giúp tăng khả năng sinh truởng của tế bào. Felker và cộng sự (1989) khi nuôi cấy tế bào cây ngô nhận thấy, fructose được vận chuyển nhanh nhất, tiếp đến là glucose và sau cùng là sucrose. Một số nghiên cứu khác cũng thu được kết quả tương tự, chẳng hạn ở tế bào của các cây Solanum eleagnifolium (Nigra et al., 1990), Ficus deltoide (Ling et al., 2008) và Tinospora cordifolia. Mặc dù fructose có tác dụng tốt cho sinh trưởng tế bào của nhiều loài thực vật, tuy nhiên nếu sử dụng ở nồng độ cao nó sẽ gây ra ức chế chẳng hạn như 19
trường hợp nuôi cấy tế bào cây thuốc lá và cây Cinchona succirubrum (Nigra et al., 1990). Tiếp đến là glucose cũng thường được đưa vào môi trường nuôi cấy và cho hiệu quả tương đương sucrose (glucose thường dùng cho nuôi cấy protoplast), còn fructose cho hiệu quả kém hơn. Sucrose, trong khi khử trùng môi trường, bị biến đổi thành glucose và fructose. Trong tiến trình này, đầu tiên glucose sẽ được sử dụng và sau đó là fructose. Các carbohydrate khác như: lactose, galactose, rafinose, maltose, cellobiose, melibiose và trehalose cũng đã được thí nghiệm, nhưng tỏ ra kém hiệu quả và chỉ được dùng trong những trường hợp đặc biệt. Mannitol hoặc sorbitol hoàn toàn trung tính vì không thâm nhập vào bên trong tế bào, nhưng chúng được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy huyền phù và nuôi cấy protoplast với chức năng là chất ổn định áp suất thẩm thấu, hoặc tương tự sucrose chúng cũng được dùng để cảm ứng stress nước. Các mô và tế bào thực vật trong môi trường nuôi cấy ít có khả năng tự dưỡng và vì thế cần thiết phải bổ sung nguồn carbon bên ngoài để cung cấp năng lượng. Thậm chí các mô bắt đầu lục hóa hoặc hình thành diệp lục tố dưới các điều kiện đặc biệt trong suốt quá trình nuôi cấy đã không tự dưỡng carbon. Việc bổ sung nguồn carbon bên ngoài vào môi trường làm tăng phân chia tế bào và tái sinh các chồi xanh. 1.6. Tình hình sản xuất, giá trị kinh tế hoa lan trên thế giới và Việt Nam 1.6.1. Tình hình sản xuất lan trên thế giới Hiện nay nhu cầu về hoa lan trên thị trường thế giới rất lớn, ngày càng tăng và mang lại lợi nhuận kinh tế cao cho nhiều nước. Theo international Statistics Flowers and Plants, 2007, thị trường tiêu thụ hoa lan của khối EU rất hấp dẫn. Trong năm 2000, kim ngạch xuất nhập khẩu của hoa lan cắt cành và cây lan trên thế giới đạt 150 triệu USD, trong đó lan cắt cành đạt 128 triệu USD. Năm 2006, khối EU có sản lượng xuất khẩu hoa lan cho thế giới đạt 55 tỷ sản phẩm, mang lại giá trị kim ngạch xuất khẩu hoa lan là 73 tỷ EUR. Trong đó, Hà Lan là quốc gia duy nhất ở Châu Âu có ngành công nghệ trồng lan xuất khẩu, do trồng trong nhà kính nên Hà Lan có thể xuất khẩu hoa quanh năm, đồng thời 20
là đầu mối trung gian nhập khẩu hoa lan (37%) từ các nước trên thế giới. Năm 2006, Hà Lan xuất khẩu hoa lan chiếm 95% (52,049 ngàn sản phẩm) trên tổng sản lượng hoa lan trong khối EU. Mặc dù khối Châu Âu có sản lượng xuất khẩu hoa lan cao hơn so với các khối khác nhưng do nhu cầu tiêu thụ hoa lan trong khối EU cao nên cũng trong năm 2006 sản lượng nhập khẩu hoa lan từ các nước lên tới 155 tỉ sản phẩm, giá trị kim ngạch nhập khẩu đạt gần 90 tỷ EUR. Tại Châu Á, Thái Lan là nước xuất khẩu chủ yếu các chủng hoa lan nhiệt đới, đặc biệt là Oncidium. Ngoài ra cũng còn một số loài nổi tiếng khác như Aranda, Mokara, Vanda và Oncidium. Hơn 80% lan trên thị trường thế giới là từ Thái Lan. Chỉ với các loại hoa chủ lực là Dendrobium, Oncidium, Thái Lan đạt doanh thu mỗi năm gần 600 triệu USD từ giá trị xuất khẩu loại hoa này. Bên cạnh đó, Đài Loan là nước đứng đầu thế giới về sản xuất và xuất khẩu hoa lan bằng quy mô công nghệ cao, giá trị doanh thu từ sản xuất loại hoa này hàng năm khoảng 43 triệu USD. Trên thị trường thế giới, sản phẩm chủ yếu của hoa lan là hoa chậu, sản phẩm này có giá trị kinh tế cao gấp nhiều lần so với lan cắt cành. Hàng năm, Đài Loan sản xuất được 36 triệu cành lan. Trong đó, 12 triệu cành hoa lan được xuất khẩu ra các nước như: 3 triệu cành đến Nhật Bản; 3 triệu cành đến trung quốc; 2,5 triệu cành đến Hoa Kỳ và 3,5 triệu cành cho các quốc gia khác. Vào tháng 6/2004, Hoa Kỳ đã cấp giấy phép xuất khẩu lan cho Đài Loan trên thị trường Hoa Kỳ. 1. 6.2. Tình hình sản xuất lan ở Việt Nam Tại Việt Nam ngành sản xuất kinh doanh hoa kiểng nói chung và lan nói riêng trong vòng 10 năm trở lại đây rất phát triển với nhiều chủng loại. Diện tích trồng hoa ở Việt Nam hiện nay là 2.500 ha nhưng hoa lan chỉ chiếm 5 – 6 %. Nước ta bắt đầu sản xuất và thương mại hóa lan tập trung khoảng 6 năm trở lại đây nhưng tốc độ phát triển rất nhanh. Tại Tp. HCM, theo thống kê của sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông thôn Tp. HCM trong năm 2003, doanh số kinh doanh hoa lan, cây kiểng chỉ đạt 200 – 300 tỉ đồng nhưng đến năm 2005 đã tăng đến 600 – 700 tỷ đồng ngay từ những tháng đầu năm. Đến quý 2, năm 2013, diện tích vườn lan đã đạt 199,9 ha trên tổng số 2010 ha diện tích sản xuất hoa và cây kiểng với sản lượng và chủng 21
loại tăng khá mạnh trong diệp tết. Chủng loại hoa lan sản xuất trong diệp Tết của thành phố chủ yếu là Denrobium và Mokara; một ít Cattleya, Phalaenopsis, Oncidium, Vanda. Hoa lan (chậu và cắt cành) có giá trị sản xuất ước 350,0 tỷ đồng, chiếm 23,4% tổng giá trị sản xuất hoa, cây kiểng Tết, đang mang lại thu nhập cao trên nhiều nông hộ. Tuy vậy hiện nay có cây giống trong nước không đủ cung cấp cho sản xuất, nên các nhà vườn nhập cây giống từ nước ngoài như: Thái Lan, Đài Loan và Trung Quốc. Tại Đà Lạt nơi sản xuất hoa lan sớm nhất cả nước với nguồn cây giống phong phú và đặc chủng, được tìm trong rừng sâu, dẫn đầu cả nước về nguồn lợi lan rừng với 101 chi và 396 loài, chiếm 55,3% về chi và 76,5% về loài lan rừng của Việt Nam phân bố ở vùng rừng Lâm Đồng. Những Năm 1980, Đà Lạt đã xuất khẩu số lượng lớn cành hoa sang các nước Đông Âu. Những năm gần đây, nghành sản xuất hoa lan ở Đà Lạt đã hồi sinh và phát triển mạnh mẽ nhờ ứng dụng kỹ thuật công nghệ cao vào sản xuất. Với công nghệ hiện đại, đã giúp làm giảm chi phí cây trồng từ 40.000 – 70.000 đồng/gốc lan trước đây, xuống chỉ còn 4.000 – 7.000 đồng/gốc. Sử dụng công nghệ nuôi cấy mô in vitro và đặt biệt bằng phương pháp gây vết thương kết hợp nuôi cấy lỏng. Năm 2007, Phân Viện Sinh Học tại Đà Lạt (Nay là Viện Nghiên cứu khoa học Tây Nguyên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đã nhân giống thành công Hồng Hài – loài lan Hài duy nhất trên thế giới có hương thơm, được Tổ chức Bảo vệ động vật hoang dã thế giới đưa vào danh mục thực vật cần bảo vệ bởi chúng chỉ phân bố hẹp ở Việt Nam, khó sống và khó sinh sản. Với khí hậu khá lý tưởng, Đà Lạt là cổ máy điều hòa khổng lồ cho phép sản xuất địa lan trong thiên nhiên theo hướng công nghiệp với chi phí sản xuất chỉ bằng 1/10 so với các quốc gia phải trồng lan trong nhà kính, có hệ thống điều hòa nhiệt độ. Lan Đà Lạt đã và đang mở rộng thị trường ra nhiều châu lục, trong đó có những thị trường khó tính như Mỹ, Nhật Bản, Đài Loan, Nhiều doanh nghiệp trong và ngoài nước đang tiến hành khảo sát lập trang trại sản xuất hoa lan quy mô lớn bởi tiềm năng, triển vọng đầu tư tại Đà Lạt là rất lớn so với Trung Quốc và các nước Asean khác. 22
1.6.3. Tình hình sản xuất lan Vũ nữ Tp. HCM những năm gần đây được xem như là đơn vị đi đầu trong cả nước về sản xuất hoa lan cắt cành theo quy mô tập trung. Chiến lược phát triển nông nghiệp của Thành phố năm 2010 là sản xuất được 300 ha trồng hoa lan phục vụ cho nhu cầu nội địa và xuất khẩu. Hoa lan trồng ở Tp. HCM chủ yếu là giống Mokara nhập từ Thái Lan, hiện nay loại hoa này đang bị xuống giá mạnh do sản phẩm của chúng trên thị trường hoa trong nước gần đạt tới mức bão. Vì vậy nhiều nhà vườn, trang trại chuyển sang trồng hoa lan chậu có giá trị kinh tế cao hơn như Oncidium, Catleya, Đáp ứng cho thị trường. Lan Vũ nữ (Oncidium) là loài hoa đẹp, có giá trị kinh tế cao, là sản phẩm được cả thị trường trong nước và thế giới ưa chuyện. Đây là chủng hoa lan nhiệt đới, chu kỳ sinh trưởng ngắn, thời gian từ trồng đến ra hoa khoảng 18 – 20 tháng tùy thuộc vào điều kiện chăm sóc và vùng trồng, dễ áp dụng sản xuất theo quy mô công nghiệp. Vì vậy từ lâu lan Vũ nữ đã được rất nhiều nhà sản xuất hoa trong nước quan tâm. Tại Tp. HCM và các tỉnh lân cận có rất nhiều vườn trồng lan Vũ nữ với quy mô từ vài trăm đến vài nghìn cây. Tuy nhiên việc sản xuất các loại lan này ở nước ta hiện nay vẫn còn rất hạn chế do nhiều nguyên nhân: không có sự liên kết giữa các nhà vườn nên sản phẩm làm ra không tìm được thị trường tiêu thụ, giữa cung và cầu hợp lý, không đầu tư nê cây giống không đạt chất lượng tốt, giống mới không nhiều nên các nhà vườn thường nhập giống từ các nước như Thái Lan, Đài Loan, Ngoài ra, hàng năm việc nhập khẩu hoa từ các nước này ước tính tiêu tốn hàng triệu USD. So với các nước có ngành trồng lan phát triển như Đài Loan, Thái Lan, Thì ngành trồng lan của nước ta cần phải học hỏi nhiều và cần có chính sách phát triển hợp lý nhằm đem lại hiệu quả kinh tế cao hơn. 1.7. Giới thiệu về lan Vũ nữ 1.7.1. Phân loại khoa học Giới: Plantace (Thực vật) Ngành: Magnoliophyta (Ngọc Lan) Lớp: Liliopsida (Hành) 23
Phân lớp: Liliidae (Hành) Bộ: Orchidales (Lan) Họ: Orchidaceae (Lan) Chi: Oncidium (Lan Vũ Nữ) Loài: Oncidium sp. Hình 1.1. Lan Vũ nữ 1.7.2. Nguồn gốc và sự phân bố Cây lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight), hay Dancing lady là loại hoa lan có khoảng 700 loài phân bố rất rộng ở bắc bán cầu từ Mexico đến Tây Ấn độ và Nam bán cầu tới tận Balivia, Paraguay. Đa số các loài hoa Oncidium đều có giả hành dẹp hay hình trụ hoa, hoa thường nhỏ nhưng đặc biệt có cánh môi rất lớn, hoa thường có nhị màu vàng và có điểm đốm đỏ trên cánh hoa, ngoài ra còn có một số loài hoa mang màu đỏ hoặc trắng, Chúng có thể mọc thành chùm và đôi khi có phân nhánh, nhụy bông hoa rất dài, có thể khoảng 80 – 120 cm. Tùy theo giống có lá dầy và cứng hoặc dài và mềm như nhiều lan khác, lan Vũ nữ có hình dạng gần giống như nhau nhưng khác ở màu sắc và một vài đặc điểm như: Dò hoa có thứ dài gần 2 m như Oncidium falcipetatum, Oncidium carthagenense, Oncidium divarcatum và cũng có những loài cho dò hoa ngắn như Oncidium cherophorum. Mỗi dò, tùy loài, mang từ 30 đến 100 hoa. Có nhiều giống cho hoa to đến 4 – 5 cm. Oncidium thường nở hoa vào mùa xuân hay hạ, nhưng cũng có cây cho hoa vào mùa thu. Theo American Orchid Society thì việc phân loại chi Oncidium lại không đơn giản: Khi được phân loại vào thập niên 1800, chi Oncidium bao gồm hàng trăm loài lan, có hình dạng bên ngoài tương đối giống nhau. Năm 2004, các nghiên cứu và DNA do Mark Chase, tại Jodrell Laboratory của Royal Botanic Garden, Kew, London đã tìm ra nhiều khác biệt giữa các loài lan được nhóm chung này, sau đó so sánh thêm những chi tiết thực vật và cấu trúc của hoa, sự phân biệt càng chính xác hơn. Norris Williams và Mark Whitten tại Florida Museum of Natural History (Gainesville) cũng có những nghiên cứu nhận định tương tự: Chi Oncidium được định danh lại là Oncidium Alliance (liên nhóm), một nhóm lan có 700 loài nguyên giống cộng thêm trên 1000 loài lai tạo. Oncidium Alliance hiện tạm chia thành những chi phụ: Oncidium, Miltonia, 24
Miltionopsis, Odontoglossum, Rossioglossum, Zenlenkoa, Cirtochilum và Tolumnia. Chi chính thống Oncidium chỉ còn khoảng 150 loài. Một đặc điểm quan trọng là có thể lai giống giữa những cây tuy thuộc chi phụ nhưng chỉ cần thuộc liên nhóm Alliance. Sự lai tạo, qua nhiều thế hệ đã tạo rất nhiều loài mới, đa dạng hơn. Một số chi phụ trong Alliance hiện nay đang được các nhà thực vật tách riêng để tạo thành những chi riêng biệt như Cyrtochilum (120 loài), Psychopsis (5 loài), Tolumnia (35 loài), Zenlenkoa (1 loài duy nhất, được tách riêng từ 2001). 1.7.3. Đặc điểm hình thái sinh học ❖ Rễ Không phân chia thành rễ chính, rễ phụ, rễ nhánh hay lông hút một cách rõ ràng. Chúng thường có dạng hình tròn, vừa, có nhánh hoặc không phân nhánh. Màu sắc: màu trắng, đầu rễ có màu xanh, màu vàng trắng. Rễ thường mọc tràn ra ngoài chậu, bám lên giá thể hoặc là than mục, buông lơ lửng trong không khí, có lợi cho việc hút oxy và nước. Nhiều nghiên cứu cho thấy rễ lan Vũ nữ nói riêng cũng như rễ phong lan nói chung có khả năng quang hợp. Hình 1.2. Rễ của lan Vũ nữ Rễ của lan Vũ nữ cũng như một số loại lan khác thường có nấm cộng sinh. Do hạt của hoa lan nói chung đều không có nội nhũ, không được cung cấp đủ dinh dưỡng khi nảy mầm, trong điều kiện mầm tự nhiên, cần dựa vào các nấm cộng sinh để hút chất dinh dưỡng. trong quá trình sinh trưởng của cây, các loài nấm này sống cộng sinh tại rễ của cây lan để hỗ trợ lẫn nhau, vì thế rễ của cây lan còn được gọi là rễ nấm. Nên việc tưới và bón phân cho cây lan Vũ nữ cần cẩn 25
thận chính là vì trên rễ cây có nấm cộng sinh. Gốc cây lan có rễ khí sinh màu trắng, cây càng mọc khỏe rễ trắng càng nhiều. ❖ Thân Có nhiều đoạn phình lớn, tạo thành củ giả (giả hành). Đó là bộ phận dự trữ nước và chất dinh dưỡng để nuôi cây trong hoàn cảnh khô hạn khi sống bám trên cao. Củ giả hình thuôn dài. Kích thước của củ giả cũng rất biến động, tùy vào lúc sinh trưởng của lan. Đa số củ giả đều có màu xanh bóng, nên cùng với lá nó cũng làm nhiệm vụ quang hợp. Hình 1.3. Thân của lan Vũ nữ ❖ Lá Cây Lan Vũ Nữ cao 20 – 90 cm, lá hình kiếm, mỏng và có màu xanh nhạt, 2 - 3 lá mọc trên một củ giả hình trứng, lá mọc lệch thành hình quạt. ❖ Hoa Lan Vũ Nữ có 2 loại: hoa to và hoa nhỏ. Cành hoa mọc từ gốc vẩy giả, hoa mọc trên các nhánh ngắn của cành với nhiều màu sắc từ màu đỏ, hung nâu đến hồng, vàng, xanh hoặc trắng. Mỗi cây Lan Vũ Nữ 1 năm mọc 2 lần hoa, sau khi hoa tàn sức sống của cây suy yếu dần. 26
Hình 1.4. Hoa lan Vũ nữ 1.7.4. Điều kiện sinh thái của lan Vũ nữ ❖ Nhiệt độ Lan Vũ nữ có thể phát triển ở nhiệt độ tối thiểu 22 – 25oC ban ngày và 18oC vào ban đêm. Nhiệt độ lý tưởng để cây phát triển tốt là 25oC. Oncidium thích nghi được với biên độ sinh thái khá rộng, chúng có thể trồng được khắp nơi các tỉnh phía Nam, phía Bắc và trên vùng cao. Oncidium là cây cần độ ẩm cao, đặc biệt trong thời kỳ tăng vì trong suốt mùa sinh trưởng cây cần được tưới 3 lần/ngày vào mùa khô, 2 lần/ngày vào mùa mưa. Mùa nghỉ (sau khi trổ hoa) chỉ cần tưới nước cho cây một lần/ngày để duy trì sự sống. ❖ Độ ẩm Lan Vũ Nữ chịu ẩm cao, cần ẩm độ 50 – 80% nhưng không chịu nhiều nước. Giàn che lan cần phải thích hợp che được 70% nắng. Lan Vũ nữ cần nhiều ẩm hơn nước tưới. ❖ Ánh sáng Lan Vũ nữ cần ánh sáng yếu vì đây là loài ưa bóng mát. Tuy nhiên không trồng lan Vũ nữ ở nơi quá râm mát vì ánh sáng rất cần cho sự sinh trưởng và trổ hoa. Ánh sáng khuếch tán vừa phải rất tốt; nếu chiếu sáng được 12 – 16h mỗi ngày, 12h cho cây lớn và 16h cho cây nhỏ thì cây sẽ phát triển tốt hơn. 27
Trồng Vũ nữ trong nhà kính cần có hệ thống làm mát, ánh sáng nhân tạo thích hợp để lan phát triển tốt; còn trồng trong nhà thì cần để lan ở gần cửa sổ có ánh nắng hoặc không cũng được. ❖ Độ thông thoáng So với các loài lan khác, sự thông thoáng rất cần thiết cho lan Vũ nữ. Lan Vũ nữ hay bị bệnh thối nhũn lá (phỏng lá), sự thông thoáng giúp lá cây mau khô sau khi tưới và bộ rễ không bị úng nước nên hạn chế bệnh rất nhiều. Ở nước ta vào mùa mưa, lan Vũ nữ tăng trưởng mạnh, nhưng những giọt mưa nặng hạt có thể làm thối đọt cây; do đó để ngăn ngừa tình trạng trên lan cần phải được che chắn cẩn thận. Cần cung cấp đủ nước cho cây tránh sự héo rũ, nhăn lá vào mùa gió nhiều và mùa nắng. ❖ Nhu cầu nước tưới Lan Vũ nữ là cây thân có giả hành để dự trữ dinh dưỡng và nước, hơn nữa nước thường tập trung ở giả hành vì lan Vũ nữ có giả hành tương đối lớn, có lá nhiều nên diện tích tiếp xúc nhiều nên rất dễ thoát hơi nước và chúng không có mùa nghỉ vì thế phải cung cấp cho cây một lượng nước đầy đủ. Tránh để lan quá khô vào mùa nắng có thể tưới 3 lần/ngày: sáng, trưa, chiều. Chú ý khi tưới nước vào buổi trưa phải tưới thật đẫm đễ tránh nắng sẽ làm sốc cây lan. Mùa mưa thì tùy theo điều kiện thời tiết mà tưới nước cho phù hợp, có thể khoảng 10 ngày tưới một lần. Nên tưới vào buổi sáng để lá cây sẽ khô, tránh nước đọng vào ngọn, lá non dễ bị thối và cây sẽ chết. ❖ Dinh dưỡng Lan Vũ nữ cần dinh dưỡng thường xuyên, quanh năm vì không có mùa nghỉ. Khi tưới phân không nên tưới với nồng độ cao và đừng tưới lên ngọn cây, nhất là lúc lá non mới nhú ra từ đỉnh sinh trưởng. Tùy từng độ tuổi của cây mà ta có lượng phân cần bón với tỷ lệ NPK thích hợp. Ngoài việc dùng phân vô cơ, ta còn có thể tưới xen kẽ thêm phân hữu cơ với nồng độ loãng có pha thêm thuốc trừ nấm. 28
Lan Vũ nữ cần bón phân với nồng độ loãng và có thể tưới nhiều lần trong tuần. Có thể tưới thêm phân hữu cơ như: Bánh dầu, vitamin B1 kích thích ra rễ, Các chất dinh dưỡng cần thiết nhất là đạm (N), lân (P), potassium (K) và calcium (Ca). Sự thiếu các chất dinh dưỡng này có thể làm ảnh hưởng đến sự tăng trưởng, phát triển và làm giảm năng suất hoa. 29
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Địa điểm tiến hành đề tài Các thí nghiệm của đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật, Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường thuộc Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, 475A Điện Biên Phủ , P. 25, Q. Bình Thạnh, Tp. HCM. 2.2. Vật liệu nghiên cứu 2.2.1. Vật liệu Đối tượng nghiên cứu: dùng chồi của lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) trong phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật, Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại Học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh làm nguồn mẫu trong nghiên cứu này. 2.2.2. Môi trường nuôi cấy Môi trường cơ bản là MS (Murashige và Skoog, 1962). Các chất bổ sung bao gồm: - Chất điều hòa sinh trưởng thực vật: 2,4-D, NAA (naphatalenacetic acid), BA (6-Benzy-aminopurine). - Agar - Nguồn carbon: sucrose, glucose, fructose, lactose, manitol, sorbitol. - Nước dừa - Than hoạt tính 2.2.3. Điều kiện thí nghiệm Để đảm bảo điều kiện vô trùng, các thí nghiệm được thực hiện trong phòng nuôi riêng với các điều kiện: - Nhiệt độ: 25 ± 2oC. - Độ ẩm trung bình: 80 – 85% - Cường độ ánh sáng: 2500 – 3000 lux 30
- Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày. 2.3. Phương pháp 2.3.1. Cách pha môi trường ❖ Pha dung dịch mẹ Để tiết kiệm nguyên liệu và thời gian cho đề tài, ta cần pha dung dịch mẹ trước khi pha môi trường nuôi cấy. Pha dung dịch mẹ dựa vào môi trường khoáng MS (Murashine và Skoog, 1962). Các chất điều hòa sinh trưởng: Cân 0,1 g BA pha và hòa tan trong 1 ml NaOH 1N rồi cho vào bình định mức cùng nước cất vô trùng vừa đủ 100 ml, lượng dùng là 1 ml tương ứng cho 1 mg BA. Tương tự cho chất NAA. ❖ Pha môi trường nuôi cấy Bước 1: Tùy theo thể tích cần pha ta hút dung dịch mẹ đã pha sẵn gồm các khoáng đa lượng, vi lượng và nhóm vitamin. Cân đường và hút BA và NAA. Khuấy đều và hòa tan hoàn toàn các chất trong nước cất đã định sẵn. Bước 2: Định mức và đo pH 5,8 – 5,9 (điều chỉnh pH bằng NaOH 1N hoặc HCl 1N). Bước 3: Cân than hoạt tính và agar cho vào môi trường. Bước 4: Khuấy đều phối vào mỗi chai thủy tinh 30 ml cho bình 250 ml mỗi thí nghiệm sử dụng 18 bình. Bước 5: Ghi rõ ngày tháng và tên (ký hiệu) môi trường để tránh nhầm lẫn khi hấp khử trùng. 2.3.2. Hấp khử trùng ❖ Hấp khử trùng môi trường nuôi cấy Môi trường sau khi phân phối vào bình thủy tinh được cho vào nồi hấp vô trùng, chỉnh nhiệt độ ở 121°C và l atm, thời gian hấp khoảng 20 phút. Sau khi hấp xong chuyển môi trường đã hấp khử trùng sang phòng lưu giữ môi trường. Giữ 2 ngày ở 25°C để kiểm tra. ❖ Hấp khử trùng dụng cụ nuôi cấy Một số dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy mô như: kẹp lớn, nhỏ, dao, giá để dụng cụ, giấy, khăn lau, được gói bằng giấy báo và nylon chịu nhiệt. Sau đó được hấp khử trùng bằng nồi hấp vô trùng ở 121°C, l tm trong 20 phút. 31
Dụng cụ cấy sau khi hấp khử trùng được bảo quản trong phòng cấy. Tránh xảy ra sự tái nhiễm, như vậy ta có thể sử dụng mọi lúc khi cần. 2.4. Bố trí thí nghiệm 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) ➢ Mục đích thí nghiệm Thí nghiệm này được tiến hành nhằm mục đích xác định nồng độ glucose thích hợp lên khả năng sinh trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight). ➢ Tiến hành thí nghiệm Tiến hành cấy các chồi lan Vũ nữ lên môi trường MS với các nồng độ glucose khác nhau (bảng 2.1). Mẫu đối chứng được cấy vào môi trường MS có bổ sung 1 mg/l NAA; 2 mg/l BA, 30 g/l sucrose, 20% nước dừa, 9 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính (A0). Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) Nghiệm thức Nồng độ (g/l) A0 30 A1 10 A2 20 A3 30 A4 40 A5 50 32
2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) ➢ Mục đích thí nghiệm Thí nghiệm này được tiến hành nhằm mục đích xác định nồng độ fructose thích hợp lên khả năng sinh trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight). ➢ Tiến hành thí nghiệm Tiến hành cấy các chồi lan Vũ nữ lên môi trường MS với các nồng độ fructose khác nhau (bảng 2.2). Mẫu đối chứng được cấy vào môi trường MS có bổ sung 1 mg/l NAA; 2 mg/l BA 30 g/l sucrose, 20% nước dừa, 9 g/l agar, 1 g/l than hoạt (B0). Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) Nghiệm thức Nồng độ (g/l) B0 30 B1 10 B2 20 B3 30 B4 40 B5 50 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của lactose lên khả năng sinh trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) ➢ Mục đích thí nghiệm Thí nghiệm này được tiến hành nhằm mục đích xác định nồng độ lactose thích hợp lên khả năng sinh trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight). 33
➢ Tiến hành thí nghiệm Tiến hành cấy các chồi lan Vũ nữ lên môi trường MS với các nồng độ lactose khác nhau (bảng 2.3). Mẫu đối chứng được cấy vào môi trường MS có bổ sung 1 mg/l NAA; 2 mg/l BA, 30 g/l sucrose, 20% nước dừa, 9 g/l agar, 1 g/l than hoạt (C0). Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) Nghiệm thức Nồng độ (g/l) C0 30 C1 10 C2 20 C3 30 C4 40 C5 50 2.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) ➢ Mục đích thí nghiệm Thí nghiệm này được tiến hành nhằm mục đích xác định nồng độ mannitol thích hợp lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight). ➢ Tiến hành thí nghiệm Tiến hành cấy các chồi lan Vũ nữ lên môi trường MS với các nồng độ manitol khác nhau (bảng 2.4). Mẫu đối chứng được cấy vào môi trường MS có bổ sung 1 mg/l NAA; 2 mg/l BA, 30 g/l sucrose, 20% nước dừa, 9 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính( D0). 34
Bảng 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) Nghiệm thức Nồng độ (g/l) D0 30 D1 10 D2 20 D3 30 D4 40 D5 50 2.4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của sorbitol lên khả năng sinh trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) ➢ Mục đích thí nghiệm Thí nghiệm này được tiến hành nhằm mục đích xác định nồng độ sorbitol thích hợp lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight). ➢ Tiến hành thí nghiệm Tiến hành cấy các chồi lan Vũ nữ lên môi trường MS với các nồng độ sorbitol khác nhau (bảng 2.5). Mẫu đối chứng được cấy vào môi trường MS có bổ sung 1 mg/l NAA; 2 mg/l BA, 30 g/l sucrose, 20% nước dừa, 9 g/l agar, 1 g/l than hoạt( E0). Bảng 2.5. Khảo sát ảnh hưởng của sorbitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) Nghiệm thức Nồng độ (g/l) E0 30 E1 10 E2 20 E3 30 35
E4 40 E5 50 2.5. Chỉ tiêu theo dõi - Số lá (lá/cây) - Đường kính lá (mm) - Chiều dài lá (mm) - Số chồi (chồi/mẫu) - Chiều cao chồi (mm) - Số rễ (rễ/mẫu) - Chiều dài rễ (mm) 2.6. Thống kê và xử lý số liệu Xử lý số liệu thu được bằng phần mềm Microsoft Excel 2010® và phần mềm SAS 9.0. Tất cả các số liệu sau khi thu thập ứng với từng chỉ tiêu theo dõi, được thống kê và biểu diễn dưới dạng các giá trị trung bình cùng ký tự a,b, thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các mẫu tự khác nhau (a,b, ) chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. 36
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) sau 12 tuần nuôi cấy Chồi lan Vũ nữ được cấy trực tiếp vào môi trường MS sự phản ứng của chúng là khác nhau khi được nuôi cấy trên môi trường thạch MS có bổ sung 1 mg/l NAA; 2 mg/l BA; 9 g/l agar; 1 g/l than hoạt tính và nồng độ glucose tương ứng (10; 20; 30; 40; 50) mg/l. Trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường glucose lên khả năng hình thành chồi của lan Vũ nữ sau 12 tuần nuôi cấy. Theo quan sát, chúng tôi ghi nhận được: Sau 2 tuần nuôi cấy ở một số mẫu cấy bắt đầu phát triển chồi nhưng mẫu cấy chưa có sự phản ứng rõ rệt so với đối chứng. Đến tuần thứ 4 và thứ 5, các mẫu cấy ở nghiệm thức có sự khác biệt rõ rệt ở các nồng độ, mẫu cấy xuất hiện nhiều chồi hơn và kích thước tăng dần theo thời gian nuôi cấy với các chỉ tiêu theo dõi thể hiện nổi bật là số lá, chiều cao chồi, khối lượng chồi, số rễ, chiều dài rễ. Sự khác biệt về hình thái giữa các nghiệm thức bắt đầu từ tuần thứ 8 trở đi, các mẫu cấy tăng trưởng tốt, nhiều chồi, ở nghiệm thức A1; A2 và A3. Sức sống của mẫu cấy bị chậm lại ở nghiệm thức A0, A4 và A5, mẫu giảm dần sức sống so với các tuần đầu ở nghiệm thức thứ 5. Đến tuần nuôi cấy thứ 12, các mẫu cấy ở các nghiệm thức có sự khác biệt về hình thái rõ rệt. Chúng tôi tiến hành thu thập số liệu. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1; đồ thị 3.1; hình 3.1; hình 3.2. 37
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của đường glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight sau 12 tuần nuôi cấy. NT Nồng Khối Khối Số chồi Số lá Số rễ Đường Chiều Chiều Chiều Đặc điểm độ lượng lượng (chồi/mẫu) (lá/cây) (rễ/mẫu) kính lá Dài lá dài rễ cao cây (g/l) tươi (g) khô (g) (mm) (mm) (mm) (mm) Cây phát triển bình thường, rễ dài, lá to A0 30 0,41de 0,04de 5,67b 29,67d 10,00bc 3,33a 11,00abc 14, 00b 15, 00ab nhưng ít chồi và lá. Cây phát triển tốt, lá to và dài. A1 10 0,85b 0,07c 5,00b 50,67bc 13,00b 2,17b 15,00a 24,33a 19, 00a Cây phát triển xanh tốt, chồi nhiều, A2 20 1,38a 0,13a 10,33a 74,00a 23,67a 2,17b 8,00bc 12,00bc 18, 67a nhiều lá, nhiều rễ, rễ dài, lá nhỏ nhưng dày, cây cao. Cây phát triển không đều, ít chồi và lá, A3 30 0,60cd 0, 06cd 5,00b 44,67cd 5,00cd 1,83b 13,33ab 8, 00bc 18, 67a rễ nhiều mà ngắn. Cây phát triển không đều, nhiều A4 40 0,79bc 0,09b 11,67a 64,00ab 11,33b 1,67b 7,00c 9,33bc 17, 00a chồi, lá nhỏ, rễ ít và ngắn Cây phát triển chậm, ít chồi, lá nhỏ và A5 50 0,20e 0,03e 1,33c 6,67e 3,00d 1,33b 13,33ab 5, 67c 9,67b ít, rễ ngắn, cây thấp. Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, thì không có sự khác biệt về mặt thống kê.các mẫu tự khác nhau (a, b, ) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05 38
80 70 60 Trọng lượng tươi (g) Trọng lượng khô (g) 50 Số chồi (chồi/mẫu) Số lá (lá/cây) 40 Số rễ (rễ/ mẫu) Đường kính lá (mm) 30 Chiều dài lá (mm) Dài rễ (mm) 20 Chiều cao (mm) 10 0 A0 A1 A2 A3 A4 A5 Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của đường glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ đường glucose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 39
Hình 3.1. Ảnh hưởng của đường glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ đường glucose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 40
Hình 3.2. Ảnh hưởng của đường glucose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (A0; A1; A2; A3; A4; A5 tương ứng với nồng độ đường glucose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 41
Nhận xét và thảo luận: Từ kết quả thu nhận được ở bảng 3.1, biểu đồ 3.1, hình 3.1, hình 3.2 sau 12 tuần nuôi cấy in vitro các chồi cây đã phát triển. Các nghiệm thức khác nhau tỷ lệ phát sinh chồi khác nhau. Ở nghiệm thức A2, cây phát triển xanh, nhiều chồi, cao hơn so với nghiệm thức A0 với (18,67 > 15,00 mm), trọng lượng tươi đạt mức cao nhất trong 6 nghiệm thức, trọng lượng tươi của nghiệm thức A2 (1,384 g) gấp 3,34 lần A0 (0,414g). Trọng lượng khô ở nghiệm thức này là A2 là (0,132 g) cao hơn 3 lần so với A0 (0,044 g). Với nồng độ thích hợp thì tế bào thực vật được cung cấp đầy đủ thích hợp để phát triển cây hoàn chỉnh. Về mặt hình thái cây phát triển xanh tốt, nhiều lá (74,00 lá/cây), lá to và nhiều, rễ nhiều (23,67 rễ/mẫu), rễ dài (12,00mm). Tỷ lệ cây phát triển giảm dần ở các nghiệm thức A0, A1, A3, A4, A5. Ở nghiêm thức A0 cây phát triển bình thường, phát triển ổn định ở các chỉ tiêu. Ở nghiệm thức A1 cây phát triển tốt, cao hơn so với nghiệm thức A0 với (19,00> 15,00 mm), trọng lượng tươi ở nghiệm thức này là 0,845 g cao hơn 2,04 lần so với A0 (0,414 g). Trọng lượng khô ở nghiệm thức A1 là 0,069 g lớn hơn 1,57 lần so với A0 (0,044 g). Nhìn chung cây phát triển không đều. Ở nghiệm thức A3 cây phát triển không tốt, lá nhỏ và có nhiều lá úa vàng. Cây phát triển không đồng đều. Ở nghiệm thức A4 cây phát triển tốt, xanh, nhưng lá nhỏ (1,67 mm) và ngắn (7.00 mm). Ở nghiệm thức A5 ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng của chồi cây vì nồng độ đường khá cao có khả năng làm giảm hay thay đổi cân bằng các chất điều hòa tăng trưởng nội sinh trong cây, làm thay đổi áp suất thẩm thấu của môi trường, gây stress cho cây. Nhìn chung cây phát triển chậm ít chồi (1,33 chồi/mẫu), ít lá (6,67 lá/cây), lá nhỏ, rễ ngắn (5,67 mm). Loại và các nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy cho thấy những tác động đáng kể về số lượng chồi mỗi mẫu cấy tăng lên nhanh chóng về chồi, chiều dài và trọng lượng tươi của chồi. glucose được tìm thấy là nguồn carbon hiệu quả hơn so với sucrose. Số lượng chồi cao nhất của mỗi mẫu cấy tăng lên nhanh chóng, chồi (10,33) và trọng lượng tươi của chồi (1,384 g) thu được khi glucose 42
được sử dụng ở 20 g/l. Ngược lại, sự trao đổi, phát triển trên môi trường sucrose cho thấy phản ứng rất kém như số lượng tối đa chồi mỗi mẫu cấy tăng lên nhanh chóng, chồi (5,67) và trọng lượng tươi của chồi được tìm thấy là (0,414 g) tương ứng với nồng độ 30 g/l. Tăng nồng độ glucose dẫn đến ức chế khá rõ ràng về số lượng chồi mỗi mẫu cấy, chiều dài và trọng lượng tươi của chồi. Số rễ khác biệt đáng kể với những loại và nồng độ của hai nguồn carbon. Số rễ tối đa (23,67) và rễ dài (12 mm) đã được quan sát trong môi trường có chứa glucose tại 20 g/l trong khi số rễ được tìm thấy trên các môi trường sucrose ở nồng độ 30 g/l chỉ là 10 và dài 14 mm. Glucose và fructose cũng được biết đến là nguồn cung cấp carbon cho sự tăng trưởng tốt của một số mô thực vật. Trong số các loại đường thì sucrose được sử dụng là nguồn carbon chủ yếu trong nuôi cấy in vitro thực vật, vì nó là carbohydrate phổ biến nhất được tìm thấy trong nhựa cây ở mạch libe của nhiều loài thực vật. Mặc dù, sucrose là carbohydrate thường được sử dụng trong ống nghiệm để tạo chồi và phát triển chồi, tuy nhiên nó không phải luôn luôn là nguồn carbon hiệu quả nhất cho sự tái sinh thực vật. Sucrose, không chỉ thuận lợi cho sự phát triển rễ mà sucrose còn thích hợp cho sự tăng trưởng của cây con. Các kết quả tương tự đã thu được khi nuôi cấy Centell asiatica L. (Anwar et al., 2005), Pogostemon cablin Berth (Swamy et al., 2010), Solanum nigrum Linn (Sridhar và Naidu, 2011). Tuy nhiên đối với Rosa rugosa (Xing et al., 2010) kết quả nghiên cứu cho thấy rằng glucose lại là nguồn carbon thích hợp cho sự phát triển và tăng trưởng của chồi hơn so với sucrose. Sự hiện diện của nguồn sucrose trong môi trường nuôi cấy còn dẫn đến sự vàng lá của cây con ở loài này. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi giống với nghiên cứu của Xing và cộng sự (2010) khi nhân nhanh Rosa rugosa. Kết quả đều cho thấy mẫu cấy trên môi trường bổ sung glucose tăng trưởng tốt hơn trên môi trường bổ sung sucrose. Thí nghiệm của chúng tôi cho thấy rằng glucose là nguồn carbon thích hợp cho sự tăng trưởng và phát triển của lan Vũ nữ. Glucose giúp lan Vũ nữ phát triển tốt về số lượng lá, số lượng chồi và chiều cao cây. Tuy nhiên nồng độ nghiên cứu của 43
chúng tôi thấp hơn so với nồng độ đường trong nghiên cứu của Võ Châu Tuấn (2014) trên đối tượng Nghệ đen và nghiên cứu của Agnieszka Ilczuk và cộng sự (2013) khi nhân nhanh chồi Ninebark (thuộc họ hoa Hồng) với hàm lượng đường glucose thích hợp từ 40 – 50 g/l. Tóm lại, việc bổ sung đường glucose với nồng độ 20 g/l thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight 3.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) sau 12 tuần nuôi cấy Chồi lan Vũ nữ được cấy trực tiếp vào môi trường MS sự phản ứng của chúng là khác nhau khi được nuôi cấy trên môi trường thạch MS có bổ sung 1 mg/l NAA; 2 mg/l BA; 9 g/l agar; 1 g/l than hoạt tính và nồng độ fructose tương ứng (10; 20; 30; 40; 50) mg/l. Trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường fructose lên khả năng hình thành chồi của lan Vũ nữ sau 12 tuần nuôi cấy. Theo quan sát, chúng tôi ghi nhận được: Sau 2 tuần nuôi cấy, chồi bắt đầu sinh trưởng. Sau 4 tuần nuôi cấy, chồi sinh trưởng mạnh. Sự khác biệt về hình thái giữa các nghiệm thức bắt đầu từ tuần thứ 8 trở đi. Đến tuần nuôi cấy thứ 12, các mẫu cấy ở các nghiệm thức có sự khác biệt về hình thái rõ rệt. Chúng tôi tiến hành thu thập số liệu. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2; đồ thị 3.2; hình 3.3; hình 3.4. 44
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của đường fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight sau 12 tuần nuôi cấy. NT Nồng Khối Khối Số chồi Số lá Số rễ Đường Chiều Chiều Chiều Đặc điểm độ lượng lượng (chồi/mẫu) (lá/cây) (rễ/mẫu) kính lá dài lá dài rễ cao cây (g/l) tươi (g) khô (g) (mm) (mm) (mm) (mm) Cây phát triển bình thường, b a b bc b a a b a B0 30 0,41 0,04 5,67 29,67 10,00 3,33 11,00 14,00 15,00 rễ dài,lá to nhưng ít chồi và lá. Cây phát triển không tốt, ít lá và rễ ít và b c b c b a bc c b B1 10 0,17 0,02 2,00 12,00 4,33 3,33 7,67 4,67 7,67 ngắn. cây thấp. b c b b b ab bc c b Cây phát triển không đều, ít chồi, cây thấp B2 20 0,28 0,02 4,33 41,67 9,67 3,00 8,00 7,33 9,00 và rễ ngắn. Cây phát triển xanh tốt,chồi nhiều, a b a a a a c a a B3 30 1,72 0,18 29,00 133,67 32,33 3,33 6,33 20,00 15,67 nhiều lá, nhiều rễ, rễ dài, lá nhỏ, cây cao Cây phát triển không đều, ít chồi, cây thấp B4 40 0,37b 0,03c 5,33b 29,67bc 5,00b 2,67ab 10,33ab 8,00c 10,33b b c b bc b b bc c b Cây phát triển chậm, ít chồi, lá nhỏ và B5 50 0,33 0,02 4,00 24,00 6,33 2,17 8,67 6,00 8,33 ít, rễ ngắn, cây thấp. Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, thì không có sự khác biệt về mặt thống kê.các mẫu tự khác nhau (a, b, ) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05 45
160 140 120 Trọng lượng tươi (g) trọng lượng khô (g) 100 Số chồi (chồi/mẫu) Số lá (lá/ cây) 80 Số rễ (rễ/mẫu) Đường kính lá (mm) 60 Chiều dài lá (mm) Dài rễ (mm) 40 Chiều cao (mm) 20 0 B0 B1 B2 B3 B4 B5 Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của đường fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với nồng độ đường fructose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 46
Hình 3.3. Ảnh hưởng của đường fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với nồng độ đường fructose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 47
Hình 3.4. Ảnh hưởng của đường fructose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (B0; B1; B2; B3; B4; B5 tương ứng với nồng độ đường fructose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 48
Nhận xét và thảo luận: Từ kết quả thu nhận được ở bảng 3.2, biểu đồ 3.2, hình 3.3, hình 3.4 sau 12 tuần nuôi cấy in vitro các chồi cây đã phát triển. Các nghiệm thức khác nhau tỷ lệ phát sinh chồi khác nhau. Nghiệm thức B0 cây phát triển xanh tốt bình thường, lá to và dài, rễ cây dài. Nghiệm thức B1 cây phát triển thấp hơn so với nghiệm thức B0 với (7,67 15,00 mm), trọng lượng tươi ở nghiệm thức này là 1,715 g cao hơn 4,1 lần so với B0 (0,414 g). Với nồng độ thích hợp thì tế bào thực vật được cung cấp đầy đủ thích hợp để phát triển cây hoàn chỉnh. Về mặt hình thái cây phát triển xanh tốt, nhiều lá (133,67 lá/cây), lá to, rễ nhiều (32,33 rễ/mẫu), rễ dài (20 mm). Ở nghiệm thức B4, B5 cây phát triển không đều, thấp hơn so với nghiệm thức B0. Về mặt hình thái cây thấp, lá nhỏ, ít chồi, lá của cây có màu xanh nhạt. Loại và nồng độ của nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng đáng kể về số lượng chồi mỗi mẫu cấy. Fructose có hiệu quả hơn đường sucrose. Số lượng cao nhất của chồi là (29) và chồi dài nhất (15,67 mm) đã thu được trên môi trường có bổ sung 30 g/l fructose. Trên môi trường sucrose cho thấy phản ứng rất nghèo, với số lượng thấp của chồi. Tăng nồng độ của fructose làm ức chế về số lượng chồi mỗi mẫu cấy độ dài chồi trong nghiệm thức. Những kết quả này cho thấy carbohydrate khác nhau, và nồng độ của chúng, ảnh hưởng đáng kể tỷ lệ 49
thành công của chồi. Số rễ khác biệt đáng kể với những loại và nồng độ của hai nguồn carbon. Số rễ tối đa (32,33) và rễ dài (20 mm) đã được quan sát trong môi trường có chứa fructose tại 30 g/l trong khi số rễ được tìm thấy trên các môi trường sucrose ở nồng độ 30 g/l chỉ là 10 và dài 14 mm. Tuy nhiên, không có khác biệt đáng kể giữa các nồng độ khác nhau của fructose. Mỗi giai đoạn nuôi cấy khác nhau thì cần nguồn đường khác nhau (Kozai, 1992). Nồng độ và loại nguồn carbon ngoại sinh bổ sung vào môi trường đóng vai trò là nguồn năng lượng và để duy trì áp suất thẩm thấu (De Neto và Otoni, 2003). Mặc dù đường fructose có tác dụng tốt cho sinh trưởng tế bào của nhiều loài thực vật, tuy nhiên trong thí nghiệm 3.2 nếu dùng ở nồng độ cao sẽ gây ra ức chế sinh trưởng, tương tự với trường hợp nuôi cấy tế bào cây thuốc lá và cây Cinchona succirubrum (Nigra et al., 1990). Preethi và cộng sự (2011) quan sát thấy rằng fructose đã cho kết quả tốt hơn so với sucrose, maltose và glucose được sử dụng để vi nhân Stevia rebaudiana. Chồi kéo dài là một bước quan trọng trong hệ thống vi nhân giống, liên quan chặt chẽ với các thành phần dinh dưỡng của môi trường (Chen et al., 2003). Sự gia tăng chiều dài chồi trên môi trường bổ sung fructose có hiệu quả trong việc phát triển của tế bào, được điều khiển bởi áp suất trương, và fructose có thể là một trong những chất tạo áp suất thẩm thấu được sử dụng để tạo ra sự trương (Bianco và Rieger, 2002). Kết quả của chúng tôi cũng cho thấy rằng fructose có hiệu quả đối với sự phát triển chồi của lan Vũ nữ hơn so với sucrose. Sự tăng trưởng của chồi của cây mọng nước không được phát huy bởi sucrose, nhưng có thể được thúc đẩy bởi fructose, maltose hoặc glucose (Oka và Ohyama, 1982). Steinitz (1999) và Da Silva (2004) đưa ra giả thuyết rằng carbohydrate được các tế bào hiểu như là các tín hiệu hóa học, với nồng độ rất cao trong ống nghiệm là tác nhân gây stress. Chồi nuôi cấy trên môi trường không có nguồn carbon đã không tạo rễ, cho thấy tầm quan trọng của đường trong sự hình thành rễ. Thorpe (1982) cho rằng rễ muốn tăng trưởng tốt đòi hỏi năng lượng cao mà năng lượng chỉ có thể lấy từ các chất chuyển hóa có sẵn, mà chủ yếu là carbohydrate. Nguồn cacbon như fructose, glucose, lactose, maltose và sucrose ở nồng độ 3% được dùng để tạo rễ ở loài Somnifera Withania 50
và thấy rằng sucrose đã cho kết quả tốt nhất vì 100% mẫu cấy tạo rễ trong khi fructose chỉ cho 65% số mẫu cấy cảm ứng tạo rễ (Sivanesan và Murugesan, 2008). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi giống với nghiên cứu của Preethi và cộng sự (2011) khi vi nhân giống Stevia rebaudiana đều thấy rằng fructose đã cho kết quả tốt hơn so với sucrose. Đối với nghiên cứu của chúng tôi nguồn fructose thích hợp cho lan Vũ nữ nhân chồi hơn so với sucrose. Fructose giúp cho lan Vũ nữ tăng trưởng tối đa về số lượng chồi trong nhân nhanh giống. Bên cạnh đó nồng độ nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn nồng độ nghiên cứu của Abdullah và cộng sự (1998) khi nuôi cấy tế bào cây Morinda elliptica đã cho thấy fructose 5% giúp tăng khả năng sinh trưởng của tế bào, ở cây Solanum eleagnifolium (Nigra et al., 1990) và Ficus deltoide (Ling et al., 2008). Tóm lại, việc bổ sung đường fructose nồng độ 30 g/l thích hợp cho nhân chồi cây lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. 3.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) sau 12 tuần nuôi cấy Chồi lan Vũ nữ được cấy trực tiếp vào môi trường MS sự phản ứng của chúng là khác nhau khi được nuôi cấy trên môi trường thạch MS có bổ sung 1 mg/l NAA; 2 mg/l BA; 9 g/l agar; 1 g/l than hoạt tính và nồng độ lactose tương ứng (10; 20; 30; 40; 50) mg/l. Trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường lactose lên khả năng hình thành chồi của lan Vũ nữ sau 12 tuần nuôi cấy. Theo quan sát, chúng tôi ghi nhận được: Sau 2 tuần nuôi cấy ở một số mẫu cấy bắt đầu phát triển chồi nhưng mẫu cấy chưa có sự phản ứng rõ rệt so với đối chứng. Đến tuần thứ 4 và thứ 5, các mẫu cấy ở nghiệm thức có sự khác biệt rõ rệt ở các nồng độ, mẫu cấy xuất hiện nhiều chồi hơn và kích thước tăng dần theo thời gian nuôi cấy với các chỉ tiêu theo dõi thể hiện nổi bật là số lá, chiều cao chồi, khối lượng chồi, số rễ, chiều dài rễ. 51
Sự khác biệt về hình thái giữa các nghiệm thức bắt đầu từ tuần thứ 8 trở đi, các mẫu cấy tăng trưởng tốt, nhiều chồi, ở nghiệm thức C0, C1 và C2. Sức sống của mẫu cấy bị chậm lại ở nghiệm thức C3, C4 và C5, mẫu giảm dần sức sống so với các tuần đầu ở nghiệm thức thứ 5. Đến tuần nuôi cấy thứ 12, các mẫu cấy ở các nghiệm thức có sự khác biệt về hình thái rõ rệt. Chúng tôi tiến hành thu thập số liệu. Kết quả được trình bày ở bảng 3.3; đồ thị 3.3; hình 3.5; hình 3.6. 52
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của đường lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight sau 12 tuần nuôi cấy. NT Nồng Khối Khối Số chồi Số lá Số rễ Đường Chiều Chiều Chiều Đặc điểm độ lượng lượng (chồi/mẫu) (lá/cây) (rễ/mẫu) kính lá dài lá dài rễ cao cây (g/l) tươi (g) khô (g) (mm) (mm) (mm) (mm) Cây phát triển xanh tốt, a a a a a a a a b C0 30 0,41 0,04 5,67 29,67 10,00 3,33 1,10 14,00 15,00 rễ dài,lá to nhưng ít chồi và lá. Cây phát triển tốt về chiều cao, lá dài a a b ab a b a ab a C1 10 0,47 0,05 1,67 23,00 10,00 1,83 1,80 12,00 29,00 và to . ab b b ab b b a ab b Cây phát triển không đều, ít chồi, C2 20 0,35 0,03 2,33 20,67 4,67 1,83 1,23 10,67 16,00 cây thấp và rễ ngắn. Cây phát triển không tốt, ít lá và rễ ít bc bc b b b b a c b C3 30 0,24 0,03 2,00 17,33 5,33 1,83 1,47 4,33 16,33 và ngắn. cây thấp. Cây phát triển không đều, ít chồi, cây thấp C4 40 0,13c 0,01c 1,67b 14,00b 6,33ab 1,17b 1,30a 9,00bc 18,33b c bc b c b b a bc b Cây phát triển chậm, ít chồi, lá nhỏ và C5 50 0,16 0,02 1,33 3,33 5,00 1,40 1,23 9,00 18,33 ít, rễ ngắn, cây thấp, lá vàng. Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, thì không có sự khác biệt về mặt thống kê.các mẫu tự khác nhau (a, b, ) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05 53
35 30 25 Trọng lượng tươi (g) Trọng lượng khô (g) Số chồi (chồi/mẫu) 20 Số lá (lá/cây) Số rễ (rễ/ mẫu) 15 Đường kính lá (mm) Chiều dài lá (mm) Dài rễ (mm) 10 Chiều cao (mm) 5 0 C0 C1 C2 C3 C4 C5 Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của đường lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với nồng độ đường lactose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 54
Hình 3.5. Ảnh hưởng của đường lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với nồng độ đường lactose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l). 55
Hình 3.6. Ảnh hưởng của đường lactose lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (C0; C1; C2; C3; C4; C5 tương ứng với nồng độ đường lactose là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l). 56
Nhận xét và thảo luận: Từ kết quả thu nhận được ở bảng 3.3, biểu đồ 3.3, hình 3.5, hình 3.6 sau 3 tháng nuôi cấy in vitro các chồi cây đã phát triển. Các nghiệm thức khác nhau tỷ lệ phát sinh chồi khác nhau. Nghiệm thức C0 cây phát triển xanh tốt, nhiều chồi, lá to và dài, rễ cây dài. Nghiệm thức C1 cây phát triển cao hơn so với nghiệm thức C0 với (29,00 > 15,00) trọng lượng tươi ở nghiệm thức này là 0,47 g cao hơn 1,1 lần so với C0 (0,414 g). Trọng lượng khô ở nghiệm thức này là C1 là 0,049 g cao hơn 1,2 lần so với C0 (0,041 g). Nhìn chung cây phát triển chậm, ít chồi (1,67 chồi/mẫu), ít lá (23,00 lá/cây). Ở nghiệm thức C2 cây phát triển không đều, cao hơn so với nghiệm thức C0 với (16,00 >15,00 mm), trọng lượng tươi ở nghiệm thức này là 0,36 g nhỏ hơn 1,2 lần so với C0 (0,414 g). Trọng lượng khô ở nghiệm thức này là C2 là 0,028 g nhỏ hơn 1,6 lần so với C0 (0,044 g). Nhìn chung cây phát triển không đều, ít chồi, ít lá, rễ ngắn, cây thấp. Ở nghiệm thức C3 cây phát triển không tốt, chồi cây ít, cao hơn so với nghiệm thức C0 với (16,33 >15,00 mm), trọng lượng tươi ở nghiệm thức này là 0,241 g thấp hơn 1,7 lần so với C0 (0,414 g). Trọng lượng khô ở nghiệm thức này là C3 là 0,025 g nhỏ hơn 1,8 lần so với C0 (0.044 g). Về mặt hình thái cây thấp, ít chồi, rễ ngắn, lá nhỏ. Ở nghiệm thức C4, C5 cây phát triển không đều, thấp hơn so với nghiệm thức C0. Về mặt hình thái cây thấp, lá nhỏ, ít chồi. lá của cây có màu xanh nhạt ở nghiệm thức C4 còn nghiệm thức C5 lá màu vàng úa. Sự khác biệt không đáng kể đã quan sát được giữa các nồng độ khác nhau của lactose. Nồng độ lactose cao làm giảm tốc độ phát triển chồi, chiều cao cây. Tốc độ phát triển thấp nhất được quan sát thấy ở 50 g/l lactose. Số lá và chiều dài lá lan Vũ nữ đã bị ảnh hưởng đáng kể bởi nguồn carbon. Nồng độ đường lactose 10 g/l thích hợp cho nuôi cấy tạo cây hoàn chỉnh và kéo dài thân. Chồi kéo dài là một bước quan trọng trong hệ thống vi nhân giống, liên quan chặt chẽ với các thành phần dinh dưỡng của môi trường (Chen et al., 2003). Trong thí nghiệm này đường lactose rất thích hợp cho sự tăng trưởng 57
chiều cao của cây. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy nồng độ đường lactose cần cho sự sinh trưởng và kéo dài thân cây ít hơn so với nghiên cứu trên đối tượng Datura stramonium L. khi nuôi cấy tạo sẹo là 2% trong mẫu của Amiri và Kazemitabar (2011). Trong thí nghiệm 3.3, khi bổ sung đường lactose với nồng độ không thích hợp sẽ gây hạn chế sự tăng trưởng hoặc không gia tăng về trọng lượng tươi, điều này tương tự với nhận định của Jain và cộng sự (1997) trên đối tượng lúa Indica và Japonica. Tóm lại, việc bổ sung đường lactose 10 g/l thích hợp cho việc tạo cây hoàn chỉnh và kéo dài thân của lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight trên môi trường MS bổ sung, 1 mg/l NAA; 2 mg/l BA 9 g/l agar, 20% nước dừa, 1 g/l than hoạt tính. 3.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) sau 12 tuần nuôi cấy Chồi lan Vũ nữ được cấy trực tiếp vào môi trường MS sự phản ứng của chúng là khác nhau khi được nuôi cấy trên môi trường thạch MS có bổ sung 1 mg/l NAA; 2 mg/l BA; 9 g/l agar; 1 g/l than hoạt tính và nồng độ manitol tương ứng (10; 20; 30; 40; 50) mg/l. Trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường manitol lên khả năng hình thành chồi của lan Vũ nữ sau 12 tuần nuôi cấy. Theo quan sát, chúng tôi ghi nhận được: Sau 2 tuần nuôi cấy ở một số mẫu cấy bắt đầu phát triển chồi nhưng mẫu cấy chưa có sự phản ứng rõ rệt so với đối chứng. Đến tuần thứ 4 và thứ 5, các mẫu cấy ở nghiệm thức có sự khác biệt rõ rệt ở các nồng độ, mẫu cấy xuất hiện nhiều chồi hơn và kích thước tăng dần theo thời gian nuôi cấy với các chỉ tiêu theo dõi thể hiện nổi bật là số lá, chiều cao chồi, khối lượng chồi, số rễ, chiều dài rễ. Sự khác biệt về hình thái giữa các nghiệm thức bắt đầu từ tuần thứ 8 trở đi . Đến tuần nuôi cấy thứ 12, các mẫu cấy ở các nghiệm thức có sự khác biệt về hình thái rõ rệt. Chúng tôi tiến hành thu thập số liệu. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4; đồ thị 3.4; hình 3.7; hình 3.8. 58
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của đường manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight sau 12 tuần nuôi cấy. NT Nồng Khối Khối Số chồi Số lá Số rễ Đường Chiều Chiều Chiều Đặc điểm độ lượng lượng (chồi/mẫu) (lá/cây) (rễ/mẫu) kính lá dài lá dài rễ cao cây (g/l) tươi (g) khô (g) (mm) (mm) (mm) (mm) Cây phát triển xanh tốt, D0 30 0,41c 0,04d 5,67cd 29,67b 10,00bc 3,33a 11,00ab 14,00bc 15,00a rễ dài,lá to nhưng ít chồi và lá. Cây phát triển xanh tốt, nhiều chồi, a a a a a b bc a a D1 10 1,72 0,18 12,67 82,67 16,00 1,83 7,00 20,00 21,00 lá dày nhưng ngắn , rễ nhiều và dài, cây cao Cây phát triển không đều, ít chồi, b b ab ab ab b c ab a D2 20 0,97 0,11 10,00 50,33 15,00 1,67 6,00 17,00 16,33 cây thấp và rễ ngắn. Cây phát triển không tốt, ít lá và rễ ít c c bc b c b c c a D3 30 0,54 0,07 8,00 41,33 5,00 1,17 6,33 11,33 17,67 và ngắn. cây thấp. Cây phát triển không đều, ít chồi, cây thấp D4 40 0,49c 0,06c 4,00d 32,00b 6,00c 1,50b 14,33a 11,67c 20,33a Cây phát triển chậm, ít chồi, lá nhỏ và D5 50 0,59c 0,06c 3,00d 18,67b 5,67c 2,00b 12,00a 12,00bc 17,33a ít, rễ ngắn, cây thấp. Lá vàng. Ghi chú: trong cùng một cột, các số liệu giá trị trung bình ký tự a, b, thì không có sự khác biệt về mặt thống kê.các mẫu tự khác nhau (a, b, ) chỉ sự sai khác thống kê với p < 0,05 59
90 80 70 Trọng lượng tươi (g) 60 Trọng lượng khô (g) Số chồi (chồi/mẫu) 50 Số lá (lá/cây) Số rễ (rễ/ mẫu) 40 Đường kính lá (mm) Chiều dài lá (mm) 30 Dài rễ (mm) Chiều cao (mm) 20 10 0 D0 D1 D2 D3 D4 D5 Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của đường manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (D0; D1; D2; D3; D4; D5 tương ứng với nồng độ đường manitol là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 60
Hình 3.7. Ảnh hưởng của đường manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (D0; D1; D2; D3; D4; D5 tương ứng với nồng độ đường manitol là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 61
Hình 3.8. Ảnh hưởng của đường manitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight. Sau 12 tuần nuôi cấy (D0; D1; D2; D3; D4; D5 tương ứng với nồng độ đường manitol là: 10; 20; 30; 40; 50 g/l) 62
Nhận xét và thảo luận: Từ kết quả thu nhận được ở bảng 3.4, biểu đồ 3.4, hình 3.7, hình 3.8 sau 3 tháng nuôi cấy in vitro các chồi cây đã phát triển. Các nghiệm thức khác nhau tỷ lệ phát sinh chồi khác nhau. Nghiệm thức D0 cây phát triển xanh tốt, nhiều chồi, lá to và dài, rễ cây dài. Nghiệm thức D1 cây phát triển cao hơn so với nghiệm thức D0 với (21,00 > 15,00) trọng lượng tươi ở nghiệm thức này là 1,724 g cao hơn 41 lần so với D0 (0,041 g). Trọng lượng khô ở nghiệm thức này là D1 là 0,181 g cao hơn 4,1 lần so với D0 (0,044 g). Nhìn chung cây phát triển tốt, nhiều chồi (12,67 chồi/mẫu), nhiều lá (82,67 lá/cây), lá ngắn. Ở nghiệm thức D2 cây phát triển không đều, cao hơn so với nghiệm thức D0 với (16,33 > 15,00 mm), trọng lượng tươi ở nghiệm thức này là 0,968 g lớn hơn 2,3 lần so với D0 (0,414 g). Trọng lượng khô ở nghiệm thức này là D2 là 0,113 g lớn hơn 2,6 lần so với D0 (0.044 g). Nhìn chung cây phát triển không đều, chồi nhiều, lá nhiều mà ngắn. Ở nghiệm thức D3 cây phát triển không tốt, chồi cây ít, cao hơn so với nghiệm thức D0 với (17,67 > 15,00 mm), trọng lượng tươi ở nghiệm thức này là cao hơn D0. Trọng lượng khô ở nghiệm thức này cũng cao hơn so với D0. Về mặt hình thái cây thấp, ít chồi, rễ ngắn, lá nhỏ. Ở nghiệm thức D4, D5 cây phát triển không đều, thấp hơn so với nghiệm thức D0. Về mặt hình thái cây thấp, lá nhỏ mà dài, ít chồi. Lá của cây có màu xanh nhạt ở nghiệm thức D4 còn nghiệm thức D5 lá màu vàng úa. Sự khác biệt đáng kể đã quan sát được giữa các nồng độ khác nhau của manitol. Kết quả cho cho thấy tốc độ phát triển, môi trường nuôi cấy của đường sucrore có tốc độ phát triển chậm hơn so với môi trường chứa mannitol ở nồng độ 10 g/l. Nồng độ mannitol tăng đã giảm tốc độ phát triển chồi đáng kể và tốc độ phát triển thấp nhất được quan sát thấy ở 50 g/l mannitol. Số lá lan Vũ nữ đã bị ảnh hưởng đáng kể bởi nguồn manitol. Vì vậy, đó là sự khác biệt đáng kể đã được quan sát giữa các môi trường nuôi cấy có chứa nồng độ khác nhau của manitol. Số lá của nguồn manitol lên đến 82,67 lá ở nồng độ 10 g/l còn ở nồng 63
độ 50 g/l là 18,67 lá còn ở nguồn sucrose là 29,67 lá. Kết quả cho thấy sự khác biệt đáng kể giữa hai nguồn carbon đến chiều dài của lan Vũ nữ. Chiều dài lá lan Vũ nữ ở đường sucrose lên đến 11 mm còn chiều dài lá lan Vũ nữ ở đường manitol chỉ có 7 mm. Nguồn manitol thích hợp cho sự phát triển chiều cao cây nhưng không có sự khác biệt giữa các nồng độ khác nhau của mannitol. Đường manitol nếu sử dụng ở nồng độ cao sẽ tác động tiêu cực đến sự tăng nhanh chồi của lan Vũ nữ. Đường manitol có hiệu quả đến sự sinh trưởng và phát triển cây lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight ở nồng độ 10 g/l. Theo Rassimwai (2015), mannose và mannitol được bổ sung ở nồng độ thấp, trong môi trường nuôi cấy cây phát triển chậm lại và thậm chí ngừng tăng trưởng đối với cây thuộc loài N. diderrichii nhận định của ông Rassimwaï (2015) cũng tương tự với Chae (2013). Charoensub và Phansiri (2004) cũng cho thấy rằng mannitol làm giảm sự tăng trưởng và số chồi của cây P. indica Linn. Theo các nghiên cứu của Da Silva và Scherwinski - Pereira (2011) ở loài Piper aduncum và P. hispidinervum, việc bổ sung mannitol (1 – 3%) trong môi trường nuôi cấy làm giảm sự tăng trưởng của cây, khi với nồng độ cao nó gây hoại tử cây con. Còn nồng độ gây chết thì phụ thuộc vào các loài thực vật. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu của chúng tôi khác với những nghiên cứu này, việc bổ sung đường manitol ở nồng độ thích hợp 10 g/l mẫu cấy tăng trưởng tốt, mẫu tạo nhiều chồi, nhiều lá. Chỉ khi bổ sung đường manitol ở nồng độ khá cao (50 g/l) mẫu mới chậm phát triển. Tóm lại, trong thí nghiệm này đường manitol ở nồng độ 10 g/l thích hợp cho sự tăng nhanh chồi của lan Vũ nữ Oncidium Kozumit Delight trên môi trường MS bổ sung, 1 mg/l NAA; 2 mg/l BA 9 g/l agar, 20% nước dừa, 1 g/l than hoạt tính. 3.5. Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của sorbitol lên khả năng tăng trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ chồi lan Vũ nữ (Oncidium Kozumit Delight) sau 12 tuần nuôi cấy Chồi lan Vũ nữ được cấy trực tiếp vào môi trường MS sự phản ứng của chúng là khác nhau khi được nuôi cấy trên môi trường thạch MS có bổ sung 1 64