›

Đồ án Đánh giá khả năng kí sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại cây trồng của chủng nấm Paecilomyces sp

pdf 66 trang thiennha21 12/04/2022 3960
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đồ án Đánh giá khả năng kí sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại cây trồng của chủng nấm Paecilomyces sp", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdo_an_danh_gia_kha_nang_ki_sinh_tuyen_trung_meloidogyne_spp.pdf

Nội dung text: Đồ án Đánh giá khả năng kí sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại cây trồng của chủng nấm Paecilomyces sp

  1. Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các nội dung nghiên cứu và kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ chương trình nào trước đó. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2015 Sinh viên thực hiện Lê Trần Quang Huy a
  2. Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Lời nói đầu tiên em xin chân thành cảm ơn tới Ban Lãnh Đạo, toàn thể quý Thầy Cô khoa Công Nghệ Sinh Học - Thực Phẩm - Môi Trường, trường Đại Học Công Nghệ TPHCM, những người đã trực tiếp giảng dạy, truyền đạt những kiến thức bổ ích cho em, đó chính là những nền tảng cơ bản, là những hành trang vô cùng quý giá, là bước đầu tiên cho em bước vào sự nghiệp sau này trong tương lai. Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn cô TS. Nguyễn Thị Hai người đã hướng dẫn trực tiếp, giúp đỡ, động viên và tận tình quan tâm em trong quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp này. Bên cạnh đó em cũng xin gửi lời cảm ơn đến thầy Thành, người đã tạo điều kiện tốt nhất về máy móc, trang thiết bị, hóa chất cho em trong suốt quá trình làm việc tại phòng thí nghiệm. Cảm ơn đến các bạn những người đã tận tình giúp đỡ, chia sẽ những kiến thức vô cùng bổ ích cho tôi để tôi có thể hoàn thành đồ án một cách tốt nhất. Vì chưa có nhiều kinh nghiệm, chỉ dựa vào kiến thức hạn hẹp cùng với thời gian ngắn ngủi nên chắc chắn không tránh khỏi những sai sót. Kính mong nhận được sự góp ý của quý Thầy, Cô để kiến thức của em ngày càng hoàn thiện hơn và rút ra được những kinh nghiệm bổ ích cho quá trình học tập và làm việc sau này. Và lời nói cuối cùng con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ba Mẹ, anh chị và những người thân trong gia đình đã luôn sát cánh, động viên và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho con trong suốt quá trình học tập cũng như là hành trang trong tương lai. Kính chúc quý Thầy, Cô và mọi người luôn vui vẻ, hạnh phúc, dồi dào sức khỏe và thành công trong công việc. Em xin chân thành cảm ơn! Tp. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2015 Sinh viên thực hiện Lê Trần Quang Huy b
  3. Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ LỜI MỞ ĐẦU a 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Mục đích nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1 Giới thiệu về tuyến trùng thực vật 3 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu tuyến trùng thực vật 3 1.1.2 Khái quát về tuyến trùng thực vật 3 1.1.3 Phân loại tuyến trùng thực vật 5 1.1.4 Hình thái, cấu tạo và hình thức sinh sản của tuyến trùng thực vật 6 1.1.4.1 Về hình thái 6 1.1.4.2 Về cấu tạo 7 1.1.4.3 Hình thức sinh sản 9 1.2 Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. 9 1.2.1 Phân loại 9 1.2.2 Đặc điểm hình thái 10 1.2.3 Đặc điểm sinh học 11 1.2.4 Vòng đời của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. 11 1.2.5 Tình hình gây hại của tuyến trùng Meloidogyne spp. trên một số loại cây trồng 12 i
  4. Đồ án tốt nghiệp 1.2.5.1 Tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại trên cây lúa 12 1.2.5.2 Tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại trên cây cà rốt 13 1.2.5.3 Tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại trên cây tiêu 13 1.2.5.4 Tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại trên cây cà chua 13 1.3 Một số biện pháp phòng trừ tuyến trùng thực vật 14 1.3.1 Chọn giống 14 1.3.2 Ngăn ngừa 14 1.3.3 Luân canh 14 1.3.4 Biện pháp canh tác 15 1.3.5 Biện pháp hóa học 15 1.3.6 Biện pháp vật lý 15 1.3.7 Biện pháp sinh học 16 1.4 Giới thiệu về nấm kí sinh Paecilomyces sp. 16 1.4.1 Vị trí phân loại và phân bố của nấm Paecilomyces sp. 16 1.4.2 Đặc điểm hình thái, sinh học của nấm Paecilomyces sp. 17 1.4.3 Độc tố của nấm Paecilomyces sp. 18 1.4.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. 19 1.4.4.1 Ảnh hưởng yếu tố dinh dưỡng 19 1.4.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm và ánh sáng 19 1.4.4.3 Ảnh hưởng của pH môi trường 20 1.4.4.4 Ảnh hưởng của độ thoáng khí 20 1.4.5 Cơ chế tác động của chủng nấm Paecilomyces sp. lên tuyến trùng 20 ii
  5. Đồ án tốt nghiệp 1.4.6 Một số sản phẩm trị tuyến trùng của nấm Paecilomyces sp. vào thực tiễn đời sống 21 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 24 2.2 Vật liệu nghiên cứu, thiết bị và hóa chất 24 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 24 2.2.2 Thiết bị 24 2.2.3 Hóa chất 25 2.3 Các môi trƣờng đƣợc sử dụng để xác định hoạt tính, nuôi cấy 25 2.3.1 Môi trường PDA (Potato D - Glucose Agar) 25 2.3.2 Môi trường thử nghiệm hoạt tính chitinase, protase sử dụng chitin và casein làm cơ chất (Nguyễn Thị Hồng Thương, 2000 - 2001) 25 2.3.3 Môi trường Sauboraud + Khoáng chất 26 2.3.4 Môi trường cảm ứng sử dụng để nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme chitinase: 26 2.3.5 Môi trường Czapeck - Dox 26 2.3.6 Môi trường Malt agar (Nguyễn Đức Lượng, 2006) 27 2.3.7 Môi trường WA khảo sát khả năng kí sinh tuyến trùng trên đĩa petri 27 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.4.1 Phương pháp làm phòng ẩm nuôi cấy để quan sát của J.T.Dunean 27 2.4.2 Khảo sát khả năng sinh trưởng của nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA. 28 2.4.3 Phương pháp xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của nấm Paecilomyces sp. 28 iii
  6. Đồ án tốt nghiệp 2.4.3.1 Xác định khả năng tổng hợp enzyme chitinase bằng cách đo đường kính vòng phân giải 28 2.4.3.2 Xác định khả năng tổng hợp enzyme protease bằng cách đo đường kính vòng phân giải 29 2.4.4 Phương pháp nuôi cấy Paecilomyces sp. trên môi trường cảm ứng sinh enzyme chitinase 29 2.4.5 Xác định hoạt độ enzyme chitinase bằng phương pháp DNS 29 2.4.6 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. 32 2.4.6.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. 32 2.4.6.2 Khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. trên các môi trường khác nhau 33 2.4.7 Ảnh hưởng của một số loại thuốc trừ bệnh cây trồng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. 34 2.4.8 Phương pháp tách tuyến trùng từ rễ tiêu (dẫn theo Lê Thị Mai Châm, 2014) 35 2.4.9 Đánh giá khả năng kí sinh con cái và trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. trên đĩa petri 35 2.4.10 Phương pháp xử lý số liệu 35 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Đặc điểm hình thái, sinh học của chủng Paecilomyces sp. phân lập được . 36 3.2 Tốc độ tăng trưởng của nấm Paecilomyces sp. qua các ngày nuôi cấy 37 3.3 Khả năng sinh enzyme chitinase của chủng nấm Paecilomycess sp. trên môi trường thạch 38 3.4 Hoạt tính chitinase trên môi trường cảm ứng của nấm Paecilomyces sp. 39 iv
  7. Đồ án tốt nghiệp 3.5 Khả năng sinh enzyme protease của chủng nấm Paecilomycess sp. trên môi trường thạch. 40 3.6 Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố pH đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. 42 3.7 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. 44 3.8 Ảnh hưởng của một số loại thuốc trừ bệnh cây trồng đối với nấm Paecilomyces sp. 47 3.9 Khả năng kí sinh con cái và trứng tuyến trùng Meloidogyne sp. của chủng nấm Paecilomyces sp. đã chọn 49 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 4.1 Kết luận 52 4.2 Kiến nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 v
  8. Đồ án tốt nghiệp DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT PDA: Potato D – Glucose Agar TCA: Trichloacetic Acid WA: Water Agar vi
  9. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Một số hình dạng của tuyến trùng thực vật 7 Hình 1.2 Cấu tạo của tuyến trùng thực vật 8 Hình 1.3 Con cái và trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. 10 Hình 1.4 Vòng đời của tuyến trùng sần rễ 12 Hình 1.5 Đặc điểm đại thể và vi thể của nấm Paecilomyces sp 18 Hình 1.6 Sản phẩm Bio- Nematon có khả năng phòng trừ tuyến trùng 21 Hình 1.7 Chế phẩm TKS – NEMA trị tuyến trùng 22 Hình 1.8 Chế phẩm sinh học BIO PEST phòng trừ tuyến trùng 22 Hình 1.9 Chế phẩm sinh học Palila 500 WP 23 Hình 2.1 Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. dưới kính hiển vi soi nổi 40X 24 Hình 2.2 Phản ứng hóa học thuốc thử DNS 30 Hình 2.3 Xác định hoạt tính enzyme chitinase của chủng nấm Paecilomyces sp 32 Hình 3.1 Đặc điểm hình thái của nấm Paecilomyces sp. phân lập được 36 Hình 3.2 Đường kính khuẩn lạc của nấm Paecilomyces sp. qua các ngày nuôi cấy 37 Hình 3.3 Đường kính vòng phân giải chitin của chủng nấm Paecilomyces sp. sau 1, 2, 3, 4 ngày nuôi cấy 39 Hình 3.4 Đường kính vòng phân giải casein của chủng nấm Paecilomyces sp. sau 1, 2, 3, 4 ngày nuôi cấy 41 Hình 3.5 Nấm Paecilomyces sp. phát triển ở các pH 5, 6, 7, 8 sau 14 ngày 43 Hình 3.6 Nấm Paecilomyces sp. phát triển trên các môi trường khác nhau sau 14 ngày 46 Hình 3.7 Nấm Paecilomyces sp. bị ức chế khi xử lý các loại thuốc sau 15 ngày 48 Hình 3.8 Con cái Meloidogyne spp. bị nấm Paecilomyces sp. ký sinh qua các ngày chụp dưới kính hiển vi soi nổi 50 Hình 3.9 Túi trứng Meloidogyne spp. bị nấm Paecilomyces sp. ký sinh qua các ngày chụp dưới kính hiển vi soi nổi 51 vii
  10. Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ Bảng 2.1 Dựng đường chuẩn N-acetyl-D-glucosamine 30 Bảng 3.1 Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA qua các ngày sau cấy 37 Bảng 3.2 Đường kính vòng phân giải chitin của chủng nấm Paecilomyces sp. 38 Bảng 3.3 Kết quả xác định hoạt tính chitinase trên môi trường cảm ứng của nấm Paecilomyces sp 40 Bảng 3.4 Đường kính vòng phân giải casein của chủng nấm Paecilomyces sp. 40 Bảng 3.5 Kết quả ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. qua các ngày 42 Bảng 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nám Paecilomyces sp. qua các ngày 44 Bảng 3.7 Kết quả ảnh hưởng của 5 loại thuốc đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. qua 10 NSC, 15 NSC 47 Bảng 3.8 Hiệu lực kí sinh con cái và trứng Meloidogyne spp. của nấm Paecilomyces sp 49 Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. qua các ngày 42 Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. qua các ngày 44 viii
  11. Đồ án tốt nghiệp LỜI MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Tuyến trùng thực vật là nhóm sinh vật gây hại rất nguy hiểm cho các loại cây trồng. Hàng năm chúng làm giảm 10 – 20% năng suất cây trồng trên thế giới. Powell (1984) cho biết: chỉ tính riêng tuyến trùng sần rễ gây hại trên cây thuốc lá năm 1982 vùng Bắc Carolina đã làm giảm 0,77% sản lượng, gây thiệt hại 8 ngàn 932 USD. Ở Việt Nam mức độ gây hại của tuyến trùng đã ảnh hưởng rất lớn đến năng suất của cây trồng. Các loại bệnh do tuyến trùng gây ra và lây lan trong môi trường đất gây ảnh hưởng rất nghiêm trọng đến sản lượng và chất lượng của cây và ảnh hưởng đến giá trị của sản phẩm. Chúng gây hại cho nhiều loại cây trồng như cà rốt, khoai tây, bầu bí, chanh, hành, cà chua, tiêu, cà phê , các loại cây cảnh, cây dược liệu. Tuyến trùng gây hại trên các bộ phận khác nhau của thực vật có thể là thân, lá hoặc rễ do chúng có kích thước hiển vi, khả năng di chuyển cao. Tuyến trùng có phổ kí chủ rộng nhất được biết đến cho đến nay là Meloidogyne, chúng gây ra tổn thất kinh tế lớn cho các cây trồng ở cả vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Bên cạnh đó, việc lạm dụng thuốc trừ sâu hay thuốc hóa học diệt tuyến trùng ngày càng nhiều không những làm tăng tính kháng thuốc, mà còn tiêu diệt hệ thiên địch, gây ra những dịch hại mới, ảnh hưởng đến sức khỏe của con người. Từ thực tế đó, các biện pháp quản lý dịch hại theo hướng sinh học ngày càng được phát triển. Trong những năm gần đây, một loạt các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về sản xuất và ứng dụng chế phẩm sinh học từ các nguồn nấm ký sinh côn trùng. Các chế phẩm sinh học từ các nguồn nấm ký sinh có một vai trò quan trọng trong việc phòng chống sâu hại cây trồng, đồng thời bảo vệ môi trường và sức khỏe con người (Noris và CS., 2002). Trên thế giới đã sản xuất sử dụng thành công nhiều loại chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ nấm Paecilomyces sp. để phòng trừ tuyến trùng gây hại mang lại hiệu quả cao (Burges H.D.,1998; Butt T.M and Copping L.,2000). Tuy nhiên, ở Việt Nam, những nghiên cứu và ứng dụng về loài này vẫn còn khá hạn chế. 1
  12. Đồ án tốt nghiệp Xuất phát từ thực tế trên, sinh viên quyết định thực hiện đề tài : “Đánh giá khả năng kí sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại cây trồng của chủng nấm Paecilomyces sp.”. 2. Mục đích nghiên cứu Chọn ra được chủng nấm Paecilomyces sp. có khả năng phòng trừ tuyến trùng gây hại cây trồng. 3. Nội dung nghiên cứu Khảo sát khả năng sinh trưởng của nấm Paecilomyces sp. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng nấm Paecilomyces sp. thu nhận được. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của nấm Paecilomyces sp. trong điều kiện in vitro. Đánh giá khả năng gây chết tuyến trùng Meloidogyne spp. của nấm Paecilomyces sp. 2
  13. Đồ án tốt nghiệp 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về tuyến trùng thực vật 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu tuyến trùng thực vật Tuyến trùng thực vật đã được tìm thấy từ giữa thế kỷ 18. Lần đầu tiên Needham (1743) đã phát hiện ra tuyến trùng thực vật trên bông lúa mì, khi quan sát những hạt lúa mì bị dị tật, teo lại ông đã phát hiện ra hàng loạt các động vật dạng sợi di chuyển xoắn vặn trong nước, mà ông cho rằng chúng là những động vật nước và chúng có thể được gọi là giun hoặc lươn giống như những con lươn giấm được quan sát khoảng 90 năm trước đó. Đến năm 1945, những công bố của ông đã giúp con người biết đến tuyến trùng như là một loài động vật đa dạng nhất trên hành tinh. Từ những năm 1960 tại Mỹ và nhiều nước khác trên thế giới, tuyến trùng học nói chung và tuyến trùng thực vật nói riêng đã trở thành môn khoa học nghiên cứu các quy luật sinh thái học, phát triển của tuyến trùng, nhất là các loài tuyến trùng ký sinh thực vật. Sự đa đạng về chủng loài, số lượng cá thể cũng như đặc điểm môi trường sống đã góp phần phong phú thêm cho ngành tuyến trùng học trên thế giới. Ở Việt Nam công trình nghiên cứu đầu tiên về tuyến trùng thực vật do nhà khoa học người Hungary – Tiến Sỹ Andrassy công bố năm 1970 về hơn 30 loài tuyến trùng ký sinh thực vật và tuyến trùng sống tự do trong đất quanh rễ cây trồng thuộc hai bộ Tylenchida và Dorylaimida. Mặc dù nghiên cứu tuyến trùng chỉ mới bắt đầu từ những năm 1970 trở lại đây nhưng đã khẳng định được vai trò to lớn của tuyến trùng về cả phương diện tuyến trùng gây hại (tuyến trùng thực vật) và có lợi (tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng, tuyến trùng sống tự do trong đất, nước) trong nông nghiệp và sinh thái môi trường ở nước ta. 1.1.2 Khái quát về tuyến trùng thực vật Tuyến trùng thực vật là nhóm động vật không xương sống có đặc điểm sinh thái thích nghi với đời sống ký sinh ở thực vật. Nhóm tuyến trùng này có một số đặc trưng quan trọng so với nhóm ký sinh ở động vật và các nhóm sinh thái khác như: có kích thước hiển vi, phần miệng có cấu tạo kim hút chuyển hóa để châm chích mô thực vật và hút chất dinh dưỡng, tạo ra các vết thương bề mặt và bên trong thân, rễ 3
  14. Đồ án tốt nghiệp thực vật, kích thước của trứng lớn so với kích thước cơ thể, đời sống của chúng có quan hệ bắt buộc và trực tiếp với thực vật đang phát triển. Trải qua quá trình tiến hóa tuyến trùng đã thích nghi và có mặt trong hầu hết các bộ phận của thực vật như: rễ, thân, lá, hoa, quả, trong đó rễ là nơi gặp nhiều nhóm tuyến trùng ký sinh nhất. Tuyến trùng ký sinh thực vật có những tập quán dinh dưỡng rất khác nhau, một số loài dinh dưỡng trên những mô ngoài của thực vật, một số khác xâm nhập vào các mô sâu hơn, một số khác có thể làm cho cây chủ tạo ra những nguồn dinh dưỡng đặc biệt tại nơi chúng ký sinh. Khi bị tuyến trùng gây hại, cây ngừng sinh trưởng, khả năng quang hợp bị biến đổi hoặc bị phá hủy, lá vàng, ra hoa và đậu quả kém. Đặc biệt, khi quan sát dưới rễ sẽ thấy có những nốt sần xuất hiện do quá trình di chuyển, châm chích và hút dinh dưỡng trên cơ thể thực vật. Ngoài tác hại trực tiếp như trên, tuyến trùng còn tạo điều kiện, liên kết, hoặc tương hỗ với các tác nhân gây bệnh khác như nấm, vi khuẩn và virus, gây nên các bệnh khác nhau cho thực vật. Người ta thấy rằng khi cây bị tuyến trùng xâm nhiễm thì dễ dàng bị héo Fusarium hơn so với cây không bị tuyến trùng xâm nhiễm (Roberts và cộng sự, 1985; Porter và Powell, 1967). Ảnh hưởng của tuyến trùng bướu rễ lên mức độ bệnh thối rễ do tác nhân gây bệnh như Phytophthora parasitica (Powell và Nusbaum, 1960), Pythium spp., Fusarium spp., Rhizoctonia solani (Brodie và Cooper, 1964) và Thielaviopsis basicola (Fichter và cộng sự, 2005) thì thấy rằng khi có sự hiện diện của tuyến trùng M. incognita làm gia tăng mức độ mẫn cảm của cây trồng với tất cả các nấm gây bệnh này.  Quá trình gây bệnh bên trong rễ của tuyến trùng trải qua 3 giai đoạn: Giai đoạn 1: Khi tuyến trùng mới bắt đầu xâm nhập vào rễ và tạo nốt sần, rễ vẫn còn màu sáng, chức năng của rễ chưa bị ảnh hưởng nhiều. Giai đoạn 2: Rễ chuyển sang màu nâu, chức năng dinh dưỡng và vận chuyển nước của rễ đã bị ảnh hưởng, xảy ra quá trình hoại sinh, tạo điều kiện cho nấm, vi khuẩn xâm nhập và có thể gây thêm các bệnh khác cho cây. Giai đoạn 3: Rễ chuyển thành màu đen, chức năng của rễ bị phá hủy hoàn toàn. 4
  15. Đồ án tốt nghiệp Bệnh sần rễ không chỉ biểu hiện ở những cây vàng lá, còi cọc mà còn ở những cây còn xanh tốt do bệnh mới phát triển ở giai đoạn đầu, chức năng của rễ chưa bị hủy hoại (Nguyễn Ngọc Châu và 14 ctv., 1990) Tuyến trùng thực vật có mặt ở khắp nơi trên các tầng đất canh tác đối với các loại cây hoa màu, trong vườn ươm và trên đồng ruộng. Mật độ tuyến trùng cao ở độ sau từ 6 – 15 cm, nhiệt độ thích hợp cho tuyến trùng phát triển là ở 25 – 280C, ẩm độ khoảng 60%, trong điều kiện khô hạn hoặc ngập nước lâu dài tuyến trùng kém phát triển. Ngoài ra các yếu tố như địa hình, tác nhân sinh học hay các hoạt động của con người cũng ảnh hưởng đến cấu trúc quần xã tuyến trùng. 1.1.3 Phân loại tuyến trùng thực vật Theo động vật chí Việt Nam, dựa vào các đặc điểm về hình thái, tập quán sinh sống, đặc tính sinh vật học, mối quan hệ giữa các nhóm tuyến trùng thực vật đối với cây trồng mà chúng được chia làm 4 bộ khác nhau: Bộ Tylenchida: gồm hầu hết các loài tuyến trùng là đại diện cho các nhóm ký sinh ở các phần khác nhau của thực vật, là nhóm tuyến trùng đông đảo nhất và có tầm quan trọng ngành sản xuất nông nghiệp. Bộ Aphelenchida: gồm khoảng 500 loài, các loài tuyến trùng ký sinh ở các phần trên mặt đất của cây như lá, hoa, hạt. Bộ Dorylaimida: gồm các loài thuộc họ Longidoridae là nhóm tuyến trùng ngoại ký sinh thực vật, một số loài có khả năng mang truyền virus. Bộ Triplonchida: gồm các loài của 2 họ Trichodoridae và Diphterophoridae là nhóm ngoại thực vật, nhiều loài có khả năng mang truyền virus. Về hình thức ký sinh trên thực vật, tuyến trùng có thể chia làm 3 nhóm: + Ngoại ký sinh: sử dụng kim chích để lấy dinh dưỡng còn cơ thể nằm ngoài mô thực vật, không xâm nhập vào bên trong. + Bán nội ký sinh: chỉ phần trước cơ thể tuyến trùng xâm nhập vào trong rễ, còn phần sau cơ thể tuyến trùng vẫn ở ngoài rễ, phình to ra. 5
  16. Đồ án tốt nghiệp + Nội ký sinh: đã xác định 17 loài ký sinh gây bệnh tổn thương rễ (Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh, 2000), toàn bộ tuyến trùng xâm nhập vào rễ. Nhóm này được chia 2 nhóm nhỏ: Nội ký sinh di động: tuyến trùng di chuyển từ mô này đến mô khác bên trong để châm chích, hút dinh dưỡng, tạo thành các khối u sưng, điển hình là giống Meloidogyne spp. Nội ký sinh cố định: không có khả năng di chuyển, chúng dinh dưỡng tại một nơi cố định bên trong mô rễ và trở nên phình to (con cái). 1.1.4 Hình thái, cấu tạo và hình thức sinh sản của tuyến trùng thực vật 1.1.4.1 Về hình thái Tuyến trùng thực vật có kích thước thân nhỏ, dạng giun, dài 0,2 – 2,5 mm, nhỏ nhất là loài Greeffiella minutum, cơ thể dài 82 µm, nhưng đa số nhỏ hơn 2 mm. Hình dáng của chúng rất đa dạng và có liên quan chặt chẽ với đặc tính sinh sống của cây. Ví dụ như loài Tylenchulus (hình quả lê), Helicotylenchus (dạng giun/xoắn), Pratylenchus (dạng giun), Heterodera (hình quả chanh), Hirschmanniella (hình giun/dài), Meloidogyne (hình cầu/bầu). Các loài tuyến trùng sống trên lá có hình sợi chỉ nằm trong các gian bào của tế bào thực vật. Loại phá hủy mô tế bào thì có dạng là hình trụ, hình thoi sống ở trong rễ hoặc trong đất 6
  17. Đồ án tốt nghiệp Tylenchulus (hình quả lê) Meloidogyne (hình cầu/bầu) (Nguồn: plpnemweb.ucdavis.edu) Pratylenchus (hình giun) Heterodera (hình quả chanh) (Nguồn: nematode.unl.edu) (Nguồn:pest.ceris.purdue.edu) Hình 1.1 Một số hình dạng tuyến trùng thực vật 1.1.4.2 Về cấu tạo Theo Eoshenko và Nguyễn Vũ Thanh (1981) cơ thể tuyến trùng được chia làm 3 phần: Phần đầu: còn gọi là vùng môi, gồm đầu và chính giữa có miệng chích hút, xung quanh là các cơ quan xúc giác. Hai đầu hơi nhọn hoặc hình tròn dẹt. Phần giữa: từ eo thắt ở phần đầu đến lỗ hậu môn con cái hoặc đến huyệt sinh dục ở con đực. Phần đuôi: bắt đầu từ hậu môn. Hình dáng của đuôi là một đặc điểm quan trọng để phân loại tuyến trùng. Có nhiều dạng khác nhau: hình kim nhọn, hình thoi thon dài, có mấu gai hoặc không. 7
  18. Đồ án tốt nghiệp Bao bọc toàn bộ cơ thể tuyến trùng là lớp vỏ cutin tương đối bền vững và có thể co giãn, trên vỏ cutin có các lỗ của hệ tiêu hóa, sinh dục, bài tiết, một số các lỗ khác của các cơ quan tiết hoặc thụ cảm khác nhau. Hệ thống thần kinh trung ương cũng liên quan rất chặt chẽ với vách thân. Hệ thần kinh của tuyến trùng gồm các bó thần kinh chạy dọc dưới da và được các vòng dây thần kinh nối liền với nhau. Bộ máy tiêu hóa của tuyến trùng thực vật gồm ống ruột, bắt đầu từ miệng và kết thúc ở hậu môn nằm về phía bụng. Hệ sinh sản của con cái và đực rất khác nhau: Con cái: gồm có buồng trứng, ống dẫn trứng, tử cung, lỗ giao phối ở giữa thân. Con đực: gồm tinh hoàn duy nhất, ống dẫn tinh và gai giao phối ở ruột dưới. Ở một số loài, con đực có vây đuôi giúp cho quá trình giao phối. Hình 1.2 Cấu tạo của tuyến trùng thực vật (Nguồn: thesoilhuggersjourney.wordpress.com) 8
  19. Đồ án tốt nghiệp 1.1.4.3 Hình thức sinh sản Tuyến trùng phần lớn sinh sản hữu tính là chủ yếu. Tỷ lệ đực cái phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Điều kiện ngoại cảnh ảnh hưởng đến quá trình sinh sản và phát triển qua các giai đoạn từ tuyến trùng non lên tuyến trùng trưởng thành để phân giới đực cái (loài Meloidogyne spp.; Globodera rostochiensis; Heterodera avenae). Tuyến trùng đẻ trứng là chủ yếu, trứng được hình thành trong cơ thể mẹ và phát triển trong tế bào trứng. Một trứng đã thụ tinh là trứng có một nhân với các nhiễm sắc thể, sau đó thực hiện quá trình phân chia nhân tế bào.Trứng sau khi thụ tinh, một số phát triển trong vỏ trứng (loài Meloidogyne spp.), một số khác nằm trong cơ thể mẹ (loài Heterodera spp.), vỏ cơ thể mẹ chuyển thành nang và tuyến trùng non phát triển trong đó, sau đó chui ra ngoài ở tuổi 2 trong điều kiện ngoại cảnh phù hợp. 1.2 Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. 1.2.1 Phân loại Giới: Animalia Ngành: Nematoda Lớp: Secernentea Bộ: Tylenchida Họ: Heteroderidae Giống: Meloidogyne Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne được Berkeley phát hiện đầu tiên vào năm 1855 trên cây dưa chuột ở Anh, là đại diện cho nhóm tuyến trùng ký sinh thực vật quan trọng nhất, chúng gây hại hơn 3.000 loài thực vật trên toàn thế giới, bao gồm hầu hết các cây trồng quan trọng như rau màu, đậu đỗ, ngũ cốc, cây hòa thảo, cây bụi và cây ăn quả, thảo mộc và nhiều loài cây cảnh thân gỗ (Malcolm và Charles, 2000). Tuyến trùng gây giảm sản lượng thu hoạch cũng như chất lượng sản phẩm cây trồng. Cho đến nay đã thống kê khoảng gần 80 loài ký sinh thuộc giống này, trong 9
  20. Đồ án tốt nghiệp đó có 4 loài ký sinh gây hại quan trọng nhất là: M. incognita, M. arenaria, M. javanica và M. hapla. Đây là các loài phân bố rộng và gây hại lớn ở các vùng nông nghiệp trên thế giới. Ngoài ra, một số loài khác mặc dù cũng gây hại quan trọng nhưng chúng chỉ gây hại ở 1 – 2 cây trồng và phân bố hẹp. 1.2.2 Đặc điểm hình thái Theo phân loại của Goldi (1887, có chỉnh sửa vào năm 2000), Meloidogyne spp. có đặc điểm sau: Đối với con cái trưởng thành thì có hình tròn tới dạng quả lê, màu trắng, ít vận động. Không có giai đoạn u nang. Có kim chích nhỏ và mảnh, thường dài từ 12 – 15 µm. Lỗ bài tiết nằm trước tới khoang giữa khối tròn, thường chỉ sau kim chích. Sáu tuyến trực tràng lớn tiết các chất đặc sệt để bảo quản trứng, đẻ trứng ra ngoài. Con đực trưởng thành có hình giống con giun, dài đến 2 mm, đuôi xoắn và tròn, phát triển qua các lần biến thái trong rễ. Có kinh chích nhỏ nhưng mảnh, dài 18 – 25 µm. Tuyến hầu chủ yếu nằm ở phần bụng đến ruột. Gai nhỏ và mảnh, thường dài 25 – 33 µm, ống dẫn dài từ 7 – 11 µm. Có tinh hoàn duy nhất. Ấu trùng: trứng của tuyến trùng sần rễ được con cái đẻ ra trong một bọc gelatin (còn gọi là bọc trứng) nằm trên bề mặt của sần rễ. Ấu trùng cảm nhiễm tuổi 2 (J2) có dạng cân đối hình giun, dài khoảng 0,4 – 0,5 mm. Kim chích và vùng đầu kitin hóa yếu, đuôi hình chóp. Hình 1.3 Con cái và trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. (Nguồn: clfs.umd.edu) 10
  21. Đồ án tốt nghiệp 1.2.3 Đặc điểm sinh học Tuyến trùng sần rễ (root – knot nematodes) được coi là nhóm tuyến trùng ký sinh quan trọng nhất cho nền nông nghiệp trên toàn thế giới. Nhóm tuyến trùng này phân bố rộng khắp và ký sinh ở hầu hết các cây trồng quan trọng ở các vùng khí hậu khác nhau. Chúng làm giảm sản lượng thu hoạch cũng như chất lượng sản phẩm cây trồng. Chu kỳ phát triển (vòng đời) phụ thuộc vào nhiệt độ các tháng trong năm và phụ thuộc cây ký chủ. Ở nhiệt độ 280C vòng đời của loài M. incognita là 30 ngày trên cây thuốc lá. Ở nhiệt độ thấp 200C vòng đời của chúng kéo dài trong khoảng 57 – 59 ngày. Mỗi con tuyến trùng cái tạo ra bọc trứng có thể tới 2.000 trứng, trung bình nở ra 200 – 600 tuyến trùng non tuổi 1. Trứng và tuyến trùng non có thể tồn tại ở trong đất hàng năm nếu gặp điều kiện thuận lợi và cây ký chủ phù hợp. 1.2.4 Vòng đời của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. Con cái đẻ trứng trong một khối chất đặc sệt chứa chất nền glycoprotein, được tiết bởi bởi sáu tuyến lớn trong ruột thông qua hậu môn (Sharon và Spiegel, 1993). Các khối trứng thường được tìm thấy trên bề mặt của sần rễ, đôi khi các bọc trứng này có thể nằm trong sần rễ. Khối trứng ban đầu mềm, dính và trong vắt như pha lê nhưng lúc sau lại cứng và có màu nâu xẫm. Sau quá trình phát triển phôi thai, lần lột xác thứ nhất xảy ra bên trong trứng và phát triển thành ấu trùng tuổi 2 dạng cảm nhiễm (J2). J2 dễ bị tổn thương, do đó chúng cần xâm nhiễm và định cư vào kí chủ càng nhanh càng tốt. Ấu trùng J2 có thể xâm nhập vào rễ ngay cạnh nốt sần hoặc có thể xâm nhập vào rễ mới, ở đó chúng tấn công vào các mô phân sinh ở đỉnh rễ, tiết các hợp chất (ascorbic acid, gibberellin hay glutamic acid) và làm cho bề mặt rễ bị tổn thương (Bird và Loveys, 1975). Sau khi J2 xâm nhập, đỉnh rễ phình ra và sự phát triển của rễ dừng lại trong một thời gian ngắn. Tuyến trùng hút dinh dưỡng tại các tế bào mô mạch của rễ, tiết men tiêu hóa làm cho quá trình sinh lý sinh hóa của mô rễ thay đổi và hình thành các điểm dinh dưỡng của tuyến trùng (vùng dinh dưỡng này gồm 5 – 6 tế bào khổng lồ). Cùng với sự hình thành tế bào khổng lồ các mô rễ xung quanh nơi tuyến trùng ký sinh cũng phình to tạo ra các bướu rễ. Sau khi 11
  22. Đồ án tốt nghiệp xâm nhập vào rễ, J2 cũng nhanh chóng thay đổi về hình thái: cơ thể phình ra và các cơ quan cũng dần phát triển. Quá trình phát triển của tuyến trùng trong rễ từ J2 trải qua 3 lần lột xác và đạt đến trưởng thành. Lần lột xác cuối cùng là sự biến thái thật sự đối với con đực, từ dạng cuộn gấp khúc trong J2 chúng được nở ra và có dạng hình giun, trong khi con cái có dạng hình tròn như quả lê hay quả chanh. Hình 1.4 Vòng đời của tuyến trùng sần rễ (Nguồn: extension.umn.edu) 1.2.5 Tình hình gây hại của tuyến trùng Meloidogyne spp. trên một số loại cây trồng 1.2.5.1 Tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại trên cây lúa Nhóm tuyến trùng gây hại trực tiếp trên cây lúa có thể kể đến là Meloidogyne graminicola, tên tiếng Anh là Root Knot Nematode, đây là loại tuyến trùng nội ký sinh, ấu trùng có dạng con sán (lãi) kim. Khi phát triển giới tính, tuyến trùng cái đổi thành dạng hình quả lê, trong khi tuyến trùng đực vẫn giữ dạng lãi kim. Tuyến trùng cái đẻ trứng bên trong bướu. 12
  23. Đồ án tốt nghiệp Khi bị tuyến trùng ký sinh, cây bị lùn, lá hơi vàng, tăng trưởng chậm. Nhổ rễ lên, thấy rễ vẫn trắng tốt nhưng bị ngắn lại, bướu xuất hiện ở nhiều đoạn của rễ hoặc ở chóp rễ. Nơi có ổ tuyến trùng bị phù to tạo bướu 1 – 2 mm. 1.2.5.2 Tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại trên cây cà rốt Tuyến trùng gây bệnh trên cây cà rốt chủ yếu thuộc nhóm M. arenaria, M. javanica, M. hapla, and M. incognita. Tuyến trùng thuộc nhóm này gây thiệt hại kinh tế rất lớn, làm giảm năng suất và chất lượng củ cà rốt. Biểu hiện bệnh đặc trưng là củ bị biến dạng. Hiện nay người ta đã nhận thấy có sự xuất hiện của bệnh này làm cho cà rốt không đạt chất lượng thương phẩm. 1.2.5.3 Tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại trên cây tiêu Tiêu bị nhiều loại tuyến trùng gây hại, trong đó loại tuyến trùng phổ biến nhất là tuyến trùng bướu rễ M. incognita. Hiện tượng bạc vàng lá xuất hiện ở toàn bộ cây. M. incognita ký sinh làm giảm khả năng hấp thu các khoáng: P, K, Cu, Zn, và Mn (Ferraz và cộng sự, 1988). Sắc tố của lá bị giảm đáng kể bởi tuyến trùng bướu rễ, làm cho lá già và chết (Ferraz và Lordello, 1989). Ở rễ xuất hiện các khối u lớn, tại đó tuyến trùng cái sẽ đẻ trứng và ký sinh sâu trong các mô rễ (Ramana, 1992; Ramana và cộng sự, 1994). Rễ bị thối, cây sinh trưởng kém đi, trở nên còi cọc, thân khô héo, tuyến trùng bướu rễ tạo ra các u bướu ở rễ, tạo đều kiện cho nấm bệnh xâm nhập và phát triển mạnh. 1.2.5.4 Tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại trên cây cà chua Ở nước ta, việc trồng cà chua còn có ý nghĩa quan trọng về mặt luân canh, tăng vụ và tăng hiệu quả kinh tế trên một đơn vị diện tích đất canh tác. Tuy nhiên, các bệnh do tuyến trùng gây nên làm ảnh hưởng đến chất lượng cũng như số lượng sản phẩm, gây thiệt hại nặng nề đến hoạt động nông nghiệp, kinh tế của bà con nông dân. Cà chua bị tuyến trùng gây hại chủ yếu là tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne spp. 13
  24. Đồ án tốt nghiệp Khi bị tuyến trùng tấn công: - Trên mặt đất: cây bị lùn cằn cỗi và chuyển màu vàng. Cây bệnh nặng có thể chết. - Dưới mặt đất: hệ thống rễ sơ cấp và thứ cấp xuất hiện những nốt sưng phồng. nốt sưng bắt đầu to lên khi bệnh phát triển nặng, lúc đầu bướu có màu trắng, sau chuyển thành nâu, cuối cùng có thể bị nát ra, khi đó rễ bị thối đen. 1.3 Một số biện pháp phòng trừ tuyến trùng thực vật 1.3.1 Chọn giống Cần chọn giống không bị nhiễm bệnh và các giống phù hợp với điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng ở những vùng canh tác khác nhau thực hiện tốt công tác bảo vệ thực vật, không lấy giống từ vườn bị tuyến trùng, xử lý giống trước khi trồng bằng một số loại thuốc phòng trị nhiễm tuyến trùng với nồng độ 0,1% (10gram/lít nước) trong 20 phút. 1.3.2 Ngăn ngừa Để ngăn ngừa sự lây lan phát triển của tuyến trùng người ta có thể chọn giống sạch bệnh, giống chịu bệnh, kiểm tra vệ sinh đồng ruộng, xử lý các nông cụ và hạn chế tưới tràn. 1.3.3 Luân canh Đây được coi là biện pháp quản lý tuyến trùng đơn giản. Các cây luân canh là cây miễn nhiễm hoặc có khả năng chống chịu cao với một hoặc một vài loại tuyến trùng. Dùng những cây trồng xen mà rễ của chúng bài tiết ra các chất mang tính xua đuổi tuyến trùng: cúc vạn thọ (Tagetes patula, T. erecta) làm giảm số lượng Pratylenchus pratensis và P. Crenatus. Gieo 1 – 2 lần trong 3 – 4 năm trên đất nhiễm Pratylenchus sp Đất trồng thuốc lá luân canh với cây trồng nước, trồng đậu và không trồng cây họ cà, kết hợp với trồng xen cây cúc vạn thọ. 14
  25. Đồ án tốt nghiệp 1.3.4 Biện pháp canh tác Các biện pháp bao gồm: Gieo trồng sớm, làm khô ruộng, làm ngập nước, luân canh, xen canh, bón chất hữu cơ Nhằm tạo điều kiện ngoại cảnh không thuận lợi cho tuyến trùng phát triển. Các biện pháp này cũng có tác dụng đáng kể trong việc phòng trừ tuyến trùng gây bệnh cho cây. 1.3.5 Biện pháp hóa học Từ những năm 1970 trở lại đây các loại thuốc hóa học khác nhau đã được sử dụng rộng rãi để phòng trừ tuyến trùng ký sinh thực vật như các loại thuốc xông hơi, các loại thuốc không xông hơi. Tuy nhiên biện pháp này lại gây hậu quả xấu đến môi trường và sức khỏe cộng đồng, đặc biệt thuốc hóa học cũng làm cho nhiều loại tuyến trùng trở nên kháng thuốc. Do đó cũng chỉ nên dùng thuốc hóa học trong trường hợp cần thiết và phải sử dụng chúng một cách hợp lý. Đưa thuốc vào độ sâu 35 – 40 cm đã cày bừa kỹ, ẩm độ 75% và nhiệt độ phải phù hợp trong thời điểm cần xử lý với từng loại thuốc. Dùng thuốc vào đúng giai đoạn mẫn cảm nhất của tuyến trùng, có thể thực hiện trước khi trồng, sau khi thu hoạch và trong bảo quản. 1.3.6 Biện pháp vật lý Tuyến trùng rất mẫn cảm với nhiệt độ, hầu hết tuyến trùng ký sinh thực vật bị phá hủy ở nhiệt độ 600C trong vòng 30 phút. Do đó sử dụng các biện pháp như: Xử lý khói (khử trùng đất bằng khói). Phơi nắng: đồng ruộng được phay đất và tháo nước cạn sau đó phủ các tấm polyetylene, hiệu quả được chứng minh đạt kết quả tốt. Khử trùng bằng nhiệt điện: được áp dụng trong các nhà kính hoặc vườn cây quý, khi nhiệt độ được duy trì ở 500C trong vòng một giờ thì hầu hết tuyến trùng bướu rễ trong đất bị chết, bằng nhiệt vi sóng. Đốt đồng sau khi thu hoạch, khử trùng nguyên liệu gieo trồng bằng nhiệt. Chiếu xạ: làm giảm khả năng thụ tinh, làm chậm sự phát triển cơ quan sinh dục, giảm lượng trứng đẻ, làm trứng nở chậm và làm biến đổi hình thái tuyến trùng. 15
  26. Đồ án tốt nghiệp Tất cả các phương pháp trên đều đem lại hiệu quả cao nhưng giá thành cao và chỉ ứng dụng ở qui mô nhỏ như nhà lưới hoặc phòng thí nghiệm. 1.3.7 Biện pháp sinh học Tuyến trùng ký sinh thực vật bị tấn công bằng các loại thiên địch trong đất như: virus, vi khuẩn, nấm, đơn bào, côn trùng và tuyến trùng ăn thịt. Sử dụng các vi sinh vật đối kháng có ở trong đất, các tuyến trùng ăn thịt, nấm ký sinh bậc 2 dùng để tiêu diệt tuyến trùng. Sử dụng các loại phân ủ (compost) có nguồn gốc thực vật cũng là một hướng mới trong phòng trừ tuyến trùng ký sinh thực vật. Sự phân hủy chất hữu cơ sẽ giải phóng các hợp chất gây độc cho tuyến trùng ký sinh. Đặc biệt, sự phân giải các chất từ phế thải thực vật sẽ giải phóng các axit hữu cơ như axetic, propionic và butyric, nồng độ các chất này có thể được lưu giữ một vài tuần trong đất và có thể giết chết một vài loại tuyến trùng. Bón phân kali cân đối giữa N.P.K bảo đảm cho cây trồng sinh trưởng và phát triển tốt , khả năng chống chịu cao, tạo điều kiện pH trong đất trung hòa kiềm để giảm khả năng sinh sản của tuyến trùng. Phân vi lượng (Bo, Mn, Cu, ) làm giảm tuyến trùng bướu rễ cà chua 50 – 60%, năng suất tăng 30 – 40% (Treskov, 1962). Các chất phế thải khác nhau có thể bổ sung vào đất làm tăng lượng hữu cơ trong đất như: phân từ các động vật nuôi, bùn cống rãnh, rác thải đô thị, rơm rạ, bèo lục bình, và các phế thải sau thu hoạch, phế thải trong các nhà máy chế biến nông nghiệp các loại phế thải khác sau khi chưng cất dầu (bánh dầu của cây dầu mè, neem ) đều có thể được sử dụng như là nguồn hữu cơ bổ sung cho đất cũng như rất có hiệu quả trong phòng trừ tuyến trùng. 1.4 Giới thiệu về nấm kí sinh Paecilomyces sp. 1.4.1 Vị trí phân loại và phân bố của nấm Paecilomyces sp. Vị trí phân loại của nấm Paecilomyces sp. theo hệ thống phân loại thuộc lớp Nấm bất toàn Deuteromycetes, họ Moniliaceae, bộ nấm bông Monilales, lớp nấm bất toàn Hyphomycetes và thuộc ngành phụ Nấm bất toàn Deuteromycotina (Wang. X. X., 2007). Hệ thống phân loại nấm bất toàn (theo Saccardo, 1880, 1886) chủ yếu 16
  27. Đồ án tốt nghiệp là căn cứ vào đặc điểm của bào tử trần, bộ máy bào tử trần cũng như đặc điểm phát sinh bào tử trần. Có rất nhiều loài trên thế giới, khoảng 31 loài và phân bố trên diện rộng trong đó có thể kể đến là Paecilomyces farinosus, Paecilomyces fumosoroseus, Paecilomyces amoeneroseus, Paecilomyces javanicus, Paecilomyces tenuipes, Paecilomyces cicadae, Paecilomyces lilacinus (trích dẫn bởi Nguyễn Phước Vĩnh, 2008). Nấm Paecilomyces sp. dễ dàng tìm thấy ở đất tơi xốp, phân hữu cơ và thức ăn, xác bã hữu cơ, dư thừa thực vật. Chúng hiện diện ở những nơi ẩm ướt cả trong phòng và ngoài tự nhiên. Một số loài quan trọng trong phòng trừ sinh học như: Paecilomyces carneus: phân lập từ đất và xác chết côn trùng. Paecilomyces farinosus: phân lập từ đất. Paecilomyces fumosoroseus: phân lập từ đất bơ, gelatin, côn trùng. Paecilomyces lilacinus: phân lập từ xác bã hữu cơ, đôi khi ở côn trùng chết, rừng cao su (Crop Protection Compennium, 2002). 1.4.2 Đặc điểm hình thái, sinh học của nấm Paecilomyces sp. Theo sự mô tả đặc điểm các loài trong chi Paecilomyces của tác giả Samson (1974, 1988, 2004) thì có một số nhóm loài có hình thái rất giống nhau. Mặt khác khi nuôi cấy trên môi trường nhân tạo, nấm có một số thay đổi về mặt hình thái tuỳ thuộc vào những điều kiện và môi trường nuôi cấy khác nhau. Nấm Paecilomyces sp. đặc trưng bởi những đặc điểm: Đại thể: Khuẩn lạc lúc đầu màu trắng sau chuyển sang màu hồng, tím nhạt, cũng có loài màu vàng, lục nhạt hoặc vàng nâu. Sợi nấm mềm, phát triển, đa số có vách ngăn ngang, trong suốt và rộng từ 2,5 – 4 µm. Khi nuôi cấy trên môi trường nhân tạo hay một số cơ chất tự nhiên, khuẩn lạc thường mọc theo hình tròn đồng tâm, dạng thảm nhung hoặc dạng bó sợi. Vi thể: Cuống bào tử phân nhánh, đơn độc hoặc thành bó, mức độ phân nhánh của nấm phình to, phân bố không đều hoặc thành vòng, có đường kính bằng hoặc nhỏ hơn đường kính của sợi nấm, phía trên nhỏ và uốn cong. Thể bình 17
  28. Đồ án tốt nghiệp đôi khi đơn độc trên các sợi nấm không phân hoá. Thể bình gồm phần gốc hình trụ hoặc hình gần trứng và phần ngọn thon nhỏ, dài hẹp. Bào tử trần không ngăn vách, không màu hoặc màu nhạt, hình bầu dục, bề mặt nhẵn hoặc có gai, mọc thành chuỗi tách xa nhau, ít khi tụ hợp thành khối (dẫn theo Đỗ Thị Hồng, 2007). Đặc điểm đại thể Đặc điểm vi thể Hình 1.5 Đặc điểm đại thể và vi thể của nấm Paecilomyces sp. (Nguồn: 1.4.3 Độc tố của nấm Paecilomyces sp. Độc tố chính của nấm Paecilomyces sp. là paecilotoxin (leucinosattins), các sản phẩm của paecilotoxin có rất nhiều dạng tùy vào từng loài kí sinh mà nấm Paecilomyces sp. sinh ra các độc tố khác nhau: variotin, ferriubin, viriditoxin, indol- 3-acetic acid, patulin Các độc tố này có hiệu quả cao đối với việc phòng trị sâu bệnh hại và diệt tuyến trùng. Paecilomyces lilacinus chủng 251 (PL251), được đánh giá là có tiềm năng trong kiểm soát tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne incognita ở cây cà chua, chúng sản sinh ra độc tố leucinotoxin kết hợp chitinase, protease và acetic acid ức chế trực tiếp lên trứng của tuyến trùng, kết quả làm giảm bướu rễ 66%, số túi trứng giảm 74%, và mật độ tuyến trùng ký sinh trong rễ giảm 71% so với mẫu đối chứng (Djian và cộng sự, 1991; Khan và cộng sự, 2003a, 2004; Park và cộng sự, 2004). 18
  29. Đồ án tốt nghiệp 1.4.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. 1.4.4.1 Ảnh hưởng yếu tố dinh dưỡng Trong quá trình phát triển, nấm Paecilomyces sp. cần nhiều dưỡng chất, nếu thiếu dinh dưỡng sẽ làm hạn chế khả năng gây bệnh của nấm đối với côn trùng (theo trích dẫn bởi Trần Văn Mão, 2002). Carbon và Nitơ cùng với sự cân bằng giữa chúng có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển cũng như sự hình thành bào tử của nấm Paecilomyces sp. (theo trích dẫn của Rayati và ctv, 2001). Các nghiên cứu cho biết, việc bổ sung nguồn đường có ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme của nấm (dẫn theo Rayati và ctv, 2001). Các tác giả còn cho biết sucrose là cơ chất tốt nhất (8,725 cm) cho sự tăng trưởng, tiếp theo là glucose (5,625 cm). Liang (1981), đã cho biết nấm Paecilomyces tenuipes khi thiếu nguồn nitơ động vật tính gây bệnh giảm xuống rõ rệt. Paecilomyces fumosoroseus có thể sử dụng tất cả các nguồn Nitơ và sử dụng Nitơ hữu cơ (các đơn và hỗn hợp amino axit) tốt hơn Nitơ vô cơ (NaNO3 và NH4Cl). Do các Nitơ hữu cơ dưới dạng các amino axit có chứa các yếu tố Carbon mà nấm có thể sử dụng và nguồn Carbon từ các amino axit hỗ trợ cho sự phát triển của nấm dẫn đến tạo được nhiều sinh khối hơn. 1.4.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm và ánh sáng Nhiệt độ và độ ẩm tương đối được coi là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển, hình thành bào tử và lây nhiễm của các loài nấm kí sinh côn trùng (Ayyasamy và Baskaran, 2005). Nhiệt độ thích hợp cho nấm trong khoảng 20 – 250C, nhưng ở 250C nấm phát triển tốt nhất (Lee et al., 1999). Gần đây, Stather và ctv đã công bố những kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. và xác định nấm Paecilomyces sp. thích hợp ở nhiệt độ 280C. Nếu nhiệt độ cao bào tử dễ bị chết hoặc không hình thành, khi tấn công côn trùng nếu gặp điều kiện nhiệt độ, ẩm độ hay ánh sáng không thích hợp thì nấm Paecilomyces sp. sẽ tạo nên những thể chịu đựng để đối phó lại môi trường (dẫn theo Penland, 1982). Nấm phát triển thích hợp ở ẩm độ 80 – 90% (Phạm Thị Thùy, 2004). Ẩm độ cao sẽ rất có lợi cho bào tử nảy mầm và sinh trưởng của sợi nấm, tuy nhiên ẩm độ 19
  30. Đồ án tốt nghiệp thấp sẽ có lợi cho duy trì sự sống của nấm. Bào tử phân sinh của nấm Paecilomyces sp. có khả năng sống lâu trong điều kiện ẩm độ từ 0 – 34% hơn là khi ẩm độ 75%. Mặc khác nấm ký sinh côn trùng nói chung rất cần có ánh sáng cho sự phát triển và nấm Paecilomyces sp. cũng không ngoại lệ, ánh sáng là nhân tố không thể thiếu cho việc hình thành bào tử (theo trích dẫn bởi Trần Văn Mão, 2002). Nếu thiếu ánh sáng thì nấm sẽ không tạo nhiều bào tử. 1.4.4.3 Ảnh hưởng của pH môi trường pH môi trường được quyết định bởi nồng độ ion H+, chính nồng độ ion H+ có ảnh hưởng đến hệ thống enzyme của tế bào và ảnh hưởng việc hấp thu khoáng, acid hữu cơ của tế bào nấm cho quá trình phát triển cũng như hình thành bào tử (Dasrupta, 1994). Nấm thường sống trong phạm vi pH = 3,5 – 8. Nhưng nấm côn trùng ưa pH hơi acid và nấm phát triển thích hợp ở pH = 5,5 – 6. Theo nghiên cứu của Sung Mi Shim et al., (2003), thì giá trị pH phù hợp cho sự phát triển của P. fumosoroseus nằm trong khoảng 6 – 9, còn P. japonica phát triển tối ưu ở pH 7 (Choi et al., 1999), P. sinclairii phát triển tối ưu ở pH 8 (Shim et al., 2003). 1.4.4.4 Ảnh hưởng của độ thoáng khí Nấm côn trùng đa số đều thuộc loại hiếu khí. Khi nấm phát triển chúng đòi hỏi có lượng oxy thích hợp trong dụng cụ nhân nuôi hay trong cả biên độ rộng của không gian nuôi cấy, nếu phù hợp nấm sẽ phát triển tốt. 1.4.5 Cơ chế tác động của chủng nấm Paecilomyces sp. lên tuyến trùng Vỏ trứng tuyến trùng được cấu tạo bởi 3 lớp: một lớp vatelline bên ngoài, một lớp chitin ở giữa và một lớp lipoprotein bên trong tổ chức thảnh một cấu trúc sợi nhỏ và vô định hình (Wharton, 1980). Do đó, muốn xâm nhập vào tuyến trùng nấm Paecilomyces sp. cần phải tiết ra một lượng enzyme chitinase, protease cần thiết mới có thể xâm nhập (Tikhonov et al., 2002). Hai loài Paecilomyces lilacinus và Paecilomyces chalmydosporia là một trong những loài kí sinh tuyến trùng hiệu quả nhất. Sự xâm nhiễm tuyến trùng và trứng tùy theo từng loài nấm mà có các phương thức khác nhau. Ban đầu các bào tử và sợi nấm sẽ tiếp xúc với vỏ trứng. Khi bào tử nấm bám trên bề mặt kí chủ, bào tử sẽ mọc mầm xuyên qua lớp vỏ trứng. Như trong 20
  31. Đồ án tốt nghiệp các cách xâm nhập bề mặt kí chủ của các nấm kí sinh côn trùng khác, nấm kí sinh trứng tuyến trùng sử dụng cả cách thức hóa học (enzyme) và áp lực cơ học. Nấm tiết ra các enzyme như chitinase, protease làm mềm lớp vỏ trứng và tạo thành một lỗ thủng tại nơi bào tử mọc mầm rồi thông qua lớp lổ thủng đó mầm của bào tử nấm sẽ xâm nhập vào bên trong trứng tuyến trùng (Perry và Starr, 2009). Sau khi xâm nhập vào bên trong chúng hoạt động, tiết ra các độc tố làm tê liệt và phá hủy bên trong cơ thể tuyến trùng, hút dinh dưỡng để sinh sản, tiêu diệt trứng, ấu trùng, sự trao đổi chất sinh lý bình thường, dẫn đến cái chết của tuyến trùng ký sinh. 1.4.6 Một số sản phẩm trị tuyến trùng của nấm Paecilomyces sp. vào thực tiễn đời sống Hình 1.6 Sản phẩm Bio- Nematon có khả năng phòng trừ tuyến trùng (Nguồn: www.tstanes.com) Bio-Nematon kiểm soát hiệu quả các tuyến trùng quan trọng như tuyến trùng nốt sưng, tuyến trùng đào hang, tuyến trùng bào nang, tuyến trùng tổn thương vv, trong phạm vi rộng của các loại cây trồng. Giúp tăng năng suất bởi có chứa các loài gây hại của tuyến trùng 21
  32. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.7 Chế phẩm TKS – NEMA trị tuyến trùng (Nguồn: minhthangdaklak.com) Chế phẩm vi sinh TKS – NEMA chứa chủng nấm Paecilomyces sp. mật độ 109 CFU/ml có khả năng tấn công các loại tuyến trùng quanh bộ rễ, giúp bộ rễ phát triển khỏe mạnh, dài và sâu hơn, đồng thời tăng cường các vi khuẩn có lợi trong đất, tăng năng suất cho bà con nông dân. Hình 1.8 Chế phẩm sinh học BIO PEST phòng trừ tuyến trùng (Nguồn: minhthangdaklak.com) Chế phẩm BIO PEST chứa bào tử nấm Paecilomyces sp. đạt 1000 CFU/g phòng trừ các loài tuyến trùng gây bệnh sần rễ, thối rễ, rễ chậm phát triển. 22
  33. Đồ án tốt nghiệp Hình 1.9 Chế phẩm sinh học Palila 500 WP (Nguồn: nongsinh.com.vn) Chế phẩm Palila 500 WP chứa thành phẩn nấm Paecilomyces lilacinus số lượng 5 x 109 cfu/g giúp phòng trừ tuyến trùng gây bệnh trên cây cà rốt, cà chua, hồ tiêu, thuốc lá, cà phê một cách hiệu quả cao. Chúng tấn công và ức chế trứng, truyến trùng nốt sưng và u nang. Giúp phục hồi nhanh chống bộ rễ, tăng cường trao đổi chất, đề kháng cho rễ. 23
  34. Đồ án tốt nghiệp 2 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài được tiến hành từ ngày 25/5 đến ngày 10/8 tại phòng thí nghiệm trường Đại Học Công nghệ TPHCM. 2.2 Vật liệu nghiên cứu, thiết bị và hóa chất 2.2.1 Vật liệu nghiên cứu Chủng nấm Paecilomyces sp. được phân lập bởi Phùng Lê Kim Yến (2014) tại phòng thí nghiệm trường Đại Học Công Nghệ TPHCM. Sinh vật thử nghiệm: Tuyến trùng con cái và trứng Meloidogyne spp. được phân lập từ đất và rễ tiêu tại tỉnh Đăk Lăk. A B C D Hình 2.1 Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. dưới kính hiển vi soi nổi 40X (A: con cái; B: túi trứng; C: túi trứng và ấu trùng; D: ấu trùng tuổi 2 (J2)) 2.2.2 Thiết bị Nồi hấp khử trùng Dao cấy Que cấy điểm Dụng cụ đục lỗ thạch 5mm Đèn cồn Đĩa petri Ống nghiệm Micropipet Kính hiển vi quang học Erlen 24
  35. Đồ án tốt nghiệp Máy li tâm Cốc thủy tinh Bếp từ Máy đo pH 2.2.3 Hóa chất Nước cất FeSO4.7H2O Dịch TCA 5% Glucose Lugol Pepton Tween 80 NaNO3 Cồn 960, 700 KCl Methylene blue CaCl2 MgSO4.7H2O (NH4)2SO4 K2HPO4 Thuốc trừ nấm NaNO3 DNS NaCl 2.3 Các môi trƣờng đƣợc sử dụng để xác định hoạt tính, nuôi cấy 2.3.1 Môi trường PDA (Potato D - Glucose Agar) D-glucose 20 g Agar 20 g Dịch chiết khoai tây 1000 ml Môi trường được hấp khử trùng ở điều kiện 1210C, 1 atm trong 30 phút. 2.3.2 Môi trường thử nghiệm hoạt tính chitinase, protase sử dụng chitin và casein làm cơ chất (Nguyễn Thị Hồng Thƣơng, 2000 - 2001) Cơ chất: 1 % MgSO4.7H2O 3 g K2HPO4 3 g NaNO3 1 g NaCl 0,5 g FeSO4.7H2O 0,01 g Agar 15 g Chloramphenicol 0,1 g 25
  36. Đồ án tốt nghiệp Môi trường được hấp khử trùng ở điều kiện 1210C, 1 atm trong 30 phút. 2.3.3 Môi trường Sauboraud + Khoáng chất Glucose 40 g Pepton 15 g KH2PO4 1 g MgSO4.7H2O 1 g Agar 20 g Môi trường được hấp khử trùng ở điều kiện 1210C, 1 atm trong 30 phút. 2.3.4 Môi trường cảm ứng sử dụng để nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme chitinase: MgSO4.7H2O 0,2 g K2HPO4 0,9 g KCl 0,2 g FeSO4.7H2O 0,002 g ZnSO4 0,002 g MnSO4 0,002 g Cloramphenicol 0,005 g Bổ sung dịch vỏ tôm huyền phù 1% đến 1 lít. pH: 6 - 7 Môi trường được hấp khử trùng ở điều kiện 1210C, 1 atm trong 30 phút. Chuẩn bị dịch huyền phù chitin 1%: Lấy 5g chitin hòa tan trong 50 ml HCl đậm đặc, khuấy liên tục trong thời gian 3 phút ở 400C. Sau đó chitin được kết tủa tạo thành huyền phù bằng cách thêm từ từ 500 ml nước lạnh (50C). Dịch huyền phù được thu lại bằng cách lọc qua giấy lọc. Huyền phù được rửa với nước cất nhiều lần cho đến pH khoảng 7. Sau đó bảo quản lạnh dịch huyền phù. 2.3.5 Môi trường Czapeck - Dox Glucose 1 % NaNO3 3,5 g K2HPO4 1,5 g 26
  37. Đồ án tốt nghiệp MgSO4.7H2O 0,5 g KCl 0,5 g FeSO4.7H2O 0,01 g Agar 20 g Môi trường được hấp khử trùng ở điều kiện 1210C, 1 atm trong 30 phút. 2.3.6 Môi trường Malt agar (Nguyễn Đức Lượng, 2006) Chuẩn bị dịch chiết malt: Lấy 250g malt nghiền nhỏ, hòa vào 1 lít nước cất. Dùng đũa thủy tinh khuấy đều và gia nhiệt từ từ, có khuấy, đến 45 - 500C, giữ ở nhiệt độ này 30 phút. Sau đó, nâng nhiệt độ lên 65 - 680C, có khuấy, giữ ở nhiệt độ này cho đến khi quá trình đường hóa xảy ra hoàn toàn (kết quả là không thấy màu xanh xuất hiện khi thử dịch cháo với dung dịch lugol). Lọc tách bã qua vải thô hoặc bông thấm nước, đem hấp phần dịch trong 1210C, 30 phút, lấy ra để lắng. Lọc tách hết tủa lần nữa. Thêm 2% agar vào dịch chiết malt, đun khuấy đều cho đến khi agar tan hết. Phối môi trường vào các dụng cụ chứa, hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C, 15 phút. 2.3.7 Môi trường WA khảo sát khả năng kí sinh tuyến trùng trên đĩa petri Agar 14 g Nước cất 1000 ml Môi trường được hấp khử trùng ở điều kiện 1210C, 1 atm trong 30 phút. 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp làm phòng ẩm nuôi cấy để quan sát của J.T.Dunean Chuẩn bị các đĩa petri, phiến kính, lamen, bông thấm nước, tất cả đều được hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm, 15 phút. Chuẩn bị môi trường thích hợp PDA hấp khử trùng đổ một lớp dày khoảng 2/3 đĩa petri. Khi thạch đông lại hoàn toàn thì dùng dao vô trùng cắt thành từng mẫu hình vuông, có diện tích nhỏ hơn diện tích lamen. Đặt 1 khối thạch lên phiến kính trong đĩa có sẵn bông thấm được làm ẩm bằng nước cất vô trùn. Dùng que cấy điểm lấy ít bào tử nấm Paecilomyces sp. lên bề mặt xung quanh khối thạch. Đậy lamen lại và đem ủ ở nhiệt độ phòng. 27
  38. Đồ án tốt nghiệp Sau 3 – 4 ngày nuôi cấy, dùng kẹp mở lamen ra, úp lên một phiến thạch có sẵn bề mặt thuốc nhuộm Metylen Blue. Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần sợi nấm trên phiến kính, nhỏ giọt Metylen Blue, đậy lame khác lên trên ta soi được 2 tiêu bản. Quan sát các đặc điểm của nấm Paecilomyces sp. dưới vật kính 40X, 100X. 2.4.2 Khảo sát khả năng sinh trưởng của nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA. Chuẩn bị môi trường PDA hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm trong 15 phút. Sau đó phối vào các đĩa petri vô trùng khoảng 2/3 đĩa. Dùng khoan lỗ thạch đường kính 5 mm đục nhẹ trên môi trường nuôi cấy nấm Paecilomyces sp. rồi cấy vào mỗi đĩa petri chứa môi trường PDA. Theo dõi tốc độ sinh trưởng của nấm Paecilomyces sp. qua 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ngày để xác định tốc độ phát triển tốt nhất. 2.4.3 Phương pháp xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của nấm Paecilomyces sp. 2.4.3.1 Xác định khả năng tổng hợp enzyme chitinase bằng cách đo đường kính vòng phân giải Nguyên tắc: Khi nuôi cấy trong môi trường thạch có bổ sung chitin, nấm sợi sinh enzyme chitinase phân giải chitin thành các dạng có cấu trúc mạch ngắn hơn và N-acetyl- D- glucosamine. Các dạng này không cho phản ứng màu với thuốc thử Lugol, do đó sau khi nhỏ thuốc thử Lugol, độ lớn của phần môi trường trong suốt phản ánh khả năng sinh tổng hợp chitinase của nấm sợi. Phương pháp này chỉ định tính enzyme, chỉ đánh giá sơ bộ khả năng tổng hợp chitinase chứ chưa xác định chính xác hoạt độ chitinase. Thực hiện: Chuẩn bị môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme chitinase, hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Cho môi trường vào các đĩa petri vô trùng khoảng 2/3 đĩa. Dùng khoan thạch có đường kính 5mm ấn nhẹ lên bề mặt nuôi cấy nấm (PDA) rồi đặt sang giữa đĩa petri chứa môi trường cảm ứng chitin, ủ ở nhiệt độ phòng và khảo sát trong 1, 2, 3, 4 ngày liên tục. Đĩa khảo sát cho thuốc thử Lugol vào, để yên 10 phút rồi sau đó đổ Lugol đi và tráng lại bằng nước cất cho sạch, tiến hành đo lần lượt đường kính vòng phân giải và đường kính nấm qua các ngày. 28
  39. Đồ án tốt nghiệp 2.4.3.2 Xác định khả năng tổng hợp enzyme protease bằng cách đo đường kính vòng phân giải Nguyên tắc: Khi nuôi cấy trong môi trường thạch có bổ sung casein 1% , nấm sẽ sinh enzyme protease phân giải casein thành các amino acid. Các dạng amino acid được tạo thành sẽ không phản ứng với thuốc thử TCA 5%, chỉ có casein mới tạo tủa trắng đục với TCA 5%. Thực hiện: Chuẩn bị môi trường cảm ứng tổng hợp enzyme protease, hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Dùng các đĩa petri vô trùng cho vào mỗi đĩa khoảng 2/3 môi trường. Dùng khoan thạch có đường kính 5 mm ấn nhẹ lên bề mặt nuôi cấy nấm rồi đặt sang giữa đĩa petri chứa môi trường cảm ứng casein, ủ ở nhiệt độ phòng và khảo sát trong 4 ngày liên tiếp. Đĩa khảo sát cho thuốc thử TCA 5% vào, để yên 10 phút rồi sau đó đổ thuốc thử đi và tráng lại bằng nước cất cho sạch và tiến hành đo đường kính vòng phân giải và đường kính nấm. Đánh giá khả năng tạo enzyme như mục trên qua các ngày. 2.4.4 Phương pháp nuôi cấy Paecilomyces sp. trên môi trường cảm ứng sinh enzyme chitinase Phối vào mỗi erlen 50 ml môi trường cảm ứng như mục 3.3.4, hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm, 15 phút. Để nguội khoảng 300C. Đĩa PDA nuôi cấy Paecilomyces sp. 7 ngày, ta cho 20 ml nước muối sinh lý vô trùng vào rồi lấy đũa thủy tinh cạo sạch sinh khối trên bề mặt thạch. Sau đó dùng micropipet hút 1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi bình erlen chứa môi trường đã hấp sao cho mật độ bào tử đạt 106/ml. Tiến hành ủ trên máy lắc với 150 vòng/phút. Sau khi nuôi cấy trong điều kiện 3 hoặc 5 ngày. Ta tiến hành lọc môi trường bằng cách li tâm 4000 vòng/10 phút, thu dịch nổi và đem xác định hoạt tính chitinase. 2.4.5 Xác định hoạt độ enzyme chitinase bằng phương pháp DNS Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử và thuốc thử Dinitrosalicylic acid (DNS). Cường độ màu của phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. So màu tiến hành ở 29
  40. Đồ án tốt nghiệp bước sóng 535 nm. Dựa vào biểu đồ đường chuẩn glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử trong mẫu nghiên cứu. Phương trình phản ứng tạo màu giữa đường khử và DNS acid: Hình 2.2 Phản ứng hóa học thuốc thử DNS Thực hiện: Bảng 2.1 Dựng đường chuẩn N-acetyl-D-glucosamine: Đối Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 chứng N-acetyl-D- glucosamine 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 10 mg/ml (ml) Nước cất 10 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9 (ml) Nồng độ N- acetyl-D- 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 glucosamine (mg/ml) OD540nm - Từ các ống nghiệm trên lấy 1 ml cho vào 10 ống nghiệm đã được rửa và làm khô, thêm vào mỗi ống 1 ml thuốc thử DNS. - Đun sôi các ống test 10 phút (có đậy nắp hay nút bông không thấm nước). 30
  41. Đồ án tốt nghiệp - Làm lạnh đến nhiệt độ phòng rồi cho 1 ml nước cất vào ống nghiệm. Đo mật độ quang ở bước sóng 535 nm với mẫu trắng pha tử ống đối chứng. - Sau khi có các giá trị OD ở các nồng độ thì tiến hành vễ đường chuẩn glucose với trục hoành là nồng độ (mg/ml) N-acetyl-D-glucosamine, trục tung là mật độ quang (OD). Tìm phương trình biễu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa 2 giá trị: y = ax + b và hệ số tương quan R2 nhờ phần mềm Excel.  Xác định hoạt độ enzyme chitinase: Nguyên tắc: Hoạt độ chitinase được xác định dựa trên phương pháp định lượng N-acetyl-D-glucosamine sinh ra trong quá trình phân giải chitin. Lượng N- acetyl-D-glucosamine tạo ra được xác định theo phương pháp Elson- Morgan. Thực hiện: Chuẩn bị các ống nghiệm đã được rửa sạch và làm khô. Ống phản ứng: - Cho vào mỗi ống nghiệm hỗn hợp phản ứng bao gồm: 3ml huyền phù chitin 1% và 3 ml dịch enzyme chitinase. Hỗn hợp được ủ ở 300C trong 60 phút. - Ngưng phản ứng bằng cách đun sôi cách thủy 5 phút. - Ly tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch nổi - Lấy 1 ml dịch nổi và 1 ml thuốc thử DNS vào 1 ống nghiệm sạch, lắc đều, đun sôi cách thủy trong 10 phút, rồi làm lạnh về nhiệt độ phòng. - Thêm 1 ml nước cất, lắc đều và đo OD ở bước sóng 535 nm. Ống không phản ứng: - Cho 3 ml dịch enzyme chitinase vào ống nghiệm và biến tính enzyme bằng cách đun sôi cách thủy 5 phút sau đó thêm 3 ml dịch cơ chất chitin vào rồi làm tương tự như cách bước của ống phản ứng. 31
  42. Đồ án tốt nghiệp A B C Hình 2.3 Xác định hoạt tính enzyme chitinase của chủng nấm Paecilomyces sp.; (A: dựng đường chuẩn Glucosamine; B: dịch enzyme thu được sau 3 ngày nuôi cấy; C: định lượng enzyme chitinase) Cách tính: Một đơn vị hoạt tính enzyme chitinase là lượng enzyme cần thiết thủy phân 1 µmol cơ chất là chitin huyền phù trong 1 phút ở nhiệt độ phản ứng nhất định. Đơn vị hoạt tính = (UI/ml) Trong đó: a: hàm lượng glucosamine (µmol/ml) suy ra từ đường chuẩn. n: hệ số pha loãng. v: thể tích hỗn hợp phản ứng. t: thời gian phản ứng (phút). V: thể tích dịch enzyme cho vào phản ứng (ml) 2.4.6 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. 2.4.6.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. Sự thay đổi pH môi trường ảnh hưởng đến khả năng thẩm thấu của tế bào vi sinh đối với những ion nhất định, làm thay đổi trạng thái điện tích của thành tế bào, ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme có mặt trên thành tế bào, làm giảm mật độ sinh bào tử. Vì vậy, xác định pH tối ưu cho nấm Paecilomyces sp. phát triển là điều cần thiết. Do đó, thí nghiệm được tiến hành theo 4 công thức tương ứng với 4 mức pH khác nhau: 32
  43. Đồ án tốt nghiệp Công thức 1: pH 5 Công thức 2: pH 6 Công thức 3: pH 7 Công thức 4: pH 8 Mỗi công thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa trên môi trường PDA. Điều chỉnh pH môi trường nuôi cấy nấm bằng cách cho từng giọt dung dịch HCl nồng độ 0,1 M hoặc NaOH nồng độ 0,1 M vào môi trường. Sử dụng pH kế để xác định và điều chỉnh độ pH của môi trường ứng với các công thức thí nghiệm, sau đó đặt môi trường đã chuẩn pH vào nồi hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm trong 30 phút rồi tiến hành đổ môi trường vào đĩa petri. Cấy một khoanh nấm có đường kính 5 mm (lấy từ mép của tản nấm cấy sẵn) vào giữa đĩa môi trường và để ở nhiệt độ 250C ± 20C. Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính tản nấm (cm): 2 ngày/lần ngày đo sự phát triển của nấm bằng cách lấy trung bình đường kính trên hai trục của khuẩn lạc theo công thức: d = Trong đó: d1, d2 là độ dài hai đường trục vuông góc phần khuẩn lạc phân bố trên đĩa petri. Thời gian theo dõi: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ngày sau khi cấy. Xác định xem nấm phát triển trên môi trường pH nào là tốt nhất. 2.4.6.2 Khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. trên các môi trường khác nhau Thí nghiệm xác định môi trường nuôi cấy nấm thích hợp được bố trí với 4 công thức tương ứng với 4 loại môi trường đang được dùng phổ biến: Công thức 1: Môi trường SABOURAUD Công thức 2: Môi trường PDA Công thức 3: Môi trường MALT - AGAR Công thức 4: Môi trường CZAPEK-DOX Mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc là 1 đĩa petri. 33
  44. Đồ án tốt nghiệp Môi trường được khử trùng ở 1210C trong 15 phút, sau đó đổ môi trường vào các đĩa. Đổ được 2/3 đĩa thì ngưng đổ rồi lắc cho đều đĩa. Cấy một khoanh nấm có đường kính 5mm (lấy từ mép của tản nấm cấy sẵn) vào giữa đĩa môi trường và để ở nhiệt độ 250C ± 20C trong điều kiện 12 giờ sáng/12 giờ tối. Chỉ tiêu theo dõi được thực hiện tương tự như trên. Sau đó so sánh và nhận xét ở môi trường nào thì nấm Paecilomyces spp. phát triển tốt nhất. 2.4.7 Ảnh hưởng của một số loại thuốc trừ bệnh cây trồng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Rachappa, (2006) và Amutha et al. (2010). Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại tương ứng với 3 đĩa petri. Các nghiệm thức gồm 5 loại thuốc trừ nấm được tính toán pha theo đúng tỉ lệ trên môi trường PDA: Hexaconazole (Saizole 5SC), Carbendazim (Carbenzim 500FL), Mancozeb (Dipomate 80WP), propineb (Antracol Zinc++), Nano đồng (Cup 2.9SL), pha theo đúng nghiệm thức đối chứng là môi trường PDA không bổ sung thuốc. Các chỉ tiêu theo dõi: Đường kính khuẩn lạc (cm) và tính phần trăm sự phát triển của sợi nấm bị ức chế so với đối chứng theo công thức: U = [(Đ-X)]/Đ]*100 Trong đó: U: % khuẩn lạc bị ức chế. Đ: đường kính khuẩn lạc được đo ở nghiệm thức đối chứng. X: đường kính khuẩn lạc được đo ở nghiệm thức xử lý thuốc. Ảnh hưởng của thuốc được đánh giá theo bốn cấp độ (Hassan, 1989):  Cấp 1: không ảnh hưởng ( 90%) 34
  45. Đồ án tốt nghiệp 2.4.8 Phương pháp tách tuyến trùng từ rễ tiêu (dẫn theo Lê Thị Mai Châm, 2014) Trứng và con cái Meloidogyne spp. được tách ra từ rễ cây tiêu thu ở tỉnh Đăk Lăk. Mẫu rễ lấy về được rửa sạch dưới vòi nước chảy, để trên giấy thắm khô tự nhiên. Sau đó, dùng dao cấy nhọn tách từ từ phần rễ dưới ánh đèn sáng và bắt con cái, túi trứng trong nốt sần. Con cái có màu trắng đục, hình quả lê, kích thước tùy vào con to nhỏ khác nhau, thường dài khoảng 0,6 – 0,7 mm, rộng 0,4 – 0,5 mm. Túi trứng có màu hơi vàng nâu, hình bầu dục với kích thước tương đương với kích thước con cái. 2.4.9 Đánh giá khả năng kí sinh con cái và trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. trên đĩa petri Chuẩn bị môi trường WA có bổ sung 0,1 g/l chloramphenicol, hấp khử trùng rồi phân phối đều ra các đĩa petri vô trùng. Cấy nấm vào giữa đĩa petri môi trường, dung kim gấp đặt 8 tuyến trùng cái (trứng) xung quanh vị trí cấy nấm, cách tâm đĩa 1 cm, sau đó ủ đĩa petri ở nhiệt độ phòng. Thí nghiệm lặp lại 3 lần và theo dõi sự xâm nhập của nấm vào cơ thể tuyến trùng sau 3, 5, 7, 9, 11 ngày cấy nấm (Khan và cộng sự, 2009). 2.4.10 Phương pháp xử lý số liệu Sử dụng phần mềm Statgraphic và Exel để xử lý số liệu. Hiệu lực phòng trừ của nấm Paecilomyces sp. được tính theo công thức Abbot (1925): M (%) = x 100 Trong đó: X là số tuyến trùng sống ở công thức đối chứng sau thí nghiệm. Y là số tuyến trùng sống ở công thức thí nghiệm sau thí nghiệm. 35
  46. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc điểm hình thái, sinh học của chủng Paecilomyces sp. phân lập đƣợc  Đặc điểm đại thể: Tản nấm có hình tròn đồng tâm, dạng thảm nhung khi nuôi cấy trên môi trường PDA. Ban đầu sợi tơ nấm có màu trắng, mềm, mịn. Sau 4 ngày nuôi cấy sợi nấm bắt đầu chuyển sang màu hồng nhạt và chuyển sang màu tím ở 14 ngày nuôi cấy.  Đặc điểm vi thể: Khi quan sát dưới kính hiển vi có thể thấy cuốn bào tử dài, cong mọc phân nhánh từ các sợi nấm, các thể bình có dạng hình chai nước ở gốc phồng to, ở cổ thì nhỏ dần và mộc vương thẳng. Các bào tử hình oval không màu, dài khoảng 1,5 – 2,5 µm, mọc thưa thớt trên các thể bình liên kết với nhau thành chuỗi dài, hay bị đứt đoạn. Đặc điểm đại thể Đặc điểm vi thể Hình 3.1 Đặc điểm hình thái của nấm Paecilomyces sp. phân lập được 36
  47. Đồ án tốt nghiệp 3.2 Tốc độ tăng trƣởng của nấm Paecilomyces sp. qua các ngày nuôi cấy Bảng 3.1 Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA qua các ngày sau cấy Ngày theo dõi Đƣờng kính tản nấm (cm) 2 NSC 1,29 ± 0,01 4 NSC 2,40 ± 0,03 6 NSC 3,27 ± 0,08 8 NSC 4,20 ± 0,13 10 NSC 5,11 ± 0,26 12 NSC 6,02 ± 0,28 14 NSC 6,83 ± 0,25 Ghi chú: NSC: Ngày sau cấy; các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD A B C Hình 3.2 Đường kính khuẩn lạc của nấm Paecilomyces sp. sau các ngày nuôi cấy; (A: 4 ngày thí nghiệm; B: 6 ngày thí nghiệm; C: 10 ngày thí nghiệm) Qua bảng 3.1 cho thấy, so với các loài nấm kí sinh côn trùng, nấm Paecilomyces sp. phát triển tốt trên môi trường PDA. Sau 14 ngày nuôi cấy đường kính tản nấm đạt 6,83 cm, điều này là phù hợp với nghiên cứu trước đó của Bharati và cộng cự (2007). Tác giả cho rằng môi trường PDA chứa hàm lượng lớn dịch chiết khoai tây (đa dạng về dinh dưỡng, vitamin ), hơn nữa còn chứa nguồn cơ chất là glucose rất thích hợp cho nấm phát triển. Ban đầu khi mới tiếp xúc với môi trường, nấm cần có thời gian thích nghi nên ở 2 ngày đầu tốc độ phát triển của nấm 37
  48. Đồ án tốt nghiệp chưa cao, nhưng sau các ngày tiếp theo tốc độ lại phát triển rất nhanh đặc biệt ở ngày thứ 4 khuẩn lạc tăng cao nhất, nấm lúc này đã dần thích nghi với môi trường nên khả năng sinh tổng hợp mạnh, các sợi tơ nấm phát triển mọc nhanh, hình thành bào tử làm cho nấm lúc đầu có màu trắng sau đó chuyển sang màu tím nhạt. Ở ngày thứ 14 trở đi, khuẩn lạc của nấm bắt đầu xuất hiện một ít màu xám đen, nguyên nhân là do các tơ nấm đã già, sinh trưởng kém, môi trường dinh dưỡng bị cạn kiệt, nên khả năng sinh trường giảm hằn. 3.3 Khả năng sinh enzyme chitinase của chủng nấm Paecilomycess sp. trên môi trƣờng thạch Bảng 3.2 Đường kính vòng phân giải chitin của chủng nấm Paecilomyces sp. Đƣờng kính vòng phân giải D (cm); đƣờng kính tản nấm d (cm) Chỉ tiêu của nấm Paecilomyces sp. ở các ngày sau cấy theo dõi 1 NSC 2 NSC 3 NSC 4 NSC D 1,13a ± 0,06 1,63b ± 0,06 2,80c ± 0,10 3,10d ± 0,10 d 0,50a ± 0,00 0,75b ± 0,03 1,37c ± 0,03 1,65d ± 0,05 D/d 2,27 ± 0.12 2,18 ± 0,16 2,04 ± 0,03 1,88 ± 0,10 Ghi chú: NSC: Ngày sau cấy, các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD, trong cùng một hàng các số có cùng chữ theo sau giống nhau thì không khác biệt ở mức 5% qua trắc nghiệm LSD. Dựa vào bảng số liệu 3.2, có thể thấy rằng chủng nấm Paecilomyces sp. có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase trên môi trường cảm ứng chứa chitin. Kết quả theo dõi cũng cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về đường kính vòng phân giải qua các ngày nuôi cấy. Ở ngày thứ nhất, đường kính vòng phân giải chỉ 1,13 cm nhưng đến 4 ngày sau nuôi cấy, đường kính vòng phân giải đã đạt đến 3,1 cm. Xét về tỷ lệ đường kính vòng phân giải và đường kính tản nấm. Số liệu ở bảng 3.2 cũng cho thấy, ở ngày thứ nhất sau cấy tỷ lệ D/d là cao nhất (2,27) và sau thời gian 2, 3, 4 ngày nuôi cấy thì tỷ lệ D/d lại giảm dần. Vì do ban đầu nấm tiếp xúc với môi trường mới là chitin, không có nguồn đường phù hợp, nên nấm phải thủy phân cơ chất (chitin) để tạo ra đường cung cấp cho cơ thể. Chính vì vậy, tỷ lệ D/d lúc này 38
  49. Đồ án tốt nghiệp đạt cao nhất. Sau ngày thứ 2 tỷ lệ D/d giảm thấp còn 2,18 chứng tỏ nấm đã dần thích nghi với môi trường hơn lúc đầu, khuẩn lạc bắt đầu lớn dần, nấm vẫn tiết chitinase để thủy phân chitin môi trường, cung cấp nguồn năng lượng cho hoạt động cơ thể. Càng về sau tỷ lệ D/d giảm mạnh, cụ thể là ngày 3 giảm còn 2,04, ngày 4 còn 1,88; nguyên nhân là do khi đã quen với nguồn cơ chất mới thì nấm cũng sẽ tiết ra enzyme vừa đủ để phát triển và nuôi sống bản thân, vì vậy ở ngày 3 và 4 tỷ lệ D/d thấp hơn so với 2 ngày đầu. Tóm lại, chủng nấm Paecilomyces sp. phân lập được có khả năng tiết enzyme ngoại bào chitinase, là cơ sở để tấn công phòng trừ tuyến trùng gây hại cây trồng. 1 2 3 4 Hình 3.3 Đường kính vòng phân giải chitin của chủng nấm Paecilomyces sp. sau 1, 2, 3, 4 ngày nuôi cấy 3.4 Hoạt tính chitinase trên môi trƣờng cảm ứng của nấm Paecilomyces sp. Việc bổ sung nguồn cơ chất tự nhiên như pepton, glucose, malt vào môi trường nuôi cấy sẽ giúp cho nấm phát triển tốt hơn (Trần Văn Mão, 2002). Vì vậy cần khảo sát hoạt tính enzyme chitinase trên môi trường có bổ sung nguồn cơ chất tự nhiên sẽ giúp xác định chính xác hơn hoạt tính của nấm Paecilomyces sp. Để định tính khả năng sinh enzyme chitinase của nấm Paecilomyces sp., sinh viên tiến 39
  50. Đồ án tốt nghiệp hành nuôi cấy trên môi trường lỏng có bổ sung huyền phù chitin. Kết quả trình bày như sau: Bảng 3.3 Kết quả xác định hoạt tính chitinase trên môi trường cảm ứng của nấm Paecilomyces sp. Ngày theo dõi Hoạt tính enzyme (UI/ml) 3 ngày 3,726 ± 0,166 5 ngày 3,958 ± 0,144 Ghi chú: hoạt tính được thể hiện dưới dạng TB ± SD, ở mức ý nghĩa α = 0,05 theo trắc nghiệm LSD. Dựa vào bảng 3.4 cho thấy, hoạt độ enzyme chitinase tăng trưởng cao nhất sau 3 ngày nuôi cấy đạt 3,726 UI/ml, còn sau 5 ngày thì tương đối thấp chỉ tăng 0,232 UI/ml. Đối với khả năng tổng hợp enzyme trên môi trường cảm ứng thì hoạt tính enzyme là tương đối cao. Hoạt tính enzyme chitinase trong nghiên cứu này bằng hoặc cao hơn so với các nghiên cứu của các tác giả khác. 3.5 Khả năng sinh enzyme protease của chủng nấm Paecilomycess sp. trên môi trƣờng PDA. Bảng 3.4 Đường kính vòng phân giải casein của chủng nấm Paecilomyces sp. Chỉ Đƣờng kính vòng phân giải D (cm); đƣờng kính tản nấm d (cm) tiêu của nấm Paecilomyces sp. ở các ngày sau cấy theo dõi 1 NSC 2 NSC 3 NSC 4 NSC D 1,30a ± 0,10 1,90b ± 0,00 2,40c ± 0,10 2,97d ± 0,06 D 0,73a ± 0,06 1,20b ± 0,00 1,67c ± 0,03 2,08d ± 0,03 D/d 1,77 ± 0,07 1,58 ± 0,00 1,44 ± 0,04 1,42 ± 0,01 Ghi chú: NSC: Ngày sau cấy, các giá trị là trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD, trong cùng một hàng các số có cùng chữ theo sau giống nhau thì không khác biệt ở mức 5% qua trắc nghiệm LSD. 40
  51. Đồ án tốt nghiệp Qua kết quả ở bảng 3.3, thấy rằng chủng nấm Paecilomyces sp. có khả năng phân giải casein trên môi trường cảm ứng. Đường kính vòng phân giải (D) tăng dần qua các ngày, cho thấy nấm đã tiết ra một lượng enzyme protease cần thiết để phân giải casein, sinh ra các amino acid không phản ứng với thuốc thử TCA 5%. Tương tự như cơ chất chitin, ban đầu nấm cũng cần có thời gian thích nghi khi tiếp xúc với nguồn cơ chất mới là casein. Tỷ lệ D/d đạt cao nhất sau 1 ngày nuôi cấy là 1,77; giảm dần khi thời gian nuôi cấy tăng và thấp nhất sau 4 ngày nuôi cấy (D/d là 1,42). Kích thước vòng phân giải casein biểu thị cho khả năng tiết enzyme ngoại bào protease của chủng nấm, kích thước càng lớn thì khả năng phân hủy cơ chất càng mạnh. Tóm lại, chủng nấm Paecilomyces sp. có khả năng sinh enzyme protease. 1 2 3 4 Hình 3.4 Đường kính vòng phân giải casein của chủng nấm Paecilomyces sp. qua 1, 2, 3, 4 ngày sau cấy 41
  52. Đồ án tốt nghiệp 3.6 Khảo sát ảnh hƣởng của yếu tố pH đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. Bảng 3.5 Kết quả ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. qua các ngày Môi trƣờng Đƣờng kính tản nấm (cm) qua các ngày nuôi cấy pH 2 NSC 6 NSC 10 NSC 14 NSC pH 5 1,05a ± 0,05 2,68a ± 0,08 4,27a ± 0,12 6,03a ± 0,08 pH 6 1,20b± 0,00 2,88b ± 0,03 4,53b ± 0,06 6,10ab ± 0,05 pH 7 1,18b ± 0,03 2,98b± 0,10 4,52b ± 0,10 6,25b ± 0,13 pH8 1,20b ± 0,00 2,90b± 0,00 4,53b ± 0,08 6,12ab ± 0,08 Mức ý nghĩa * * * * Ghi chú: NSC: Ngày sau cấy; Các giá trị được biểu diễn ở dạng TB ± SD, trong cùng một cột các số có cùng chữ theo sau giống nhau thì không khác biệt ở mức 5% qua trắc nghiệm LSD; (*) khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05 theo trắc nghiệm LSD. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng DKN (cm) 7.000 6.000 5.000 pH 5 4.000 pH 6 3.000 pH 7 2.000 pH8 1.000 NSC 0 2 ngày 6 ngày 10 ngày 14 ngày Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. qua các ngày nuôi cấy 42
  53. Đồ án tốt nghiệp Hình 3.5 Nấm Paecilomyces sp. phát triển ở các pH 5, 6, 7, 8 sau 14 ngày Dựa vào bảng số liệu 3.5 và biểu đồ 3.1, có thể thấy rằng nấm Paecilomyces sp. có thể phát triển tốt ở pH 5 – pH 8 với đường kính khuẩn lạc 6,03 – 6,25 cm sau 14 ngày nuôi cấy. Tuy nhiên, đường kính tản nấm có xu hướng nhỏ nhất ở pH 5. Kết quả này cũng khá phù hợp với các kết quả của tác giả khác. Theo Sung Mi Shim et al. (2003) pH phù hợp cho sự phát triển của nấm ký sinh côn trùng Paecilomyces fumosoroseus là từ 5 đến 9, nhưng tốt nhất là ở pH 6. Còn Choi et al. (1999) cho rằng sợi nấm của P. japonica phát triển tốt nhất ở pH 7. Ngoài ra Shim et al. (2003) đề cập rằng P.sinclairii phát triển tốt nhất ở môi trường PDA pH 8. Như vậy, nấm Paecilomyces sp. đều phát triển trong môi trường có phổ pH rộng với pH từ 5 – 8. Tuy nhiên, sự phát triển còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nữa. cụ thể như sau: 43
  54. Đồ án tốt nghiệp 3.7 Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. Bảng 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. qua các ngày Môi trƣờng Đƣờng kính nấm qua các ngày nuôi cấy (cm) 2 NSC 6 NSC 10 NSC 14 NSC PDA 1,28b ± 0,03 3,43bc ± 0,12 5,20b ± 0,21 6,97c ± 0,17 Malt agar 1,33b ± 0,06 3,60c ± 0,10 5,93c ± 0,15 7,70d ± 0,12 Czapek – Dox 1,02a ± 0,03 2,67a ± 0,03 4,15a ± 0,05 5,35a ± 0,05 Sabouraud 1,24b ± 0,03 3,40b ± 0,13 5,13b ± 0,31 6,35b ± 0,31 Mức ý nghĩa * * * * Ghi chú: NSC: Ngày sau cấy; Các giá trị được biểu diễn ở dạng TB ± SD, trong cùng một cột các số có cùng chữ theo sau giống nhau thì không khác biệt ở mức 5% qua trắc nghiệm LSD; (*) khác biệt với mức ý nghĩa α = 0,05 theo trắc nghiệm LSD. Ảnh Hƣởng Của Môi Trƣờng DKN (cm) 9 8 7 6 PDA 5 Malt agar 4 Czapek – Dox 3 Sabouraud 2 1 0 NSC 2 ngày 6 ngày 10 ngày 14 ngày Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. qua các ngày 44
  55. Đồ án tốt nghiệp Kết quả theo dõi dựa vào bảng 3.6 và biểu đồ 3.2 cho thấy trong số 4 loại môi trường thử nghiệm để nuôi cấy nấm Paecilomyces sp. thì môi trường Malt là môi trường nấm phát triển tốt nhất, khuẩn lạc đạt 7,7 cm sau 14 ngày nuôi cấy, tiếp đến là môi trường PDA với đường kính là 6,97 cm, Sauboraud là 6,35 cm, và thấp nhất là môi trường Czapek-Dox, khuẩn lạc chỉ đạt 5,35 cm, mặc dù ở 2 ngày đầu đường kính khuẩn lạc có kích thước tương đương nhau. Điều này cũng dễ hiểu vì ở giai đoạn đầu kích thước khuẩn lạc nhỏ, hệ sợi nấm ít nên nhu cầu dinh dưỡng thích hợp còn chưa cao, nhưng ở các ngày tiếp theo khuẩn lạc lớn lên đòi hỏi nhu cầu về các nguồn dinh dưỡng (Carbon, vitamin ) tăng cao, làm cho khả năng sinh trưởng của nấm trong các môi trường sẽ khác nhau. Nấm Paecilomyces sp. mọc chậm trên môi trường Czapek-Dox điều này là phù hợp với nghiên cứu của Sung Mi Shim (2003) cho rằng sự chênh lệch khác nhau giữa 2 môi trường nuôi cấy PDA (đạt 6,73 cm sau 14 ngày nuôi cấy) và Czapek-Dox (đạt 6,25 cm sau 14 ngày nuôi cấy). Nguyên nhân là do trong môi trường Czapek-Dox hàm lượng đường rất thấp (glucose chiếm 1%) nên khả năng sinh tổng hợp của nấm còn hạn chế, ảnh hưởng đế sự phát triển của tơ nấm (nấm mọc yếu, mỏng), còn đối với môi trường Sabouraud hàm lượng đường chiếm 4% cùng với nguồn protein như pepton giúp nấm phát triển tốt hơn, hệ sợi tơ nấm mọc nhanh hơn, nhưng khi quan sát khuẩn lạc lại có màu trắng, không giống với các môi trường còn lại (khuẩn lạc màu tím), điều này có thể là do nấm sinh bào tử ít vì màu tím là màu của bào tử. Đối với môi trường PDA, nấm phát triển tốt hơn 2 môi trường trên, do nguồn dinh dưỡng dồi dào trong dịch chiết khoai tây cộng với việc bổ sung nguồn glucose 2% nên đáp ứng được dinh dưỡng cho nấm Paecilomyces sp. phát triển. Theo Nguyễn Hoài Hương (2009) cho rằng thành phần amino acid và peptide có trong dịch malt chiếm 5 – 7% chất hòa tan, lượng đường chiếm 60 – 63% cùng với nhiều khoáng chất, vitamin, vì vậy nấm sẽ phát triển trên môi trường Malt là tốt nhất. Điều này phù hợp với các nghiên cứu về các loại nấm kí sinh tuyến trùng. 45
  56. Đồ án tốt nghiệp A B C D Hình 3.6 Nấm Paecilomyces sp. phát triển trên các môi trường khác nhau sau 14 ngày; (A: môi trường Malt; B: môi trường PDA; C: môi trường Sabouraud; D: môi trường Czapek-Dox). 46
  57. Đồ án tốt nghiệp 3.8 Ảnh hƣởng của một số loại thuốc trừ bệnh cây trồng đối với nấm Paecilomyces sp. Bảng 3.7 Kết quả ảnh hưởng của 5 loại thuốc đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. qua 10 NSC, 15 NSC. Tỉ lệ (%) ức chế nấm của các loại thuốc ở các ngày sau cấy Công thức 10 NSC 15 NSC Liều sử dụng ĐKKL Tỉ lệ bị Cấp độ ĐKKL Tỉ lệ bị Cấp độ (cm) ức chế ảnh (cm) ức chế ảnh (%) hƣởng (%) hƣởng Haxaconazole (Saizole 5SC) 0,2 % 0,5 100 4 0,5 100 4 Carbendazim (Carbenzim 500FL) 0,2 % 0,5 100 4 0,5 100 4 Mancozeb (Dipomate 80WP) 0,2 % 0,5 100 4 0,5 100 4 Nano đồng (Cup 2.9SL) 0,25 % 4,86 3,95 1 6,48 8,69 1 Propineb (Antracol Zinc++) 2,5 % 0,5 100 4 0,5 100 4 NSC: Ngày sau cấy ; DKKL: Đường kính khuẩn lạc; Cấp 1: không ảnh hưởng ( 90%). (Hassan,1989) 47
  58. Đồ án tốt nghiệp Kết quả bảng 3.7 cho thấy trong 5 loại thuốc trừ bệnh cây trồng khảo sát thì có 4 loại thuốc ức chế hoàn toàn 100% sự phát triển của nấm là Haxaconazol, Carbendazim, Mancozeb và Propineb, riêng đối với loại thuốc trừ bệnh Nano đồng (Cup 2,9SL) thì khả năng ức chế không cao nên không ảnh hưởng nhiều, tỷ lệ chỉ chiếm 3,95% ở 10 ngày sau cấy. Đến 15 ngày sau cấy, cấp độ ảnh hưởng vẫn không thay đổi, tỷ lệ ức chế của 4 loại thuốc nói trên vẫn đạt 100%, Cup 2,9SL vẫn không ảnh hưởng nhiều đến khả năng phát triển của nấm. Tóm lại, có 4 loại thuốc ức chế hoàn toàn nấm Paecilomyces sp. là Haxaconazol, Carbendazim, Macozeb, Propineb, còn Nano đồng không ức chế. A B C D E F Hình 3.7 Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. ở các công thức xử lý thuốc hóa học (sau 15 ngày nuôi cấy) (A: Haxaconazol; B: Carbendazim; C: Propineb; D: Macozeb; E: Nano đồng; F: Môi trường PDA đối chứng không bổ sung thuốc) 48
  59. Đồ án tốt nghiệp 3.9 Khả năng kí sinh con cái và trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. của chủng nấm Paecilomyces sp. đã chọn Việc đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào chỉ mới là những cơ sở bước đầu để lựa chọn chủng Paecilomyces sp. Chỉ tiêu quan trọng để kết luận đây có phải là chủng nấm ký sinh tuyến trùng hay không thì cần phải khảo sát chúng trên cơ thể ký chủ. Tuyến trùng Meloidogyne spp. đã được phân lập từ rễ và đất cây hồ tiêu bị hại tại Đăk Lăk và chủng nấm Paecilomyces sp. trong điều kiện phòng thí nghiệm. Kết quả khảo sát khả năng ký sinh của nấm Paecilomyces sp. trên tuyến trùng được ghi nhận như sau: Bảng 3.8 Tỉ lệ (%) tuyến trùng cái và trứng bị ký sinh bởi Paecilomyces sp. theo công thức Abbot (1925) Số lƣợng con chết sau 3 lần lặp lại Tỷ lệ ký sinh (%) Tuyến trùng bởi nấm Mẫu đối Mẫu có cấy nấm Paecilomyces sp. chứng Paecilomyces sp. Con cái Meloidogyne spp. 2,67 ± 1,52 7,33 ± 0,57 86,9% ± 12,5% Trứng 1,33 ± 0,57 3,67 ± 0,57 34,92% ± 7,27% Meloidogyne spp. Ghi chú: Số lượng tuyến trùng chết là các giá trị trung bình trên 3 đĩa cấy ± SD Dựa vào kết quả bảng 3.8 cho thấy chủng nấm Paecilomyces sp. có khả năng ký sinh con cái và trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. Điều này chứng tỏ nấm đã tiết một lượng enzyme ngoại bào chitinase, protease phá hủy lớp vỏ tế bào và xâm nhiễm vào tuyến trùng (Khan et al.,2004). Trong thí nghiệm này, khả năng ký sinh trứng của chủng nấm Paecilomyces sp. yếu hơn so với ký sinh con cái, cụ thể là sau 11 ngày cấy phần trăm con cái bị ký sinh là 86,9 %, còn khối trứng là 34,92 %. Như vậy, chủng nấm Paecilomyces sp. khảo sát có khả năng ký sinh rất cao. Tỷ lệ tuyến 49
  60. Đồ án tốt nghiệp trùng cái bị nấm ký sinh trong nghiên cứu này là cao hơn so với nhiều nghiên cứu khác. Đối với con cái thì sau 3 ngày nuôi cấy, thấy xuất hiện ít sợi nấm phân nhánh đã bắt đầu phát triển xung quanh tuyến trùng. Qua các ngày tiếp theo các sợi nấm vẫn tiếp tục phát triển xuyên qua màng tế bào, bám kín cả tuyến trùng. Kết quả này tương tự như trong nghiên cứu của Pau và cộng sự (2012) khi thử nghiệm khả năng ký sinh con cái của các dòng P.lilacinus, sau 6 ngày khuẩn ty nấm bắt đầu xâm nhập vào con cái Meloidogyne incognita. Hơn nữa, tuyến trùng cái bị biến dạng hoàn toàn sau 11 ngày nuôi cấy, điều này khằng định khả năng kí sinh con cái tương đối mạnh của chủng nấm Paecilomyces sp. A B C D Hình 3.8. Con cái Meloidogyne spp. bị nấm Paecilomyces sp. ký sinh qua các ngày chụp dưới kính hiển vi soi nổi; (A: sau 3 ngày thí nghiệm; B: sau 5 ngày thí nghiệm; C: sau 7 ngày thí nghiệm; D: sau 11 ngày thí nghiệm). 50
  61. Đồ án tốt nghiệp Đối với ký sinh trứng tuyến trùng thì sau các ngày nuôi cấy các sợi tơ nấm phát triển chậm hơn, khả năng ký sinh trứng tuyến trùng kém hơn con cái. Điều này dễ hiểu vì trứng tuyến trùng có lớp vỏ dày hơn con cái nên khả năng phân hủy đòi hỏi cần thời gian để nấm có thể tiết enzyme chitinase, protease cần thiết mới có thể xâm nhập tuyến trùng. Tuy nhiên, mặc dù tỷ lệ ký sinh gây chết trên trứng không cao nhưng khi tuyến trùng J2 phát tán ra khỏi trứng thì bị nấm ký sinh. A B C D Hình 3.9 Túi trứng Meloidogyne spp. bị nấm Paecilomyces sp. ký sinh qua các ngày chụp dưới kính hiển vi soi nổi; (A: khối trứng chưa cấy nấm; B: sau 3 ngày thí nghiệm, C: sau 11 ngày thí nghiệm; D: ấu trùng J2 bị nấm quấn quanh). Do không quan sát được tỷ lệ chết của tuyến trùng J2 nên sinh viên không trình bày trong luận văn này. Như vậy, kết quả khảo sát này có thể kết luận được rằng, nấm Paecilomyces sp. có khả năng ký sinh cả trứng và tuyến trùng trưởng thành của loài Meloidogyne spp Đây là những tiền đề cho các nghiên cứu về sau. 51
  62. Đồ án tốt nghiệp 3 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Chủng nấm Paecilomyces sp. có khả năng sinh enzyme chitinase và protease mạnh và sinh trưởng tốt trong môi trường có pH từ 5 đến 8. Môi trường tốt nhất cho nấm Paecilomyces sp. phát triển là môi trường Malt- agar. Các loại thuốc trừ nấm gây bệnh hại cây trồng khảo sát là Haxaconazol, Carbendazim, Mancozeb và Propineb ức chế rất mạnh đối với nấm Paecilomyces sp. Nhưng nano đồng (Cup 2,9SL) rất ít ảnh hưởng. Chủng nấm Paecilomyces sp. khảo sát có khả năng tấn công trứng và con cái cũng như ấu trùng của tuyến trùng Meloidogyne spp. với tỷ lệ con cái bị tấn công là 86,9 %. 4.2 Kiến nghị Định danh loài nấm Paecilomyces sp. Khảo sát khả năng trừ tuyến trùng hại rễ của nấm Paecilomyces sp. trên đồng ruộng để có cơ sở ứng dụng chúng vào việc phòng trừ tuyến trùng hại cây trồng. Tiếp tục khảo sát khả năng ký sinh của chúng trên ấu trùng của loài Meloidogyne spp. và các loài tuyến trùng gây hại khác. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. và khả năng nhân sinh khối chủng nấm này để tạo chế phẩm trừ tuyến trùng hại cây trồng. 52
  63. Đồ án tốt nghiệp 4 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT - Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh, Tuyến trùng ký sinh ở cây hồ tiêu và các bệnh do chúng gây ra, Tuyển tập các công trình nghiên cứu sinh thái và tài nguyên sinh vật (1990-1992), Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, (1993), 265-270. - Lê Thị Mai Châm (2014), “Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne spp. trên cây hồ tiêu”. - Nguyễn Hoài Hương (2009), Bài giảng thực hành công nghệ lên men, Trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM. - Dương Đức Hiếu, Phạm Thị Hồng Thủy, Nguyễn Vũ Thanh, (2010) Phòng trừ tuyến trùng gây bướu rễ (Meloidogyne sp.) cây hồ tiêu bằng chế phẩm từ phân ủ và bánh dầu Neem (Azadirachta indica A.Juss) Tạp chí Bảo vệ thực vật. - Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền và Nguyễn Ánh Tuyết, Thực hành công nghệ sinh học tập 2, NXB Đại Học Quốc gia TP.HCM. - Trần Văn Mão (2002). Sử dụng côn trùng và vi sinh vật có ích. Tập II. Hà Nội: Nhà xuất bản Nông Nghiệp. - Nguyễn Thị Hồng Thương (2000 – 2001). Khảo sát một số yếu tố tác động quá trình sinh tổng hợp enzyme chitinase của các chủng nấm mốc Trichoderma, Đề tài dự thi giải thưởng “Sinh viên nghiên cứu khoa học”. - Viện Bảo vệ thực vật (2011), Giới thiệu một số nguồn nấm kí sinh côn trùng có tiềm năng trong phòng trừ dịch hại cây trồng mới thu thập được ở Việt Nam, cập nhật ngày 16/01/2011. TÀI LIỆU TIẾNG ANH - Bharati, T., J.H. Kulkami, P.U Krishnaraj and A.R Algawadi, 2007. Effect of different carbon sources on the biomass of Meterrhizium anisopliae. Kamataka J. Agric. Sci., 20: 310-311. - Berkeley M.J. (1855) Vibrio forming cysts on the roots ò cucumbers, The Gardeners’ chronicle and agricutural gazette, 220. 53
  64. Đồ án tốt nghiệp - BrodieB.B., CooperW.E. (1964) Relation of parasitic nematodes to post- emergence daming-off of cotton, Phytopathology, 1023-1027. - Choi, Y. J., Hwang, H. K. and Lee, W. H. 1999. The production of artificial fruiting body of Paecilomyces japonica. Kor. J.Mycol. 27(2): 87-93. - CharlesL., CarbonneI., DaviesK.G., BirdD., BurkeM., KerryB.R., OppermanC.H. (2005) Phylogenetic analysis of Pasteuria penetrans using multiple genetic loci, Journal of Bacteriology, 5700-5708. - Eroshenko.A.S & Nguyen Vu Thanh. (1981). Ectoparasitic nematodes of pineapple plantation in northern and central districts of VietNam. In: Free living and plant parasitic nematode fauna in oriental region. Nauka, Leningrad. 128 pp. - FisherP.J., StradlingD.J., SuttonB.C., PetriniL.E. (1996) Microfungi in the fungus gardens of the leaf-cutting ant Atta cephalotes: a preliminary study, Mycol. Res., 541-546. - KhanA.,WilliamsK.L., NevalainenH.K.M. (2006) Control of plant-parasitic nematodes by Paecilomyces lilacinus and Monacrosporium lysipahumin pot trials, Bio Control. - PowellN. T., NusbaumC. J. (1960) The black shank-root knot complex in flue cured tobacco, Phytopathology, 899-906. - PorterD.M., PowellN.T. (1967) Influence of certain Meloidogyne species on Fusarium wilt development in fluecured tobacco, Phytopathology, 282-285. - Paecilomyces lilacinus 251 for Paecilotoxin production”. FEMS microbiology letters 227 (2007): 107-111. - Sung Mi Shim Kyung Rim Lee, Seong Hwan Kim, Kyung Hoan Im, Jung Wan Kim, U Youn Lee, Jae ỎukShiml, Min Woong Leel and Tae Soo Lee (2003), The Opimal Culture Condition Affecting the Mycelial Growth and Fruiting Body. - SmithA.L (1902) The fungi of germinating farm seeds, Trans. Br. Mycol. Soc., 182-186. - SamsonR. A. (1974) Paecilomyces and some allied Hyphomycetes, Studies in Mycology, 1 – 199. 54
  65. Đồ án tốt nghiệp - Trinh Thi Thu Thuy, 2010, Incidence and effect of Meloidogyne incognita (nematoda: meloidogyeninae) on black pepper plants in VietNam, Dotoral theis. K.U.Leuven, Belgium, 121-122. - Wraight, S.P., R.I. Carruthers, C.A. Bradley, S.T. Jaronski, L.A. Lacey, P. Wood and S. Galaini-Wraight. 1998. Pathogenicity of the entomopathogenic fungi Paecilomyces spp. and Beauveria bassiana against the silverleaf whitefly, Bemisia argentifolii. J.Invertebr. Pathol. 71: 217-226. - Wharton D. (1980) Nematode egg-shells, Parasitology, 447-463. - Yuzuru Mikam , Katsukiyo Yazawa , Kazutaka Fukushima, Tadashi Arai , Shun-ichi Udagawa & Robert A. Samson (1989). Paecilotoxin production in clinical or terrestrial isolates of Paecilomyces lilacinus strains. - Zong Qi Liang , Yan Feng Han, Hua Li Chu and Ai Ying Liu (2005).Studies on the genus Paecilomyces in China. TÀI LIỆU INTERNET - hyaline)/Paecilomyces/ - - Wikipedia. Potato, - PhongTruTuyenTrungKySinhCayAnQua.PDF - - _an_khao_sat_tac_dong_cua_mot_so_dich_chiet_comp.xTA2yDVTMV.swf - 214.pdf 55