Đồ án Khả năng sử dụng một số vi khuẩn LAB phân lập trong khoang miệng ức chế sự tạo thành màng sinh học của Lactobacillus fermentum

129 trang thiennha21 13/04/2022 4390

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Khả năng sử dụng một số vi khuẩn LAB phân lập trong khoang miệng ức chế sự tạo thành màng sinh học của Lactobacillus fermentum", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

do_an_kha_nang_su_dung_mot_so_vi_khuan_lab_phan_lap_trong_kh.pdf

Nội dung text: Đồ án Khả năng sử dụng một số vi khuẩn LAB phân lập trong khoang miệng ức chế sự tạo thành màng sinh học của Lactobacillus fermentum

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢ NĂNG SỬ DỤNG MỘT SỐ VI KHUẨN LAB PHÂN LẬP TRONG KHOANG MIỆNG ỨC CHẾ SỰ TẠO THÀNH MÀNG SINH HỌC CỦA Lactobacillus fermentum Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Hoài Hương Sinh viên thực hiện: Nguyễn Đặng Vân Anh MSSV: 1311100138 Lớp: 13DSH02 TP.Hồ Chí Minh, 2017
Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Hoài Hương Giảng viên Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi trường của trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. Những kết quả này hoàn toàn không sao chép từ các nghiên cứu khoa học khác dưới bất kì hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án này đều hoàn toàn trung thực. Tôi xin chịu trách nhiệm toàn bộ về đồ án của mình. Tp.HCM, ngày tháng năm 2017 Sinh viên thực hiện Nguyễn Đặng Vân Anh i
Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành được đồ án “Khả năng sử dụng một số vi khuẩn LAB phân lập trong khoang miệng ức chế sự tạo thành màng sinh học của Lactobacillus fermentum” trong suốt quá trình học tập, rèn luyện và trau dồi kiến thức em đã gặp phải không ít lần khó khăn nhưng nhờ có sự quan tâm, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình của TS. Nguyễn Hoài Hương, Giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi trường trường Đại học Công nghệ TPHCM, cùng những kiến thức và kỹ năng cần thiết Cô truyền dạy mà em có thể đạt được thành quả của ngày hôm nay. Em xin chân thành cảm ơn cô. Bên cạnh đó, em cũng xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến các Thầy Cô giảng viên và Ban lãnh đạo Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường trường Đại học Công nghệ TPHCM đã tạo điều kiện giúp em tiếp cận được nhiều nguồn tài liệu để hoàn thành đồ án tốt nghiệp đúng thời gian quy định. Dù đồ án đã hoàn thành nhưng không tránh khỏi những sai sót nhất định do khả năng hiểu biết hạn hẹp và thông tin tài liệu không mấy khả quan để phục vụ quá trình thực hiện đồ án. Kính mong nhận được sự góp ý và chỉ dạy của các Thầy Cô để em học hỏi thêm những kinh nghiệm, tích lũy cho quá trình học tập rèn luyện và chuẩn bị hành trang bước sang một môi trường làm việc mới sau này. Ngoài ra, con xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến ba mẹ, gia đình, những người đã bên con và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn! TP.HCM, ngày tháng năm 2017 Sinh viên thực hiện Nguyễn Đặng Vân Anh ii
Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CÁM ƠN ii MỤC LỤC iii PHỤ LỤC THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ii DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH ẢNH iv MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Tình hình nghiên cứu 2 3. Mục tiêu nghiên cứu 3 4. Nhiệm vụ nghiên cứu 4 5. Phương pháp nghiên cứu 4 6. Các kết quả đạt được 5 7. Kết cấu đồ án 5 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 6 1.1. Tổng quan về vi khuẩn Lactic (LAB) 6 1.2. Tổng quan về Probiotic 19 1.3. Màng sinh học 31 1.4. Sâu răng 37 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44 2.1. Địa điểm nghiên cứu 44 2.2. Thời gian thực hiện 44 2.3. Vật liệu và thiết bị 44 2.4. Phương pháp luận 45 2.5. Phương pháp thí nghiệm 47 iii
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 64 3.1. Kết quả thử nghiệm sinh lý 64 3.2. Kết quả thử nghiệm sinh hóa 67 3.3. Kết quả khả năng sinh enzyme 71 3.4. Kết quả khả năng kháng khuẩn 75 3.5. Kết quả khả năng kháng kháng sinh 77 3.6. Kết quả khảo sát khả năng ức chế màng sinh học của các vi khuẩn lactic sau khi qua xử lý nhiệt 81 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 84 1. Kết luận 84 2. Kiến nghị 84 TÀI LIỆU THAM KHẢO 85 PHỤ LỤC XỬ LÝ SỐ LIỆU 94 iv
Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG  Thành phần môi trường de Man, Rogosa, Sharpe agar (MRS agar): Tween 80 1ml MgSO4.7H2O 0.2g Cao thịt 10g MgSO4.4H2O 0.2g Pepton 5g K2PO4 2g Yest Extract 5g Nước cất 1000ml D-glucose 10g Agar 2% Diamonium Citrate 2g Điều chỉnh pH = 6.5 ± 0.2 tại 25oC.  Thành phần môi trường de Man, Rogosa, Sharpe broth (MRS broth): Tween 80 1ml Diamonium Citrate 2g Cao thịt 10g MgSO4.7H2O 0.2g Pepton 5g MgSO4.4H2O 0.2g Yest Extract 5g K2PO4 2g D-glucose 10g Nước cất 1000ml Điều chỉnh pH = 6.5 ± 0.2 tại 25oC.  Thành phần nước muối sinh lí: NaCl 9g Nước cất 1000ml  Thành phần môi trường Glucose Phosphate broth (MR – VP broth): Peptone 7g Dextrose 5g K2HPO4 5g Nước cất 1000ml v
Đồ án tốt nghiệp  Thành phần môi trường Simmon citrate agar (SCA) MgSO4.7H2O 0,2g NH4H2PO4 1g K2HPO4 1g Na3C6H5O7 2g NaCl 5g Bromothymol blue 0,08g Agar 15g Nước cất 1000ml Điều chỉnh pH = 6.8 ± 0.2 tại 25oC.  Thành phần môi trường canh tryptone: Tryptone 10g NaCl 5g Nước cất 1000ml Điều chỉnh pH = 7.5 ± 0.2 tại 25oC  Thành phần môi trường Triple sugar iron agar (TSI): Cao thịt 3g NaCl 5g Peptone 20g Na2S2O3 0,3g Yeast extract 3g Phenol red 0,024g Lactose 10g Agar 15g Sucrose 10g Nước cất 1000ml Dextrose 1g Điều chỉnh pH = 7.0 ± 0.2 tại o FeSO4 0,2g 25 C. ii
Đồ án tốt nghiệp  Thành phần môi trường Blood agar: Beef heart infusion 500g Tryptose 10g NaCl 5g Agar 15g Máu cừu 50ml Nước cất 950ml Điều chỉnh pH = 7.3 ± 0.2 tại 25oC.  Thành phần môi trường Skim milk agar: Bột sữa gầy 28g Casein enzymic hydrolysate 5g Cao nấm men 2,5g Dextrose 1g Agar 15g Điều chỉnh pH = 7.0 ± 0.2 tại 25oC.  Thành phần môi trường Lactobacillus biofilm medium (LBM): Peptone 5g CH3COONa.H2O 2,5g Cao nấm men 2,5g MgSO4 0,05g K2HPO4 3g MnSO4 0,025g (NH4)3C6H5O7 1g CaCl2 0,1g Dextrose 10g Nước cất 1000ml Cao thịt 5g Tween 80 0,5g Điều chỉnh pH = 7.0 ± 0.2 tại 25oC. ii
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT LAB Lactic acid bacteria /Lactobacillales MRS de Man, Rogosa and Sharpe SCA Simmon citrate agar SAS Statistical Analysis Systems TSI Triple sugar iron TN Thí nghiệm VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật ii
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Tổng hợp các nghiên cứu khảo sát một số chủng probiotic trong việc bảo vệ răng miệng 3 Bảng 1.1. Đặc điểm sinh lý của một số chủng vi khuẩn lactic 11 Bảng 1.2. Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn LAB 19 Bảng 2.1. Phân loại khả năng kháng kháng sinh dựa vào đường kính vòng kháng 62 Bảng 3.1. Kết quả thử nghiệm sinh lý 64 Bảng 3.2. Kết quả thử nghiệm sinh hóa 67 Bảng 3.3. Kết quả thử nghiệm lên men carbohydrate 69 Bảng 3.4. Kết quả khả năng sinh enzyme của các chủng lactic 71 Bảng 3.5. Tỉ lệ kháng khuẩn của các chủng lactic (%) 76 Bảng 3.6. Kết quả kháng kháng sinh của các chủng lactic 77 Bảng 3.7. Kết quả ức chế khả năng tạo màng sinh học của vi khuẩn lactic sau khi xử lý nhiệt 82 iii
Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Môṭ số vi khuẩn lactic điển hình 8 Hình 1.2. Sơ đồ các con đường lên men lactose của vi khuẩn lactic 13 Hình 1.3. Cơ chế tác động của Lactobacillus spp. lên những vi khuẩn trong khoang miệng 28 Hình 1.4. Các dạng sản phẩm từ sữa có chứa probiotic 29 Hình 1.5. Các giai đoạn hình thành màng sinh học 32 Hình 1.6. Mạng lưới EPS cùng tế bào vi khuẩn trong màng sinh học, hình thành dưới đáy một chai thủy tinh được chụp dưới kính hiển vi điện tử 32 Hình 1.7. Vi sinh vật, bùn đất bám dưới đáy tàu thông qua sự hình thành màng sinh học 35 Hình 1.8. Vi khuẩn chịu nhiệt hình thành màng sinh học dày khoảng 20 mm trong hồ nước nóng Mickey, Oregon 36 Hình 1.9. Đốm trắng – dấu hiệu đầu tiên của sự khử khoáng ở men răng 39 Hình 1.10. Răng bị tổn thương nghiêm trọng do quá trình khử khoáng 39 Hình 1.11. Giản đồ mô tả lý thuyết nguyên nhâu gây sâu răng 40 Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu 46 Hình 2.2. Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế màng sinh học sau khi vi khuẩn lactic bị xử lý nhiệt 63 Hình 3.1. Kết quả nhuộm bào tử bằng Malachite green của các chủng lactic 66 Hình 3.2. Kết quả thử nghiệm sinh dưỡng kỵ khí. Dưới đáy ống nghiệm có xuất hiện sinh khối, chứng tỏ các chủng đều tăng trưởng bình thường khi không có khí O2 67 Hình 3.3. Kết quả thử nghiệm Citrate (+: Salmonella typhimurium) 68 Hình 3.4. Kết quả thử nghiệm H2S 68 Hình 3.5. Kết quả thử nghiệm Indole (+:Escherichia coli) 69 Hình 3.6. Kết quả lên men carbohydrate của các chủng lactic 70 Hình 3.7. Kết quả thử nghiệm tan huyết của các chủng lactic 72 iv
Đồ án tốt nghiệp Hình 3.8. Kết quả khả năng sinh enzyme thủy phân Casein 73 Hình 3.9. Kết quả khả năng sinh enzyme thủy phân Gelatin 73 Hình 3.10. Tất cả các chủng đều chuyển sang màu vàng cho kết quả dương tính với thử nghiệm β- galactosidase 74 Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ kháng khuẩn của các chủng lactic 75 Hình 3.12. Kết quả kháng kháng sinh của các chủng lactic 80 Hình 3.13. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ ức chế khả năng tạo màng sinh học của các vi khuẩn lactic sau khi xử lý nhiệt 81 v
Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Song song với sự phát triển về kinh tế, chính trị và xã hội thì các nghiên cứu khoa học thuộc lĩnh vực Công nghệ sinh học cũng ngày càng phát triển. Ngày nay con người đã ứng dụng các thành tựu khoa học công nghệ vào trong cuộc sống, từ công nghiệp, nông nghiệp, an ninh quốc phòng cho đến giải trí, v.v Các nhà khoa học cùng với các nhà nghiên cứu đã ứng dụng các kiến thức từ các tài liệu trên toàn thế giới và áp dụng các biện pháp kỹ thuật mới để cho ra đời các giống cây trồng, vật nuôi, vi sinh vật có tính năng ưu việt hơn các giống hiện có. Bên cạnh đó người ta còn tạo ra những loại thức ăn mới, nghiên cứu ra các loại thuốc, các bộ kit xác định bệnh, những nhân tố mới có giá trị phục vụ đời sống, phát triển kinh tế - xã hội và bảo vệ môi trường. Ngoài ra, đã có nhiều kết quả nghiên cứu khoa học áp dụng cho lĩnh vực công nghệ thực phẩm. Từ những nghiên cứu đó chúng ta cho ra đời các loại vi sinh vật dùng trong chế biến nhằm làm tăng giá trị dinh dưỡng, cảm quan và bảo quản thực phẩm, làm cho thực phẩm không đơn giản chỉ là bổ sung năng lượng mà còn có thể giúp con người phòng chống một số bệnh, tăng cường hệ miễn dịch của cơ thể. Đi đôi với sự phát triển không ngừng của xã hội, nhu cầu sử dụng các chế phẩm, thực phẩm cũng như việc sinh hoạt lành mạnh để có được sức khỏe tốt luôn là mục tiêu của rất nhiều người đang hướng tới. Thời gian gần đây, chúng ta thường nghe nhiều về khái niệm “Probiotics” mà không phải ai cũng hiểu Probiotics là gì. Probiotics trên thực tế chính là các vi khuẩn sống có lợi đường ruột, khi ăn vào đem lại các lợi ích sức khoẻ con người nhờ cải thiện hệ vi sinh đường ruột và chức năng của ruột. Hai loài vi khuẩn probiotics thông dụng hiện này Bifidobacteria và Lactobacillus. Vi khuẩn probiotic giúp tăng cường hệ miễn dịch, ngăn ngừa ung thư Ngoài ra, việc có thể phát hiện được một loài vi khuẩn có khả năng ức chế sự tạo thành màng sinh học của các vi khuẩn có hại trong khoang miệng để hạn chế khả năng gây sâu răng đồng thời mang 1
Đồ án tốt nghiệp tính an toàn như một chủng vi khuẩn Probiotic cũng được khá nhiều nhà khoa học quan tâm và đó là lý em em chọn thực hiện đề tài này. Em muốn mình có thể tìm hiểu cụ thể hơn về loại vi khuẩn này cũng như hy vọng rằng có thể vận dụng những điều mình biết được vào thực tế, cụ thể là khi làm việc sau này. 2. Tình hình nghiên cứu Trong nhiều năm qua, đã có nhiều nghiên cứu in vivo và in vitro nhằm tìm ra tác động của vi khuẩn lactic trong khoang miệng. Các nhà khoa học cũng mong muốn khi vi khuẩn lactic được sử dụng dưới dạng probiotic sẽ có khả năng tồn tại một thời gian nhất định trong nước bọt. Năm 2006, Haukioja và cộng sự đã tìm được một số chủng probiotic có khả năng này [43], khiến cho việc sử dụng vi khuẩn lactic nói chung và probiotic nói riêng để bảo vệ răng miệng trở nên khả quan hơn. Bussher và cộng sự đã xác định được rằng L. acidophilus và L. casei có trong sữa chua đã làm giảm tỷ lệ của các Lactobacillus spp. khác và Streptococcus mutans trong nước bọt và mảng bám răng của các đối tượng nghiên cứu xuống sau một tuần sử dụng [48]. Ahola và cộng sự cũng khảo sát tương tự nhưng trong sản phẩm lên men pho mát, LGG và Lactobacillus rhamnosus LC 705 có trong pho mát có thể làm giảm tỷ lệ sâu răng ở trẻ nhỏ [49]. Hallstrom và cộng sự cũng đã chứng minh được việc sử dụng chủng probiotic L. reuteri ATCC 55730 và ATCC PTA 5289 không góp phần hình thành mảng bám trong khoang miệng [44]. Hầu hết các nghiên cứu lâm sàng của probiotic trong việc bảo vệ răng miệng đều thông qua việc định lượng tổng vi khuẩn mutans streptococci (MS) trong khoang miệng. Các thành quả nghiên cứu trong những năm gần đây được tổng hợp ở bảng 1. 2
Đồ án tốt nghiệp Bảng 0. Tổng hợp các nghiên cứu khảo sát một số chủng probiotic trong việc bảo vệ răng miệng [50]. Độ tuổi – Thời Tổng MS Tình số đối gian trong trạng Tác giả Chủng probiotic tượng nghiên khoang sâu nghiên cứu miệng răng cứu Nase và cs, 2001 L. rhamnosus GG 7 m 1–6, 594   Ahola và cs, 2002 Lactobacillus spp. 3 w 18–35, 74  - Nikawa và cs, 2004 L. reuteri ATCC 55730 2 w 20, 40  - Montalto và cs, 2004 Lactobacillus spp. 45 d 23–37, 35  - Caglar và cs, 2005 Bifidobacterium animalis ssp. 2 w 21–24, 21  - lactis DN-173010 Caglar và cs, 2006 L. reuteri ATCC 55730 2 w 21–25, 120  - Caglar và cs, 2007 L. reuteri ATCC 55730 3 w 21–24, 80  - Caglar và cs, 2008 Bifidobacterium lactis BB-12 10 d 20–24, 40  - Caglar và cs, 2009 L. reuteri ATCC 55730, L. reuteri 10 d 20, 20  - ATCC PTA 5289 Cildir và cs, 2009 Bifidobacterium animalis ssp. 2 w 12–16, 24  - lactis DN-173010 Stecksen-Blicks và cs, L. rhamnosus LB21 21 m 1–5, 174   2009 Lexner và cs, 2010 L. rhamnosus LB21 2 w 12–15, 20  - Singh và cs, 2011 L. acidophilus La5 10 d 12–14, 40  - Bifidobacterium lactis Bb-12 Jindal và cs, 2011 L. rhamnosus, Bifidobacterium 14 d 7–14, 150  - longum, Saccharomyces cerevisae Marttinen và cs, 2012 L. rhamnosus GG, L. reuteri 2 w 20–30, 13  - SD2112, L. reuteri PTA 5289 Chuang và cs, 2011 L. paracasei GMNL- 33 2 w 20–26, 70  - Cildir và cs, 2012 L. reuteri ATCC PTA 5289, L. 25 d 4–12, 19  - reuteri DSM 17938 Petersson và cs, 2011 L. rhamnosus LB21 15 m 58–84, 160   Taipale và cs, 2012 Bifidobacterium animalis BB-12 2 tháng 15 m tuổi đến 2   tuổi, 106 Juneja và Kakade, 2012 L. rhamnosus hct 70 9 w 12-15, 40  - Sudhir và cs, 2012 L. acidophilus 3 w 10-12, 40  - (d, ngày; w, tuần; m, tháng;, giảm;  , không thay đổi; -, âm tính) 3. Mục tiêu nghiên cứu Sử dụng các chủng vi khuẩn lactic đã được phân lập từ khoang miệng. Mục tiêu cuối cùng sau khi thực hiện các thử nghiệm khảo sát là xác định xem chúng có khả 3
Đồ án tốt nghiệp năng ức chế sự tạo thành màng sinh học của Lactobacillus fermentum không và có đủ an toàn để bổ sung vào các sản phẩm sử dụng cho con người và động vật không. 4. Nhiệm vụ nghiên cứu _ Tiến hành các thử nghiệm sinh lý, sinh hóa. _ Khảo sát khả năng kháng khuẩn. _ Khảo sát khả năng kháng kháng sinh. _ Xác định độ an toàn và khả năng ức chế màng sinh học của Lactobacillus fermentum. 5. Phương pháp nghiên cứu a) Phương pháp luận _ Tiến hành các thử nghiệm sinh lý: khả năng chịu nhiệt ở 10oC, 45oC, 60oC; khả năng chịu mặn: 3,5% NaCl và 6,5% NaCl; khả năng sinh bào tử; khả năng sinh dưỡng trong điều kiện kỵ khí. _ Tiến hành các thử nghiệm sinh hóa: khả năng lên men carbohydrate; thử nghiệm MR – VP; thử nghiệm Citrate; Thử nghiệm Indole; khả năng sinh H2S. _ Khảo sát khả năng sinh enzyme: enzyme thủy phân Gelatin; enzyme thủy phân Casein; thử nghiệm tan huyết; thử nghiệm 훽 – Galactosesidase. _ Khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp đo độ đục. _ Khả năng kháng kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Agar Diffusion Test). _ Khả năng ức chế tạo màng sinh học của Lactobacillus fermentum sử dụng các vi khuẩn lactic sau xử lý nhiệt. b) Phương pháp xử lý số liệu - Sử dụng phần mềm excel để vẽ đồ thị. - Sử dụng phần mềm SAS 9.4 để xử lý số liệu. 4
Đồ án tốt nghiệp 6. Các kết quả đạt được _ Chọn được chủng vi khuẩn lactic an toàn và có thể ứng dụng để ức chế sự hình thành màng sinh học của Lactocbacillus fermentum. 7. Kết cấu đồ án Mở đầu Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung chương đề cập đến các nội dung liên quan đến tài liệu nghiên cứu Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án. Chương 3: Kết quả và biện luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề tài thực hiện được và đưa ra những biện luận cho kết quả thu được. Chương 4: Kết luận và kiến nghị – nội dung chương tóm lại những kết quả mà đề tài đạt được và đề nghị cho những hướng cải thiện thêm trong đề tài. 5
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về vi khuẩn Lactic (LAB) 1.1.1. Giới thiệu chung Vi khuẩn lactic (LAB) có vai trò rất quan trọng trong cuộc sống của chúng ta. Chúng tạo ra các thực phẩm lên men và bảo quản thực phẩm khỏi bị hư hỏng. Từ đầu thế kỷ 20, Elie Metchnikoff (1845-1916) đã đề xuất sử dụng các LAB cho mục đích chữa bệnh. Từ đó, lĩnh vực nghiên cứu probiotic đã ra đời và phát triển. Đến nay, những nghiên cứu về probiotic đã không ngừng cung cấp những bằng chứng có tính khoa học về hiệu quả thực sự của probiotic đối với sức khỏe con người. Từ lâu vi khuẩn lactic đã được con người ứng dụng rộng rãi để chế biến các loại thực phẩm lên men (sữa chua, muối dưa, muối cà, ), ủ chua thức ăn cho gia súc hoặc để sản xuất acid lactic và các loại muối của acid lactic. Từ năm 1780, lần đầu tiên nhà hóa học người Thụy Điển Scheele đã tách được acid lactic từ sữa bò lên men chua. Năm 1875, L. Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic. 21 năm sau đó (1878), Lister đã phân lập được vi khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactic (ngày nay gọi là Streptococcus lactic) và đến năm 1881 ngành công nghiệp lên men nhờ vi khuẩn lactic đã được hình thành. Vi khuẩn lên men lactic gọi là vi khuẩn lactic, hiện nay chúng được công nhận là an toàn sinh học (generally recognized as safe - GRAS), được sử dụng thường xuyên trong thực phẩm và có đóng góp trong hệ vi sinh vật có ích của con người. Một đặc tính quan trọng khác của vi khuẩn lactic là chúng có khả năng tạo ra bacteriocin (chất kháng khuẩn) như lactacin, brevicin, lacticin, helveticin, sakacin, plantacin, có tác dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển của các nguồn bệnh trong thực phẩm [2] [3]. 6
Đồ án tốt nghiệp Vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn diện rộng do có khả năng sản xuất ra các chất ức chế: như một số acid hữu cơ, hydrogen peroxide, diacetyl, các chất có khối lượng phân tử thấp và bacteriocin là chất có khả năng ức chế cả vi khuẩn gram (+) và vi khuẩn gram (-). Các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sản sinh acid hữu cơ, đặc biệt là acid lactic trong quá trình sinh trưởng và phát triển. Đối với hydroxy peroxide thì khả năng kháng khuẩn là do việc tạo ra các chất oxy hóa mạnh như oxygen nguyên tử, các gốc tự do superoxide và các gốc tự do hydroxyl. Đối với bacteriocin, cơ chế kháng khuẩn do vi khuẩn lactic tổng hợp đã được nghiên cứu đầu tiên ở nisin, bacteriocin gram (+) [4]. 1.1.2. Đăc̣ điểm hình thá i của vi khuẩn lactic. Các tế bào có hình dáng đa dạng: từ hình que dài, mảnh đến hình que ngắn uốn cong, thường tạo thành chuỗi. Không có khả năng di động (ngoại trừ một số chủng có tiên mao hoặc lông roi trên bề mặt cơ thể), không sinh bào tử, gram dương. Một số chủng thể hiện tính lưỡng cực, xuất hiện các chấm nhỏ hoặc các đường kẻ dọc (quan sát qua kính hiển vi) khi nhuộm vi khuẩn với thuốc nhuộm gram hoặc methylene blue. [51] Khuẩn lạc của vi khuẩn lactic tròn nhỏ, trong bề măṭ bóng, màu trắng đục hoặc màu vàng kem, hoặc khuẩn lạc có kính thước to hơn tròn lồi trắng đục. Đặc biệt khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của acid. Về kích thước tế bào thì đối với các dạng cầu khuẩn là từ 0.5 – 1.5μm. Các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau. Còn với trực khuẩn thì từ 1 - 8μm. Trực khuẩn đứng riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi.  Đặc điểm hình thái giống vi khuẩn lactic điển hiǹ h: Trong số các vi khuẩn lactic, giống Lactobacillus đươc̣ xem là đaị diêṇ cho chủng vi khuẩn này. 7
Đồ án tốt nghiệp Tùy thuộc vào hình thái tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành 2 dạng : hình cầu và hình que. Kích thước của chúng thay đổi tùy theo từng loài. _ Giống Lactobacillus Giới : Vi khuẩn Ngành : Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillales Họ: Lactobacillacea Giống: Lactobacillus a) c) b) d) Hình 1.1. Môṭ số vi khuẩn lactic điển hình a) Lactobacillus casei b) Latobacillus brevis c) Lactobacillus bulgaricus d) Lactobacillus plantarum 8
Đồ án tốt nghiệp Chi Lactobacillus hiện bao gồm hơn 125 loài như: L. acidophilus, L. brevis, L. casei, L. fermentum, L. plantarum, L. bulgaricus Tế bào có dạng hình que nhưng hình dạng của chúng có thể thay đổi tùy vào điều kiện của môi trường sống, có thể là dạng que ngắn hoặc dài, xếp thành chuỗi hay đứng riêng lẻ hoặc ở dạng que kép. Lactobacillus là vi khuẩn Gram dương, không di động, không sinh bào tử, âm tính với catalase, kỵ khí chịu oxy, có khả năng chịu được môi trường có pH thấp. Một số loài có thể phát triển ở môi trường nghèo chất dinh dưỡng, và chịu được nhiệt độ cao. Ngoại trừ loài L. plantarum thì những loài khác không có khả năng chuyển hóa nitrate khi ở điều kiện nhất định. Các loài Lactobacillus thường được tìm thấy các sản phẩm lên men từ động vật và thực vật, đặc biệt là trong các sản phẩm sữa, trong hệ tiêu hóa, hệ bài tiết và hệ sinh dục người. Các loại thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩm chức năng cũng có chứa các vi khuẩn này như: Lactobacillus pasterian, Lactobacillus brevis, Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus sake, Lactobacillus plantarum. Sự phân chia của vi khuẩn lactic dựa theo các sản phẩm của quá trình trao đổi chất của chúng. Vì vậy có thể chia các loài Lactobacillus thành 3 nhóm như sau: - Nhóm I (Lên men đồng hình bắt buộc): Chúng được gọi là Thermobacterium, có fructose - 1,6 - diphosphate aldolase (FDP aldolase) nhưng không có phosphoketolase. Chúng lên men được hexose để tạo acid lactic nhưng không lên men được pentose, thường phát triển ở 45oC. - Nhóm II (Lên men dị hình tùy nghi): Chúng được gọi là Streptobacterium (có FDP aldolase và cảm ứng phosphoketolase). Tuy nhiên, hexose là lên men đồng hình và pentose được chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acid acetic. 9
Đồ án tốt nghiệp - Nhóm III (Lên men dị hình bắt buộc): Chúng được gọi là Betabacterium (có phosphoketolase nhưng không có FDP aldolase), quá trình trao đổi chất cả hexose và pentose lên men dị hình. Trên thực tế, đã có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng Lactobacillus rất hữu ích trong việc điều trị hoặc ngăn ngừa nhiễm nấm, nhiễm trùng đường ruột, hội chứng ruột kích thích, tiêu chảy do dùng thuốc kháng sinh, tiêu chảy do nhiễm khuẩn Clostridium difficile, cơ thể không phân giải được lactose, bệnh về da như: ban đỏ do sốt, chàm, viêm loét da và ngăn ngừa nhiễm trùng đường hô hấp. 1.1.3. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa 1.1.3.1. Đăc̣ điểm sinh lý , sinh trưởng Sinh dưỡng ở điểu kiện kỵ khí tùy nghi, thường tăng trưởng trên bề mặt môi trường rắn kèm theo các điều kiện: kỵ khí, giảm áp suất oxy, 5-10% CO2. Có thể bị ức chế tăng trưởng trong điều kiện hiếu khí, một số loài thuộc nhóm sinh vật kỵ khí bắt buộc. Có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp đối với các amino acid, peptide, dẫn xuất acid nucleic, vitamin, khoáng, acid béo, ester acid béo và carbohydrate. Các yêu cầu dinh dưỡng đặc trưng cho từng loài, thường là các chủng đặc biệt. Nhiệt độ tăng trưởng từ 2 – 53oC, nhiệt độ tối ưu khoảng 30 – 40oC. Tăng trưởng tốt trong điều kiện môi trường acid, pH tối ưu khoảng 5.5 – 6.2, thường tăng trưởng ở mức pH 5.0 hoặc thấp hơn, tốc độ tăng trưởng giảm trong điều kiện pH môi trường trung tính hoặc kiềm. 10
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.1. Đặc điểm sinh lý của một số chủng vi khuẩn lactic Nhiệt Khả năng Hình Lên độ tăng pH tăng chịu Lactic aicd Chi thái tế men trưởng, trưởng muối,% isomer bào lactic oC 10 45 6,5 18 4,4 9,6 Lactobacillus que đh/dh ± ± ± - ± - D,L,DL Lactococcus Cầu đh + - - - ± - L Leuconostoc Cầu dh + - ± - ± - D Oenococcus Cầu dh + + ± - ± - D Pediococcus Tứ cầu đh ± ± ± - + - D,L,DL Streptococcus Cầu đh - + - - - - L Tetragenococcu Tứ cầu đh + - + + - + L s Aerococcus Tứ cầu đh + - + - - + L Carnobacterium Que dh + - - - - - L Enterococcus Cầu đh + + + - + + L Vagococcus Cầu đh + - - - ± - L Weissella Cầu dh + - ± - ± - D,L,DL (đh: đồng hình ; dh: dị hình) 1.1.3.2. Đăc̣ điểm sinh hoá Vi khuẩn lactic là vi khuẩn gram (+), oxidase âm tính, không có khả năng di đôṇ g đồng thời không sinh bào tử , có khả năng lên men carbonhydrate. Hiếm khi khử nitrate, chỉ khi pH cuối cùng từ 6.0 trở lên hoặc có bổ sung vào môi trường tăng trưởng. Không thủy phân gelatine (làm gelatine hóa lỏng), không phân giải 11
Đồ án tốt nghiệp casein nhưng một lượng nhỏ nitơ hòa tan được sản xuất ra bởi hầu hết các chủng. Thử nghiệm Indole âm tính và không sản xuất H2S. Catalase và cytochrome âm tính (không có prophyrin), tuy nhiên, một vài chủng của một số loài phân hủy H2O2 bằng pseudocatalase hoặc bằng chính catalase của heme có mặt trong môi trường. Phản ứng Benzidine âm tính. Hiếm có trường hợp hình thành sắc tố, nếu có sẽ xuất hiện màu cam, vàng, đỏ gạch. [51] 1.1.3.3. Quá trình trao đổi chất Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông qua việc lên men lactic. LAB có khả năng lên men các loại đường hexose (glucose, mannose, galactose, fructose ), disaccharide (lactose, saccharose ); pentose (arabinose, xylose, ribose ) và các hợp chất liên quan. Chúng chỉ sử dụng được các loại đường ở dạng đồng phân D. Tuy nhiên, LAB có thể thích ứng với nhiều điều kiện khác nhau làm thay đổi cách thức trao đổi chất và dẫn đến các sản phẩm cuối cùng tạo ra cũng khác nhau. Quá trình lên men lactic có thể đồng hình hoặc dị hình. Lên men đồng hình gồm con đường EMP chuyển hóa đường thành pyruvate, sau đó pyruvate bị khử thành lactic acid 90% đường được chuyển hóa thành acid lactic. Trong khi đó ở lên men lactic dị hình chỉ 50% đường được chuyển hóa thành acid lactic, còn lại là CO2, acetaldehyde, ethanol. 12
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.2. Sơ đồ các con đường lên men lactose của vi khuẩn lactic A) Lên men đồng hình . B) Lên men dị hình 13
Đồ án tốt nghiệp  Lên men lactic đồng hình Lên men đồng hình là quá trình lên men trong đó có các sản phẩm acid lactic tạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng nhỏ acid acetic, acetol, diacetyl. Phương trình chung biểu diễn quá quá trình lên men: C6H12O6 2CH3CHOHCOOH + 21,8.104 J Con đường Glycolysis hay con đường EMP (Embden-Meyerhof-Parnas pathway) được sử dụng bởi hầu hết các LAB (ngoại trừ leuconostocs, nhóm III Lactobacilli, Oenococci và Weissellas) tạo ra fructose-1,6-diphosphate (FDP) và nhờ FDP aldolase để tiếp tục chuyển thành dihydroxyacetonephosphate (DHAP) và glyceraldehyde-3- phosphate (GAP) đối với những chất có mức phosphoryl hóa ở 2 vị trí, sau đó tạo thành pyruvate. Trong điều kiện có nhiều đường và hạn chế oxy, pyruvate bị khử thành acid lactic bởi lactate dehydrogenase (nLDH) và NAD+, do đó NADH đã được oxy hóa trước đó, khi thế oxy hóa khử được cân bằng, sản phẩm cuối cùng được tạo ra chủ yếu là acid lactic và quá trình này được gọi là lên men lactic đồng hình. (Hình 1.2A)  Lên men lactic dị hình Đặc điểm của con đường này là sự khử hidro ngay từ bước đầu tạo 6-phosphogluconate. Theo sau đó là sự tách carbon tạo pentose-5-phosphate và tiếp tục chuyển hóa thành glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) và acetyl phosphate. GAP được tạo thành tương tự như trong con đường glycolysis và kết quả là tạo ra acid lactic. Trong điều kiện không có mặt của các chất nhận điện tử, acetyl phosphate sẽ bị khử tạo thành ethanol thông qua CoA và acetaldehyde. Khi quá trình này ngoài sản phẩm acid lactic còn tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như CO2, ethanol, acid acetic, acid succinic thì nó được gọi là lên men lactic dị hình. Phương trình chung biển diễn quá trình lên men: C6H12O6 CH3CHOHCOOH + HOOC(CH2)COOH + CH3COOH + C2H5OH +CO2 14
Đồ án tốt nghiệp Trong đó, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%, rượu etylic và acid acetic 10% các loại khí 20% đôi khi không có các khí mà thay vào đó là sự tích luỹ một lượng ít acid foocmic. 1.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men, quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic Trong công nghiệp, vật liệu dùng để làm môi trường cho vi sinh vật phát triển cần đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, không có độc tố, cho hiệu suất thu hồi là lớn nhất và giá thành rẻ [79]. Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy mà còn ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm sinh khối sau này.  Thành phần môi trường nuôi cấy Vi khuẩn lactic thuộc loại vi sinh vật dị dưỡng. Nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống và phát triển của chúng là nguồn năng lượng do trao đổi chất với môi trường bên ngoài. Thành phần môi trường MRS để nuôi cấy vi khuẩn lactic có chứa nhiều chất dinh dưỡng và dễ bị tạp nhiễm cũng ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn lactic. Ngoài ra, để duy trì sự sống, điều hòa các quá trình chuyển hóa trong tế bào, chúng cần sử dụng nguồn glucid có trong môi trường dinh dưỡng làm nguồn carbon (chủ yếu là đường lactose), nguồn nitơ (pepton, acid amin), vitamin, muối khoáng và các yếu tố vi lượng.  Yếu tố môi trường Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ là một trong những nhân tố quan trọng, ảnh hưởng đến enzyme của tế bào vi sinh vật. Khi nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các enzyme, dẫn đến ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Nhiệt độ càng cao thì sự lên men càng mạnh. Phần lớn vi khuẩn lactic sinh trưởng tốt nhất ở 15
Đồ án tốt nghiệp nhiệt độ 30 – 40oC. Một số có thể sinh trưởng dưới 15oC và thậm chí một số dòng có thể sinh trưởng dưới 5oC [5]. Ảnh hưởng của pH Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh acid làm pH môi trường giảm và khi nó giảm tới mức nào đó nó sẽ ảnh hưởng lên sự phát triển của vi khuẩn lactic. Do đó, cần phải luôn điều chỉnh pH về khoảng tối thích cho vi khuẩn trong suốt quá trình nuôi, pH tối ưu phải giữa 5.5 và 6.0. Ảnh hưởng của nồng độ acid Acid là sản phẩm chính của quá trình lên men lactic do hoạt động sống của vi khuẩn lactic tạo nên. Các vi khuẩn này chịu được acid, tuy nhiên với lượng acid tích lũy trong môi trường ngày một nhiều sẽ ức chế chúng. Để giúp vi khuẩn lactic phát triển bình thường không bị chính sản phẩm do hoạt động của chúng để tạo ra, người ta cho vào môi trường các chất đệm thích hợp với một lượng đủ để trung hòa lượng acid sinh ra thông thường chất đệm này là CaCO3. Vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình lên men Hệ vi sinh vật tạp nhiễm, thường ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men ở những mức độ khác nhau có thể phá hủy các tế bào giống hoặc phá vỡ tế bào quá trình trao đổi chất cần thiết cho sự tạo thành sản phẩm lên men. 1.1.5. Ứng dụng của vi khuẩn lactic Nhờ khả năng tạo ra acid lactic từ các nguồn carbohydrate khác nhau, hoạt tính kháng nhiều loại vi sinh vật có hại mà các chủng vi khuẩn lactic được ứng dụng nhiều trong công nghệ lên men truyền thống và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: _ Thực phẩm: Chúng giúp giảm việc sử dụng các chất hóa học cũng như cường độ xử lý nhiệt, có thể thay thế các chất bảo quản thực phẩm, làm cho thực phẩm sau bảo quản vẫn giữ được trạng thái tự nhiên và đảm bảo tính cảm quan và 16
Đồ án tốt nghiệp dinh dưỡng, đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng về tính an toàn, độ tươi ngon, thực phẩm ăn liền, thực phẩm chế biến tối thiểu và gia tăng sản phẩm có tính cảm quan mới lạ như giảm tính acid hoặc giảm nồng độ muối đồng thời kéo dài đươc̣ thời gian bảo quản của các sản phẩm thưc̣ phẩm như bánh mì. _ Công nghiệp: Vi khuẩn lactic là nguồn để lên men sản xuất acid lactic, đem lại nguồn thu hàng tỷ đô vì đây là chất được sử dụng rất rộng rãi ở nhiều lĩnh vực khác nhau. _ Y học: Chữa các bệnh đường ruột, cải thiện hệ tiêu hoá _ Nông nghiệp và môi trường: Vi khuẩn lactic hạn chế sự phát triển của nấm Fusarium, Aspergillus, chế phẩm EM có vai trò cải tạo đất và không gây ô nhiễm, ứ c chế môṭ số vk gây bêṇ h trên các loài thuỷ hải sản. Ngoài ra còn đươc̣ ứ ng duṇ g trong bảo quản haṭ giống do sư ̣ phát triển của nấm mốc như: bắp, đâụ phôṇ g, . 1.1.6. Hoaṭ tính sinh hoc̣ Các vi khuẩn lactic (LAB) có thể sản xuất một số chất kháng sinh như acid lactic và reuterin, ngoài ra còn có các acid hữu cơ, peroxit hydro, bacteriocin kháng khuẩn và các loại peptide kháng nấm. LAB đã được biết đến trong nhiều năm và đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất của một loạt các thực phẩm lên men. Lợi ích sức khỏe của LAB được biết là ảnh hưởng tích cực nhất định trong đường tiêu hóa của con người [6] [7]. 1.1.6.1. Khả năng kháng khuẩn của chủng vi khuẩn lactic LAB cũng ứ c chế sư ̣ phát triển của vi sinh vâṭ có haị gây thối rữa thông qua các sản phẩm chuyển hoá như hydrogen peroxide, carbon dioxide, diacetyl và đăc̣ biêṭ là bacteriocin. Bacteriocin: Bacteriocin là protein có hoạt tính sinh học do vi khuẩn tiết ra, có thể tiêu diệt hoặc ức chế sự tăng trưởng của các vi khuẩn khác có quan hệ họ hàng với 17
Đồ án tốt nghiệp chúng [8]. Bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn, được sản sinh ra bởi nhiều nhóm vi khuẩn đa dạng, có thể khác nhau bởi phương thức và phổ hoạt động, phân tử lượng, đặc điểm sinh hóa và nguồn gốc [9]. Ưu điểm của bacteriocin là có hoạt tính kháng khuẩn cao ngay cả khi ở nồng độ rất thấp. Tuy nhiên, bacteriocin thường có phổ kháng khuẩn hẹp hơn kháng sinh. Khác với chất kháng sinh, bacteriocin thường được dùng trong thực phẩm và không có ảnh hưởng độc lên tế bào nhân chuẩn còn chất kháng sinh chỉ được dùng trong y tế và có ảnh hưởng độc lên tế bào nhân chuẩn. Trên thế giới bacteriocin được sản xuất bằng công nghệ lên men vi sinh bởi vi khuẩn lactic. Bacteriocin còn có môṭ số haṇ chế như: ít đươc̣ biết đến hơn chất bảo quản hoá hoc̣ . Bi ̣thoái biến nhanh chóng bởi các enzyme phân giải protein. Bacteriocin đươc̣ ứ ng duṇ g: Bổ sung bacteriocin tinh chế hay bán tinh chế như là các chất bảo quản thực phẩm, dùng màng polyethylen hoạt tính bacteriocin cho đóng gói thực phẩm. Sản phẩm chuyển hoá của LAB sử duṇ g để chống laị các vi sinh vâṭ gây thối rữa và chứ c năng hoá có thể ứ c chế vi sinh vâṭ của chúng đươc̣ tóm tắt như sau: 18
Đồ án tốt nghiệp Bảng 1.2. Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn LAB [5]. Sản phẩm Các sinh vật ảnh hưởng Acid lactic Vi khuẩn gram âm, một vài loài nấm Acid acetic Nấm, nấm men, vi khuẩn gây thối rửa H2O2 Sinh vật gây bệnh, đặc biệt trong thức ăn giàu protein Hệ thống lactoperoxidase với Vi khuẩn gây bệnh (sữa và các sản phẩm làm từ sữa) H2O2 Lysozyme Vi khuẩn gram dương Reuterin (3-OH- Nấm mốc, nấm men propoonaldehyde) Diacetyl Vi khuẩn gram âm Acid béo Các loại vi khuẩn khác nhau 1.2. Tổng quan về Probiotic 1.2.1. Lược sử nghiên cứu Lịch sử nghiên cứu probiotic bắt đầu trong những năm cuối thế kỷ 19, khi các nhà vi sinh vật học phát hiện ra sự khác biệt giữa hệ VSV trong ống tiêu hóa của người bệnh và người khỏe mạnh. Hệ vi sinh vật có ích trong hệ thống ống tiêu hóa được gọi là probiotic. Năm 1870, khi nghiên cứu tại sao những người nông dân Bungary có sức khỏe tốt, nhà sinh lý học người Nga Eli Metchnikoff đã đưa ra thuật ngữ “probiotic” có nguồn gốc từ Hy Lạp, theo nghĩa đen là “vì cuộc sống” để chỉ những vi sinh vật đã được chứng minh có ảnh hưởng tốt đến sức khỏe của người và động vật. [83] Khái niệm này sau đó được làm rõ hơn bởi định nghĩa của Tổ chức Y tế thế giới và Tổ chức Lương nông thế giới (WHO/FAO, 2001): “Probiotic là những vi sinh vật còn sống khi đưa vào cơ thể một lượng đầy đủ sẽ có lợi cho sức khỏe của người sử dụng.” [90] 19
Đồ án tốt nghiệp Đây là những nhóm vi khuẩn (VK) sống trong đường tiêu hóa của người, chúng tạo thành một khu hệ VSV, cản trở sự phát triển của một số VSV gây bệnh, cung cấp cho con người một số chất có lợi cho cơ thể, ảnh hưởng tốt đến hệ miễn dịch. Con người sử dụng các chế phẩm probiotic như một loại thực phẩm, thuốc, sử dụng chúng như một phương tiện để vận chuyển vi khuẩn probiotic vào trong cơ thể, từ đó giúp phòng và chữa bệnh. 1.2.2. Các vi sinh vật probiotic thường gặp Vi sinh vật được sử dụng làm probiotic gồm nhiều nhóm khác nhau như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm men, nấm mốc. Tuy nhiên, vì những đặc tính ưu việt của vi khuẩn lactic (LAB) phù hợp với việc tạo chế phẩm probiotic cho người cũng như vật nuôi nên thành phần của hầu hết các chế phẩm probiotic hiện nay chủ yếu là các chủng LAB. Một số nhóm vi sinh vật probiotic thường gặp:  Nhóm vi khuẩn lactic: Theo Lee, Nomoto, Salminen và Gorbach (1999), một số loại chế phẩm probiotic được biết đến nhiều nhất với các chủng LAB, trong đó chủ yếu là những loài thuộc chi Lactobacillus và Streptococcus như L. acidophilus, L. casei, L. plantarum, L. bulgaricus, L. kefir, L. delbruckii, L. sporogenes, Bifidobacterium breve, Bifidus bacteria, Streptococcus faecalis, Những chủng này đều có thể chịu đựng nhiệt độ cũng như các tác động trong quá trình sản xuất thuốc, không tương tác với các thành phần bổ sung thêm trong chế phẩm như vitamin, acid amin, acid béo, đường và đặc biệt là fructoligosaccharide, là một tá dược được dùng phổ biến trong hầu hết các chế phẩm propiotic. Các chế phẩm probiotic có thể sử dụng chỉ một chủng LAB (như L. acidophilus hay L. sprorogenes, ) hoặc kết hợp nhiều chủng LAB (L. acidophilus, L. sprorogenes, L. kefir, Streptococcus faecalis, ). Sử dụng chế phẩm probiotic - lactic là liệu pháp rất tốt cho các trường hợp rối loạn đường tiêu hóa, giúp duy trì hệ VSV có 20
Đồ án tốt nghiệp lợi cho hệ tiêu hóa, ngăn ngừa tiêu chảy hữu hiệu và nhiều trường hợp bệnh khác nhờ những tác dụng trong cơ thể người. [71] [75]  Bacillus subtilis B. subtilis là VK ứng dụng làm probiotic từ rất sớm. Chúng được sử dụng qua đường uống để phòng và chữa các rối loạn tiêu hóa như tiêu chảy sau khi dùng kháng sinh. B. subtilis có tác dụng hồi phục hệ VSV tự nhiên trong đường tiêu hóa của người sau khi dùng kháng sinh kéo dài. Các chế phẩm B. subtilis được bán ở hầu hết các nước Châu Âu, mặc dù người ta còn chưa biết nhiều về cơ chế tác dụng của chúng. Bào tử của B. subtilis có thể vượt qua rào chắn đường tiêu hóa, một phần bào tử nảy mầm trong ruột non và sinh sôi trong đường ruột. Một số tác dụng lâm sàng của B. subtilis đã được biết như làm tác nhân kích thích miễn dịch trong một số bệnh [83].  Bacillus clausii Thuộc giống Bacillus, GP+P, không di động, nuôi cấy dễ dàng với các môi trường dinh dưỡng thông dụng, có khả năng sinh bào tử giúp VK tồn tại trong điều kiện khắc nghiệt. Bào tử của B. clausii có thể qua dạ dày với tỉ lệ sống sót cao, có thể sống được trong môi trường dịch vị với pH = 2 ít nhất l2 giờ. Chúng đề kháng rất tốt với nhiều loại kháng sinh. Vì thế, có thể dùng chung trong thời gian điều trị kháng sinh. Khi vào ruột non, bào tử B. clausii sẽ nảy mầm thành dạng sinh trưởng và tiếp tục sinh sôi nảy nở trong ruột. Nhờ đó lấp đầy lại được khoảng trống rối loạn hệ VK trong đường ruột. Đồng thời sự sinh trưởng của B. claussi sẽ tái lập được điều kiện kỵ khí, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển trở lại của các VK có lợi ở đường ruột (như Bifidobacterium, Lactobacillus, Bacteroides) đã bị rối loạn vì các nguyên nhân khác nhau. B. clausii thường được dùng tạo chế phẩm probiotic cho người như chế phẩm Enterogermina ở dạng lỏng. Bào tử được bào chế dưới dạng hỗn dịch không màu, 21
Đồ án tốt nghiệp không mùi, không vị trong từng ống nhựa nhỏ nên tiện lợi khi sử dụng, đặc biệt là cho trẻ em.  Nấm men Được sử dụng làm probiotic như Saccharomyces cerevisiae, S. boulardii. Trong các chế phẩm probiotic tạo ra sinh khối chứa acid amin, các vitamin nhóm B, hấp thu độc tố và bài thải ra ngoài. Chúng chuyển hóa glucose thành acid pyruvic là cơ chất cho các VSV có lợi hoạt động và sinh sản. Ngoài ra, chúng còn tiết enzyme tiêu hóa như amylase, protease, . [78] S. boulardii: được dùng như probiotic từ năm 1950. Là thành phần chính của một số chế phẩm probiotic như ultralevure (Pháp), florastor, bioflora (Pháp). Tác động hiệu quả trong điều trị tiêu chảy nhiễm trùng cấp. Ngừa tiêu chảy do KS và trị liệu phối hợp trong nhiễm trùng H. pylori. S. boulardii tác động thông qua cơ chế:  Tiết enzyme proteinase làm giảm độc tố do Clostridium difficile, sản sinh phosphatase làm bất hoạt các nội độc tố do E. coli tiết ra.  Tăng lượng kháng thể IgA, tăng các men lactase, sucrase, maltase, và N- aminopeptidase, tăng hấp thu ở người tiêu chảy, duy trì các acid béo chuỗi ngắn cần thiết cho cho việc hấp thu nước và chất điện giải.  Ngoài ra, chúng còn tác dụng giảm viêm ở đường ruột do kích thích tế bào T. 1.2.3. Tiêu chuẩn chọn chủng vi khuẩn lactic sử dụng làm probiotic Vi sinh vật được sử dụng trong hầu hết các sản phẩm probiotic hiện nay chủ yếu là LAB, do chúng mang những đặc điểm ưu việt vốn có thích hợp cho việc tạo chế phẩm probiotic. Tuy nhiên, không phải bất kì LAB nào cũng được ứng dụng làm probiotic. Những chủng LAB được chọn phải đảm bảo các tiêu chuẩn sau:  Là VK hiện diện bình thường ở ruột của người, sinh trưởng và phát triển nhanh.  Là VK chịu được pH thấp nên có thể sống được khi qua dạ dày. 22
Đồ án tốt nghiệp  Lên men lactic làm giảm pH môi trường sống, ức chế sự phát triển của VSV gây bệnh khác.  Có khả năng làm mất sự liên kết của các acid mật nên chịu acid mật tốt.  Đề kháng được kháng sinh.  Tạo enzyme lactase giúp đồng hóa được đường lactose trong sữa.  Làm tăng quá trình tiêu hoá thức ăn, tăng hấp thu chất dinh dưỡng.  Sản sinh một số chất kháng khuẩn ức chế sự phát triển các VSV gây bệnh.  Điều hoà khả năng miễn dịch.  Làm giảm lượng cholestrol trong huyết thanh.  Hoạt tính chống đột biến và chống ung thư. 1.2.4. Đặc điểm chung của vi sinh vật probiotic Vi sinh vật probiotic khi được bổ sung vào cơ thể qua đường tiêu hóa, chúng tác động thông qua một số cơ chế khác nhau. Tuy nhiên, để có thể tác động lên hệ tiêu hóa vật chủ thì trước hết chúng phải có khả năng sống sót ở điều kiện khắc nghiệt trong đường tiêu hóa. Điển hình là các điều kiện như pH thấp, acid mật, kháng sinh,  Chịu pH thấp Đây là yếu tố cần thiết để tạo sự thích nghi ban đầu. Các nhà khoa học đã chứng minh, các probiotic phải trải qua các quá trình tiêu hóa khắc nghiệt hơn 90 phút trước khi được giải phóng từ dạ dày vào ruột. Tuy nhiên, các quá trình tiêu hóa có thời gian xảy ra lâu hơn nên VSV probiotic phải chống lại được các điều kiện áp lực của dạ dày với pH thấp đến khoảng 1,5. Do đó, các chủng được chọn lọc để sử dụng như trong chế phẩm probiotic cần phải chịu được môi trường pH thấp ít nhất 90 phút. Sống sót ở pH 3.0 trong 2 giờ và nồng độ acid 1000 mg/l được xem như là khả năng chống đỡ đối với acid tối ưu đối với các chủng probiotic [70]. 23
Đồ án tốt nghiệp Ngoài ra, VSV probiotic phải chống lại được các enzyme trong đường miệng như lysozyme. Vì vậy, khả năng chịu acid là một trong những tính chất đầu tiên để sàng lọc khi muốn tuyển chọn các dòng probiotic [69].  Chịu acid mật Acid mật được coi là chất kháng khuẩn trong đường tiêu hóa, bảo vệ ruột khỏi sự xâm nhập của các VSV gây bệnh. Ở hầu hết các sinh vật (bao gồm người), quá trình tổng hợp acid mật chủ yếu thông qua sự tiêu thụ cholesterol. Cơ thể tổng hợp khoảng 8mg cholesterol một ngày và dùng 4mg cholesterol để tổng hợp acid mật. Tổng cộng có khoảng 20 – 30 g acid mật tiết vào ruột mỗi ngày [85]. Do vậy, khi thức ăn cùng VSV từ dạ dày chuyển xuống vùng ruột. Tại đây, chúng chịu sự tác động của acid mật. Khi acid mật đi vào khu vực tá tràng thì số lượng VSV sẽ giảm. Khả năng chịu đựng acid mật là một trong những đặc tính cần thiết của VSV có hoạt tính probiotic [1].  Chịu kháng sinh Kháng sinh được ứng dụng phổ biến trong điều trị một số bệnh cho người cũng như vật nuôi. Tuy nhiên, bên cạnh những lợi ích do kháng sinh mang lại thì phương pháp trị liệu kháng sinh có một số hạn chế nhất định như là tác động loại bỏ không phân biệt được mầm bệnh thật sự và hệ VSV có lợi trong ruột. Vì vậy, phương pháp trị liệu này đã dẫn đến thay đổi sự cân bằng hệ VSV của ruột và gây ra một vài ảnh hưởng xấu có thể tồn tại lâu dài ngay cả sau khi ngưng sử dụng cách điều trị này. Chính vì vậy, việc sử dụng probiotic thường được chỉ định uống trong thời gian điều trị bệnh bằng kháng sinh, để phòng mất cân bằng hệ VSV trong đường ruột. Do đó, các chủng dùng làm probiotic cần phải có khả năng chịu đựng được kháng sinh [77].  Khả năng bám dính vào tế bào biểu mô ruột Các chủng VSV probiotic khác nhau có những ảnh hưởng khác nhau lên đường tiêu hóa. Chúng chỉ có thể tác động được khi chúng có thể sinh trưởng và phát triển tốt 24
Đồ án tốt nghiệp trong đường tiêu hóa. Do vậy, bên cạnh khả năng sống sót thì chúng phải có khả năng bám vào thành biểu mô ruột, nhờ đó chúng mới không bị rửa trôi ra ngoài cùng với phân [67]. Sự kết bám với tế bào biểu mô ruột là một yêu cầu quan trọng cho việc định cư lâu dài của VK probiotic trong đường ruột, chống lại sự loại bỏ do nhu động ruột và tạo được một ưu thế cạnh tranh trong hệ VSV đường ruột (Pedersen và Tannock 1989; Freter 1992; Alander và cộng sự 1997) [66] [68]. Bên cạnh đó vi sinh vật probiotic còn có khả năng sản sinh những chất có hoạt tính kháng khuẩn như các acid hữu cơ, ethanol, bacteriocin, H2O2, Những chất này được sản sinh cùng với quá trình sinh trưởng và phát triển của chúng trong đường tiêu hóa, tác động ức chế và tiêu diệt các VK gây bệnh, tạo nên sự cân bằng hệ sinh thái đường ruột. Ngoài ra, chúng còn có khả năng ảnh hưởng đến hoạt tính biến dưỡng như đồng hóa cholesterol, lactose, tạo ra các vitamin và giải phóng nhiều enzyme có lợi giúp cho việc tiêu hóa thức ăn diễn ra dễ dàng. Bên cạnh đó, chúng còn giúp hấp thu các chất dinh dưỡng cần thiết, khử các chất có khả năng gây ung thư, các hợp chất độc hại, kích thích điều hòa hệ miễn dịch cơ thể chủ, tăng khả năng đề kháng cho cơ thể vật chủ, [71] [75]. 1.2.5. Cơ chế tác động chung của probiotic Vi sinh vật probiotic khi được bổ sung vào cơ thể vật chủ, chúng tác động lên đường tiêu hóa của vật chủ theo những cơ chế như cạnh tranh và đối kháng với các VK gây bệnh, sản sinh các chất có hoạt tính kháng khuẩn, kích thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ,  Cạnh tranh và đối kháng với các VK gây bệnh Hệ vi sinh vật ở đường tiêu hóa mất cân bằng do nhiều nguyên nhân khác nhau, một trong những nguyên nhân chính là do việc sử dụng kháng sinh dài ngày dẫn đến 25
Đồ án tốt nghiệp việc tiêu diệt các VSV có lợi trong ruột. Để khắc phục điều này, người ta thường bổ sung các VSV có lợi thông qua sử dụng probiotic. Các VSV probiotic sẽ phát triển, chiếm ưu thế trong đường ruột bằng cách cạnh tranh về mặt vị trí bám, về hấp thu chất dinh dưỡng và khối lượng các chất được sản sinh. Từ đó, ức chế và tiêu diệt được VSV gây hại, thiết lập lại sự cân bằng hệ VSV đường ruột. Trong một nghiên cứu cho thấy, khi cung cấp thường xuyên các VSV có lợi dưới dạng sữa lên men hoặc dạng đông khô cho người và động vật nuôi với liều lượng thích hợp (1,2 tỷ CFU/ kg thức ăn/ ngày), sự cân bằng của hệ VSV đường ruột được duy trì [57] [64] [74] [76] .  Tác động kháng khuẩn do sản sinh một số chất kháng khuẩn Probiotic tác động không chỉ thông qua sự phát triển, gia tăng về số lượng cạnh tranh vị trí bám với VK gây bệnh, chúng còn tác động nhờ vào khả năng sản sinh các chất có hoạt tính kháng khuẩn như kháng sinh, một số acid hữu cơ (acid lactic, acid acetic, acid formic, acid béo, ), diacetyl, hydrogen peroxide, ethanol, Đặc biệt, nhiều chủng VSV còn sản xuất bacteriocin và các phân tử có hoạt tính kháng khuẩn [58]. Những chất này có tác dụng ức chế và tiêu diệt các VK gây bệnh ở đường ruột.  Tăng cường hoạt động chuyển hóa của vi khuẩn đường ruột. Một số chủng VSV probiotic khi được bổ sung vào đường tiêu hóa có vai trò tăng cường hoạt động chuyển hóa của một số chủng VK đường ruột khác. Chẳng hạn như khi sử dụng L. rhamnosus dưới dạng sữa lên men, chúng kích thích hoạt động enzyme và khả năng biến dưỡng của VK đường ruột [57].  Điều hòa phản ứng miễn dịch Vi sinh vật probiotic có thể có khả năng điều hòa phản ứng miễn dịch thông qua ảnh hưởng lên lympho bào B. Như khi cho chuột sử dụng L. plantarum ATCC 14917 và L. fermentum YIT 0159, chúng sẽ kích thích sự đồng hóa P3PH - thymidine trong tế bào lách ở chuột. Ngoài ra, L. plantarum ATCC 14917 và L. fermentum YIT 0159 cũng 26
Đồ án tốt nghiệp có thể tăng cường bổ thể và kháng huyết thanh ở thỏ. Điều này chứng tỏ chúng kích thích hoạt động trên lympho bào B của tế bào lách [57]. Ngoài ra, VSV probiotic còn tác động lên hệ tiêu hóa của người cũng như vật nuôi bằng những cơ chế khác, như đồng hóa lactose trong sữa, Sự không dung hòa lactose là tình trạng sinh lí xảy ra ở những người thiếu khả năng sản xuất enzyme lactase hay β-galactosidase. Lactase cần thiết để đồng hóa lactose trong sữa, phân giải chúng thành các phân tử đường glucose và galactose đơn giản. Các cá thể thiếu lactase sẽ không tiêu hóa được sữa và thường gây ra những khó khăn trong quá trình tiêu hóa, đặc biệt ở trẻ sơ sinh. Triệu chứng thường thấy là khó chịu ở bụng, tiêu chảy, bị vọp bẻ, đầy hơi, nôn và buồn nôn, khi dùng sữa. Một vấn đề khác có liên quan đến việc không dung hòa lactose là tình trạng thiếu canxi do không dùng sữa. Ngoài ra, VK khu trú trong ruột kết không lên men tiêu hóa được lactose sẽ sản xuất acid và khí, gây ra các triệu chứng như đau bụng, sưng phù và tiêu chảy. Các dòng probiotic đã được chứng minh là có thể giải quyết vấn đề không dung hòa được lactose nhờ khả năng sản xuất lactase và tăng nồng độ β-galactosidase ở ruột non. Do vậy, người ta cho các bệnh nhân không dung hòa được lactose sử dụng probiotic. Các dòng probiotic sẽ thủy phân lactose trong sữa uống và lactose sẽ được đồng hóa, đồng thời canxi cũng được hấp thu [58].  Cơ chế bảo vệ răng miệng của vi khuẩn Probiotic nói chung và Lactobacillus spp. nói riêng Vi khuẩn probiotic có tác động trực tiếp lên các tế bào khác và môi trường xung quanh chúng. Các cơ chế kháng này được chia như sau:  Tác động trực tiếp lên tế bào vi khuẩn khác  Tăng khả năng miễn dịch của vật chủ  Ức chế vi khuẩn khác thông qua khả năng sinh hydrogen peroxide, bacteriocins, và một số acid hữu cơ. 27
Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3. Cơ chế tác động của Lactobacillus spp. lên những vi khuẩn trong khoang miệng [44]. 28
Đồ án tốt nghiệp 1.2.6. Tình hình nghiên cứu và sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc probiotic  Các sản phẩm thực phẩm chứa probiotic từ sữa Hình 1.4. Các dạng sản phẩm từ sữa có chứa probiotic [91] Ở Việt Nam hiện nay, các sản phẩm thực phẩm có chứa probiotic thường được sản xuất ở dạng sữa chua (Vinamilk, Dutch Lady ) hoặc sữa chua uống (Yakult, Probi). Ngoài ra, gần đây còn có các sản phẩm sữa bột cho trẻ nhỏ (Nestle Nan 1, 2) hoặc sản phẩm kẹo có chứa vi khuẩn probiotic (Kẹo Huro). 29
Đồ án tốt nghiệp  Chế phẩm probiotic Theo tổ chức lương thực và thực phẩm Quốc Tế (FAO) [82]. Một chủng VSV được sử dụng tạo chế phẩm probiotic cần phải đảm bảo tiêu chuẩn sau đây:  Giống dùng cho probiotic phải mang tính đại diện và được công nhận chung về tính an toàn cho người và vật nuôi (GRAS microorganism) [65] [72].  Có nguồn gốc từ người được chứng minh an toàn cho người.  Có khả năng sống sót trong điều kiện acid ở dạ dày, nồng độ acid mật và kháng sinh trong ruột.  Có khả năng kết bám vào biểu mô ruột, định cư và tăng trưởng nhanh về số lượng trong ruột người.  Góp phần điều chỉnh tích cực chức năng của ruột.  Khả năng ảnh hưởng đến hoạt tính biến dưỡng như đồng hóa cholesterol và lactose, tạo ra các vitamin và giải phóng các enzyme có lợi giúp cho việc tiêu hóa thức ăn được diễn ra dễ dàng, hấp thu các chất dinh dưỡng cần thiết và khử các chất có khả năng gây ung thư và các hợp chất độc hại [73] [75].  Tạo ra chất có hoạt tính kháng khuẩn và kháng mầm bệnh ở người như sản sinh acid L - lactic và những chất ức chế VK gây hại.  Có khả năng tiết ra các chất có hoạt tính sinh học có thể kích thích đáp ứng miễn dịch, làm gia tăng chức năng phòng thủ của mạng lưới tế bào chủ.  Có khả năng tồn tại trong suốt quá trình sản xuất và bảo quản bằng đông khô. Chế phẩm probiotic hiện nay rất đa dạng với nhiều hình thức khác nhau. Một trong những chế phẩm probiotic được biết đến phổ biến với tên thường gọi là “men vi sinh”. Chúng tồn tại ở các dạng như cốm, bột, lỏng, viên nén, chứa VSV có thể ở dạng sống, chết đông khô, xác VK. Các sản phẩm probiotic có thể phối hợp nhiều chủng VK (như L. acidophilus, L. sprorogenes, L. kefir, Streptococcus faecalis, ) hoặc chỉ sử dụng một chủng VK ( như L. acidophilus hay L. sprorogenes, ). [71] [75] 30
Đồ án tốt nghiệp Một số chế phẩm thông dụng ở dạng men tiêu hóa trên thị trường hiện nay như Antibio (Hàn Quốc), Probio (Việt Nam), Acidophilus (Mỹ), Biolactyl (Việt Nam), Lactéol (Pháp), Bio - acimin (Việt Nam), Biolactyl (liên doanh Pháp), L – bio - 3D (Việt Nam), Bioflora (Pháp), Các chế phẩm này được sử dụng nhằm khắc phục: các chứng bệnh về đường tiêu hóa, một số hạn chế do điều trị bằng KS dài ngày mang lại, điều trị tiêu chảy cấp, tăng cường khả năng miễn dịch, 1.3. Màng sinh học 1.3.1. Sự hình thành Các tế bào vi khuẩn sinh sống trôi nổi trong môi trường lỏng (dạng phù du) vô tình bám vào một bề mặt nào đó, và nếu sau một thời gian chúng không chịu tác động di chuyển đi nơi khác, quá trình sinh trưởng vẫn cứ tiếp tục, dần sẽ hình thành một kiểu khuẩn lạc trên bề mặt đó, đây là giai đoạn đầu của sự hình thành màng sinh học. Kế đến vi khuẩn sẽ bắt đầu thay đổi thay đổi kiểu hình, khả năng sinh hóa mới để thuận lợi hơn trong việc tổng hợp nên cơ chất ngoại bào - extracellular polymeric substance (EPS). Phân tích về mặt hình thái học kết hợp với di truyền học, người ta xác định rằng các tế bào xuất hiện cấu trúc tua, nhung mao hoặc tiên mao sẽ tăng thêm độ vững chắc của màng sinh học. Giai đoạn cuối của sự hình thành màng sinh học, các tế bào sẽ một lần nữa biến đổi quay lại dạng phù du, tách ra khỏi màng sinh học để tìm địa điểm định cư khác, giai đoạn này gọi là giai đoạn phát tán [11]. 31
Đồ án tốt nghiệp Hình 0.5. Các giai đoạn hình thành màng sinh học Hình 0.6. Mạng lưới EPS cùng tế bào vi khuẩn trong màng sinh học, hình thành dưới đáy một chai thủy tinh được chụp dưới kính hiển vi điện tử [12]. 32
Đồ án tốt nghiệp 1.3.2. Mạng lưới polymer ngoại bào (EPS) EPS là các polymer sinh học cao phân tử được vi sinh vật tiết ra ngoài môi trường sống xung quanh chúng. EPS là thành phần chính, đồng thời quyết định tính hóa lý của màng sinh học [13]. EPS chiếm từ 50 – 90% tổng lượng chất hữu cơ của một màng sinh học [14]. EPS chủ yếu là polysaccharide và một số protein. Ngoài ra còn có một lượng nhỏ các thành phần khác như: DNA, lipid, mùn đất. EPS là vật liệu giúp cho tế bào vi khuẩn bám dính lên một bề mặt nào đó và đồng thời liên kết với các tế bào khác. Đa số các loài trong chi Lactobacillus đều có khả năng tổng hợp EPS, nhưng chia thành hai dạng. Homopolysaccharides là dạng EPS được tổng hợp từ carbohydrate chủ yếu là dextran, glucan và levan. Trong khi dạng Heteropolysaccharides được tổng hợp từ nucleotide. Homopolysaccharides chủ yếu được tổng hợp từ loài lên men dị hình như L. pontis, L. frumenti, L. sanfranciscensis, và L. reuteri. Heteropolysaccharides được tổng hợp với số lượng ít, khoảng 0.1 – 1.5 g/l bởi những loài lên men đồng hình như L. kefiranofaciens, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. paracasei, L. rhamnosus, L. helveticus, và L. sakei [47]. 1.3.3. Tính chất Màng sinh học có thể là cả một quần thể vi khuẩn cùng nhau sinh trưởng và phát triển, quan hệ hợp tác hay cạnh tranh đều có thể diễn ra trong màng, phụ thuộc vào những loài có mặt trong đó [15]. Tính kỵ nước có một phần ảnh hưởng đến khả năng tạo màng sinh học của vi khuẩn. Vì nếu tế bào có tính kỵ nước thì lực tác động của các phân tử ngoại bào hoặc các tế bào khác lên chúng sẽ giảm đáng kể [16]. Một số vi khuẩn không có khả năng bám trực tiếp lên một bề mặt nào đó, nhưng lại có khả năng liên kết với mạng lưới cơ chất ngoại bào hoặc với tế bào vi khuẩn khác. Những vi khuẩn không có khả năng di động sẽ kéo theo hạn chế về khả năng bám dính [16]. 33
Đồ án tốt nghiệp Trong màng sinh học, các tế bào liên kết với nhau bằng mạng lưới do chúng tự tổng hợp nên EPS. EPS không chỉ bao gồm polysaccharides do tế bào tổng hợp ra, mà còn các thành phần từ môi trường xung quanh như các ion khoáng, bụi bẩn, hồng cầu, fibrin, protein và các acid nucleic [16]. Xen kẽ với mạng lưới EPS còn có các kênh nước, giúp vận chuyển chất dinh dưỡng và tín hiệu giữa các tế bào [17]. EPS sẽ bao phủ tế bào vi khuẩn, nhưng vẫn tạo điều kiện cho các tế bào trao đổi tín hiệu sinh hóa cũng như trao đổi gen với nhau. EPS chính là chìa khóa quan trọng cho việc sự hình thành, phát triển của màng sinh học. EPS còn có chức năng giữ cho các enzyme ngoại bào gần với tế bào, giúp hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn ổn định hơn [18]. Dù cùng loài nhưng nếu sinh trưởng trong màng sinh học thì vi khuẩn sẽ có một số đặc tính khác biệt rõ ràng hơn so với dạng phù du. Một nghiên cứu đã cho thấy trong một số trường hợp khả năng kháng các chất diệt khuẩn, chất kháng sinh của vi khuẩn trong màng sinh học cao hơn gấp 1000 lần so với dạng phù du [19]. Mức độ hình thành màng sinh học phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: mật độ vi khuẩn, hàm lượng chất dinh dưỡng, độ bão hòa, pH, thành phần dinh dưỡng trong môi trường, độ tĩnh và hệ gen của vi khuẩn [22]. 1.3.4. Phân bố 1.3.4.1. Trong tự nhiên Màng sinh học có ở khắp nơi trong mọi cơ thể sống. Ngoài ra màng sinh học còn có thể hình thành trong cả những môi trường cực kỳ khắc nghiệt: dưới dòng chảy mạnh, nhiệt độ cao trong suối nước nóng, môi trường độ kiềm/acid cao, các hồ đông lạnh. Ta có thể dễ dàng tìm thấy màng sinh học có thể trên các tảng đá, sỏi ở những con sông. Màng sinh học cũng nằm trong chuỗi thức ăn của động vật dưới nước. Màng sinh học hình thành trên hoặc trong thân cây thì lại góp phần gây bệnh cho cây, ngoại trừ 34
Đồ án tốt nghiệp trường hợp màng sinh học của vi khuẩn Rhizobium (vi khuẩn nốt sần) ở rễ cây họ đậu. Một số bệnh ở cây trồng do sự hình thành màng sinh học: Citrus Canker (bệnh thối quả ở chi cam chanh); Pierce (nho héo lá); bệnh đốm trắng cà chua, ớt [20]. Màng sinh học còn được tìm thấy bên trong các đường ống nước, đặc biệt là ống nước thải, gây tắc nghẽn và ăn mòn. Trường hợp xuất hiện trong đường ống dẫn nước lạnh/nóng thì sẽ giảm khả năng truyền nhiệt đáng kể [21]. Màng sinh học xuất hiện trên vỏ của các con tàu sẽ hỗ trợ cho sự neo bám của các sinh vật khác và bùn đất. Điều này kiến cho vận tốc di chuyển của tàu giảm đi một phần đáng kể, bên cạnh đó còn phát sinh khoảng chi phí vệ sinh đáy tàu (cạo bỏ sinh vật biển). Hình 0.7. Vi sinh vật, bùn đất bám dưới đáy tàu thông qua sự hình thành màng sinh học 35
Đồ án tốt nghiệp Hình 0.8. Vi khuẩn chịu nhiệt hình thành màng sinh học dày khoảng 20 mm trong hồ nước nóng Mickey, Oregon [47]. 1.3.4.2. Trong cơ thể sống a) Đường ruột Trong cơ thể người, màng sinh học được tìm thấy nhiều nhất trong đường ruột, một trong những môi trường ẩm ướt nhưng ấm áp, cực kỳ thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn. Một nghiên cứu gần đây đã cho rằng hệ miễn dịch trong cơ thể chúng ta đang hỗ trợ cho vi khuẩn trong ruột già tạo mảng bám. Từ phát hiện này người ta đã đưa ra một số giả thuyết về chức năng của ruột thừa. Trong ruột thừa chứa một lượng lớn mảng bám vi khuẩn, vì thế khi ruột già bị tổn thương, hệ vi sinh vật trong ruột đang mất cân bằng thì vi khuẩn trong ruột thừa có thể giúp hồi phục lại hệ vi khuẩn trong đường ruột [23]. b) Khoang miệng Khi xuất hiện trong khoang miệng, màng sinh học được gọi là mảng bám răng. Chúng hình thành ở mọi nơi trong khoang miệng kể cả trên răng giả. Phần nước chiếm 36
Đồ án tốt nghiệp khoảng 80 – 90% trong mảng bám, trong khi 70% phần khô là vi khuẩn, còn lại là các hợp chất polysaccharides và glycoproteins [24]. Các yếu tố sinh thái trong khoang miệng góp phần thúc đẩy sự hình thành của mảng bám răng. Phổ pH bình thường trong miệng là 6 – 7, trong khi màng sinh học được hình thành trong phổ pH 6.7 – 8.3 [25]. Và ngoài vai trò như là một chất đệm, nước bọt còn chứa một số yếu tố dinh dưỡng như acid amin, protein và glycoprotein. Chế độ ăn uống chỉ đóng một vai trò nhỏ trong việc cung cấp nơi cư trú cho vi khuẩn [31]. Sự oxy hóa-khử của vi khuẩn hiếu khí đã góp phần cho lượng oxy trong khoang miệng ở trạng thái bán ổn định, tạo điều kiện cho toàn quần thể vi khuẩn tồn tại. 1.4. Sâu răng 1.4.1. Bệnh học 1.4.1.1. Định nghĩa Sâu răng là hiện tượng các tổ chức cứng của răng (men, ngà và cement) bị tổn thương, đặc trưng bởi sự khử khoáng ở men răng, ngà răng tạo thành các lỗ sâu và không hoàn nguyên được. Có nhiều định nghĩa về bệnh sâu răng, dựa trên những nghiên cứu và nhận xét khác nhau về nguyên nhân cũng như tiến trình của bệnh, sâu răng có thể được định nghĩa như sau: - Bệnh sâu răng là một quá trình động, diễn ra trong mảng bám vi khuẩn dính trên mặt răng, đưa đến mất cân bằng giữa mô răng với chất dịch xung quanh và theo thời gian, hậu quả là sự mất khoáng của mô răng [27]. - Là bệnh nhiễm trùng của mô răng biểu hiện đặc trưng bởi các giai đoạn mất và tái khoáng xen kẽ nhau [28]. 1.4.1.2. Lịch sử Sâu răng là một bệnh phổ biến trên toàn thế giới, xảy ra ở mọi lứa tuổi, giới tính, dân tộc. Bệnh đã có từ rất lâu đời, nhưng chỉ thực sự nghiêm trọng khi đồ ngọt trở 37
Đồ án tốt nghiệp thành thứ không thể thiếu trong chế độ ăn uống của con người. Trong các bệnh thường gặp ở trẻ em, sâu răng đứng thứ hai sau bệnh hen suyễn [29]. Suốt một thể kỷ qua người ta tin rằng mọi quần xã vi sinh vật có trong miệng đều có thể gây sâu răng và việc chữa trị duy nhất đó là đánh răng – loại bỏ các mảng bám vi khuẩn. Trong thế chiến thức I, II và chiến tranh Triều Tiên, lý do bị từ chối đi nghĩa vụ quân sự nhiều nhất đó là sâu răng. Cuối thế kỷ 19, với dự đoán: nếu một người sống đủ lâu thì sau này chắc chắn sẽ không còn răng, người ta đã phân ra nhánh mới riêng biệt trong nền y học lúc bấy giờ - nha khoa, với mức đầu tư 34 tỷ đô la (năm 1990). Tới những năm cuối thế kỷ 20 thì bệnh sâu răng có thể kiểm soát và phòng ngừa. Gần 50% trẻ nhỏ không bị sâu răng và tỷ lệ sún răng ở người cao tuổi giảm từ 50% xuống còn 20% [30]. Dù không nguy hiểm đến tính mạng nhưng sự khó chịu khi sâu răng và chi phí cho việc chữa trị/phòng ngừa là không hề nhỏ (đứng thứ 3 sau tim mạch và ung thư). 1.4.1.3. Dấu hiệu và triệu chứng Dấu hiệu sớm nhất của bệnh là sự xuất hiện các đốm phấn trắng trên bề mặt răng, đây là vùng men răng đang bị khử khoáng [31]. Khi các thương tổn tiếp tục diễn ra thì lúc này vùng men sẽ chuyển sang màu nâu và bắt đầu lõm xuống, gọi là lỗ sâu. Ở giai đoạn đốm trắng, men răng vẫn có thể tái khoáng hóa bởi các ion Ca2+ có trong nước bọt. Ở giai đoạn hình thành lỗ sâu thì men răng hoàn toàn không có khả năng tái khoáng hóa nhưng quá trình khử khoáng vẫn có thể bị dừng lại [32]. 38
Đồ án tốt nghiệp Hình 0.9. Đốm trắng – dấu hiệu đầu tiên của sự khử khoáng ở men răng. Khi cả men răng và ngà răng đồng thời bị khử khoáng thì lỗ sâu càng dễ nhìn thấy bằng mắt thường, và không cứng chắc như trước. Lúc này tủy răng và mạch máu có thể bị hở ra, chịu tác động bởi lực bên ngoài nhiều hơn, dẫn đến các cảm giác đau nhói khi nhai hoặc tiếp xúc với đồ ăn nóng/lạnh và kể cả ngọt. Hình 0.10. Răng bị tổn thương nghiêm trọng do quá trình khử khoáng. Răng sâu còn là một trong những nguyên nhân gây hôi miệng. Trường hợp xấu hơn là nhiễm trùng lan sang vùng mô mềm (nướu). Biến chứng có thể xảy ra là nghẽn mạch hang xoang, viêm họng Ludwig, đe dọa đến tính mạng của người bệnh. 39
Đồ án tốt nghiệp 1.4.1.4. Nguyên nhân Cần có bốn yếu tố chính đồng thời xuất hiện để gây nên triệu chứng sâu răng: men răng hoặc ngà răng, vi khuẩn gây sâu răng, nguồn carbohydrates (thường là sucrose) và thời gian [33]. Mức độ sâu răng thì lại phụ thuộc vào hình dáng của răng, thói quen vệ sinh răng miệng, thành phần nước bọt, Sự sâu răng có thể xảy ra ở bất kỳ nơi nào trên răng. Sâu răng là do sự xuất hiện và phát triển của mảng bám (màng sinh học) trên răng. Các vi khuẩn trong mảng bám sinh acid khi có sự hiện diện của các nguồn carbohydrates khác nhau như sucrose, fructose và glucose. Hình 0.11. Giản đồ mô tả lý thuyết nguyên nhâu gây sâu răng. a) Vi khuẩn Khoang miệng của người chứa vô số vi khuẩn, nhưng chỉ một số ít trong đó có khả năng gây sâu răng, đáng nói đến nhất là Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus và một số loài trong chi Lactobacillus. Đặc tính để quyết định vi khuẩn có khả năng gây sâu răng hay không bao gồm: khả năng tạo nên màng sinh học trên bề mặt răng, sinh ra một lượng acid lactic cao khi lên men đường, khả năng sinh trưởng trong môi trường pH thấp [34]. 40
Đồ án tốt nghiệp Những vi khuẩn này đa số đều có mặt trong mảng bám răng miệng, nhưng chỉ với mật độ rất thấp, chưa đủ để gây nên sự khử khoáng men răng. Nhưng nếu không trực tiếp vệ sinh mảng bám thường xuyên hoặc lượng đường trong miệng liên tục cao, thì sẽ diễn ra sự mất cân bằng mật độ vi khuẩn trong mảng bám. Lúc này mật độ của những vi khuẩn gây sâu răng sẽ tăng cao, dẫn đến sự mất cân bằng pH trong khoang miệng và gây sâu răng. Mảng bám thường hình thành ở những nơi chịu ít tác động của quá trình nhai nghiền thức ăn và vệ sinh răng miệng. Những vi khuẩn gây sâu răng, thường lây từ người lớn sang trẻ nhỏ thông qua việc bú sữa mẹ, hành động mớm ăn và hôn của người chăm sóc trẻ [35]. b) Nguồn carbohydrates Vi khuẩn có khả năng lên men đường glucose, fructose và nhất là sucrose (đường ăn) thành acid (thường là acid lactic). Khi acid tiếp xúc với răng sẽ diễn ra quá trình khử khoáng, gây sâu răng. Dù vậy nhưng acid sinh ra bởi quá trình lên men đường của vi khuẩn có thể bị trung hòa bởi nước bọt hoặc nước súc miệng. Đối với môi trường có 2 nguồn đường glucose và fructose thì khả năng gây sâu răng không cao so với môi trường chỉ có một nguồn đường sucrose. Dù rằng sucrose là đường đôi được cấu thành từ 1 đơn vị đường đơn glucose và fructose. Lý do là vì vi khuẩn gây sâu răng cần sử dụng năng lượng của liên kết saccharide giữ glucose và fructose trong phân tử sucrose để tạo ra một hợp chất kết dính dextran polysaccharide bởi enzyme dextransucranase. n sucrose  (glucose)n + n fructose c) Thời gian Thời gian răng bị phơi nhiễm trong môi trường acid sẽ quyết định sự sâu răng. Sau những bữa ăn, vi khuẩn sẽ bắt đầu lên men đường và sinh acid làm giảm pH. Trong khoảng thời gian nước bọt có thể trung hòa lại pH môi trường trong khoang 41
Đồ án tốt nghiệp miệng, thì một lượng khoáng trên men răng đã bị trung hòa. Vì thế sự khử khoáng gây sâu răng phụ thuộc khá nhiều vào tần suất phơi nhiễm trong môi trường pH thấp. d) Răng Hàm lượng khoáng chiếm đến 96% trong men răng. Sự khử khoáng bắt đầu xảy ra khi pH môi trường đạt 5.5 [36]. Ngà và lớp cementum dễ bị tổn thương hơn vì chúng có hàm lượng khoáng thấp hơn men răng [37]. Có một số bệnh rối loạn ở răng nhất định ảnh hưởng đến mức độ gây sâu răng của cá thể. Bệnh hụt khoáng răng ngày càng phổ biến [38]. Nguyên nhân có thể là do yếu tố di truyền hoặc chế độ dinh dưỡng. Ngoài ra các trường hợp khác như nồng độ dioxins, polychlorinated biphenyl (PCB) cao trong sữa mẹ; trẻ sinh non, thiếu oxy trong lúc sinh; các rối loạn nhất định trong 3 năm đầu đời của trẻ như bệnh quai bị, bạch hầu, sốt xuất huyết, sởi, suy giáp, suy dinh dưỡng, cũng ảnh hưởng đáng kể đến mật độ khoáng của răng [39] [40]. Nhưng dù sao rối loạn do bệnh tật cũng không phải là nguyên chính gây sâu răng. Trường hợp thức ăn bị mắc lại trong các lỗ sâu, chân răng, kẽ răng cũng là nguyên nhân dẫn đến gây sâu răng. e) Yếu tố khác Khả năng tiết nước bọt thấp sẽ tăng mức độ sâu răng, do tốc độ trung hòa pH trong môi trường khoang miệng diễn ra chậm. Một số hiệu thuốc lá không khói chứa hàm lượng đường cao, làm tăng khả năng gây sâu răng [41]. Việc hút thuốc có thể dẫn đến bệnh nha chu, khiến nướu co lại, để hở chân răng và tạo khoảng trống thuận lợi cho sự hình thành mảng bám. 42
Đồ án tốt nghiệp 1.4.2. Điều trị Nên kết hợp giữa đánh răng và dùng chỉ nha khoa thường xuyên để loại bỏ triệt để mảng bám vi khuẩn. Khám răng định kỳ mỗi 6 tháng để chuẩn đoán trạng thái của răng vì các dấu hiệu ban đầu của bệnh sâu răng rất khó nhận thấy. Hơn nữa chỉ có nha sĩ mới có đầy đủ phương tiện và khả năng chuyên môn để chẩn đoán, điều trị và đưa ra những lời khuyên cần thiết cho hàm răng của bạn. Nếu đợi đến khi răng đau rồi mới đi gặp nha sĩ thì việc điều trị sẽ trở nên phức tạp hơn, có khi phải chữa tủy răng, mổ nướu răng hay phải nhổ răng vì đã quá muộn. Phương pháp phủ Sealant cũng nên được cân nhắc đến. Phương pháp này thường dành cho trẻ em và thanh thiếu niên, những chất liệu nha khoa phủ trên bề mặt nhai của răng che phủ đi tâm tinh thể HA, hạn chế được quá trình khử khoáng. Những nghiên cứu khoa học cho thấy ngoài việc Florua đóng vai trò ức chế sự khử khoáng của acid lên men răng, với một nồng độ cao nhất định Florua còn có khả năng diệt khuẩn [42]. Do vậy, Florua trong các sản phẩm răng miệng là một vũ khí vô cùng lợi hại trong việc phòng ngừa sâu răng. Chỉ nên đáp ứng nhu cầu năng lượng của cơ thể bằng những nguồn carbohydrates có trong trái cây, rau đậu, ngũ cốc, tinh bột. Hạn chế tối đa dùng những thực phẩm được chế biến từ sucrose (bánh kẹo, syrups, nước ngọt). Ngoài ra trái cây, rau quả còn có nhiều chất xơ (fiber) tác động làm sạch răng. Bên cạnh đó có thể dùng đường xylitol thay thế các loại đường ăn thông thường để tăng khẩu vị trong thực phẩm, vì vi khuẩn không thể lên men được xylitol. Tránh những thức ăn dẻo, loại thức ăn này rất dễ bám quanh răng, tạo điều kiện cực kỳ thuận lợi cho mảng bám vi khuẩn phát triển. Từ bỏ thói quen ăn ngọt giữa các bữa ăn. Ăn vặt sẽ làm tăng các khoảng thời gian men răng phơi nhiễm trong môi trường có pH thấp. Nếu phải uống soda, cam, chanh thì nên dùng ống hút, tránh để chúng tiếp xúc với răng (cam chanh có tính acid sẽ khử khoáng men răng). Nên súc miệng ngay sau khi ăn ngọt hoặc dùng xong các loại nước uống có tính acid. 43
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Địa điểm nghiên cứu Phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh. 2.2. Thời gian thực hiện Đề tài được thực hiện trong 15 tuần, từ ngày 03/04/2017 đến ngày 16/07/2017. 2.3. Vật liệu và thiết bị 2.3.1. Thiết bị - Dụng cụ - Máy đo quang phổ (UV – Vis) specific 20 genesis (USA) - Máy đo pH Horiba (Nhật Bản) - Autoclave (Memmmert – Đức) - Kính hiển vi quang học Olympus – Nhật Bản - Cân phân tích, cân kỹ thuật - Tủ cấy vô trùng, tủ ấm (Memmmert – Đức), tủ sấy (Memmmert – Đức) - Lò vi sóng (Microwave) - Pipetteman 100 – 1000 µl - Bếp điện - Bông thấm nước, bông không thấm nước - Giấy lọc, lame, lamell - Các dụng cụ thí nghiệm: becher, erlen, que cấy, đèn cồn, bình định mức, ống đong, pipette, 2.3.2. Hóa chất Các hóa chất dùng để pha các loại thuốc nhuộm, thuốc thử, chất chỉ thị màu: 44
Đồ án tốt nghiệp _ Safranine _ Ethanol 95% _ Chất chỉ thị màu Bromoresol green, Bromocresol purple _ Chất chỉ thị màu Methyl red, Phenol red _ Malachite green _ Phenolphthalein _ NaOH, KOH _ NaCl _ H2O2 2.3.3. Giống vi khuẩn lactic Sử dụng giống đã phân lập được từ đồ án “Phân lập vi khuẩn Lactic trong khoang miệng có khả năng ức chế sự tạo màng sinh học của một số Lactobacillus spp.” của bạn Nguyễn Tuấn Anh – 1311100138 – 13DSH02. Năm chủng vi khuẩn gây bệnh: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium do bạn Nguyễn Tuấn Anh – 1311100138 – 13DSH02 cung cấp. 2.4. Phương pháp luận  Mục tiêu: Khảo sát các vi khuẩn lactic phân lập từ khoang miệng có khả năng ức chế sự tạo thành màng sinh học Lactobacillus fermentum hay không.  Nội dung: _ Tiến hành các thử nghiệm sinh lý, sinh hóa. _ Khảo sát khả năng kháng khuẩn. _ Khảo sát khả năng kháng kháng sinh. _ Xác định độ an toàn và khả năng ức chế màng sinh học của Lactobacillus fermentum. 45
Đồ án tốt nghiệp LAB có khả năng ức chế sự tạo màng sinh học của L. fermentum Sinh dưỡng Chịu mặn Citrate Sinh H2S VP - MR kị khí 3.5 - 6.5% NaCl Thử nghiệm Khả năng lên men sinh hóa carbohydrates Thử nghiệm Sinh dưỡng sinh lý 10oC, 45oC, 60oC Vòng indole Lactobacillus spp. Khảo sát Gelatinase β-galactosidase E.coli Staphylococcus aureus Hệ enzyme Kh ả năng kháng khuẩn Bacillus subtilis Caseinase Thủy phân Salmonella typhimurium Pseudomonas aeruginosa hồng cầu 0oC Ampicilli Chloramphenicol n Khả năng ức chế sự tạo màng Khả năng kháng kháng sinh sinh học của L. fermentum sau 80oC khi bị xử lý nhiệt Penicillin Streptomycin 100oC Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu 46
Đồ án tốt nghiệp 2.5. Phương pháp thí nghiệm 2.5.1. Thử nghiệm sinh lý 2.5.1.1. Khả năng sinh dưỡng ở 10oC, 45oC, 60oC trong 48 giờ _ Bước 1: Chuẩn bị 200ml môi trường MRS broth, phối môi trường vào các ống nghiệm mỗi ống 10ml, hấp tiệt trùng. _ Bước 2: Cấy giống vi khuẩn lactic vào các ống nghiệm chứa môi trường đã tiệt trùng, sau đó ủ ở nhiệt độ 10oC, 45oC, 60oC trong 24 giờ và 48 giờ _ Bước 3: Quan sát kết quả. Kết luận 2.5.1.2. Khả năng chịu mặn: NaCl 3,5% và 6,5% trong 48 giờ _ Bước 1: Chuẩn bị 100ml môi trường MRS broth, NaCl 3,5% và 100ml môi trường MRS broth, NaCl 6,5%, phối môi trường vào các ống nghiệm mỗi ống 10ml, hấp tiệt trùng. _ Bước 2: Cấy giống vi khuẩn lactic vào các ống nghiệm chứa môi trường đã tiệt trùng, sau đó ủ ở nhiệt độ 37oC trong 48 giờ. _ Bước 3: Quan sát kết quả. Kết luận. 47
Đồ án tốt nghiệp 2.5.1.3. Khả năng sinh bào tử Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử (dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipid). Đầu tiên xử lý để tế bào chất bào tử dễ bắt màu bằng nhiệt và acid. Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh. Tẩy màu tế bào chất của tế bào và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm khác bổ sung. Nhờ đó tế bào chất của bào tử và tế bào chất của tế bào bắt màu phân biệt. Trong đó bào tử sẽ có màu xanh và tế bào có màu hồng. Sử dụng sinh khối vi khuẩn khi đã già (khoảng 7 ngày) để nhuộm bào tử. Từ kết quả thu được ta loại bỏ các chủng có bào tử, do LAB là vi khuẩn Gram dương không sinh bào tử. Tiến hành: dùng phương pháp Schaeffer-Fulton - Nuôi cấy vi khuẩn ở 37oC, 5 – 7 ngày. - Làm vết bôi và cố định tế bào trên lame như đối với nhuộm Gram. - Nhuộm bằng dung dịch Malachite green trong 10 phút, đặt trên 1 cốc nước đun sôi, rửa nước, thấm khô. - Nhuộm lại bằng dung dịch Safranine trong 30 – 90 giây, rửa nước, thấm khô. - Soi kính: dùng vật kính dầu 100x Kết quả: Bào tử có màu lục, tế bào sinh dưỡng có màu đỏ. 2.5.1.4. Khả năng sinh dưỡng kỵ khí _ Bước 1: Chuẩn bị 100ml môi trường MRS broth, phối môi trường vào các ống nghiệm mỗi ống 10ml, hấp tiệt trùng. _ Bước 2: Cấy giống vi khuẩn lactic vào các ống nghiệm chứa môi trường đã tiệt trùng, bơm 1 lớp parafin có độ dày 1cm, sau đó ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ. _ Bước 3: Quan sát kết quả. Kết luận. 48
Đồ án tốt nghiệp 2.5.2. Thử nghiệm sinh hóa Các phương pháp sinh hóa sau đây được thực hiện như trong mô tả của cuốn: Microbiological Methods” C.H. Collins, P.M. Lyne, J.M. Grange & J.O. Falkinham III (2004). 2.5.2.1. Thử nghiệm lên men carbohydrate Thử nghiệm này nhằm kiểm tra xem vi sinh vật có khả năng lên men các loại đường nào. Các loại đường được sử dụng là: Arabinose, Cellobiose, Galactose, Glucose, Lactose, Maltose, Mannitol, Mannose, Ribose, Salicin, Sorbitol, Sorbose, Sucrose, Glycerol. Kết quả từ thí nghiệm này giúp ta định danh đến cấp giống các chủng vi khuẩn lactic phân lập được dựa theo khóa phân loại của Bergey. Môi trường và thuốc thử: _ Peptone 10g _ NaCl 5g _ Cao thịt 1g _ Bromocresol purple 0,17g _ Carbohydrate 1% (Arabinose, Cellobiose, Galactose, Glucose, Lactose, Maltose, Mannitol, Mannose, Ribose, Salicin, Sorbitol, Sorbose, Sucrose, Glycerol) _ Nước cất 1000ml _ Điều chỉnh pH = 7.0 ± 0.2 tại 25oC. Tiến hành: - Chuẩn bị môi trường test đường: Phối môi trường cơ bản (không chứa đường) vào trong các lọ thủy tinh, sau đó đem hấp khử trùng. Đường được cân riêng lẻ trong các eppendorf vô trùng và được phơi dưới tia UV trong 20 phút (khoảng cách với đèn là 10cm). Sau khi hấp khử trùng môi trường cơ bản, tiến hành hòa đường vào từng lọ 49
Đồ án tốt nghiệp chứa môi trường. Dùng micropipette phối 500휇l các loại môi trường vào các giếng trong đĩa giếng 48. - Dùng micropipette cấy 20휇l giống vào trong các giếng, ủ 37oC trong 24 giờ. Kết quả: Dương tính: Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường (sinh acid) thì môi trường chuyển sang màu vàng. Việc môi trường chuyển màu không hoàn toàn cũng được đánh giá là dương tính yếu. Âm tính: Nếu môi trường vẫn giữ nguyên màu tím, nghĩa là vi khuẩn không có khả năng lên men đường. 2.5.2.2. Thử nghiệm VP (Voges proskauer) Acid pyruvic là một hợp chất quan trọng trong quá trình lên men glucose, được tạo thành thông qua các quá trình trao đổi chất khác nhau, phụ thuộc vào các hệ thống enzyme của các vi khuẩn khác nhau. Trong số đó sẽ có một con đường trao đổi chất sản xuất ra acetion (acetyl methyl carbinol), một sản phẩm tạo thành của con đường butylene glycol (sản phẩm cuối cùng của phản ứng trung hòa). Các chủng sinh vật thuộc các nhóm Klebsiella-Enterobacter-Hafnia-Serratia sẽ sản xuất acetoin như là sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi chất glucose và tạo thành một lượng nhỏ acid hỗn hợp. Trong điều kiện tiếp xúc với oxy trong khí quyển và 40% kali hydroxyde, acetoin chuyển hóa thành diacetyl, alpha-naphthol đóng vai trò là chất xúc tác để tạo ra một phức hợp màu đỏ. Môi trường và thuốc thử: _ Môi trường: MR – VP broth _ Thuốc thử:  훼 – naphthol: 5g 훼 – naphthol + 100ml cồn tuyệt đối  KOH 40%: 40g KOH + 100ml nước cất 50
Đồ án tốt nghiệp Tiến hành: - Chuẩn bị 100ml môi trường MR – VP, phối môi trường vào các ống nghiệm mỗi ống 10ml, hấp tiệt trùng - Cấy giống vi khuẩn lactic vào các ống nghiệm chứa môi trường đã được tiệt trùng, ủ ở 37oC trong 24 giờ. - Hút 1ml dịch nuôi cấy cho vào ống nghiệm sạch. Bổ sung 0,6ml 훼 – naphthol 5% và 0,2ml KOH 40% (Lưu ý: Bổ sung thuốc thử theo trình tự này sẽ cho kết quả tốt nhất). - Lắc nhẹ và giữ cố định các ống nghiệm trong 10 – 15 phút. Quan sát kết quả và kết luận. Kết quả: Dương tính: ống nghiệm xuất hiện màu đỏ sau 15 phút cho thuốc thử vào. Điều này cho thấy sự của mặt của diacetyl, do quá trình oxy hóa acetoin tạo thành. Âm tính: màu không đổi sau khi cho thuốc thử 15 phút.  Lưu ý: Không nên đọc kết quả sau khi cho thuốc thử hơn 1 giờ, vì khi đó môi trường MR – VP sẽ có màu đỏ đồng do các chủng vi khuẩn âm tính VP hình thành, gây sai lệch kết quả. 2.5.2.3. Thử nghiệm MR (Methyl red) Xét nghiệm Methyl Red (MR) xác định xem vi khuẩn có lên men glucose tạo hỗn hợp acid hay không. Các loại và tỉ lệ của các sản phẩm lên men là một trong những đặc tính phân loại chính giúp phân biệt các loại vi khuẩn đường ruột khác nhau. Trong quá trình lên men tạo hỗn hợp acid, ba acid (acetic, lactic và succinic) được tạo thành với số lượng đáng kể. Mỗi mol glucose được lên men sẽ cho ra 4 mol các sản phẩm có tính acid (acid lactic và chủ yếu là acetic), 1 mol các sản phẩm lên men trung tính (ethanol), 1 mol CO2 và 1 mol H2. 51
Đồ án tốt nghiệp Lượng lớn acid tạo thành làm giảm đáng kể độ pH của môi trường đến dưới 4,4. Điều này được phát hiện bằng cách sử dụng chỉ thị pH, methyl red (p- dimethylaminoaeobenzene-O-carboxylic acid), nếu pH trên 5.1 sẽ cho màu vàng hoặc cam và màu đỏ khi pH 4.4. Methyl red có phổ pH phát hiện axit thấp hơn đáng kể so với các loại thuốc thử khác được sử dụng trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Do đó, để tạo ra sự thay đổi màu sắc, vi khuẩn thử nghiệm phải sản xuất một lượng lớn acid khi lên men carbohydrate đang được sử dụng. Tiến hành: - Sử dụng các ống nghiệm nuôi cấy chủng vi khuẩn lactic trong môi trường MR – VP của thử nghiệm Voges proskauer ủ tiếp ở 37oC trong 4 ngày. Sau đó, hút 1ml dịch nuôi cấy cho vào ống nghiệm sạch. Thêm vào mỗi ống 5 giọt Methyl red. Kết quả: Dương tính: xuất hiện màu đỏ sau khi thêm thuốc thử. Màu đỏ là do vi khuẩn lên men glucose, sản xuất acid làm pH môi trường giảm xuống còn 4.4 hoặc thấp hơn. Âm tính: không có màu đỏ xuất hiện hoặc có màu cam sau khi thêm thuốc thử. Màu cam xuất hiện là do vi khuẩn sản xuất ít acid nên pH môi trường cao hơn 4.4. 2.5.2.4. Thử nghiệm Citrate Thử nghiệm Citrate được sử dụng để xác định khả năng của vi khuẩn sử dụng Natri citrate như nguồn carbon duy nhất và là nguồn nitơ cố định duy nhất (NH4H2PO4) Khi một acid hữu cơ như citrate (trong chu trình Krebs) được sử dụng như một nguồn cacbon và năng lượng, carbonate có tính kiềm và bicarbonate được tạo ra. Ngoài ra, NH4OH được sản xuất khi muối amoni trong môi trường được sử dụng làm nguồn nitơ. Việc sử dụng citrate ngoại sinh đòi hỏi sự hiện diện của các protein vận chuyển citrate (permeases: protein mang). Khi tế bào hấp thu, citrate được tách bằng cytrate 52
Đồ án tốt nghiệp lyase thành oxaloacetate và acetate. Oxaloacetate sau đó được chuyển hóa thành pyruvate và CO2 . Quá trình chuyển hóa phụ thuộc vào độ pH của môi trường.  Trong môi trường kiềm: pyruvate được chuyển hóa thành acetate và formate.  Ở pH 7.0 và thấp hơn: lactate và acetoin cũng được sản xuất. CO2 được giải phóng sẽ phản ứng với nước và ion natri trong môi trường để tạo ra natri cacbonate, hợp chất kiềm sẽ làm tăng pH. Ngoài ra, NH4OH được sản xuất khi muối amoni trong môi trường được sử dụng làm nguồn nitơ. Quá trình tăng trưởng của vi khuẩn thường dẫn đến phản ứng làm bromothymol blue chuyển màu từ xanh lá sang xanh dương. Chỉ thị pH bromothymol blue có màu xanh lá đậm ở pH trung tính. Khi tăng pH đến trên 7.6, bromothymol blue chuyển sang màu xanh dương. Tiến hành: - Cấy vi sinh vật lên môi trường thạch nghiêng SCA, ủ ở 37oC trong 24 giờ. - Quan sát kết quả và kết luận Kết quả: Dương tính: vi khuẩn mọc trên mặt nghiêng của môi trường và môi trường sẽ có màu xanh dương. Do các cacbonate có tính kiềm và bicarbonate được tạo ra như là các sản phẩm phụ của quá trình dị hóa citrate làm tăng pH môi trường lên trên 7.6, làm cho bromothymol blue thay chuyển từ màu xanh lá ban đầu sang màu xanh dương. Âm tính: không nhìn thấy vi khuẩn mọc trên mặt nghiêng của môi trường, môi trường không đổi màu. 53
Đồ án tốt nghiệp 2.5.2.5. Thử nghiệm Indole Thử nghiệm Indole được sử dụng để xác định khả năng phân tách amino acid tryptophan để hình thành hợp chất indole. Tryptophan được thủy phân bằng tryptophanase để sản xuất ba sản phẩm cuối - một trong số đó là indole. Indole được phát hiện bởi chất thử Kovac’s hoặc Ehrlich có chứa 4(p) - dimethylamino benzaldehyde , thuốc thử phản ứng với indole tạo ra một hợp chất màu đỏ. Tiến hành: - Cấy chủng vi khuẩn lactic vào các ống nghiệm chứa môi trường canh tryptone, ủ ở 37oC trong 24 – 48 giờ. - Thêm 0,5ml thuốc thử Kovac’s vào dịch nuôi cấy. - Quan sát kết quả và kết luận. Kết quả: Dương tính: Có màu hồng sau khi thêm thuốc thử. Âm tính: Không đổi màu sau khi thêm thuốc thử. 2.5.2.6. Thử nghiệm khả năng sinh H2S trên môi trường TSI: Thử nghiệm nhằm xác định khả năng vi sinh vật sử dụng các nguồn carbohydrate có mặt trong môi trường, khả năng sinh H2S, khả năng sinh gas trong môi trường. Môi trường TSI chứa các nguồn carbohydrate: lactose 1%, sucrose 1%, glucose 0,1% là môi trường rắn sử dụng trong thử nghiệm sinh hóa. Trên môi trường này, vi sinh vật sử dụng cả 3 nguồn carbohydrate trên hay chỉ sử dụng glucose. Quá trình lên men này có thể sinh H2S và sinh gas hay không tùy vào từng loại vi sinh vật. Sự sử dụng các nguồn carbohydrate khác nhau ở hai điều kiện: hiếu khí phần nghiêng và kỵ khí phần sâu. Tiến hành: - Sử dụng que cấy thẳng lấy một ít sinh khối vi khuẩn lactic. 54
Đồ án tốt nghiệp - Đâm que cấy xuyên qua môi trường thạch (giữa ống nghiệm) cho đến khi gần chạm đáy ống nghiệm thì ngừng lại, tiếp tục dùng que cấy đó cấy ria trên mặt nghiêng của môi trường thạch. - Đậy nắp lỏng, ủ các ống nghiệm ở 37oC trong 18 – 24 giờ. - Quan sát kết quả và kết luận. Kết quả: Nếu vi sinh vật lên men được đường lactose hoặc sucrose, tạo ra một lượng lớn acid, làm cho chỉ thị phenol red chuyển thành màu vàng ở cả phần nghiêng và phần sâu của môi trường. Một số chủng còn kèm theo hiện tượng tạo khí, xuất hiện các bong bóng khí hoặc vết nứt trong môi trường. Nếu vi sinh vật không lên men đường lactose hoặc sucrose nhưng có lên men glucose, phần sâu của môi trường không tiếp xúc với oxy sẽ có màu vàng, nhưng ở phần trên acid sẽ bị oxy hóa thành CO2 và nước bởi các chủng vi sinh vật vì thế phần trên sẽ có màu đỏ (pH kiềm hoặc trung tính). Nếu không có bất kì loại đường nào bị được lên men, cả phần sâu và phần nghiêng của môi trường thạch sẽ có màu đỏ. Phần trên có thể có màu đỏ tím (có nhiều kiềm) là do quá trình oxy hóa các acid amine tạo ra NH3 (peptone là một thành phần chính của môi trường). Nếu có H2S sinh ra, màu đen của FeSO4 sẽ xuất hiện. 2.5.3. Khả năng sinh enzyme 2.5.3.1. Khả năng sinh enzyme thủy phân gelatin Gelatin là một protein có nguồn gốc từ collagen (protein) động vật, là một thành phần của mô liên kết và gân trên người cũng như các động vật khác. Nó đã được sử dụng như là một tác nhân làm đông đặc trong thực phẩm trong một thời gian 55
Đồ án tốt nghiệp dài. Robert Koch sử dụng gelatin có bổ sung chất dinh dưỡng như là một loại môi trường thạch tăng trưởng đầu tiên. Gelatin tan trong nước ở nhiệt độ 50oC và tồn tại ở dạng lỏng khi nhiệt độ trên 25oC, đông rắn hoặc tạo gel khi nhiệt độ dưới 25oC. Thử nghiệm này được sử dụng để xác định khả năng sinh ra các enzyme proteolytic ngoại bào, gelatinase thủy phân gelatin. Phản ứng xảy ra gồm hai bước lần lượt: phản ứng đầu tiên, gelatinase thủy phân gelatin thành polypeptide và sau đó polypeptide được chuyển đổi thành các acid amin. Acid amin bị lấy bởi các tế bào và được sử dụng cho mục đích trao đổi chất. Sự hiện diện của gelatinase được phát hiện bằng cách sử dụng môi trường gelatin có bổ sung dưỡng chất. Môi trường này là một môi trường đơn giản bao gồm gelatin, peptone và cao thịt bò. Khi cấy chủng vi sinh vật có khả năng sinh gelatinase vào ống nghiệm chứa môi trường gelatin, gelatinase tiết ra làm cho gelatin hóa lỏng, làm môi trường hóa lỏng theo. Trong khi các sinh vật không sinh gelatinase không tiết ra enzyme và không làm mềm môi trường. Môi trường và thuốc thử: _ Gelatin 120g _ Peptone 5g _ Cao thịt bò 3g _ Nước cất 1000ml _ Điều chỉnh pH = 6.8 ± 0,2 ở 25 ° C. Chuẩn bị: - Hoà tan tất cả các thành phần trong 1000ml nước cất hoặc nước khử khoáng. - Cho 2-3 ml môi trường vào ống nghiệm. - Hấp khử trùng các ống nghiệm ở 121°C trong 15 phút. - Để ống nguội ở tư thế thẳng đứng trước khi sử dụng. - Lưu trữ môi trường đã được chuẩn bị ở 2 – 8 oC 56
Đồ án tốt nghiệp Tiến hành: - Cấy giống vào ống nghiệm với tỷ lệ 1%. Ủ các ống nghiệm ở 37oC trong 14 ngày. - Sau quá trình ủ cho các ống thử nghiệm vào tủ lạnh ít nhất 30 phút để gelatin đông tụ (Gelatin có trạng thái lỏng ở 28oC trở lên). - Nghiêng ống nghiệm để xác định khả năng đông tụ. Kết luận kết quả. Lưu ý: Không lắc hoặc đảo ngược ống trước khi làm lạnh. Nhẹ nhàng đảo ngược để kiểm tra độ đặc/lỏng của các thử nghiệm sau 30 phút làm lạnh. Kết quả: Dương tính: Môi trường thử nghiệm hoàn toàn không còn khả năng đông tụ khi ở nhiệt độ thấp. Âm tính: Môi trường thử nghiệm vẫn còn khả năng đông tụ ở nhiệt độ thấp. 1. Lưu ý: Gelatinase thường hoạt động ở bề mặt môi trường. Lắc ống nghiệm khi ấm có thể kết luận âm tính sai. 2.5.3.2. Khả năng sinh enzyme thủy phân casein Tế bào tiết enzyme caseinase (enzyme ngoại bào) vào môi trường xung quanh, xúc tác sự phân hủy protein sữa (casein), thành các peptide kích thước nhỏ hơn và các amino acid riêng biệt được các vi sinh vật hấp thụ để sinh năng lượng và làm nguyên liệu tạo nên tế bào. Phản ứng thủy phân thạch sữa, làm sữa từ màu đục trở nên trong suốt tại khu vực vi sinh vật phát triển, vì casein sẽ chuyển hóa thành dạng hòa tan tạo thành các sản phẩm: các chuỗi amino acid nhỏ, dipeptide, polypeptide. Môi trường: Skim milk agar Tiến hành: - Cấy ria vi sinh vật cần thử nghiệm lên đĩa môi trường, sau đó ủ ở 37oC trong 24 giờ. Quan sát kết quả và kết luận. Kết quả: Giữ đĩa ở trước ánh sáng để quan sát kết quả 57
Đồ án tốt nghiệp Dương tính: có vùng trong suốt xuất hiện xung quanh vị trí khuẩn lạc phát triển. Âm tính: không có sự thay đổi màu sắc xung quanh vị trí khuẩn lạc phát triển 2.5.3.3. Thử nghiệm tan huyết Tan huyết là quá trình phá vỡ tế bào hồng cầu. Khả năng làm tan hồng cầu của các vi sinh vật khi nuôi trên thạch máu được sử dụng để phân loại các vi sinh vật nhất định. Điều này đặc biệt hữu ích khi phân loại các loài thuộc Streptococcus. Các hemolysin là các tác nhân làm tan hồng cầu động vật. Một số loài vi khuẩn sản xuất ra các enzyme ngoại bào có thể làm tan các tế bào hồng cầu trong thạch máu. Các hemolysin lan ra môi trường xung quanh vùng phát triển của vi khuẩn gây ra sự phá vỡ một phần hoặc hoàn toàn các tế bào hồng cầu. Chúng có thể làm hồng cầu bị biến tính dẫn đến việc các tế bào hồng cầu mất màu. Có ba dạng tan huyết: tan huyết hoàn toàn (훽), tan huyết không hoàn toàn (훼) và không tan huyết (훾). Sự tan huyết được quan sát tốt nhất bằng cách kiểm tra khuẩn lạc được nuôi cấy trong điều kiện môi trường kỵ khí hoặc kiểm tra các khuẩn lạc dưới bề mặt. Lưu ý: Để phân biệt các dạng tan huyết, đĩa thạch thử nghiệm phải được giữ trước nguồn sáng. Nếu có sự tan huyết xảy ra, sẽ có một vùng trong suốt xung quanh khuẩn lạc vi khuẩn. Môi trường: Thạch máu (Blood agar) Tiến hành: - Dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối cấy ria chủng vi sinh vật cần thử nghiệm lên đĩa môi trường. Sau đỏ ủ ở 37oC trong 24 giờ. Quan sát kết quả và kết luận. Kết quả: - Tan huyết hoàn toàn (훽): vòng tan huyết trong, rõ. 58
Đồ án tốt nghiệp - Tan huyết không hoàn toàn (훼): xung quanh và dưới khuẩn lạc chuyển đục, có màu khác. - Không tan huyết (훾): không có hiện tượng tan huyết xảy ra. 2.5.3.4. Thử nghiệm 훽 – Galactosesidase O-Nitrophenyl-훽-D-galactopyranoside (ONPG) có cấu trúc tương tự như lactose (tức là ONPG là một chất tương tự lactose), ngoại trừ orthonitrophenyl đã thay thế cho glucose. Trong quá trình thủy phân, thông qua hoạt động của enzyme β-galactosidase, ONPG đã bị thủy phân thành 2 hợp chất, galactose và o-nitrophenol. ONPG là hợp chất không màu: O-nitrophenol có màu vàng, là nhân tố chứng tỏ quá trình thủy phân đã xảy ra. Vi khuẩn lên men lactose có cả hai chất ức chế lactose và β-galactosesidase, 2 enzyme cần thiết để sản xuất acid trong kiểm tra lên men lactose. Các permease (protein mang) giúp các phân tử lactose xâm nhập vào các tế bào vi khuẩn nơi β- galactosesidase có thể cắt đứt liên kết galactoside để sản xuất glucose và galactose. Các vi khuẩn không lên men lactose không có enzyme và không có khả năng sản xuất acid từ lactose. Một số loài vi khuẩn không lên men lactose vì chúng không có protein vận chuyển, nhưng có chứa β-galactosidase và cho kết quả dương tính với ONPG. Vì vậy được gọi là lên men lactose muộn vì quá trình sản xuất acid từ lactose bị hoãn lại do protein vận chuyển hoạt động chậm. Trong trường hợp này, có thể dùng một phương pháp kiểm tra ONPG dương tính giúp nhận biết nhanh quá trình lên men lactose chậm. Môi trường và thuốc thử: _ Đệm phosphat natri 1M, pH 7.0 _ O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) 0,75 M _ Nước muối sinh lý 59
Đồ án tốt nghiệp _ Toulene Tiến hành: - Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường có chứa lactose (TSI) (để tạo ra enzym galactosidase), cho kết quả tối ưu trong thử nghiệm ONPG. Lưu ý: enzym β-galactosidase (enzym cảm ứng) chỉ được sản xuất khi có sự hiện diện của lactose. - Khuẩn lạc vi khuẩn được hòa trong dung dịch muối sinh lý với dung tích 0.5ml để tạo ra một dịch huyền phù. - Thêm một giọt toluene để giải phóng enzyme của các tế bào vi khuẩn. - Thêm vào một lượng dung dịch ONPG đã được hòa tan trong dung dịch đệm tương đương với lượng huyền phù. - Ủ hỗn hợp ở 37oC. Kết quả Dương tính: Tốc độ thủy phân của ONPG thành o-nitrophenol có thể rất nhanh đối với một số vi khuẩn. Tạo phản ứng màu vàng có thể nhìn thấy trong vòng 5 đến 10 phút. Màu vàng xuất hiện nghĩa là vi khuẩn đã sinh o-nitrophenol từ ONPG thông qua hoạt động của enzyme β-galactosidase. Âm tính: không có màu vàng xuất hiện. Lưu ý: Hầu hết các kết quả là dương tính nếu thử nghiệm trong vòng 1 giờ. Tuy nhiên, nếu thử nghiệm kéo dài quá 24 giờ sẽ không còn kết quả chính xác. 60
Đồ án tốt nghiệp 2.5.4. Khả năng kháng khuẩn Sử dụng phương pháp đo độ đục: Độ đục của huyền phù tỷ lệ thuận với số lượng tế bào vi sinh vật có trong môi trường. Trong một thời gian nhất định, mối quan hệ giữa số lượng vi sinh vật trong nước tỷ lệ tuyến tính với độ đục của môi trường. Định lượng vi sinh vật trong môi trường bằng máy đo độ đục hay máy so màu ở bước sóng 550 – 610nm. Trong phương pháp này cần xây dựng biểu đồ tương quan tuyến tính giữa độ đục và số lượng vi sinh vật trong môi trường bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trực tiếp. Tiến hành: - Nuôi cấy các chủng Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium trong môi trường LB lỏng ở 37oC trong 24 giờ. - Nuôi cấy các chủng lactic trong môi trường MRS ở 37oC trong 24 giờ. - Cho 1,5ml dịch tăng sinh 24 giờ của các chủng đối kháng vào tủ đông -70oC trong 30 phút nhằm gây thương tổn tế bào. Sau đó ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng trong 10 phút để thu dịch. - Lần lượt phối 100μl canh trường của các chủng đối kháng và 100μl dịch tăng sinh của các chủng gây bệnh vào đĩa giếng 96. - Đối chứng âm: 100μl dịch tăng sinh + 100μl môi trường MRS + 2mg Cloramphenicol. Đối chứng dương: 100μl dịch tăng sinh + 100μl môi trường MRS. - Mỗi thí nghiệm lặp lại 2 lần. Ghi nhận số đo OD 2 lần ở bước sóng λ=600nm, một lần sau khi cấy và một lần sau khi ủ 24 giờ. 61
Đồ án tốt nghiệp 2.5.5. Khả năng kháng kháng sinh Vì mức độ thuận tiện, hiệu quả tốt nhưng ít tốn kém chi phí nên phương pháp khuếch tán đĩa có lẽ là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để xác định tính kháng kháng sinh trong các phòng thí nghiệm. Môi trường tăng trưởng thông thường sử dụng là MRS agar, đầu tiên vi khuẩn cần thử nghiệm (đã làm thuần) được pha loãng đến nồng độ khoảng 10-8 bằng nước muối sinh lý, sau đó cấy trang lên đĩa môi trường. Các giấy tẩm kháng sinh thương mại, mỗi loại được ngâm tẩm trước với nồng độ chuẩn của một loại kháng sinh cụ thể, sau đó dùng giấy kháng sinh đặt lên bề mặt thạch. Kháng sinh xét nghiệm ngay lập tức bắt đầu khuếch tán ra khỏi đĩa, tạo ra một gradient nồng độ kháng sinh trong thạch. Ủ qua đêm ở 37oC, quan sát sự phát triển của vi khuẩn trên mỗi đĩa. Nếu vi khuẩn nhạy cảm với một kháng sinh đặc biệt, sẽ có 1 vùng vi khuẩn không phát triển có thể nhìn thấy rõ ràng xung quanh giấy tẩm kháng sinh. Lúc này, có thể kết luận vi khuẩn đã bị ức chế bởi kháng sinh đó (nồng độ kháng sinh tối thiểu đủ để ức chế vi khuẩn). Vùng ức chế này sẽ được đo bằng đơn vị milimet (mm) và được so sánh với biểu đồ chuẩn để phân loại xem vi khuẩn này dễ dàng bị ức chế, có thể kiểm soát được hay có thể kháng lại kháng sinh. Kết quả: Sau khi quan sát và đo đường kính vòng kháng, để có thể đưa ra kết luận ta sẽ dựa vào bảng phân loại sau: Bảng 2.1. Phân loại khả năng kháng kháng sinh dựa vào đường kính vòng kháng [1] Khả năng kháng kháng sinh Đường kính vòng kháng (mm) Kháng mạnh (R: Resistant) 13 trở xuống Trung bình (I: Intermediate) 14 – 16 Kháng yếu (S: Sensitive) 17 trở lên 62
Đồ án tốt nghiệp 2.5.6. Khảo sát khả năng ức chế màng sinh học của các vi khuẩn lactic sau khi qua xử lý nhiệt Dịch tăng sinh 24h của các vi khuẩn lactic chọn lọc không tạo màng sinh học (non-biofilm group - NBG) sau khi điều chỉnh thông số OD600 về gần bằng 0.8 thì sẽ được chia làm 3 phần để xử lý ở 3 mốc nhiệt độ 0oC, 80oC, 100oC trong 30 phút. Thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế màng sinh học của các chủng vi khuẩn lactic sau khi qua xử lý nhiệt được mô tả trong hình 2.2. Mỗi ô nghiệm thức chứa 100 µl dịch tăng sinh vi khuẩn lactic đã xử lý nhiệt, 100 µl môi trường LBM, 1% giống các chủng tạo màng sinh học (biofilm group – BG). Đối chứng âm: 200 µl môi trường LBM, 1% giống chủng tạo màng sinh học. Đối chứng dương: 100 µl dịch tăng sinh vi khuẩn lactic đã xử lý nhiệt, 100 µl môi trường LBM. Mọi nghiệm thức đều được lặp lại 3 lần. Hình 2.2. Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế màng sinh học sau khi vi khuẩn lactic bị xử lý nhiệt Tiến hành định lượng màng sinh học và xác định khả năng kháng theo như phương pháp đã được mô tả như trên. 63
Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Kết quả thử nghiệm sinh lý Từ hai mươi bảy chủng vi khuẩn lactic của đề tài “Phân lập vi khuẩn lactic trong khoang miệng có khả năng ức chế sự tạo màng sinh học của một số Lactobacillus spp.” mười chủng được tuyển chọn có khả năng ức chế màng sinh học của ba chủng chỉ thị (Lactobacillus fermentum 1B, L. fermentum 12R2 và L. fermentum 30B2) lên đến 50%. Trong thí nghiệm này vì mục tiêu hướng tới là vi khuẩn chi Lactobacillus ứng dụng làm probiotic/prebiotic trong nên nhóm thực hiện đồ án sẽ loại bỏ chủng cầu khuẩn 16B. Các chuỗi thí nghiệm sinh hóa, sinh lý sẽ được tiến hành trên các chủng trực khuẩn được cấp bởi Nguyễn Tuấn Anh bao gồm chủng: 7B2, 8R2, 21R2, 21B2, 23B1, 23B2, 26R1. Bảng 3.1. Kết quả thử nghiệm sinh lý Sinh dưỡng Chịu mặn Sinh Sinh dưỡng 10oC 45oC 60oC 3,5% 6,5% bào tử kỵ khí 7B2 + + + + - - + 8R2 + + + + + - + 21R2 + + + + - - + 21B2 + + + + + - + 23B1 + + + + + - + 23B2 + + + + + - + 26R1 + + + + + - + (+, dương tính; -, âm tính) Các thử nghiệm sinh lý nhằm chọn lọc đặc tính probiotic của LAB gồm khả năng bền nhiệt, chịu acid, chịu mặn và chịu được môi trường muối mật [61]. Nhưng vì hệ sinh vật mà nhóm thực hiện đồ án mong muốn các LAB sẽ có tác động trực tiếp lên đó 64
Đồ án tốt nghiệp là hệ sinh vật trong khoang miệng. Vì thế thí nghiệm khảo sát các khả năng chịu acid và chịu được môi trường muối mật sẽ không được tiến hành. Bên cạnh đó, ba thử nghiệm sinh lý: Khả năng sinh dưỡng ở 10oC, 45oC, 60oC; Khả năng chịu mặn: NaCl 6,5%, 6,5%; Khả năng sinh dưỡng kỵ khí là những thử nghiệm định tính, kết quả dựa trên sự xuất hiện của sinh khối dưới đáy ống nghiệm hoặc môi trường chuyển từ trong suốt sang đục. Nhìn chung tất cả các chủng sinh dưỡng ở 10oC và 45oC. Theo Ibourahema và cộng sự (2008) [53], khả năng sinh dưỡng được ở nhiệt độ cao là một đặc điểm tốt vì nó có thể gia tăng tốc độ tăng trưởng của LAB, hơn nữa nó sẽ mang tính tích cực khi ứng dụng các LAB vào sản xuất sản phẩm lên men, thông qua việc hạn chế bớt sự tạp nhiễm của các vi khuẩn khác. Thử nghiệm khả năng sinh dưỡng ở môi trường có các nồng độ muối khác nhau nhằm đánh giá mức độ thẩm thấu tế bào. Môi trường có nồng độ muối cao sẽ ảnh hưởng đáng kể lên các hoạt động trao đổi chất các LAB. Bên cạnh đó theo Adnan và Tan (2007) [59], khả năng chịu mặn của LAB đóng vai trò quan trọng trong việc ứng dụng các LAB vào sản phẩm lên men. Các sản phẩm lên men sau quá trình ủ có thể đạt ngưỡng pH rất thấp, có thể làm giảm mức độ ưa thích cho người tiêu dùng. Để khắc phục việc này người ta thường trung hòa sản phẩm lên men bằng dung dịch kiềm, theo sau đó các acid tự do sẽ chuyển thành dạng muối của nó. Vì thế nếu LAB không thể chịu được nồng độ muối cao thì sau quá trình trung hòa acid, lượng tế bào giảm sút, ảnh hưởng trực tiếp lên chất lượng sản phẩm. Nhìn chung kết quả của các thử nghiệm sinh lý, chỉ có các chủng 8R2, 21B2, 23B1, 23B2 và 26R1 là khác biệt về khả năng sinh trưởng trong môi trường NaCl 6.5% (Bảng 3.1). Vì thế nếu đánh giá về mặt ứng dụng vào sản phẩm lên men, các chủng này sẽ có tiềm năng cao hơn hẳn. 65