›

Báo cáo Nghiên cứu thay thế chủng Nakayama bằng chủng Beijing-1 trong sản xuất vắc xin viêm não Nhật Bản

pdf 141 trang yendo 5260
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Báo cáo Nghiên cứu thay thế chủng Nakayama bằng chủng Beijing-1 trong sản xuất vắc xin viêm não Nhật Bản", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfbao_cao_nghien_cuu_thay_the_chung_nakayama_bang_chung_beijin.pdf

Nội dung text: Báo cáo Nghiên cứu thay thế chủng Nakayama bằng chủng Beijing-1 trong sản xuất vắc xin viêm não Nhật Bản

  1. viÖn vÖ sinh dÞch tÔ trung −¬ng c«ng ty v¾c xin vµ sinh phÈm sè 1 b¸o c¸o tæng kÕt ®Ò tµi KHCN cÊp Nhµ n−íc nghiªn cøu thay thÕ chñng nakayama b»ng chñng Beijing-1 trong s¶n xuÊt v¾c xin viªm n∙o NhËt b¶n M∙ sè ch−¬ng tr×nh : kc.10.22 chñ nhiÖm ®Ò tµi: GS.TS Huúnh ph−¬ng liªn 5983 23/8/2006 Hµ néi – 2006
  2. CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1. Lịch sử nghiên cứu bệnh viêm não Nhật Bản - Bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) lần đầu tiên được ghi nhận năm 1871, với các triệu chứng viêm não ở ngựa và ở người. Năm 1873, bệnh xuất hiện rải rác ở nhiều vùng tại Nhật Bản. Năm 1924, một vụ dịch lớn xảy ra tại Nhật Bản với 6000 người mắc và có đến 60% trong số này tử vong [62]. - Năm 1934, Hayashi đã gây bệnh thực nghiệm trên khỉ bằng cách lấy não người tử vong do mắc viêm não tiêm vào não khỉ và sau thời gian ủ bệnh từ 10-14 ngày, thấy xuất hiện các triệu chứng viêm não [57, 115]. - Năm 1935, lần đầu tiên phân lập được virut VNNB từ não một trẻ em bị chết do viêm não tại Tokyo (Nật Bản), chủng được đặt tên là Nakayama [24, 183]. - Năm 1937, phân lập được virut gây viêm não ở ngựa, về sau virut này được xếp vào chủng viêm não ngựa miền Tây. - Năm 1938, Mitamura đã phân lập được virut VNNB từ muỗi Culex tritaeniorhynchus, mặc dù từ những năm 1930 người ta đã nghi ngờ sự lây truyền của bệnh là do muỗi truyền [183]. - Năm 1936-1938, Mitamura và Takanouchi đã nghiên cứu sản xuất thử văcxin viêm não từ não chuột, dù bước đầu nhưng là rất sớm sau khi đã phân lập được virut VNNB [16]. Công nghệ này 40 năm sau mới được hoàn thiện. Văcxin bất hoạt tinh khiết, an toàn cao và hiện đang có mặt trên thị trường quốc tế, đó là văcxin của hãng Biken theo phương pháp hóa lý của Takaku Nhật Bản [111]. - Năm 1959, Buecher và Scherer đã nghiên cứu về sinh thái học bệnh VNNB ở Nhật Bản và đã chứng minh chim và lợn là những vật chủ chính bị nhiễm virut huyết và nhờ có muỗi là vectơ hút máu các động vật nhiễm truyền virut sang cho người. Từ đó bệnh VNNB được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu [21]. 2. Phân loại virut VNNB Virut VNNB là một thành viên của virut Arbo (arthropod borne viruses). Là những virut do côn trùng tiết túc truyền cho động vật có xương sống qua đường máu. Tất cả các virut arbo đều có hệ gen (genome) là ARN, hầu hết chúng đều có vỏ lipit và bị bất hoạt bởi ether hoặc sodium deoxycholate [20, 24]. Việc đặt tên cho các virut arbo đôi khi dựa vào bệnh như sốt Dengue, số vàng (yellow fever) hoặc theo vùng địa lý mà ở đó lần 1
  3. đầu tiên phân lập được virut như viêm não Nhật Bản (Japanese encephalitis), St. Louis encephalitis, West Nile fever Có trên 350 loài trong nhóm virut arbo, trong đó arbo gây bệnh cho người có trên 75 thành viên, được sắp xếp theo mối quan hệ kháng nguyên. Một số tác giả nghiên cứu để xếp loại theo các đặc tính địa lý. Nhiều virut arbo được xếp vào họ Togaviridae, Bunyaviridae, Reoviridae, Rhabdoviridae Họ Togaviridae được chia thành 2 chi (genus) là Alphavirus thuộc nhóm A trong đó điển hình là các loài Aura; Babanki; Barmah Forest; Eastern equine encephalitis; Everglades; Western equine encephalitis; Whataroa. Họ Flaviviridae thuộc nhóm B bao gồm: Japanese encephalitis (VNNB); Dengue; Yellow fever; West Nile fever; Brazilian encephalitis DEN JE TBE YF DEN WN KUN MVE JE SLE POW LGT LI TBE 3 1 2 4 CEE RSSE 100 96 93 90 91-94 85-89 80 82 77 77-78 77-78 72-74 70 69 62 60 46-53 50 E-Protein Amino Acid Homology (%) 40-44 40 Hình 1: Mô hình so sánh các virut trong nhóm Flavivirus dựa vào trình tự axit amin của protein vùng vỏ (E-protein), sử dụng phần mềm Beckman Microgenie Software package, Version 4.0 [101]. (DEN: Dengue; WN: West Nile; KVN: Kunjin; MVE: Murray Valley encephalitis; JE: Japanese encephalitis; SLE: St. Louis encephalitis; YF: Yellow fever; POW: Powassan; LGT: Langat; LI: Louping ill; TBE: Tick borne encephalitis) Các tác giả phân tích trong 3 nhóm chính DEN, JE và TBE cho thấy: Phân tích huyết thanh hỗn hợp JE và DEN thì tỷ lệ giống nhau là 46-53%. DEN1 và DEN3 có quan hệ gần nhất (77% tương đồng); với DEN2 là 69% và DEN4 là 62%. JE và TBE có tỷ lệ nucleotit cùng loại 72-77%, còn axit amin của protein E cùng loại là 40-44% [101]. 2
  4. Hội nghị 1992 tại Geneve, Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) đã xếp loại viêm não do muỗi truyền và gây tổn thương thần kinh trung ương được ký hiệu như sau: A83.0 Viêm não Nhật Bản A83.1 Viêm não ngựa miền Tây A83.2 Viêm não ngựa miền Đông A83.3 Viêm não St. Louis A83.4 Viêm não châu Úc A83.5 Viêm não California A83.6 Viêm não virut Nga A83.7 Viêm não virut do muỗi truyền khác A83.8 Viêm não virut do muỗi truyền không xác định Viêm não Nhật Bản được xếp hàng đầu trong các loại viêm não do muỗi truyền, bệnh để lại hậu quả nặng nề nên đã có văcxin phòng bệnh từ 1954, và sớm có các phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm để xác định căn nguyên [31, 47, 95, 115, 120, 139, 148, 187]. 3. Đặc điểm và cấu trúc của virut VNNB Virut có hình cầu, đường kính trung bình 40-50nm, có màng lipid kép, gắn vào lớp vỏ là glycoprotein E và protein màng (M). Vật liệu di truyền là 1 sợi ARN đơn phân cực dương xoắn, được bao bọc bởi nucleocapsid. Hạt virut VNNB tinh khiết cho thấy sợi ARN chiếm 6%, protein 66%, lipid 17% và carbonhydrate chiếm 9%, cấu trúc của lớp lipid kép phụ thuộc vào tế bào chủ, nơi virut nhân lên [152, 180]. Cấu trúc phân tử của sợi ARN bao gồm 11000 nucleotid, tương ứng với 3400 axit amin. Đây chính là yếu tố gây nhiễm của virut. Hệ gen của virut VNNB mã hóa cho 10 protein gồm 3 protein cấu trúc và 7 protein không cấu trúc trong một khung đọc mở liên tục và trật tự từ đầu 5’ đến đầu 3’ và các vùng không mã hóa. Kết quả dịch mã để hình thành một polyprotein đơn được giải phóng sau sự hoạt hóa của tế bào chủ và enzym chuyển hóa tạo ra sự phân cắt của các protein [31]. 3
  5. Vỏ (Envelope) M (Membrane) Lớp Lipit kép Nucleocapsid 118 nt ORF ®¬n (10233 nt) 51 nt 5’ 7-mG 3’ Sù phiªn m· vµ ph©n c¾t protein Capsid preM E NS1NS2 NS3 NS4 NS5 Phiªn m· trªn m¹ng l−íi néi chÊt h¹t NS2A NS2B NS4A NS4B Hình 2: Sơ đồ cấu trúc hạt virut VNNB (Flaviviruses) Trên hình 2, cho ta thấy sắp xếp thứ tự các protein trong sợi ARN: Cap 5’-C- preM-M-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3’. Đầu 3’ sợi ARN của virut VNNB không chứa đuôi polyA nhưng được coi là làm khuôn mẫu cho các cấu trúc tiếp theo. Từ đầu 5’ các gen được mã hóa cho protein vỏ capsid của ARN (C); protein tiền màng (preM); hoặc protein màng (M) của virut trưởng thành và protein vỏ (E) là protein cấu trúc chiếm 1/4 chiều dài của hệ gen. Các protein không cấu trúc là phần còn lại của hệ gen [149, 181]. 4
  6. 3.1 Protein C Protein C rất nhỏ, chỉ 9-12 KDa gồm 112-127 axit amin được tạo thành rất vững chắc gồm một số lớn axit amin Lys và Arg. Các axit amin trong protein C liên kết với nhau rất chặt chẽ, có thể loại trừ khả năng trung hòa của phân tử ARN của virut với các tác nhân liên quan [106, 148]. 3.2 Protein M Protein M có 2 dạng: protein preM chưa trưởng thành trong tế bào chủ và quan sát thấy có 165 axit amin không trùng lặp với protein E. Từ đó một số tác giả nghiên cứu sử dụng protein E trong sản xuất văcxin VNNB tái tổ hợp để tổng hợp preM của virut với mục đích tạo các nếp gấp chính xác ở tại protein M và lắp ráp vào protein E của 1 flavivirus nào đó (như yellow fever). Trước khi virut được giải phóng ra ngoài tế bào, preM được phân cắt bởi một phân tử protease (furin-like) để tạo thành protein M hoàn chỉnh. PreM chưa trưởng thành không tự tiến tới tế bào đích nhưng lại rất cần thiết cho hoạt động chức năng duy trì nòi giống của virut trưởng thành [148, 170, 189]. Protein M có trong virut trưởng thành ngoài tế bào. Hạt virut trưởng thành có khả năng kháng axit kém hơn hạt virut chưa trưởng thành khoảng 400 lần khi nghiên cứu so sánh trên hạt virut chưa hoàn chỉnh, vì vậy khả năng tiếp cận với tế bào đích dễ dàng hơn. Sự ly giải preM khi ra ngoài tế bào tạo ra sự sắp xếp lại các cấu trúc oligo trên bề mặt hạt virut do đó làm tăng khả năng gây nhiễm của virut trưởng thành tới vật chủ [58, 104]. 3.3 Protein E Có trọng lượng phân tử 55-60KDa, là một glycoprotein bao gồm khoảng 494-501 axit amin là thành phần cấu tạo chính của vỏ (E). So sánh các chuỗi axit amin tương đồng cho thấy protein E là một protein cấu trúc có tính bảo tồn cao trong các virut thuộc nhóm flavivirus. Protein E có liên quan chặt chẽ đến chức năng sinh học của virut như chức năng bám dính, thụ cảm thể, ngưng kết hồng cầu, trung hòa kháng thể, điều chỉnh pH nội nguyên sinh chất của tế bào chủ [56, 59, 115, 139, 147, 149]. 3.4 Các protein không cấu trúc (NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5) - NS1: có trọng lượng phân tử 42-50KDa, là một glycoprotein gồm 353-354 axit amin. Chức năng chưa rõ, có thể như một bổ thể hòa tan cố định kháng nguyên khi bộc lộ trên tế bào cảm nhiễm, có thể NS1 như là đích của đáp ứng miễn dịch chăng? [86, 88, 148]. 5
  7. - NS3: có trọng lượng phân tử 67-70 KDa gồm 618-623 axit amin và có tính bảo tồn cao trong chuỗi nucleotid của nhóm flavivirus, đóng vai trò mã hóa cho enzym proteaza và helicaza [31, 101, 148]. - NS5: có trọng lượng phân tử 104-106 KDa gồm 900-905 axit amin và cũng có tính bảo tồn cao trong chuỗi nuleotid. Một số nghiên cứu khác cho thấy NS5 gắn liền với sự tạo vỏ capsid của ARN. Các nghiên cứu invitro polymeraza đã thẩm định và cho thấy NS3 và NS5 được sử dụng khi ARN của virut nhân lên [148, 149, 176, 179, 181]. - NS2A-NS2B-NS4A và NS4B: đều rất nhỏ bé, có tính chất bảo tồn kém trong chuỗi nucleotid, có thể nghĩ đến sự mã hóa của chúng có liên quan đến protein M. Những năm gần đây, các nghiên cứu về sinh học phân tử của virut VNNB đã có những bước tiến đáng kể. Định loại cấu trúc 3 protein của virut VNNB là M, C và E. Protein E phân lập được từ bề mặt của hạt virut. Thử nghiệm trên động vật có vú cho thấy protein E tạo ra kháng thể trung hòa sau khi tiêm và các động vật này (chuột nhắt trắng) đã sống sót sau khi thử thách bằng chủng độc lực. Khả năng bảo vệ của protein E được thử nghiệm và phân tích bằng thử nghiệm kháng thể đơn dòng (MAb) để định loại nhiều epitop có phản ứng chéo với các flavivirus và cũng giống nhau về đặc tính sinh học [23, 24, 31]. 3.5 Tính chất hóa lý và bền vững của virut VNNB [31, 82] - Virut VNNB có tỷ trọng 1,19-1,20g/cm3 trong đường và 1,22-1,24g/m3 trong cesium chlorid. - Hệ số lắng 200S. - Trọng lượng phân tử 60-70 x 106 dalton. - Độ bền vững: với độ pH giao động từ 7-9. Thích hợp nhất là pH 8. - Virut dễ bị bất hoạt bởi nhiệt độ cao: 50oC trong 50 phút ; 37oC trong vài giờ. Nhiệt độ thấp như -80oC, -20oC virut tồn tại trong nhiều năm và trong nitơ lỏng (-196oC) virut tồn tại vĩnh cửu. - Virut VNNB rất nhạy với dung môi hòa tan như ether, sodium deoxycholate, dễ dàng bị bất hoạt bởi tia cực tím, formaldehyt 3.6 Thành phần và quyết định kháng nguyên Theo nhiều nghiên cứu đã cho thấy kháng nguyên của flavivirus có phản ứng chéo với nhau, 3 nhóm kháng nguyên quan hệ mật thiết và rất khăng khít với nhau đó là sốt Tây sông Nile (West Nile fever), viêm não Louis (Louis encephalitis) và viêm não Nhật Bản (Japanese encephalitis) [29, 140]. Bằng các phản ứng huyết thanh với kháng thể đa dòng rất khó phân biệt. Riêng phản ứng trung hòa (NT) là nhạy nhất tiếp đến là phản ứng 6
  8. kết hợp bổ thể (CF), rồi miễn dịch huỳnh quang (IF). Vậy đánh giá đáp ứng miến dịch sau khi tiêm văcxin bằng ký thuật trung hòa là đặc hiệu nhất, đặc biệt là trung hòa giảm 50% đám hoại tử (PRNT) trên tế bào [126, 127]. Hoặc dùng kháng thể đơn dòng để định loại flavivirus và phân biệt với virut VNNB [59, 68, 74, 102, 104, 123, 126, 127, 128, 139, 151]. Những năm cuối thập kỷ 90, công nghệ sinh học phân tử phát triển không ngừng và chỉ cần sử dụng kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR), với cặp mồi (primer) đặc hiệu thì rất nhanh chóng định loại được typ virut trong các flavivirus [118, 133]. Hoặc xa hơn còn phân tích được đặc tính di truyền của các virut VNNB lưu hành ở các vùng khác nhau bằng phương pháp phân tích trình tự gen (sequencing), so sánh trình tự các nucleotid của các chủng virut VNNB khác nhau [134, 185] Ngày nay, nhờ công nghệ này mà nhiều nhà khoa học đã cố gắng chế tạo các văcxin tái tổ hợp ADN nhằm cải thiện một bước công nghệ gen trong việc bảo vệ sức khỏe cộng đồng [65]. 3.7 Khả năng bảo vệ của kháng nguyên Kháng nguyên tạo ra kháng thể tương ứng, nhưng không phải tất cả các kháng nguyên đều liên quan đến việc gây bệnh và sinh miễn dịch. Thường có 1-2 kháng nguyên quyết định tính sinh miễn dịch và cũng là kháng nguyên bị kháng thể trung hòa nếu xâm nhập vào cơ thể đã được miễn dịch. Kháng nguyên này nằm ngay trên bề mặt của hạt virut. Đó là kháng nguyên chịu trách nhiệm tiếp xúc đầu tiên trên tế bào chủ. Với hạt virut VNNB thì kháng nguyên ngưng kết hồng cầu (HA) và hoạt tính trung hòa là glycoprotein trên preM và E (vỏ và tiền màng của virut), cũng chính 2 thành phần glycoprotein này sinh kháng thể ƯCNKHC (HI) và kết hợp bổ thể (CF), kháng thể trung hòa (NT) [31, 96, 111, 151]. Để chứng minh đều này khi Kitano và Suzuki đã tách chiết ngưng kết tố hồng cầu trên bề mặt hạt virut VNNB rồi gây miễn dịch cho chuột nhắt trắng. Kết quả là kháng thể trung hòa ở chuột được gây miễn dịch với hạt virut VNNB nguyên vẹn và bằng kháng nguyên HA đều có hiệu giá như nhau. Từ đó hai tác giả kết luận yếu tố ngưng kết hồng cầu (HA) là kháng nguyên kích thích tạo ra kháng thể trung hòa [82]. 4. Sự nhân lên của virut trên tế bào 4.1 Chu kỳ nhân lên của virut ARN Khi virut gặp tế bào cảm thụ và nhận biết các thụ thể trên màng tế bào, tiến đến và bám vào thụ thể, màng tế bào bị tác động và tạo khe hở cho virut thâm nhập vào bên trong tế bào gây cảm ứng tổng hợp ARN [35, 115, 148]. Sau đó sợi ARN được bộc lộ là ARN đơn-polymeraza để tạo thành ARN phân cực (-) bổ sung thành chuỗi ARN kép nhờ phiên mã sớm và thông tin trung gian sao chép sợi ARN kép được làm khuôn để tổng 7
  9. hợp các sợi ARN mới theo cách bán bảo tồn và không đối xứng. Khung đọc mở được đồng dịch mã bằng cách cắt đoạn protein liên tiếp thành các đoạn protein cấu trúc và không cấu trúc [172]. ARN và protein của virut được tổng hợp trên lưới nội chất có hạt, vùng quanh nhân trong nguyên sinh chất của tế bào chủ. Sự nhân lên của virut liên quan đến phát triển của lưới nội chất tạo thành các nội bào đặc trưng. Các sản phẩm tổng hợp được lắp ráp ở màng tế bào chất. Sau đó các hạt virion được giải phóng qua bộ máy Golgi bằng ngoại bào xuất tiết và các virut mới tiếp tục xâm nhập vào tế bào khác và bắt đầu một chu kỳ mới [52, 53, 54]. 4.2 Sự nhân lên của virut trong tế bào 4. Cởi áo (bộc 1. Gắn kết lộ sợi ARN) thụ thể 3. Dung hợp màng 5. Dịch mã thành chuỗi tế bào ở pH thấp polyprotein 2. Thụ thể của tế bào 6. Sao chép ARN 7. Sự hình thành virion trong NSC 8. Lắp ráp và hoàn thiện 9. Phóng thích các hạt virut Hình 3 : Sơ đồ nhân lên của flaviviruses [148] Virut VNNB nhân lên trên nhiều loại tế bào cả ở trên tế bào tiên phát và tế bào thường trực, chúng có nguồn gốc từ người, khỉ, gặm nhấm, lợn, chim, gia cầm và muỗi [23, 24, 45]. Tế bào thận bào thai người, thận khỉ, thận lợn, tế bào phôi gà các dòng tế bào thường trực như GMK2, Vero (thận khỉ), BHK21 (thận chuột đất vàng), C6/36 (tế bào muỗi Albobitus). Virut nhân lên gây hủy hoại tế bào (CPE) nhưng cũng có một số 8
  10. loại tế bào quan sát dưới kính hiển vi quang học, không thấy hiện tượng CPE [119]. Hiệu giá virut đạt được tùy thuộc vào tế bào chủ, loại cảm ứng và thích hợp virut nhân lên tốc độ nhanh, thời gian tạo CPE nhanh sau 1-2 ngày gây nhiễm (Tế bào C6/36, Vero và BHK21) [117]. Hình ảnh tế bào tổn thương quan sát trên kính hiển vi quang học cho thấy: tế bào phình to, các tiểu thể hạt xuất hiện ở lưới nội chất làm rối loạn chức năng phân chia tế bào, vỏ màng nội bào tạo thành các không bào căng phồng và các tiểu thể trong nhân bị méo mó. Tăng sinh tiểu thể Lysosom và làm loãng nguyên sinh chất của tế bào. Hoạt tính enzym lysosom tăng lên trong tổ chức tế bào nhiễm [132]. 5. Sinh bệnh học Virut VNNB có cấu trúc kháng nguyên giống như các flavivirus khác, bao gồm virut viêm não St. Louis, virut West Nile vì vậy, chúng có phản ứng chéo với các epitop trung hòa với virut VNNB trên kháng nguyên bề mặt E. Một số phân typ của kháng nguyên đã được nghiên cứu, mặc dù vậy cho đến nay nghiên cứu sự khác nhau giữa các phân typ về độc tính thần kinh, vật chủ vẫn còn nghèo nàn. Vẫn các giả thiết, muỗi đốt qua da rồi virut nhân lên tại chỗ sau đó tiến đến các hạch lympho vùng. Virut tấn công đến hệ thần kinh trung ương và chắc chắn sẽ đến hệ tuần hoàn tổn thương tế bào thần kinh trung ương rồi hủy hoại hệ thần kinh trung ương [92]. Virut nhân lên và khu trú ở não, vùng chất xám, vùng đồi thị, tiểu não và có mặt trong nước não tủy [40, 74, 75, 76]. Chẩn đoán căn nguyên VNNB chủ yếu dựa vào huyết thanh học [61, 80]. Sử dụng bộ sinh phẩm MAC-ELISA để phát hiện sớm IgM đặc hiệu kháng virut VNNB trong nước não tủy hoặc trong máu bệnh nhân trong vòng 4-7 ngày sau khởi bệnh [8, 22, 25, 26, 48, 71, 194]. Những phương pháp chẩn đoán khác như dot-blot hoặc kỹ thuật tủa miễn dịch (immuniprecipitation IgM assay) phát hiện IgM [167]. Có thể phân lập virut từ máu bệnh nhân trong giai đoạn sớm, từ dịch não tủy hoặc từ não tử thi. Kỹ thuật PCR để phát hiện hệ gen đặc hiệu của virut, đặc biệt trong dịch não tủy cũng dễ dàng phát hiện được sự có mặt của hệ gen virut VNNB [68, 93, 107, 133]. Mô hình nghiên cứu thí nghiệm trên chuột nhắt trắng là rõ ràng nhất [40]. Những nghiên cứu sâu về các thể lâm sàng và nhiễm virut thể ẩn cho thấy mức độ thể hiện lâm sàng: từ từ, đột ngột, thể nhẹ, thể nặng, thể ẩn phụ thuộc vào các yếu tố: đường gây nhiễm (dưới da, phúc mạc, não); số lượng virut xâm nhập vào cơ thể; tính độc lực của chủng virut; tuổi cảm nhiễm của vật chủ Vật chủ là yếu tố rất quan trọng về tạo miễn dịch, sinh interferon. Sức khỏe của vật chủ ảnh hưởng đến tính sinh bệnh [73]. Thử nghiệm tiêm vào não chuột liều cao thì bệnh thể hiện dồn dập, đột ngột. Nếu liều gây nhiễm qua da, lượng virut thấp nên diễn biến trước tiên virut nhân lên ở máu ngoại vi rồi 9
  11. hướng thần kinh trung ương và sau đó gây ra Hội chứng não cấp. Tính từ khi virut nhân lên đến thời điểm sốt, đó là giai đoạn ủ bệnh. Thời gian này có thể 6-16 ngày, tùy thuộc vào các yếu tố trên. Hệ miễn dịch hoạt động trước khi xuất hiện các triệu chứng lâm sàng. Do đó, khởi bệnh sau 3-4 ngày đã có thể phát hiện kháng thể IgM và chính giai Virut truyền qua da Tổ chức ngoài thần kinh - Cơ vân, cơ trơn Hạch Lympho vùng - Tuyến tụy, thượng thận - Các tổ chức liên quan Tuyến ức Huyết tương Kháng thể thể dịch Máu Tổ chức biểu mô Nội mô mao mạch Mô thần kinh Tế bào nội mạc võng mô KT của hệ thần kinh trung ương Thần kinh đệm Lymphocyt Macrophage - Rối loạn chức năng tế bào - Ly giải tế bào - Viêm tế bào đoạn sớm này có thể phân lập được virut một cách dễ dàng từ dịch não tủy [25] . Hình 4: Quá trình xâm nhập và phát triển trong cơ thể sau nhiễm virut VNNB [121] Theo sơ đồ trên cho thấy: muỗi đốt, virut truyền qua da, nhân lên tại chỗ và tiến tới hạch lympho vùng, tuyến ức (hệ miễn dịch) rồi vào máu. Trước tiên, gây nhiễm virut huyết và các tổ chức ngoài thần kinh như cơ vân, cơ trơn, cơ tim, nội mao mạch, các tổ chức lympho, tuyến nội tiết, ngoại tiết và vào hệ tuần hoàn. Nhiễm virut huyết dao động bởi tỷ lệ di chuyển của macrophage và cuối cùng kích thích sinh kháng thể dịch thể, qúa trình này diễn biến khoảng một tuần sau khi nhiễm virut. Khi virut tiến tới hệ thần kinh trung ương, ngay lập tức gây cảm ứng thần kinh: thử nghiệm rất rõ ở chuột nhắt và khỉ, biểu hiện thương tổn chủ yếu ở vùng chất xám, đồi thị và tiểu não. Huang và Wong đã 10
  12. nghiên cứu theo dõi và miêu tả các tổn thương thần kinh trung ương cho thấy, liệt ngoại biên, liệt 4 chi và liệt toàn thân [66]. Miyake mô tả lại bệnh lý thể hiện ở người trong giai đoạn cấp: xung huyết, phù nề, xuất huyết vi thể ở não, gây hủy hoại và thái hóa tế bào thần kinh, viêm tắc mạch vi thể chủ yếu xảy ra ở chất xám, não giữa và thân não [111]. Ngoài ra các thương tổn ngoài tổ chức thần kinh như tăng sinh các trung tâm bạch huyết, viêm cơ tim, xuất hiện các tế bào kuffler ở gan, viêm phổi, xuất huyết thận [160]. Lợn nhiễm virut viêm não dẫn đến sẩy thai và tìm thấy các thương tổn ở bào thai lợn bị sẩy. Virut viêm não còn gây vô tinh, viêm mào tinh hoàn, viêm bao tinh hoàn và dừng sinh tinh dịch. Sau khi tiêm virut viêm não vào chuột cái chửa cũng gây sẩy thai. Ở người cũng đã chứng minh nhiễm virut truyền qua nhau thai, gây sẩy thai và đã phân lập được virut ở bào thai [111]. Đáp ứng miễn dịch bảo vệ: miễn dịch bảo vệ được kết hợp với sự phát triển của kháng thể trung hòa [193]. Mặc dù chưa có tiêu chuẩn quốc tế quy định, hiệu giá kháng thể trung hòa 1:10 hoặc lớn hơn 1:10 là đủ bảo vệ. Vai trò của miễn dịch trung gian tế bào cũng được chứng minh trong nghiên cứu trên mô hình chuột. Đáp ứng miễn dịch thụ động: Globulin miễn dịch để điều trị viêm não điều chế từ huyết tương người chưa có. Theo kinh nghiệm của một số tác giả, bệnh viêm não do ve truyền thì phải được sử dụng ngay trước khi khởi bệnh mới có hiệu quả, nếu chỉ muộn 4 ngày sau khởi bệnh cũng không có hiệu quả. Một số nghiên cứu để điều trị sớm bằng α-interferon, có thể kết hợp với plasma miễn dịch điều trị dự phòng tốt hơn [50, 51, 64 165]. Đáp ứng miễn dịch chủ động: Văcxin phòng bệnh VNNB được sử dụng rộng rãi trên thế giới. Tuy nhiên, hiện tại chỉ có văcxin bất hoạt, tinh khiết từ não chuột là được sử dụng rộng rãi [1, 4, 5, 6, 63, 70, 72, 168, 171, 182]. Văcxin bất hoạt và văcxin sống giảm độc lực trên tế bào thận chuột đất vàng tiên phát (PHK) được sản xuất và phân phối tại Trung Quốc với hơn 75 triệu liều văcxin bất hoạt và 25 triệu liều văcxin sống giảm động lực được sử dụng hàng năm tại Trung Quốc để dự phòng cho trẻ em [60, 116]. Tại Nhật Bản, các nhà sản xuất hàng năm chỉ đạt 11 triệu liều, đủ cung cấp trong nước và xuất khẩu 2 triệu liều. Văcxin bất hoạt từ não chuột do BIKEN (Nhật Bản) và Green Cross (Hàn Quốc) sản xuất đều được sử dụng ở các nước châu Âu, bắc Mỹ và Úc. Sau khi một sinh viên Mỹ ở Bắc Kinh chết do VNNB. Trung tâm kiểm soát bệnh tật (CDC, Hoa Kỳ) chỉ sử dụng văcxin của BIKEN để tiêm cho lính Mỹ và du khách Mỹ đến các vùng có dịch. 11
  13. Gây bệnh thực nghiệm: Mô hình thực nghiệm có hiệu quả nhất là chuột nhắt, chuột hamster. Đó là động vật dễ cảm nhiễm với virut VNNB nhưng các yết tố có quyết định đến tính sinh bệnh là : + Đường gây nhiễm. + Lượng virut thâm nhập vào cơ thể. + Tuổi cảm nhiễm. + Độc lực thần kinh của chủng gây nhiễm. Nhiều tác giả đã nghiên cứu, đều có chung một nhận xét là chuột non có tính cảm nhiễm mạnh hơn chuột già [54]. Họ còn chứng minh đường gây nhiễm trực tiếp vào não, thời gian ủ bệnh và phát bệnh nhanh hơn đường ngoại biên [52]. Năm 1991, Ogata đã chứng minh virut viêm não có ái tính với tế bào thần kinh [125]. Dù đường vào cơ thể bằng trực tiếp với tổ chức não hay bằng đường ngoại biên thì virut cũng theo các hạch bạch huyết, hướng tới các nơron thần kinh và nhân lên mạnh mẽ, nhanh chóng ở tổ chức tế bào thần kinh. Miura đã nghiên cứu, phân tích về tính độc lực thần kinh ở chủng độc lực có một gen trội, chính gen này quyết định tính độc lực của chủng virut VNNB. Huang và Wong đã nghiên cứu và công bố kết quả trùng lặp với một số tác giả trước đó là: Trong giai đoạn cấp tính virut VNNB nhân lên và gây tổn thương tổ chức não như hiện tượng xung huyết, phù nề và xuất huyết ở não chuột [66, 122]. Các tiêu bản cắt cực mỏng soi trên kính hiển vi cho thấy sự thoái hóa, hoại tử tế bào thần kinh, hạch thần kinh đệm, nơron thần kinh, hiện tượng viêm quanh mao mạch [54, 132]. Các hiện tượng này xảy ra ở não trung gian, não giữa và thân não chủ yếu ở vùng chất xám. Ngoài ra người ta cũng ghi nhận được sự tăng sinh của các trung tâm bạch huyết, tăng các tiểu thể Malpighi ở lách, viêm cơ tim, viêm tế bào Kuffler ở tổ chức gan, viêm giãn phế nan ở phổi và các nốt xuất huyết cục bộ ở thận. Johnson đã phát hiện thấy các kháng nguyên virut VNNB tập trung ở nơron thần kinh vùng đồi thị và thân não của bệnh nhân tử vong do VNNB [75]. Nghiên cứu virut VNNB ở lợn cho thấy lợn không có triệu chứng viêm não mà thường virut viêm não gây thai chết lưu hoặc sẩy thai và đã chứng minh virut viêm não ở não của lợn con bị sẩy. Ở lợn đực thì virut gây thiểu năng tinh dịch hoặc không có tinh dịch, viêm mào tinh hoàn và vỏ tinh hoàn. Ở phụ nữ mang thai bị viêm não sẽ gây sẩy thai và phân lập được virut từ bào thai. Tiêm virut viêm não qua đường phúc mạc cho chuột chửa cũng gây sẩy thai. Chuột nhiễm virut thể ẩn trong thời kỳ mang thai có thể nhiễm virut thể ẩn ở lần mang thai sau. 6. Xét nghiệm cận lâm sàng và chẩn đoán nghiên cứu phòng thí nghiệm 12
  14. 6.1 Xét nghiệm lâm sàng [77, 109, 110] - Bạch cầu tăng: 10-34x109/l; số lượng trung tính giao động 51-90% - Áp lực nước não tủy tăng (NNT) - Tế bào trong NNT tăng 10-980 x 106/l; protein < 900mg/l; nồng độ glucose bình thường. - Điện não đồ không có gì đặc biệt, bao gồm cả sóng theta và delta. Điện não đồ thay đổi có thể giúp phân biệt với viêm não do Herpes. Phân tích hình ảnh qua computer có thấy một chút thay đổi ở vùng chất xám, nhưng phải là chuyên gia có nhiều kinh nghiệm mới phát hiện được. 6.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm Các phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm vẫn thường theo một quy trình nhất định. Chẩn đoán sớm, nhanh và các phương pháp dịch tễ học. Phát hiện kháng thể IgM đặc hiệu kháng virut VNNB còn phục vụ nghiên cứu, xác định căn nguyên là phân lập virut. Chúng tôi trình bày tuần tự các phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm theo qui trình của TCYTTG. 6.2.1 Phân lập virut [43, 80, 81, 94, 162, 112, 193] - Tiêm vào não chuột sơ sinh - Nuôi cấy trên tế bào phôi gà, phôi vịt tiên phát - Nuôi cấy trên các dòng tế bào thường trực: Vero, LLCMK2, C6/36 và AP/61. - Kỹ thuật tiêm vào muỗi 6.2.2 Phát hiện kháng nguyên [39, 143, 145, 193] - Ngưng kết hồng cầu thụ động ngược. - Miễn dịch huỳnh quang. - Miễn dịch gắn vàng, bạc (MIGSS). 6.2.3 Phát hiện kháng thể [26, 36, 45, 55, 167] - ELISA tóm bắt kháng thể IgM - Avidin biotin system - Kỹ thuật hấp phụ miễn dịch gắn Biotin - Thử nghiệm miễn dịch DOT tóm bắt IgM phát hiện màng nitrocellulose - Kỹ thuật ngưng kết hồng cầu - Kỹ thuật kết hợp bổ thể - Kỹ thuật tan huyết phóng xạ đơn - Kỹ thuật trung hòa 13
  15. Để có thể chẩn đoán phân biệt viêm não do herpes hay VNNB , vùng tổn thương chủ yếu là diencephalon và basal ganglia, nơi virut herpes gây viêm não thường gây biến đổi ở vùng sừng trước. 6.2.4 Chẩn đoán căn nguyên [8, 166, 167] Dựa vào phân lập virut, phát hiện kháng nguyên, kháng thể đặc hiệu trong máu, trong dịch não tủy. Chẩn đoán phòng thí nghiệm xác định VNNB theo một trong ba yêu cầu sau: - Hiệu giá kháng thể lấy máu lần 2 tăng hơn máu lần 1 gấp 4 lần, hoặc cao hơn, nếu là kỹ thuật HI hoặc ELISA-IgG (hiệu giá kháng thể HT2 ≥ 4 lần so với HT1). - Phân lập và định loại virut hoặc xét nghiệm trình tự hệ gen trong dịch nuôi cấy virut, máu, dịch não tủy hoặc các dịch khác của cơ thể; - Phát hiện kháng thể IgM trong máu, dịch não tủy bằng thử nghiệm miễn dịch enzym (ELISA). Đây là phương pháp chẩn đoán nhanh và rất đặc hiệu, với độ pha loãng của huyết thanh là 1/100 cho kết quả OD mẫu thử/OD HT (-) ≥ 2 là dương tính. Thời gian thực hiện chỉ sau 4 giờ là đã có kết quả. 6.2.4.1 Phân lập virut trên não chuột Cho đến nay việc phân lập virut VNNB cũng như các virut Arbo hiệu quả nhất là tiêm vào não chuột nhắt trắng 1-3 ngày tuổi 0,01-0,02ml/con và thường kết hợp với 1 liều tiêm dưới da hoặc tiêm phúc mạc 0,03-0,05ml/com. Chuột sơ sinh được coi là vật chủ nhạy cảm nhất. Chuột đất vàng sơ sinh cũng có thể sử dụng nhưng không cho kết quả tốt hơn. Điểm tiêm là vùng đồi thị của não, giữa tai và mắt. Sau khi tiêm chuột vẫn bú mẹ, vì vậy chú ý mỗi ổ chuột không quá 6-8 con để chuột mẹ chăm sóc tốt hơn. Chuột bị chết trước 24 giờ đều loại bỏ do đó trong 24 giờ đầu phải thăm chuột 2 lần để loại bỏ chuột chết do tiêm hoặc do các nguyên nhân khác. Quan sát các biểu hiện lâm sàng ở chuột ốm, bỏ bú, dạ dày không có sữa, chuột mất màu hồng, tím tái, chậm chạp, nằm liệt nhưng khó quan sát thấy liệt. Thu thập chuột ốm, xử lý chuột bằng dung dịch khử trùng và mổ lấy não vô trùng. Sau đó nghiền đồng nhất 10% trong PBS pH8 có chứa BSA (albumin bò). Ly tâm lạnh 2000v/p trong 20 phút. Lấy nước nổi bảo quản ở -80oC hoặc Nitơ lỏng. Một phần thử nghiệm ngưng kết hồng cầu ngỗng. Cũng có thể phải tiêm truyền 3 lần, chuột không ốm mới loại bỏ. 6.2.4.2 Phân lập virut trên tế bào [44, 69] 14
  16. Sau khi tiêm não chuột ổ (+). Não chuột nhiễm được nghiền đồng nhất 10-20% trong PBS pH8. Ly tâm loại tủa, lọc vô trùng (millipore Millex). Huyền dịch virut sau lọc được cấy vào tế bào C6/36 (nhạy nhất) hoặc Vero Theo dõi sử hủy hoại của tế bào, trong 14 ngày nếu có CPE sớm hơn thì gặt và cấy truyền tiếp để nâng hiệu giá. Bệnh nhân Tử thi - Máu, huyết thanh, plasma - Não: Sinh thiết vùng chất xám. Mẫu bệnh phẩm để (khởi bệnh 1-4 ngày) tiêm truyền - Lách, phổi, gan và các cơ quan - Dịch não tủy khác - Tách chắt huyết thanh, bỏ - Nghiền đồng nhất 10-20% máu đông. trong PBS pH8, có chất bền Xử lý - Pha loãng 1/10 hoặc không vững và kháng sinh. Ly tâm pha loãng 1000v/p, trong 20 phút. - Lấy nước nổi pha 10-1-10-2 - Chuột nhắt 1-3 ngày tuổi: tiêm não 0,01-0,02ml - Chuột hamster sơ sinh: tiêm não 0,01-0,02ml Tiêm truyền - Nuôi cấy tế bào C6/36, BHK21, Vero CPE hoặc plaques - Tiêm vào ngực của muỗi Culex Chuột ốm hoặc Tế bào: CPE, Phôi gà Muỗi, FA, CF Quan sát chết PFU, FA (không đặc hiệu) - Huyền dịch não - Dich nổi tế bào, Tiếp tục tiêm 10% (±) tiếp tục cấy truyền trên chuột, trên tế bào hoặc - Tiêm truyền truyền: CPE. Tiêm truyền tiếp trên muỗi não chuột (+) - Chuẩn độ PFU bằng phương pháp phủ thạch Xác định động Tế bào muỗi Phương pháp khó vật hoặc tế bào Chuột ổ C6/36, BHK21, thực hiện (cần thích hợp Vero phải điêu luyện) (+) (-) (+) (-) Hủy Hủy Hình 5: Sơ đồ phân lập virut viêm não Nhật Bản [150] 6.2.5 Định loại virut VNNB [43] 15
  17. Sau khi tiêm truyền nhiều lần (theo sơ đồ phân lập) cho đến khi đạt hiệu giá ≥ 10-5 (LD50) và hình ảnh thương tổn tế bào CPE điển hình. Sau đó kiểm tra vô khuẩn và bảo quản ở dạng pha loãng 20% có chất bền vững và chất bảo quản virut. Định loại Nếu nghi ngờ mẫu phân lập có ít virut, Nếu việc định loại không nghi ngờ chuẩn bị kháng huyết thanh hoặc kháng thể đơn dòng, để thử nghiệm tiếp Pha dung dịch borate pH9 cho phản ứng CF và HI Lọc, tinh khiết, soi HVĐT - Thử nghiệm HA - Thử nghiệm CF và HI với kháng huyết thanh chuẩn Định loại bằng kỹ thuật trung hòa Tách chiết thành phần HA bằng (NT) hoặc CF, HI, ELISA sucrose aceton và siêu âm. Nếu virut có phản ứng chéo phải Lấy kháng nguyên HA thử nghiệm chuẩn bị kháng thể đơn dòng để với KHT mẫu chuẩn loại trừ. Thử nghiệm khuếch đại gen bằng Nếu nghi ngờ virut Arbo mới cần kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc mở rộng định loại, phối hợp với hiệu. các phòng Thí nghiệm chuẩn thức quốc tế để thực hiện định loại bằng kỹ thuật PCR và phân tích trình tự gen (sequencing). Nếu không tìm thấy virut nhưng nghi ngờ thì phải phân lập lại từ đầu Hình 6: Sơ đồ định loại virut [150] 6.2.5.1 Các phương pháp chẩn đoán huyết thanh học - Ngăn ngưng kết hồng cầu (HI): Đặc hiệu là ngưng kết hồng cầu Ngỗng, kỹ thuật này đã ứng dụng cách đây 50 năm và ngày nay vẫn được sử dụng ở nhiều phòng thí 16
  18. nghiệm vì kỹ thuật đơn giản và không cần thiết bị [38]. Do đó, giá thành để xét nghiệm rẻ hơn so với các kỹ thuật khác. - Kết hợp bổ thể (CF): Hầu như ít phòng thí nghiệm còn sử dụng vì phức tạp và độ tin cậy thấp. - Hấp phụ liên kết enzym (ELISA): gồm có GAC-ELISA để phát hiện kháng thể IgG và MAC-ELISA để phát hiện IgM. Là các kỹ thuật đang sử dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm trên thế giới [22, 43]. - Miễn dịch huỳnh quang (IF)[143]: với kháng nguyên chuẩn: Yêu cầu trước tiên kính hiển vi huỳnh quang, đây là một loại thiết bị đắt tiền và các sinh phẩm chuẩn thức quốc tế, do đó các tuyến dưới khó có thể áp dụng nếu không có kinh phí và không được đào tạo. - Miễn dịch phóng xạ (RIA): để phục vụ nghiên cứu ở các Viện. Ở Bệnh viện lớn kỹ thuật này ít có giá trị trong chẩn đoán nên áp dụng hạn chế 6.2.5.2 Các phương pháp phát hiện virut: Để phục vụ nghiên cứu là chủ yếu - Nhuộm âm bản soi hiển vi điện tử (cần phải có mẫu virut tinh khiết). - Miễn dịch HVĐT (miễn dịch gắn vàng): là kỹ thuật rất đặc hiệu và chỉ những nước phát triển và các phòng thí nghiệm chuẩn thức mới thực hiện vì rất tốn kém. Phòng thí nghiệm Hiển vi Điện tử, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã ứng dụng kỹ thuật này nhưng để nghiên cứu về virut VNNB thì các phương pháp trên đã đủ để xác định, chưa phải dùng kỹ thuật này trừ khi là một virut mới gây viêm não. - Miễn dịch điện di đối lưu, khuếch tán. - Miễn dịch huỳnh quang: dễ dàng phát hiện virut khi có kháng thể đơn dòng. - Sinh học phân tử: Bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu cho kết quả chính xác, có thể phát hiện một lượng virut rất nhỏ (100 hạt virut/ml bệnh phẩm). Ngày nay nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới sử dụng kỹ thuật này để phát hiện nhanh virut, chỉ cần mồi đặc hiệu [37, 93, 107]. Tuy nhiên, các thiết bị cho kỹ thuật này thường tốn kém, sinh phẩm đắt tiền cho nên không thể phổ biến cho tuyến cơ sở. 7. Đặc điểm lâm sàng Các triệu chứng của hội chứng não cấp do virut về lâm sàng không thể nào nhận biết được. Thời gian ủ bệnh VNNB từ 4-14 ngày, khởi bệnh thường đột ngột sốt, đau người, mệt mỏi, đau đầu, đặc biệt viêm não ở người lớn. Ở trẻ em đau dạ dày, ruột và có thể rối 17
  19. loạn tinh thần, ngủ gà ngay ở giai đoạn đầu, lên cơn co giật. Thể nặng dẫn đến hôn mê nhanh chóng và có thể không hồi phục. Một số trường hợp tiến triển viêm não, màng não rất nhanh chỉ trong phút chốc. Trong 50.000 ca được báo cáo mỗi năm thì 10.000 ca tử vong. Số còn sống sót đều để lại di chứng thần kinh và tinh thần cần tiếp tục điều trị và chăm sóc. Hầu hết di chứng để lại ở trẻ 38oC, co giật liên tiếp hoặc liệt vận động, ngủ gà hoặc hôn mê. - Xét nghiệm lâm sàng 18
  20. + Dịch não tủy: Tế bào 10-100 bạch cầu/ml, chủ yếu là lympho bào; protein 0,5- 1g/l ; glucoza và clo bình thương + Công thức máu: bạch cầu tăng cao, chủ yếu là bạch cầu trung tính. - Xét nghiệm huyết thanh + ELISA phát hiện kháng thể IgM (+), kháng nguyên đặc hiệu là Nakayama hoặc Beijing-1 + HI và ELISA phát hiện kháng thể IgG. Nếu lấy máu 2 lần cách nhau 1-2 tuần thì hiệu giá kháng thể máu 2 tăng gấp 4 lần so với máu 1. Nếu lấy máu đơn với HI phải đạt ≥ 1/640 và ELISA là ≥ 1/1600. - Xét nghiệm bệnh nhân đã tử vong + Phân lập và định loại virut VNNB: sinh thiết não vùng đồi thị và chất xám (phương pháp phân lập chuột ổ, trên tế bào C6/36). + Giải phẫu bệnh vi thể: hình ảnh tổn thương thường gặp nhất là viêm quanh mạch, các đám tế bào hoại tử rải rác chiếm ưu thế trong chất xám. 8. Dịch tễ học bệnh VNNB 19
  21. Hình 7: Sự lan truyền của virut VNNB kể từ lần đầu tiên được ghi nhận 1871 cho đến năm 1998 đã đến Australia [163] Virut VNNB lưu hành rộng rãi ở hầu hết các nước trong khu vực châu Á (hình 7), bao gồm: Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Triều Tiên, Philippine, vùng viễn đông Nga, tất cả các nước Đông Nam Á và Ấn Độ. Dần dần nó đã lan tràn đến các vùng khác không thuộc châu Á như vùng Torres của Australia [49, 141]. Hàng năm, trong khu vực này có khoảng 50.000 trường hợp mắc và trong đó có khoảng 10.000 tử vong, số sống sót mang nhiều di chứng thần kinh nặng nề [164]. Bảng 1 : Phân bố bệnh VNNB ở một số nước theo vùng và mùa [171] Nước Vùng lưu hành Mùa truyền bệnh Ghi chú Ít số liệu, dự đoán lưu Tháng 7- tháng 12 Dịch rải rác một số huyện, Bangladest hành rộng (giống miền Bắc Ấn không thông báo đầy đủ Độ) Bhutan Không có số liệu Không có số liệu Không có số liệu Brunei Dịch rải rác giống Lưu hành quanh năm Malaysia Lưu hành dịch cao và Tháng 5 - tháng 10 Dự phòng cao ở những Cambodia rộng khắp trong cả nước vùng nông thôn gần Phnom Penh Hong Kong Hiếm xảy ra ở lãnh thổ Tháng 4 - tháng 10 Tiêm văcxin không thường mới xuyên Ấn Độ Tất cả các bang trong cả Nam Ấn Độ: Tháng Dịch bùng phát ở Bắc nước trừ 16 bang không 5-10 ; ở Goa: tháng Bengal, Bihar Goa, Urbun có dịch 10- 1; ở Tamil Nadu: (theo Lucknow) tháng 8-12 ; ở Kanataka (đỉnh dịch tháng 2 tháng 4-6 ở Mandya) ; Andrha Pradesh : tháng 9-12 ; Bắc Ấn Độ : tháng 7- 12 Indonesia Kalimantan, Bali, Nusa, Nguy cơ quanh năm, Bệnh dịch ở người xảy ra ở Tenggara, Sulawesi, tùy thuộc từng đảo. Bali và Java ; chỉ 4 ca Mollucas, Tây Irian Đỉnh dịch kết hợp với khách du lịch đến Bali Jaya và Lombok mùa lúa canh tác, chăn nuôi lợn. Dịch tháng 11-tháng 3 ; 20
  22. tháng 6- tháng 7 ở một số nơi Nhật Bản Hiếm, một vài ca rải rác Tháng 6 - tháng 9, Tiêm văcxin không thường ở tất cả các đảo trừ Đảo Okinawa tháng 4 xuyên, khuyến cáo du Hokkaido – tháng 10 khách đến Tokyo và các thành phố có dịch phải tiêm văcxin Hàn Quốc Bắc Triều Tiên không Tháng 7 - tháng 10 ; Vụ dịch lớn xảy ra vào năm có số liệu; Nam Triều hầu hết ca dịch vào 1982-1983 Tiên dịch xảy ra rải rác tháng 8 và tháng 9 Lào Lưu hành trong cả nước Có thể tháng 5 - Không thống kê, rất ít tiêm tháng 10 văcxin Malaysia Dịch rải rác ở tất cả các Phân bố quanh năm, Dịch ở Penang, Perak, bang của Peminsula, không có mùa rõ rệt Salagor, Johore và Sarawak Sarawak và Subah Myanma Lưu hành dịch cao tháng 5 - tháng 10 Dịch xảy ra ở Shan và trong cả nước thung lũng ChangMai Nepal Dịch ở phía Nam tháng 7 - tháng 12 ; Không tiêm phòng thường (Terai), thung lũng hầu hết các ca bệnh xuyên, khuyến cáo khách Kathmandu dịch vào bùng phát ở tháng 8 du lịch nên tiêm phòng những năm gần đây và tháng 11 trước khi đến vùng lưu hành dịch Trung Quốc Tất cả các tỉnh ngoại trừ Bắc Trung Quốc: Đang tiêm phòng tích cực, Xizang, Xinziang, tháng 5 – tháng 9; khuyến cáo du khách tiêm Quinghai. Dịch thường Nam Trung Quốc: phòng trước khi vào Trung xuyên ở phía Nam tháng 4 – tháng 10 Quốc Trung Quốc Pakistan Châu thổ miền trung Tháng 6 - tháng 1 Thông báo ca bệnh ở Karachi, vùng lưu hành VNNB và West Nile virus Philippine Hầu như xảy ra ở tất cả Tháng 4 – tháng 11 ; Dịch được thông báo ở các đảo đỉnh vào tháng 9 và Nueva Ecija, Luzon và tháng 1 Manila LB Nga Vùng Trung cận đông Tháng 7 – tháng 9 Ca bệnh ghi nhận đầu tiên maritime, Phía Nam của cách đây 30 năm Khabarousk Singapore Hiếm gặp Quanh năm, đỉnh Không tiêm phòng thường bệnh vào tháng 4 xuyên 21
  23. Srilanka Dịch xảy ra ở tất cả các Tháng 10 – tháng 1, Những năm gần đây dịch vùng núi ở các tỉnh đỉnh tháng 5 – tháng xảy ra ở miền Trung và các miền Bắc và miền 6 (mùa truyền bệnh tỉnh Tây Bắc Trung trong động vật chứa virut) Đài Loan Có dịch rải rác Tháng 4 – tháng 10, Ca bệnh thông báo ở vùng đỉnh tháng 6 Đài Bắc Thái Lan Dịch thường xuyên ở Tháng 5 – tháng 10 Dịch hàng năm ở phí Bắc, phí Nam rải ChangMai, ca bệnh rải rác rác ở Bang Kok, Saburbs Việt Nam Lưu hành dịch ở tất cả Tháng 5 – tháng 10 Tỷ lệ cao ở các vùng gần các tỉnh thành Hà Nội Tây Thái Dịch ở miền Bắc đảo Tháng 9 – tháng 1 Chu kỳ truyền bệnh trong Bình Mariana và Torres (Thái Bình Dương) động vật không thể duy trì Dương, Strait, Australia và một và tháng 3 – tháng 4 ở các đảo, dịch có thể theo Australia và số ca rải rác ở bờ biển (Torres Strait) mùa và phụ thuộc vào virut Papua New phía Tây, của Cap York phát triển Guinea Penninsula, Australia và phía Tây của Papua New Guinea Bệnh VNNB thường do muỗi Culex đốt truyền vào ban đêm. Tỷ lệ nhiễm ở muỗi vào khoảng 1-3% [70]. Loài muỗi này sống chủ yếu ở đồng ruộng lúa nước nhưng có thể di chuyển vào vùng dân cư sinh sống gần đó. Các ca bệnh thường là ở vùng ngoại ô thành phố [70, 175, 186]. Các động vật hoang dã và động vật nuôi như Lợn, Chim là vật chủ chính cho virut VNNB phát triển, người là vật chủ cuối cùng và tồn tại trong thời gian ngắn với hiệu giá virut ở máu ngoại vi rất thấp [186]. Hầu hết số nhiễm không có biểu hiện lâm sàng, tỷ lệ nhiễm trên thể ẩn vào khoảng 1/30-1/50 [186]. Theo Bernard Field là 1/200-1/300 (tùy thuộc từng vùng lưu hành). Tuổi mắc tập trung ở trẻ <15 tuổi, ở người lớn tại các vùng lưu hành dịch đều có huyết thanh dương tính [70, 175]. Tỷ lệ tử vong 10-25% tùy thuộc vào sự điều trị và chăm sóc. Khoảng 30-55% số sống sót để lại di chứng thần kinh. Virut có thể gây nhiễm bào thai gây ra sẩy thai trong thời kỳ mang thai 3 tháng đầu [175, 186]. Bệnh VNNB thường xảy ra quanh năm, nhưng dịch thường bắt đầu trong mùa mưa khi quần thể muỗi phát triển tối đa và nhiệt độ ở các khu vực này thích nghi cho nguồn bệnh [186]. Thường là vào khoảng tháng 5 đến tháng 9 ở các nước bán nhiệt đới và nhiệt đới phụ thuộc vào mật độ muỗi và động vật khuếch đại, lượng mưa, chim di cư 22
  24. và canh tác nông nghiệp là các yếu tố quan trọng. Tỷ lệ mắc giảm dần ở Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản nhưng lại tăng lên ở Bangladest, Myanmar, Ấn Độ, Nepal, Bắc Thái Lan và Việt Nam [186]. Phòng bệnh bằng giám sát vectơ, động vật chứa virut, nằm màn chống muỗi đốt và tiêm văcxin cho người và động vật [175]. Hình 8: Số mắc VNNB đã thông báo ở một số nước trong vùng lưu hành dịch hoặc nghi ngờ 1986-1990 [183] Nguy cơ cho du khách đến vùng có dịch lưu hành với tỷ lệ 1/106 trong vòng 4 tuần, ngoài ra còn phụ thuộc vào mùa, vùng nguy cơ, thời gian lưu trú. Nếu du khách vào vùng trong mùa dịch thì tỷ lệ này là 1/5000 [161, 168, 174, 175]. Năm 1969, có ít nhất 10000 lính Mỹ đã bị nhiễm ở Việt Nam và 57 ca VNNB và 24 ca viêm não là các khách du lịch ở phương Tây đến Việt Nam từ 1978-1992 [70, 175]. Theo Igarashi và cộng sự, chu kỳ truyền bệnh của virut VNNB trong tự nhiên cũng được biết đến rất nhiều. Vectơ chính là muỗi Culex tritaeniorhynchus hoặc một số loài muỗi có liên quan. Lợn và chim là động vật khuếch đại chủ yếu [9, 11, 13, 124]. Như chúng ta biết virut VNNB tồn tại ở nhiều nước Đông Á, Đông Nam Á và Nam Á. Hầu hết khí hậu những khu vực này là ôn hòa, mưa nhiều, gió mùa phù hợp với các cánh đồng ruộng lúa nước, đồng thời chăn nuôi lợn cũng phát triển ở các nước này. Trên cơ sở về môi trường của các nước nông nghiệp này tạo điều kiện cho chu kỳ truyền bệnh trong thiên nhiên được dễ dàng. Vectơ phát triển tỷ lệ thuận với các động vật khuếch đại và chu 23
  25. kỳ truyền virut sang người cũng dễ dàng nên số mắc bệnh ngày càng tăng nếu không có văcxin dự phòng [14, 65]. - Miền Bắc Thái Lan có tỷ lệ mắc 25/105 dân số. - Việt Nam: lưu hành rộng rãi từ Bắc đến Nam, nhưng đặc biệt nghiêm trọng là ở vùng châu thổ Sông Hồng và Trung du, tỷ lệ mắc trung bình 5-6/105 dân. - Nhật Bản và Hàn Quốc đã dự phòng bằng văcxin từ lâu nên số mắc bệnh rất thấp. Ở Nhật Bản chỉ có 10-20 trường hợp/năm. Bệnh VNNB trước tiên xuất hiện tại châu Á, chủ yếu là ở trẻ em dưới 15 tuổi. Trong số nhiễm có 70% phát bệnh thể lâm sàng. Số mắc bệnh hoặc chết hoặc để lại di chứng thần kinh suốt đời. Từ ca bệnh được ghi nhận cuối thế kỷ 19, bệnh VNNB lan truyền do du khách từ vùng viễn nam như châu Úc và viễn Tây như Pakistan. Đến nay bệnh VNNB chưa lan truyền đến châu Phi, châu Âu và châu Mỹ. Văcxin VNNB được sử dụng từ năm 1941 nhưng rất hạn chế ở nhiều nước lưu hành bệnh. 60 năm trước có khoảng 10 triệu trẻ em mắc VNNB, tử vong 3 triệu và di chứng thần kinh lâu dài > 4 triệu. Việc giám sát bệnh VNNB còn nghèo nàn và hạn chế. Không được tiêm văcxin đầy đủ, thiếu sự hướng dẫn và hỗ trợ thường xuyên để tiêm chủng và ý thức về phòng chống bệnh VNNB còn chưa quán triệt đầy đủ. Tổ chức PATH đã đưa ra một dự án nhằm mục đích: - Cải thiện việc giám sát bệnh VNNB - Phát triển nhanh văcxin VNNB thích hợp - Đưa văcxin VNNB đến nơi cần nhất - Đẩy mạnh đầu tư tiêm chủng VNNB Đây cũng là một chủ trương đúng đắn nhằm ngăn chặn sự lan truyền bệnh VNNB. 9. Sinh thái bệnh VNNB 9.1 Diễn biến dịch VNNB trong mối quan hệ ổ chứa, vectơ và người Virut VNNB được truyền qua người do muỗi đốt, các động vật mang virut và truyền sang cho người. Như vậy, người được cho là vật chủ cuối cùng của virut VNNB [18, 188]. Ở người, virut VNNB tồn tại trong một thời gian rất ngắn ở máu ngoại biên và hiệu giá rất thấp, do đó virut không thể truyền trực tiếp từ người sang người. Mặt khác, muỗi thích hút máu động vật hơn máu người [21]. 24
  26. Theo nghiên cứu tại đảo Honshu (Nhật Bản) năm 1964 cho thấy: Lợn bị nhiễm virut huyết 4 ngày, sau đó muỗi đốt truyền bệnh. Có 20% lợn bị nhiễm virut VNNB vào đầu tháng 7. Sau khi hút máu lợn có chứa virut VNNB, virut nhân lên ở muỗi sau 14 ngày của chu kỳ ủ bệnh và chính những con muỗi này lại tiếp tục truyền virut viêm não đợt 2 cho lợn cảm nhiễm khác và như vậy 100% số lợn có kháng thể. Số lợn nhiễm virut và số muỗi nhiễm virut luôn luôn tỷ lệ thuận với nhau. Từ đó muỗi truyền virut qua cho người một cách dễ dàng. Tuy nhiên, người sống trong vùng lưu hành dịch có miễn dịch do các liều virut truyền từ muỗi sang chưa đủ gây bệnh do vậy tỷ lệ mắc bệnh VNNB thể lâm sàng so với thể ẩn là 1/200-1/300. Muỗi hoặc động vật Khuếch đại nhân tái nhiễm lên của virut Người và động vật nhiễm cuối cùng của chu kỳ Chu kỳ truyền virut trong động vật, ổ chứa thiên nhiên Hình 9 : Chu kỳ truyền bệnh VNNB [183] Theo Maeda và cộng sự 1978, đã chứng minh rằng: phân lập được virut từ muỗi sau 17-20 ngày thì dịch viêm não xảy ra nếu không có biện pháp phòng chống [153]. Igarashi 1994, đã nghiên cứu cho thấy virut VNNB tồn tại trong thiên nhiên bởi sự phát triển kế tiếp nhau của virut trong vật chủ và vectơ, quan trọng nhất là Culex tritaeniorhynchus và một số loài muỗi khác sống ở đồng ruộng lúa nước, chỉ cần một mảnh ruộng lúa nước trong vòng 1 ngày có thể sản sinh ra 30.000 con muỗi trưởng thành 25
  27. [190]. Lợn là vật chủ mà muỗi ưa hút máu nhất. Lợn bị nhiễm virut huyết nhưng không biểu hiện các triệu chứng lâm sàng nhưng có thể gây ra thai chết lưu hoặc sẩy thai [28]. Igarashi còn nghiên cứu, mặc dù bò rất ít cảm nhiễm với virut VNNB nhưng cũng là vật chủ thu hút vectơ, do đó không loại trừ được sự lây truyền virut [124]. Ngoài lợn ra, một số loài chim như diệc đen, cò trắng, liếu điếu được coi là ổ chứa quan trọng trong thiên nhiên [183]. Ngựa nhiễm virut viêm não có thể hiện các triệu chứng lâm sàng và tỷ lệ tử vong cao như ở Trung Quốc và đã gây thiệt hại lớn về kinh tế qua các vụ dịch viêm não ở ngựa. Tuy nhiên, ngựa không có vai trò quan trọng trong việc lây truyền virut viêm não như lợn và chim. 9.2 Ổ chứa virut VNNB trong thiên nhiên Nhiều nghiên cứu về động vật cảm nhiễm cho thấy trong máu lợn, ngựa và chim có hiệu giá kháng thể kháng virut VNNB cao. Còn trâu, bò, dê, khỉ và chó có hiệu giá kháng thể thấp. Lợn và chim là những vật chủ quan trọng nhất để dự trữ, nhân lên và lây truyền bệnh VNNB [27]. Còn loài gặm nhấm được chứng minh là vật chủ không quan trọng. Lợn là ổ chứa virut quan trọng để truyền cho muỗi vì: - Chỉ số lợn bị nhiễm virut viêm não trong thiên nhiên cao nhất. - Virut VNNB nhân lên ở máu ngoại vi của lợn rất nhanh và rất cao nên khi muỗi hút máu lợn là có thể lây truyền virut một cách dễ dàng. - Thời gian nhiễm virut huyết ở lợn kéo dài 2-4 ngày có điều kiện cho muỗi hút máu nhiều lần. - Sự lây truyền virut từ lợn qua lợn bằng đường muỗi Culex tritaeniorhynchus đốt đã được chứng minh trong phòng thí nghiệm. - Muỗi Culex tritaeniorhynchus rất ưa hút máu lợn. - Một số lượng lớn quần thể lợn cảm nhiễm mới từ 6 đến 8 tháng tuổi được thay thế hàng năm cho lò mổ, do vậy ổ chứa này không tiêm phòng sẽ là nguồn mang bệnh để muỗi dễ dàng truyền bệnh sang cho người và động vật khác. Chu trình truyền bệnh VNNB chim-muỗi-chim cũng được coi là quan trọng trong môi trường sống. Ở Ấn Độ đã thử nghiệm giám sát 514 loài chim và kết quả cho thấy 34,8% có kháng thể kháng virut VNNB, 25% điệc đen và cò trắng truyền kháng thể từ mẹ sang con và kháng thể tồn tại ở con được 3-5 tuần. 26
  28. 9.3 Vectơ truyền bệnh [24, 95, 108, 123] Những yếu tố quan trọng để vectơ truyền bệnh : - Vectơ truyền bệnh là muỗi cái. Sau khi hút máu động vật nhiễm, virut nhân lên ở muỗi cái rất nhanh và có thể truyền virut qua thế hệ ấu trùng muỗi. - Muốn truyền được virut qua một vật chủ khác thì virut phải có mặt ở tuyến nước bọt của muỗi để truyền theo nốt đốt và gây nhiễm cho động vật cảm nhiễm. - Mật độ vectơ càng cao thì khả năng truyền bệnh càng dễ dàng nhưng vectơ này phải có mặt ở quần thể động vật cảm nhiễm. - Nhiều nghiên cứu cho thấy muỗi Culex tritaeniorhynchus là vectơ chính để truyền bệnh. Trong 17 loài muỗi phát triển ở đồng ruộng có 2 loài phát triển quanh năm và khả năng truyền bệnh cao nhất đó là C. tritaeniorhynchus và C. vishnui [19, 23, 95, 155]. Mặc dù vậy 2 loài muỗi này thích hút máu lợn và chim non hơn là máu người. 2 loài muỗi này bay xa 1,5km, chúng có thể sống cách mặt đất 13-15m, trên các ngọn cây cao để hút máu các loài chim. - Các loài muỗi khác: C. anulus, C. quinquefasciatus và Armigeres subalbatus cũng truyền virut VNNB qua trứng như C. tritaeniorhynchus nhưng virut nhân lên ở các loài muỗi này với hiệu giá rất thấp do vậy khả năng truyền bệnh kém hơn và cơ hội phân lập được virut ở chúng cũng rất hạn chế. 9.4 Virut VNNB tồn tại và nhân lên ở muỗi trong điều kiện khí hậu lạnh Chúng ta biết là khí hậu nhiệt đới là điều kiện tốt nhất cho muỗi phát triển và cũng là nhiệt độ thích hợp cho virut tồn tại và nhân lên ở muỗi. Vậy ở các nước ôn đới và á nhiệt đới thì virut sống qua đông giá như thế nào? người ta chứng minh rằng virut vẫn tồn tại ở cơ thể muỗi ngủ đông ở ngay trong trứng muỗi, trong cơ thể bò sát hoặc trong các loài chim di cư đi trốn đông đến xứ ấm áp. Ở Hàn Quốc người ta đã thu thập và nghiên cứu trên 50000 con muỗi trong mùa đông liên tiếp trong 6 năm và đã phát hiện được 2 chủng virut VNNB (1 chủng vào tháng 12 và 1 chủng vào tháng 2). Virut cũng phân lập được vào tháng 6. Những nghiên cứu này đã chứng tỏ muỗi truyền virut qua trứng là khả năng sinh tồn của virut VNNB giữa các vụ dịch. Hay nói một cách khác sự duy trì của muỗi qua thời kỳ giá lạnh trong cơ thể muỗi gọi là virut sống qua đông [158]. 9.5 Vai trò của loài bò sát trong việc duy trì virut VNNB Năm 1965-1970 Hàn Quốc đã nghiên cứu trên 2000 con rắn đã chứng minh 40% có kháng thể kháng virut VNNB (bằng kỹ thuật HI). Đã phân lập được 2 chủng virut từ 27
  29. 747 con rắn (1 chủng tháng 1 và 1 chủng tháng 10). Điều này cho thấy điều kiện ngủ đông nhân tạo của virut VNNB có thể được hồi phục từ các loài rắn, ếch, nhái sau 6 tháng mùa đông ở Hàn Quốc [158]. 9.6 Bệnh VNNB phân bố theo mùa Những nước thuộc khí hậu nhiệt đới có lưu hành VNNB thì bệnh xảy ra quanh năm. Nhưng dịch VNNB thường bắt đầu vào mùa mưa, đó là thời điểm muỗi phát triển tối đa. Tại Tamil Nadu ở Ấn Độ đã chứng minh: Tiếp theo lượng mưa tăng thì mật độ muỗi tăng và sự biến động có chiều hướng tăng lên của kháng thể trong máu lợn ở các trại chăn nuôi và cuối cùng bệnh VNNB xuất hiện ở người. Tại bang Karnataka Ấn Độ mỗi năm có 2 mùa dịch vào tháng 4 đến tháng 7 và từ tháng 9 đến tháng 12 [30, 42]. Ở Thái Lan: mùa nóng, khô thì hiệu giá kháng thể trong lợn rất thấp nhưng chỉ vài tuần sau mưa đầu tiên quần thể lợn đã bị nhiễm virut [126]. Ở Việt Nam: Một nghiên cứu của Vũ Sinh Nam và cộng sự tại Đông Anh, Hà Nội cho thấy: Mật độ muỗi C. tritaeniorhynchus cao và tháng 4 đến tháng 9 và rất thấp ở các tháng còn lại. Hai đỉnh mật độ muỗi tăng lên rõ rệt là tháng 4 và tháng 8. Trong khi đó đỉnh của lượng mưa lại là tháng 6. Do đó mật độ muỗi không phụ thuộc trực tiếp vào lượng mưa mà có liên quan đến 2 vụ lúa nước trong tháng 5-6 và tháng 11-12. Đỉnh cao thứ 2 của mật độ C. tritaeniorhynchus là tháng 8 nhưng hiệu giá kháng thể lợn giảm xuống và nhiệt độ từ tháng 10 đến tháng 3 không đủ cao để C. tritaeniorhynchus hoạt động và phát triển. Trong khi đó bệnh VNNB đỉnh cao ở tháng 5, tháng 6 hoặc tháng 7 tùy thời tiết hàng năm. Tác nhân gây bệnh VNNB cho đến nay đã dễ dàng xác định. Trước hết là bằng kỹ thuật MAC-ELISA để phát hiện kháng thể IgM. Đây là một kỹ thuật chẩn đoán sớm (3 ngày sau phát bệnh) và rất nhanh, chỉ sau vài giờ là có kết quả. Đặc biệt là rất đặc hiệu vì IgM chỉ xuất hiện trong giai đoạn cấp nên không thể nhầm với các flavivirus (như sốt xuất huyết Dengue) [8, 11, 22, 26, 33]. Nhưng hiện nay chẩn đoán sàng lọc của lâm sàng còn rất hạn chế. Tất cả các bệnh nhân có các triệu chứng giống hội chứng não cấp (HCNC) đều cho là VNNB. Ở Việt Nam chưa có thống kê chính xác về tỷ lệ VNNB trong tổng số bệnh nhân mắc HCNC do virut nói chung. Tuy nhiên, sau hơn 10 năm sử dụng văcxin VNNB của Việt Nam cho thấy tỷ lệ VNNB trong tổng số viêm não do virut đã giảm đi từ 70-75% đến nay chỉ còn 25-30% [4, 5, 6, 7, 9]. 28
  30. Một số nước như Nhật Bản, Hàn Quốc thì 100% số ca bệnh đều được xác định căn nguyên vì số mắc rất ít < 50 ca/năm. Ở Việt Nam số mắc HCNC từ 1500-2500 ca/năm, số được chẩn đoán chỉ có khoảng 10% [2, 6, 10, 12]. 9.7 Sự phân bố bệnh VNNB theo tuổi Tuổi mắc bệnh còn tùy thuộc vào từng vùng khác nhau [99]. Nhưng nhìn chung nhóm tuổi có tỷ lệ mắc cao nhất là 1-3 tuổi, là nhóm tuổi vừa mất kháng thể mẹ truyền. Nhưng theo giám sát dịch tễ học và đã thống kê thì tỷ lệ mắc cao ở trẻ 3-6 tuổi [5, 72, 85, 99]. Đặc điểm của nhóm trẻ này là rất hiếu động, vào lúc chập tối thường đùa nghịch ở quanh nhà, gần chuồng gia súc và cũng là lúc muỗi C. tritaeniorhynchus hoạt động, trẻ bị muỗi đốt và truyền bệnh. Tỷ lệ mắc bệnh giảm ở trẻ trên 14 tuổi cùng với sự tăng hiệu giá kháng thể trung hòa ở nhóm tuổi này. Điều này cũng chứng minh rằng tại nơi lưu hành bệnh, trong suốt thời kỳ niên thiếu, trẻ có nhiều cơ hội bị phơi nhiễm với virut VNNB và có thể đã mắc bệnh VNNB không điển hình hoặc nhiễm thể ẩn và tạo được miễn dịch cho các em. Ở một số vùng như miền Bắc Ấn Độ, Nepal và Srilanca thì tất cả mọi lứa tuổi đều cảm nhiễm với VNNB. Khách du lịch ở vùng không có lưu hành dịch đến nơi có dịch rất dễ mắc bệnh nếu có đủ các yếu tố truyền bệnh. Ở Việt Nam, giám sát dịch tễ học từ năm 1985 đến 1998 ở miền Bắc Việt Nam số ca bệnh VNNB thể lâm sàng đều ở trẻ dưới 15 tuổi [3, 9]. Tỷ lệ mắc ở trẻ em trên 15 tuổi không đáng kể, nhóm tuổi có tỷ lệ mắc cao nhất là 1-4 tuổi chiếm 36,9%, 5-9 tuổi chiếm 34,6%, trẻ dưới 1 tuổi là 3,9%. Một nghiên cứu khác của Viện VSDTTƯ trên 793 bệnh nhân VNNB thể lâm sàng thuộc 12 tỉnh phía Bắc từ 1989-1991 cho thấy 401/793 có kháng thể IgM kháng virut VNNB dương tính (50,57%). Trong số 401 ca thì 381 ca là trẻ em dưới 15 tuổi chiếm 95%. Nếu tính số trẻ em dưới 10 tuổi tỷ lệ này là 85,5% [6]. Dựa vào kết quả trên ta thấy ở miền Bắc Việt Nam số trẻ có nguy cơ mắc tập trung ở lứa tuổi dưới 15 tuổi. Trong đó trẻ cảm nhiễm cao với virut VNNB là 1-10 tuổi. Như vậy, nhóm tuổi cần thiết tiêm phòng văcxin VNNB trước hết là 1-10 tuổi ở những nơi có lưu hành dịch [6]. 9.8 Sự phân bố VNNB theo vùng địa lý Những nước đã được thông báo có dịch VNNB là Ấn Độ, Nepal, Srilanca, Malysia, Singapore, Philipppine, Indonesia, Trung Quốc, vùng viễn đông Liên Xô cũ, 29
  31. Hàn Quốc và Nhật Bản. Nói chung chỉ có một số ít ca bệnh được chẩn đoán lâm sàng bằng huyết thanh học còn hầu hết các trường hợp đều dựa trên lâm sàng. Bangladesh : 1977 lần đầu tiên VNNB được thông báo, là nước có điều kiện sinh thái và dịch tễ học để virut VNNB phát triển. Trung Quốc : hàng năm có khoảng 10000 người mắc, phân bố ở hầu hết các tỉnh, trừ 2 tỉnh phía Tây Trung Quốc. Lần đầu tiên ở Trung Quốc phân lập được virut VNNB là 1941. Dịch VNNB bùng nổ ở Bắc Kinh năm 1982-1983. Vectơ chính là C. tritaeoniorhynchus. Trung Quốc đang sử dụng văcxin trên tế bào nuôi để tiêm phòng đồng loạt cho trẻ em Trung Quốc, do đó tỷ lệ mắc hàng năm có giảm [67, 188]. Ấn Độ : Thường xuyên có dịch VNNB xảy ra ở nhiều vùng khác nhau với các thể lâm sàng khác nhau [46, 91, 159]. Lần đầu tiên phát hiện ra VNNB năm 1955 có 63 ca. Năm 1973 tại tỉnh Bengal xuất hiện 763 trường hợp trong đó có 325 trường hợp tử vong (42,6%), năm 1976 vụ dịch 307 ca trong đó 126 tử vong (34,05%) ; 1978 dịch bùng phát có 1256 trường hợp trong đó 544 ca tử vong (43,3%) kết quả chẩn đoán huyết thanh học dương tính 64-69%. Sau đó Ấn Độ sản xuất được văcxin tiêm phòng và tỷ lệ mắc đã giảm xuống đáng kể. Từ năm 1997 Bộ Y tế Ấn Độ quyết định dừng sản xuất văcxin VNNB và bệnh lại có xu hướng tăng trở lại [146]. Từ tháng 7 đến tháng 10 năm 2005, đã xảy ra một vụ dịch VNNB tại bang Uttar Pradesh (Ấn Độ) có 4679 ca mắc và 1016 ca đã tử vong (21,7%) và miền Tây của Nepal có 1879 ca mắc trong số đó có 298 đã tử vong (15,8%) [129]. Indonesia : Không có thông báo dịch VNNB, hàng năm có 1000-2500 ca. Từ năm 1991 đã có thông báo ở một số bệnh nhân hội chứng não cấp và chẩn đoán huyết thanh học cho thấy 24% dương tính. Đã phân lập được virut từ người, lợn, muỗi. Các vùng khác nhau ở Indonesia cũng có tỷ lệ người lành mang kháng thể VNNB khác nhau như Lombok 14%, Bali 52%, Borneo 25% [33]. Nhật Bản : Là nước đầu tiên phát hiện và nghiên cứu bệnh VNNB. Số mắc trước đây rất cao, mỗi đảo có hàng 1000 ca/năm. Cuối thập kỷ 60 của thế kỷ trước đã bắt đầu sử dụng văcxin và các vụ dịch giảm dần. Ngoài tiêm phòng văcxin cho người, Nhật Bản còn thay đổi phương thức canh tác và chăn nuôi lợn, tăng cường dùng hóa chất để diệt côn trùng. Đến nay các trường hợp VNNB chỉ còn xuất hiện rải rác với số lượng không quá 10 ca/năm. Hàn Quốc : Một vụ dịch lớn đã được thông báo năm 1949, với số mắc 5548 ca và trong số này đã có 2429 ca tử vong (43,78%). Hàn Quốc là nước sản xuất được văcxin và tiêm phòng tích cực từ năm 1971. Tỷ lệ mắc giảm dần và ngày nay chỉ còn vài chục ca mắc mỗi năm [37]. 30
  32. Malaysia : Dịch xảy ra hàng năm, chẩn đoán huyết thanh học có 20-60% dương tính. 80% số mắc là trẻ em dưới 15 tuổi. Phân lập được virut từ C. tritaeniorhynchus và C. gelidus. Miền Tây Malaysia và Sarawak thường có dịch viêm não rải rác quanh năm [124]. Myanmar : Lần đầu tiên đã phát hiện được VNNB vào 7/1974, ở vùng biên giới với Thái Lan (tại 1 huyện có 5 ca mắc trong đó có 4 ca tử vong và 1975: 42 ca mắc trong đó có 32 ca tử vong), giám sát vectơ phát hiện thấy C. tritaeniorhynchus. Huyết thanh lợn dương tính 81,5% và người lành có kháng thể kháng virut VNNB là 42%. Đài Loan : Số mắc cao ở trẻ 2-4 tuổi. Đã phân lập virut để xác định căn nguyên. Là nước sản xuất được văcxin và dự phòng bệnh sớm từ năm 1968 nên hiện tại số mắc rất ít ở những người không tiêm phòng. Thái Lan : Là nước tích cực giám sát VNNB. Nhìn chung ở Thái Lan có 10-20% người lành mang kháng thể. Riêng ở tỉnh Chang Mai gần 100% người lành mang kháng thể. 10 năm trở lại đâymỗi năm có khoảng 1500-2500 ca thể lâm sàng. Một số nơi trước đây không có bệnh viêm não thì nay lại xuất hiện. Dịch thường xảy ra từ tháng 5 đến tháng 9, đỉnh là tháng 7. Bệnh xảy ra ở phía Bắc nhiều hơn. 66% ở trẻ em dưới 15 tuổi. Véctơ truyền bệnh là C. tritaeniorhynchus , C. gelidus, C. fuseocephala. Lợn và trâu bò là ổ chứa. Giữa miền Bắc và Nam Thái Lan có những đặc điểm dịch tễ học giống nhau về quần thể dân cư, trồng lúa nước, mật độ lợn, lượng mưa, nhiệt độ. Nhưng miền Bắc tỷ lệ mắc cao hơn. Thái Lan đã nghiên cứu và giải thích có thể là : + Chủng virut VNNB ở miền Nam tính độc lực đối với người thấp hơn. + Miền Nam Thái Lan sốt xuất huyết Dengue lưu hành rộng rãi, có lẽ vậy mà miễn dịch chéo với Dengue vì cùng nhóm Flavivirus. Về mặt virut học: các chủng virut viêm não phân lập ở miền Nam Thái Lan, Malaysia và Singapore có cấu trúc gen khác với các chủng phân lập được ở miền Bắc Thái Lan. Có thể có mối liên quan về vùng địa lý, loại hình gen của những chủng virut VNNB lưu hành. Một nghiên cứu khác ở 995 trẻ em ở tuổi đến trường ở miền Nam Thái Lan thì chỉ có 21% trẻ có mang kháng thể. Trong khi đó ở miền Bắc Thái Lan gần 80% trẻ em 10-14 tuổi có mang kháng thể. Theo dõi từ 1977-1983 ở Thái Lan cho thấy tỷ lệ mắc ở miền Nam là 2,09/100.000 dân ở miền Bắc là 9,02/100.000 dân. Thái Lan đã xản xuất được văcxin VNNB và đang đưa vào chương trình TCMR quốc gia và tỷ lệ mắc hàng năm đã giảm xuống đáng kể [33, 34, 122]. 10. Các biện pháp phòng chống bệnh viêm não Nhật Bản 10.1 Phòng chống vectơ 31
  33. Ngày nay việc sử dụng nhiều hóa chất để diệt muỗi đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu. Hãng Sumitomo chemical ở Nhật Bản đã nghiên cứu màn olyset để đuổi muỗi và diệt muỗi mà không độc cho người đó là chất permethrin đang được sử dụng rỗng rãi ở các nước có mật độ muỗi cao [158, 164, 174]. - Hàn Quốc phun feritrothion giảm 80% C. tritaeniorhynchus trưởng thành. - Các hóa chất diệt ấu trùng : CNP (P-nitro-phenyl 2,4,6 trichlophenyl-P, Nitrophenyl ether, dichlorophenyl-P, nitrophenyl ether. Nhưng việc sử dụng hóa chất cũng còn hạn chế do: + Phạm vi phun thuốc quanh nhà và chồng gia súc, còn muỗi C. tritaeniorhynchus bay xa và ở cao nên không thể diệt hết. + Phun hóa chất trên ruộng lúa để diệt ấy trùng chỉ có tác dụng 1-2 tuần cho nên rất tốn kém. + Các hóa chất có gốc lân hữu cơ và carbamate đã bị vectơ kháng thuốc. - Thái Lan đã sử dụng nhiều hóa chất phun diệt muỗi đều không có hiệu quả lâu dài và rất tốn kém. - Dùng bẫy đèn hoặc bẫy siêu âm để gần chuồng gia súc cũng góp phần trừ muỗi culex. - Theo Igarashi nhận xét: Phải chấp nhận phương pháp phun hóa chất rộng rãi để diệt côn trùng trên đồng ruộng cũng đã làm giảm mật độ muỗi ở Nhật Bản nhưng là diệt côn trùng nói chung chứ không phải là diệt véc tơ truyền bệnh VNNB. - Ở Việt Nam, là nước 90% nông nghiệp do đó đã có ruộng lúa nước thì có vectơ truyền viêm não, theo như phân tích trên thì việc diệt vectơ bằng hóa chất là hoàn toàn không thực tế và không có hiệu quả với điều kiện kinh tế nước ta hiện nay. 10.2 Văcxin phòng bệnh Sau khi phân lập được virut VNNB năm 1935 nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu văcxin phòng bệnh cho động vật và cho người. Họ nhận thấy rằng, số súc vật còn sống sót sau khi phải trải qua những vụ dịch lớn như dịch viêm não ở ngựa miền Tây nước Nga. Điều đó có nghĩa là có thể chúng có đủ miễn dịch để thử thách với các virut hoang dại. Văcxin virut sống giảm độc lực, văcxin bất hoạt đã sớm ra đời để tiêm phòng cho lợn, ngựa. Các văcxin này độ an toàn và công hiệu đủ dùng cho súc vật. Đặc biệt ở Trung Quốc, đã gây miễn dịch tích cực ở các trại chăn nuôi lợn và đã góp phần giảm tỷ lệ mắc bệnh ở các vùng có lưu hành VNNB [16, 78, 173, 177, 178]. 11. Những nghiên cứu về văcxin dự phòng bệnh VNNB 32
  34. 11.1 Sự ra đời và phát triển của văcxin viêm não Mitamura và cộng sự (1936), Takanouchi và cộng sự (1938) đã nghiên cứu văcxin VNNB từ chuột được gây nhiễm virut VNNB và bất hoạt bằng formalin. Sau đó Takaki và Takanouchi thử công hiệu của văcxin này. Kết quả đã phát hiện kháng thể trung hòa ở chuột sau khi tiêm văcxin. Những nghiên cứu tiếp của Mitamura trên thực địa lâm sàng trên người và nhận xét có đáp ứng miễn dịch ở vùng không lưu hành dịch và đáp ứng miễn dịch kém hơn ở vùng lưu hành dịch [90, 111]. Năm 1944, tác giả Ku thông báo về văcxin bất hoạt thử trên ngựa đáp ứng kháng thể tốt, hiệu giá kháng thể trung hòa cao. Năm 1946-1949, hợp tác nghiên cứu của các nhà khoa học Mỹ và Nhật về công hiệu của văcxin VNNB do Nhật Bản sản xuất. Họ đã chọn vùng có lưu hành dịch là Okayama để thử nghiệm. Kết quả thống kê cho thất tỷ lệ mắc giảm 1/3 đến 1/4. Tại thời điểm này công nghệ sản xuất văcxin VNNB là một loại văcxin thô từ não chuột sau khi gây nhiễm, nghiền đồng nhất thành hỗn dịch sau đó bất hoạt bằng formalin. Văcxin này gây ra nhiều phản ứng phụ đáng kể và gây viêm não dị ứng sau khi tiêm văcxin vì protein của não chuột chưa được loại bỏ. Năm 1954, những tiến bộ trong khoa học sinh học ngày càng phát triển, yêu cầu chất lượng cho các loại văcxin trong đó có văcxin VNNB cao hơn. Các nhà khoa học Nhật Bản nghiên cứu tìm cách loại bỏ bớt protein của não chuột, chính là chất gây ra các phản ứng phụ viêm não dị ứng. Bộ Y tế Nhật Bản đã thiết lập hệ thống kiểm định văcxin. Văcxin VNNB được đưa ra thử nghiệm thực địa tại 4 vùng có lưu hành dịch: Tokyo, Toyama, Shiga, Osaka và 2 vùng không có lưu hành dịch Saporo và Kitami để đánh giá đáp ứng miễn dịch và phản ứng phụ. Văcxin có đáp ứng miễn dịch nhưng tỷ lệ phản ứng phụ cao làm cho các nhà nghiên cứu rất quan tâm đến hàm lượng protein trong văcxin [111, 113]. Năm 1957, công nghệ sản xuất và chất lượng văcxin đã được cải thiện một bước, hàm lượng protein trong văcxin được qui định là 0,2mg/ml. Với các tiêu chuẩn này văcxin VNNB vẫn chưa đạt độ tinh khiết vì vậy nhiều trường hợp phản ứng phụ nghiêm trọng đã xảy ra. Năm 1962 tại Nhật Bản có 2 nhóm nghiên cứu về văcxin VNNB đó là “Biken” ở Osaka và Nisseiken ở Tokyo. Họ đã nghiên cứu tinh chế văcxin bằng siêu ly tâm để loại bỏ protein tạp và đã giảm được hàm lượng protein trong văcxin xuống 10 lần (từ 0,2mg/ml xuống 0,02mg/ml). 33
  35. Năm 1965, Nhật Bản lại tiếp tục nghiên cứu nhằm giảm tối đa hàm lượng protein trong văcxin điều chế từ não chuột. Trước hết loại bỏ lipoprotein bằng protaminsulfate. Bất hoạt bằng formalin và cuối cùng tinh chế bằng siêu ly tâm. Từ đó chất lượng văcxin VNNB được cải thiện về tính an toàn cũng như công hiệu. Dựa vào những nghiên cứu này tác giả Takaku đã hoàn thiện qui trình sản xuất văcxin VNNB bằng phương pháp hóa, lý. Đạt độ tinh khiết rất cao 10-25µg/ml. Và các phản ứng phụ không đáng kể, chúng chỉ xảy ra ở một số cơ thể quá mẫn. Văcxin này có hiệu quả bảo vệ cao và rất an toàn khi tiêm cho trẻ em. Từ năm 1959 đến 1981, một trường phái khác ở Trung Quốc đã nghiên cứu sản xuất văcxin sống giảm độc lực từ chủng virut độc lực. Bằng cách cấy truyền 110 lần trên tế bào phôi gà sau đó tiếp tục cấy truyền trên tế bào thận chuột đất 100 lần nhưng vẫn còn yếu tố gây độc tế bào thần kinh. Chủng virut này tiếp tục được lựa chọn bằng phương pháp tạo đám hoại tử và có được chủng 12.1.7 [192]. Năm 1973, Yu và cộng sự sử dụng chủng 2.8 cũng bắt nguồn từ chủng 12.1.7 và tiếp tục giảm độc lực bằng tia cực tím. Năm 1974, Chen và Wang chọn lọc chủng virut thuần khiết về di truyền bằng kỹ thuật tạo đám hoại tử để có được một chủng cho sản xuất văcxin. Sau đó đã sản xuất thử nghiệm và đánh giá thực địa trên 8000 trẻ em sống ở vùng không có lưu hành dịch. Kết quả cho thấy 50% có đáp ứng kháng thể. Năm 1981, Yu và cộng sự lại tiếp tục chuyển chủng này bằng đường tiêm dưới da cho chuột sơ sinh và đã đạt được 1 chủng giảm độc lực cao đó là chủng 12.4. Sau đó tác giả tiếp tục lựa chọn, thuần khiết để cuối cùng có được 1 chủng nhân lên mạnh hơn và tính miễn dịch mạnh hơn trên tế bào so với chủng ban đầu [183, 192]. Song song với việc nghiên cứu văcxin sống giảm độc lực, Li và cộng sự đã nghiên cứu văcxin bất hoạt từ tế bào nuôi, loại văcxin này an toàn nhưng khả năng bảo vệ thấp. Từ 1968, qui trình công nghệ sản xuất văcxin từ não chuột của Takaku là công nghệ được coi là công nghệ tiên tiến nhất. Thử nghiệm thực địa được tiến hành ở nhiều nơi. Riêng Thái Lan đánh giá rộng rãi trên trẻ em và có đáp ứng kháng thể 91%. Văcxin này được tiêm phòng trong các quần thể dân cư ở một số nơi như Nhật Bản, Đài Loan, Trung Quốc và Thái Lan và đạt hiệu quả cao đặc biệt không có các phản ứng phụ đáng kể cũng như không có trường hợp nào viêm não dị ứng sau khi tiêm văcxin. Năm 1971, Viện BIKEN được chỉ đạo của Giáo sư Fukai (nguyên Chủ tịch Hiệp Hội nghiên cứu Văcxin và Sinh phẩm của Nhật Bản) đã nghiên cứu tinh chế văcxin để đạt độ tinh khiết với hàm lượng protein ≤80µg/ml. Đây cũng là hàm lượng tiêu chuẩn của 34
  36. protein cho phép trong văcxin VNNB sản xuất từ não chuột theo phương pháp hóa lý của Takaku. Cho đến nay phương pháp tinh chế này vẫn là tiên tiến nhất được TCYTTG công nhận. Còn văcxin thế hệ 2 bằng phương pháp công nghệ gen cho đến nay có rất nhiều tác giả nghiên cứu nhưng cũng chỉ dừng lại ở mức nghiên cứu thử nghiệm [63]. 11.2 Những nước đã ứng dụng qui trình công nghệ sản xuất văcxin từ não chuột (chủng sản xuất là Nakayama và Beijing- 1) - Nhật Bản: có 7 hãng sản xuất với tổng số 11 triệu liều/năm (Biken, Chiba, Denka, Katetsu-ken, Kitasato, Saika-ken và Takeda). Riêng Biken hàng năm sản xuất 2 triệu liều xuất khẩu. Đây là hãng sản xuất văcxin nổi tiếng trên thế giới về chất lượng, khả năng bảo vệ cao và rất an toàn. - Ấn Độ: Viện nghiên cứu Trung ương (Central research Institute), nhưng đã dừng sản xuất từ năm 1998. - Hàn Quốc: Hãng Korea Green Cross Corporation (KGCC) - Đài Loan: Viện nghiên cứu Quốc gia về Y học dự phòng (National Institute of Preventive Medicine). - Thái Lan: Tổ chức Dược chính phủ (GPO). - Việt Nam: VABIOTECH No1- Viện VSDTTƯ (NIHE). Việt Nam tiếp nhận công nghệ sản xuất văcxin VNNB từ năm 1989 của Viện Biken, thuộc Trường Đại học Osaka-Nhật Bản. 11.3 Những nghiên cứu sản xuất văcxin trên tế bào nuôi Trung Quốc là nước đầu tiên nghiên cứu sản xuất văcxin trên tế bào, hiện nay Nhật Bản cũng đã nghiên cứu thành công công nghệ này. Sau nhiều năm nghiên cứu, các tác giả Yu và Lee của Trung Quốc đã tạo được một chủng VNNB giảm độc lực SA 14-14-2, chủng này nhân lên tốt trên tế bào thận chuột đất vàng tiên phát (PHK). SA 14-14-2 được dùng để sản xuất văcxin VNNB sống giảm độc lực. Trung Quốc đã gây miễn dịch cho lợn ở các trại chăn nuôi để hạn chế ổ dịch virut viêm não gần người. Ngày nay văcxin sống giảm độc lực trên tế bào PHK (thận chuột đất tiên phát) đã dùng cho người và thấy có khả năng bảo vệ đến gần 70% [98, 100] Tuy nhiên về mặt an toàn thì còn phải được chứng minh đầy đủ. Từ năm 1994, Viện sản xuất các chế phẩm sinh học Chengdu, Vũ Hán, Lanzhou bắt đầu ứng dụng công nghệ này để sản xuất và đưa ra sử dụng ở một số nơi tại Trung Quốc. 35
  37. Văcxin bất hoạt được nuôi cấy trên tế bào thận chuột đất vàng tiên phát đã sử dụng chủng Beijing-3 (P3) và sản xuất tại Viện sản xuất các sản phẩm sinh học Bắc Kinh, Thượng Hải, Vũ Hán và Thành Đô. Loại văcxin bất hoạt này rất an toàn nhưng hiệu quả bảo vệ chỉ < 70%. Tại Việt Nam, từ thập kỷ 70 tác giả Đỗ Quang Hà cũng đã nghiên cứu sản xuất thử văcxin VNNB từ tế bào thận lợn tiên phát, nhưng đã thử nghiệm thực địa không có đáp ứng miễn dịch. 11.4 So sánh hiệu quả của hai loại văcxin viêm não Tìm hiểu về hiệu quả của 2 loại văcxin VNNB bất hoạt sản xuất từ não chuột và trên tế bào nuôi. Bảng dưới đây cho chúng ta 1 số thông tin về hai loại văcxin này: Bảng 2: So sánh hiệu quả của 2 loại văcxin VNNB bất hoạt Tiêu chuẩn so sánh Văcxin bất hoạt từ não Văcxin bất hoạt trên tế bào chuột nuôi 1. Số lượng sản xuất Hạn chế Không hạn chế 2. Phản ứng phụ An toàn An toàn 3. Khả năng bảo vệ 85-99% < 70% 4. Giá thành Cao Thấp hơn 5. Nơi sử dụng Nhiều nước trên Thế giới Trung Quốc 6. Chấp nhận của Đã được chứng nhận của Chưa được TCYTTG TCYTTG TCYTTG chấp nhận. So sánh văcxin sản xuất từ não chuột và trên tế bào ta thấy: việc nuôi và cung cấp chuột phải được tổ chức và quản lý tốt. Chuột phải đạt tiêu chuẩn chất lượng để sản xuất văcxin. Một não chuột 3-4 tuần tuổi chỉ được 1-3 liều văcxin. Vì vậy muốn sản xuất được nhiều văcxin thì phải có một hệ thống nghiên cứu và chăn nuôi chuột. Cả chuỗi công đoạn sản xuất văcxin thô cần phải đầu tư nhà xưởng, thiết bị và nhân lực do đó sản lượng bị hạn chế. Còn văcxin trên tế bào nuôi, tổ chức hậu cần không phức tạp, nguồn nguyên liệu đầu là tế bào thận chuột đất được nhân lên trên chai Roux hoặc chai plastique nhiều tầng và gây nhiễm virut VNNB chủng Beijing 1. Như vậy, cứ 1 chai tế bào có thể thu ít nhất là 100ml văcxin trong đó 1 não chuột chỉ được 2,5ml văcxin. Trung Quốc là một nước rất đông dân, muốn đảm bảo đủ văcxin để sự phòng VNNB thì chỉ có phương pháp sản xuất trên tế bào đạt sản lượng cao và giá thành rẻ, tuy rằng khả năng bảo vệ thấp nhưng đáp ứng được nhu cầu trước mắt cho nhân dân Trung Quốc. Những năm cuối thập kỷ 90 của thế kỷ trước, nhiều nhà sản xuất trên thế giới đã nghiên cứu về văcxin trên tế bào Vero như Aventis, Biken Nhật Bản, Viện văcxin và 36
  38. huyết thanh Bắc Kinh. Đã nghiên cứu văcxin viêm não Nhật Bản bất hoạt, tinh khiết và bước đầu đánh giá về tỷ lệ bảo vệ trên thực địa cao >80%. Có lẽ đây là 1 hướng để cải tiến qui trình công nghệ trong tương lai. Đồng thời hướng nghiên cứu văcxin VNNB tái tổ hợp cũng được nhiều nhà khoa học rất quan tâm, song việc nghiên cứu tái tổ hợp với Pox virus, varicella virus, Bacculovirus thì còn chưa đạt được. Các nghiên cứu trên dừng lại ở phòng thí nghiệm vì hiệu quả rất thấp [88, 86, 89, 97, 105, 154, 156, 157, 169, 195]. Hiện tại có 3 loại văcxin đang sản xuất và sử dụng rộng rãi: - Văcxin bất hoạt sản xuất từ não chuột. - Văcxin bất hoạt trên nuôi cấy tế bào. - Văcxin sống giảm độc lực trên nuôi cấy tế bào. 11.4.1 Văcxin bất hoạt sản xuất từ não chuột Loại văcxin này được sản xuất ở một số nước ở Châu Á và cho đến nay cũng chỉ có loại văcxin này có mặt trên thị trường quốc tế. Nhìn lại vào những năm 1940 khi mới bắt đầu nghiên cứu sản xuất văcxin này ở dạng thô, chứa toàn bộ protein não chuột và hàm lượng Myelin rất cao do đó tỷ lệ gây viêm não dị ứng cũng cao. Ngày nay công nghệ tinh chế cải thiện rất nhiều đã làm giảm tối đa protein Myelin ( 3 tuổi. Dựa vào các nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy trẻ <1 tuổi vẫn còn kháng thể của mẹ truyền. Theo khuyến cáo của TCYTTG về văcxin VNNB: Liều sơ chủng 2 mũi cách nhau 1-2 tuần. 1 số thí nghiệm thực địa ở một vài nước Châu Á sau sơ chủng có 95% trẻ em được bảo vệ. Nhóm đối chứng cũng đạt được 91%. Tỷ lệ chuyển dịch huyết thanh không bị giảm khi được tiêm bổ sung để kích thích miễn dịch. Tuy nhiên chương trình sơ chủng có khác nhau giữa các nước ở Châu Á. Hơn nữa, khoảng cách tối đa và số liều bổ sung cũng có nơi còn chưa thực hiện đầy đủ vì vậy hiệu quả cũng khác nhau ở từng địa phương. Nhiều nước ở Châu Á đã chấp nhận chương trình sơ chủng gồm 2 liều và trong vòng 4 tuần. Sau đó 1 năm tiêm bổ sung mũi 3 và tiếp tục 3 năm tiêm nhắc lại 1 lần. Tuy 37
  39. nhiên, sau nhiều lần tiêm nhắc lại cũng chưa được xác định đầy đủ là bao nhiêu lần. Nếu tiêm đầy đủ thì mũi 3 lúc trẻ 2 tuổi, mũi 4 là 5 nuổi và tiếp tục là 8 tuổi, 11 tuổi vấn đề này cần nghiên cứu để xác định cần tiêm bổ sung bao nhiêu liều? 80% đối tượng tiêm văcxin theo phác đồ sơ chủng 2 liều tuy nhiên 1 số tác giả nghiên cứu cho thấy hiệu quả kháng thể trung hòa giảm xuống trong vòng 6-12 tháng đến mức dưới khả năng bảo vệ (<1/10 lần) với binh lính của Mỹ thì phác đồ tiêm 3 liều sơ chủng ngày 0, ngày 7 và ngày 30 cho thấy 100% có chuyển dịch huyết thanh với hiệu giá kháng thể trung hòa cao và tồn lưu ở mức cao trong 3 năm. Các tác dụng phụ ở các đối tượng tích lũy chưa được xác định, mặc dù dị ứng với gelatin có chứa trong văcxin dùng làm chất bền vững cũng có nghi ngờ trong 1 số trường hợp. Các phản ứng như trên có thể xảy ra muộn từ 12-72 giờ sau khi tiêm văcxin. Loại trừ những người quá mẫn với văcxin này, thì không có trường hợp nào chống chỉ định để tiêm văcxin VNNB (cho binh lính Mỹ). 11.4.2 Văcxin VNNB bất hoạt điều chế từ tế bào Loại văcxin này sản xuất tại Trung Quốc, chủng virut VNNB P3, có đáp ứng kháng thể với nhiều chủng virut viêm não khác trên chuột và nhân lên rất tốt trên tế bào thận chuột đất vàng tiên phát. Văcxin bất hoạt bằng formalin và gây miễn dịch cho trẻ em đạt 80% đáp ứng kháng thể. Giá văcxin rẻ và mỗi năm cung cấp 90 triệu liều đáp ứng đủ nhu cầu cho Trung Quốc. Nhưng rồi Trung Quốc lại nghiên cứu thay thế 1 loại văcxin sống giảm độc lực trên nuôi cấy tế bào để có hiệu quả hơn. 11.4.3 Văcxin sống giảm độc lực Trung Quốc nghiên cứu sử dụng chủng SA14-14-2 là chủng giảm độc lực và không gây ảnh hưởng thần kinh. Thử nghiệm tại 1 vùng không lưu hành dịch cho thấy có đáp ứng kháng thể 83-100% ở trẻ em 6-7 tuổi. Trẻ lớn hơn tiêm 2 liều cách nhau 1-3 tháng đạt 94-100% có đáp ứng miễn dịch. Các phản ứng phụ thông báo rất ít gặp phải. Giá văcxin này tại Trung Quốc rất rẻ. Hiện nay hàng năm sản xuất 40 triệu liều cho trẻ em Trung Quốc sử dụng. Chưa theo dõi đầy đủ về mức độ an toàn cũng như tính đột biến gen của virut viêm não trong loại văcxin này, đây chính là điều cần quan tâm [60, 184]. 11.4.4 Nghiên cứu tính miễn dịch của văcxin VNNB sản xuất từ chủng Nakayama và Beijing-1 Trong thập kỷ 80 của thế kỷ trước, toàn bộ văcxin VNNB đều được sản xuất từ chủng Nakayama NIH. Những nghiên cứu về các chủng phân lập được ở các vùng khác nhau của Nhật Bản chia ra thành 3 nhóm kháng nguyên: Nakayama NIH, JaGAr-01 và nhóm mang tính kháng nguyên giữa 2 nhóm này. Bằng kỹ thuật ức chế ngưng kết hồng 38
  40. cầu hấp phụ (absorption haemagglutination inhibition test), trung hòa hấp phụ (absorption neutralization test) hoặc sử dụng kỹ thuật ngăn ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination Inhibition-HI). Vì vậy, trong vùng có lưu hành dịch với các chủng khác nhau. Hiệu quả bảo vệ của văcxin chủng Nakayama đã được đưa ra tranh luận giữa các nhà nghiên cứu chọn chủng sản xuất đạt hiệu quả cao. Năm 1984 thử nghiệm văcxin viêm não do trường đại học Osaka nghiên cứu sử dụng chủng Beijing-1, tính kháng nguyên giống JaGAr-01. Sau đó so sánh tính miễn dịch giữa Nakayama và Beijing-1. Kết quả cho thấy Beijing-1 có miễn dịch trội hơn và diện miễn dịch chéo với các chủng rộng hơn. Cũng trong nghiên cứu này cho thấy đáp ứng kháng thể trung hòa (NT) với kháng nguyên cùng loại cao hơn kháng nguyên khác loại ví dụ: Beijing-1 + Beijing-1 → hiệu giá kháng thể trung hòa 2,31 và 2,32 nhưng với Nakayama 1,51 và 1,85 với JaGAr-01 là 1,86. Nakayama + Nakayama → hiệu giá kháng thể trung hòa 2,61 và 2,31 nhưng với Beijing-1 1,8 và 1,55 [83, 84]. Theo Kitano và cộng sự: có thể Beijing-1 tạo ra đầy đủ các kháng thể trung hòa kháng lại tất cả các epitop của cả Beijing-1 và Nakayama. Những kết quả này đã được xác định và tập hợp số liệu của 7 nhà sản xuất tại Nhật Bản. Tác giả Kitano và cộng sự chỉ chọn các đối tượng huyết thanh 1 (-) từ 3-13 tuổi: tiêm 2 liều cách nhau 1-2 tuần và liều thứ 3 sau 1 tháng. Đánh giá hiệu giá kháng thể trung hòa trung bình thử nghiệm trên 4 chủng virut VNNB Nakayama, JaGAr-01, Mie 44-1 và Beijing-1. Kết quả hiệu giá kháng thể trung hòa thấp nhất là chủng Mie 44-1 (chỉ đạt 1,4-1,6). Chủng JaGAr-01 chỉ số trung hòa 3,5. Beijing-1 + Nakayama tăng 2,5. Chủng Beijing-1 có động lực kháng thể tăng rất rõ rệt. Thử nghiệm thực địa văcxin bất hoạt từ chủng Beijing-1 do Viện NIH, Nhật Bản thực hiện: 121 người tình nguyện sau khi tiêm miễn dịch cơ bản cho đáp ứng miễn dịch với chủng Beijing-1 là 97,6% và Nakayama là 83,1% và 89,5% trong 2 nhóm thử. Sau khi tiêm văcxin 1 tháng tỷ lệ chuyển dịch huyết thanh Beijing-1 là 100% và Nakayama 88,9% và 97,2%. Với chủng Beijing-1 chỉ số trung hòa trung bình 2,86 sau miễn dịch cơ bản và sau mũi bổ sung là 3,55 [83, 84]. 39
  41. Mặt khác hiệu giá kháng thể trung hòa của chủng Nakayama tăng lên không rõ rệt kể cả sau mũi tiêm bổ sung. Điều đó có thể thấy rằng hiệu giá kháng thể trung hòa tăng thấp có thể phụ thuộc vào khoảng cách giữa mũi tiêm sơ chủng và mũi bổ sung [83, 84]. 11.4.5 Những nghiên cứu về các chủng virut để sản xuất văcxin Hàng năm những nghiên cứu về sự thay đổi kháng nguyên trong các chủng virut VNNB lưu hành ở các nơi về các đặc tính sinh học như sự phát triển trên nuôi cấy tế bào, các thương tổn thần kinh qua thí nghiệm trên chuột, đặc tính di truyền cũng phân tích trình tự giới hạn và xếp loại phân typ đầu tiên của virut VNNB nhưng những nghiên cứu phòng thí nghiệm chưa chứng minh đầy đủ về phản ứng chéo với các chủng virut viêm não ở các thể lâm sàng khác nhau và tính gây độc thần kinh với người. - Chủng Nakayama là chủng phân lập từ dịch não tủy của 1 ca bệnh năm 1935 và được cấy truyền nhiều lần trên não chuột và được sử dụng là chủng sản xuất văcxin [24, 183]. - Ở Châu Á chủng Nakayama được chọn để sản xuất văcxin vì khả năng nhân lên rất nhạy trên não chuột và có phản ứng chéo với các chủng khác trên chuột. Việc giám sát dịch tễ học bệnh viêm não ngày càng phát triển ở Châu Á vì vậy tiếp tục nghiên cứu về miễn dịch chéo giữa các chủng VNNB là rất cần thiết. Thí nghiệm trên chuột cho thấy JaGAr-01/Beijing-1 (P1) tương đương với chủng P3 và đáp ứng kháng thể trung hòa kháng các typ virut viêm não khác nhau lại cao hơn Nakayama. Kết quả cho thấy chủng Beijing-1 có hiệu giá cao hơn và phản ứng chéo rộng với các chủng VNNB lưu hành ở các vùng khác nhau so với chủng Nakayama [130, 131]. Từ 1954 chủng Nakayama đã được chọn là chủng để sản xuất văcxin VNNB. 1960 Kobayashi và Ogata thông báo phân lập được virut viêm não từ muỗi và các cấu trúc khả năng giống Nakayama NIH. 1968 Okano và cộng sự đã sử dụng 26 chủng virut VNNB phân lập được ở các vùng khác nhau và định loại bằng kỹ thuật ức chế ngưng kết hồng cầu (HI) và nhận thấy rằng có ít nhất 3 typ miễn dịch (inmunotypes) trong nhóm virut VNNB: Nakayama NIH, JaGAr-01 và 1 typ giữa 2 typ này. 1969 hợp tác nghiên cứu trên diện rộng giữa NIH Nhật Bản và các phòng thí nghiệm cơ sở để kiểm tra lại tất cả các chủng virut viêm não phân lập được ở các vùng khác nhau của Nhật Bản. Họ nhận xét hầu hết các chủng đều có khác nhau chút ít về tính kháng nguyên hoặc kháng nguyên giống cả 2 chủng Nakayama NIH và JaGAr-01. Nhưng cũng nhận thấy tính kháng nguyên giống Nakayama trội hơn. 40
  42. Đồng thời 1969 khi dịch viêm não xảy ra ở các nước Nam Á thì TCYTTG bắt đầu hợp tác nghiên cứu để phát triển văcxin viêm não dùng cho các nước Nam Á. Lúc bấy giờ nghiên cứu tập trung tìm chủng virut viêm não thay cho chủng Nakayama- NIH. 1983 nhóm các nhà khoa học ở Viện BIKEN đã thử nghiệm 10 chủng virut VNNB phân lập được ở các vùng khác nhau trên thế giới. Cuối cùng họ nhận thấy rằng chủng dự tuyển chính là Beijing-1. Chủng này đều cho kết quả công hiệu cao khi dùng các chủng virut viêm não khác nhau để thử thách [83, 84, 130, 131]. Cuối cùng kết quả đã được Bộ Y tế Nhật Bản và Bộ Ngoại giao chấp nhận: chủng Beijing-1 tạo kháng thể trung hòa cao và phản ứng chéo rộng với tất cả các chủng VNNB ở các vùng khác nhau nên chọn chủng Beijing-1 thay chủng Nakayama NIH để sản xuất văcxin VNNB từ năm 1989. 12. Vai trò của TCYTTG về các văcxin Văcxin đưa ra sử dụng rộng rãi trong cộng đồng cần phải: 1. Đạt yêu cầu chất lượng của chính phủ nước sở tại và chủ trương của GPV (Global Program Vaccine) về chất lượng văcxin. 2. Phải đảm bảo an toàn và đạt được mục tiêu bảo vệ sức khỏe, phòng bệnh hiệu quả trong cộng đồng. 3. Phải dễ dàng thích nghi với kế hoạch, thời gian của chương trình TCMR dành cho trẻ em. 4. Đảm bảo khả năng không gây ra các ức chế miễn dịch đối với các loại văcxin khác. 5. Phải được pha chế theo đúng qui định về kỹ thuật và tiêu chuẩn, đảm bảo cả kho lạnh để bảo quản văcxin. Giá cả phù hợp cho trẻ em ở các nước nghèo. * Vai trò của TCYTTG đối với văcxin VNNB Trên thị trường quốc tế chỉ được lưu hành văcxin VNNB dạng đông khô sản xuất từ não chuột bằng 1 trong 2 chủng virut Nakayama hoặc Beijing-1. Văcxin này đang sản xuất theo yêu cầu chất lượng quốc tế và được công nhận là hiệu quả và an toàn trong chương trình tiêm chủng cho trẻ em như Thái Lan, Việt Nam đã thành công trong dự phòng bệnh VNNB của chương trình TCMR và cần tiếp tục phủ hết cho trẻ em sống trong vùng có dịch lưu hành. 41
  43. Các phản ứng phụ ảnh hưởng thần kinh rất hiếm xảy ra theo các báo cáo ở những vùng có dịch và không có dịch VNNB lưu hành. Cũng có khoảng 0,6% người lớn ở phương tây tiêm chủng trước khi đi đến các nước có dịch bị dị ứng do các thành phần trong văcxin[15, 70, 124, 126, 135, 136, 137]. Vì vậy cần nâng cao nhận thức về các phản ứng thần kinh hoặc dị ứng, đặc biệt là các vùng có mô hình dịch tễ học viêm não thay đổi ở trẻ em và cả người lớn. Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 4 cho thấy trong quần thể những đối tượng đã tiêm văcxin đều cho đáp ứng miễn dịch ở trẻ em và người lớn. Bảng 3: Phản ứng quá mẫn sau khi gây miễn dịch với văcxin VNNB bất hoạt (BIKEN) [70] Nước Loạt văcxin Số ca có Số người tiêm Tỷ lệ/10000 phản ứng văcxin Đan Mạch 16 13 17500 7 32 2 7500 3 33 2 10000 2 12 4 6500 6 Thụy Điển 30 1 15000 0,7 Anh (UK) 13 1 1950 5 Australia - Cả nước Úc 17, 42 4 3400 12 - Bệnh viện Fairfield 17, 42 3 601 50 Canada - Cả nước 32, 54 Không rõ Không rõ Không rõ - Trường ĐH Calgary 32 1 96 104 Mỹ - Khách du lịch (CDC) Không rõ 2 1328 15 - Lính Mỹ 29, 30, 31 1 526 19 - Lính Mỹ ở Okinawa 49, 55 220 35253 62 Mặc dù genotyp và phenotyp của virut viêm não có khác nhau chút ít và cũng cho thấy chủng Nakayama vẫn có bảo vệ với các chủng địa phương cho dù so với chủng Beijing-1 thì diện bảo vệ không rộng bằng. Một thông tin cần được lưu ý là thời gian bảo vệ khi tiêm phòng văcxin VNNB. Thực hành tiêm chủng thường xuyên là biện pháp tốt nhất. Thực ra chu kỳ dịch có khi khó được dự đoán trong 3 hoặc 4 năm. Còn các nước có lưu hành dịch thì phải phòng bệnh quanh năm và tiêm văcxin trước mùa dịch hoặc sau mùa dịch. 42
  44. Nguy cơ của những người công tác do vậy phải thực hiện lịch tiêm chủng khi đến vùng lưu hành dịch. Nói chung khả năng mắc bệnh thấp và còn phụ thuộc nhiều yếu tố: - Mùa dịch của từng nước, từng khu vực. - Thời gian lưu trú của khách và địa điểm đến như: nông thôn, nơi canh tác ruộng nước. - Phương pháp dự phòng cá nhân, không để muỗi đốt (quần áo bảo vệ, nằm màn, kem chống muỗi đốt, điều hòa không khí, thông gió ở phòng nghỉ ). Người dân ở các nước phát triển thường không được miễn dịch với VNNB do đó tất cả khách đến vùng có dịch không phân biệt tuổi tác, nam nữ đều có thể bị nhiễm dễ dàng nếu không phòng trước bằng văcxin. Có 1 trường hợp đến nghỉ tại vùng nông thôn chỉ trong 2 tuần và sau đó mắc bệnh. Năm 1981 có 11 người Mỹ bị VNNB trong đó có 8 người là lính Mỹ [70, 138]. Sau đó 13 người phương tây cũng mắc VNNB đều là khách du lịch [70]. Nhận xét về số người đi đến vùng có dịch viêm não (Châu Á) 2-3 triệu người Mỹ/năm (Theo dõi trong 5 năm). Tỷ lệ mắc 1/106. Từ 1984-1987 dự phòng bằng văcxin nên tỷ lệ này đã giảm đi [70, 138]. 12 trong 54 loạt văcxin sản xuất từ tháng 4/1988 đến tháng 1/1991 đã có biểu hiện các phản ứng quá mẫn. Tuy nhiên 26 trong số 33 loạt còn lại cung cấp cho các nước Châu Á không thấy có các phản ứng tương tự. Có lẽ cơ địa của người da vàng và người da trắng khác nhau chăng? Văcxin viêm não bất hoạt, tinh khiết có nguồn gốc từ não chuột đã chứng minh không có chất myelin ở mức độ 2ng/ml (bằng phương pháp myelin basic protein (MBP). Văcxin Biken đã được Mỹ cấp phép lưu dùng trên thị trường Mỹ hơn 30 năm qua và cũng là văcxin được sử dụng rộng rãi nhất trên thế giới. 13. Nghiên cứu phát triển văcxin mới * Một số công nghệ văcxin tái tổ hợp Hiện nay một vài công nghệ văcxin tái tổ hợp đang được nghiên cứu. Potein E và preM của virut VNNB được tách chiết từ các plasmit tái tổ hợp đã tạo ra kháng thể ƯCNKHC và kháng thể trung hòa, thử nghiệm trên chuột được bảo vệ đầy đủ với 2 liều văcxin. Cấu trúc của protein E và preM sinh miễn dịch tối ưu, phần tái tổ hợp bên ngoài tế bào có chứa protein E và preM và ngưng kết tố. Đồng tổng hợp preM và E có thể rất quan trọng để tạo ra các thành phần với quyết định kháng nguyên E và preM để bảo vệ, vấn đề này thật phù hợp và đúng đắn [88, 86, 89, 97, 105, 154, 156, 157, 169, 191, 195]. 43
  45. - Theo các nghiên cứu của Seif và Konishi, tái tổ hợp protein E của Bacculovirus tách chiết từ Spondoptera frugiperda cũng tạo ra kháng thể trung hòa và cũng được bảo vệ một phần trên chuột. Kháng nguyên E tái tổ hợp cũng được tách chiết từ Escherichia coli và từ Saccharomyces cerevisiae [103, 105, 156, 157]. - Nghiên cứu của Konishi và Sato, tách chiết protein NS2A, NS1, E và preM của virut VNNB từ Canarypox, thử nghiệm tiêm chủng cho lợn và đã thấy xuất hiện kháng thể bảo vệ [87, 154]. - Một hỗn hợp polypetit protein E của Flavivirus với Lipopolysaccharide-free màng ngoài của menigococcus cũng cho thấy đáp ứng miễn dịch rất cao trên chuột và cũng đề nghị một văcxin phối hợp với các kháng nguyên khác. - Nhiều nghiên cứu phát triển các văcxin mới nhằm cải thiện việc tìm ra văcxin đơn giản, hiệu quả hơn. Hiện nay, một số nghiên cứu văcxin bằng đường uống, văcxin bọc viên nhộng, văcxin bằng đường ăn đang được nghiên cứu [144]. Bảng 4: Đánh giá về gen miễn dịch của virut VNNB bất hoạt và tái tổ hợp đã thử nghiệm trên mô hình động vật Vectơ/JE Các gen được tách chiết Đáp ứng kháng thể Kháng thể Kháng thể Chuột Khỉ Lợn trung hòa ƯCNKHC Pox/JE preM-E Có Có Có Có Có JE preM-E-NS1-NS2 Có Có Có Có Có JE E-NS1-NS2A-NS2B Không Không Không Bacculovirus/JE 80% E Có ± JE preM-E-NS1-NS2A-NS2B Có ± JE NS1 Không ± * Văcxin VNNB tái tổ hợp tạo kháng thể bảo vệ trên mô hình chuột Vec tơ plasmit có chứa các thành phần của virut VNNB là gen tiền màng (preM) và gen vỏ (E) được cấu trúc biểu thị protein preM và E dưới sự kiểm soát của gen khởi động sớm tức thời của cytomegalovirus (CMV). Vec tơ plasmit này được biến nạp và tế bào COS-1 (JE-4B Clone) bài tiết vào môi trường cấy các thành phần đặc hiệu ngoài tế bào của virut VNNB. Nhóm chuột ICR tiêm bắp 1 đến 2 liều văcxin tái tổ hợp plasmit DNA hoặc 2 liều văcxin viêm não đang có bán ở thị trường. Tất cả chuột tiêm 1 hoặc 2 liều văcxin tái tổ hợp đã duy trì miễn dịch 18 tháng sau mũi tiêm đầu tiên. JEVAX có đáp ứng kháng thể 100% ở chuột 3 tuần tuổi còn chuột 3 ngày tuổi thì hiệu giá kháng thể là 1/400 (ELISA). Chuột cái gây miễn dịch với văcxin DNA tạo được kháng thể trung hòa bằng kỹ thuật PRNT đạt hiệu giá từ 1/20- 44
  46. 1/160. 100% có đáp ứng kháng thể sau khi thử thách bằng đường tiêm phúc mạc với liều 5000 PFU chủng virut độc lực SA-14 [142]. * Chimeric-JE văcxin Chimeric-JE là một virut tái tổ hợp sống giảm độc lực điều chế bằng gen mã hóa 2 protein cấu trúc (preM và E) của virut sốt vàng 17D với gen chịu trách nhiệm của virut sống giảm độc lực VNNB SA14-14-2, protein E và preM chứa các kháng nguyên tạo được miễn dịch dịch thể và miễn dịch trung gian tế bào, đáp ứng miễn dịch trực tiếp với VNNB [17, 32]. Trình tự đoạn gen preM-E của Chimerivax-JE trong tế bào lưỡng bội phôi bào thai khỉ (FRhL) là 1 chất được cơ thể người chấp nhận. Nghiên cứu này đã xác định rằng văcxin VNNB SA14-14-2 khác với cách sắp xếp của các chủng hoang dại độc lực (SA14 và Nakayama). So sánh 6 axít amin có trong gen E (E107, E138, E176, E279, E315 và E439), Chimerivax-JE được giảm độc lực hoàn toàn khi tiêm vào não chuột đã cai sữa. Ngược lại văcxin sốt vàng 17D (YFvax) gây viêm não với liều PFU bằng log101,76. Các nhóm của 4 khỉ Rherus tiêm dưới da 2,0; 3,0; 4,0 và 5log10 PFU của Chimerivax-JE thì cả 16 khỉ đều nhiễm virut huyết nhẹ (giá trị trung bình 1,7-2,0 log10PFU/ml thời gian kéo dài trung bình là 1,8 – 2,3 ngày). Kháng thể trung hòa tương tự nhóm kia. Đáp ứng kháng thể cùng loại chủng cao hơn các typ virut hoang dại. Tất cả số khỉ gây miễn dịch và nhóm đối chứng được thử thách vào ngày 54 bằng đường tiêm vào não, chúng biểu hiện nhiễm virut huyết, ốm và có tổn thương não nhẹ. Ngược lại, nhóm chứng lại phát triển nhiễm virut huyết và viêm não lâm sàng biểu hiện các thương tổn vi thể. Nhóm khỉ tiêm văcxin hiệu giá kháng thể trong huyết thanh và trong dịch não tủy tăng ≥ 4 lần so với trước khi tiêm văcxin. Sau khi thử thách bằng đường tiêm não. Một thí nghiệm chuẩn thức về độc lực thần kinh, Chimerivax-JE và YFvax được so sánh trong 10 con khỉ tiêm vào não và phân tích về bệnh sinh vi thể vào ngày 30 thương tổn vùng sừng trước của não và tủy sống ở những khỉ tiêm YFvax. Chimerivax-JE bước đầu đã đạt được về các tín hiệu an toàn, đạt yêu cầu của một văcxin cho người, chứng tỏ là an toàn hơn văcxin sốt vàng (yellow fever 17D) nhưng tính sinh miễn dịch và hiệu quả bảo vệ thì tương tự [114]. Thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 2 về tính an toàn, miễn dịch, liều tiêm, lịch tiêm và đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên VNNB bất hoạt. Thử nghiệm ngẫu nhiên 2 lần mù với 99 người tình nguyện tiêm văcxin, nhóm chứng hoặc YFvax. Chimerivax-JE đã đạt được kết quả khả quan. Các phản ứng phụ không có sự khác nhau giữa các nhóm thử nghiệm. Hiện tượng nhiễm virut huyết xảy ra ngắn và hiệu giá thấp 82/87 (44%) với liều tiêm 1,8- 5,8log10. Chimerivax-JE phát triển kháng thể trung hòa. Liều thứ 2 sau 30 ngày, không có biểu hiện gì khác. Trước khi tiêm YFvax không có sự giao thoa với Chimerivax-JE (nhưng chưa được thống kê rõ ràng rằng Chimerivax-JE giao thoa với YFvax sau 30 45
  47. ngày tiêm). Một nghiên cứu riêng biệt về bộ nhớ miễn dịch cả hai nhóm đối tượng đã tiêm văcxin Chimerivax-JE, 9 tháng trước và đã có miễn dịch. Do đó, khi thử thách quan sát thấy có kháng thể trung hòa sau một liều đơn rất an toàn [116]. * Tính an toàn, miễn dịch và hiệu giá bảo vệ của văcxin VNNB tái tổ hợp NYVAC- JEV và ALVAC-JEV trên khỉ Rhesus [142] Đây là một hợp tác nghiên cứu giữa viện nghiên cứu Khoa học Y học của quân đội Mỹ tại Bangkok Thái Lan và Pasteur Merieux Connaught (Pháp). Văcxin được nghiên cứu phát triển bởi Viện nghiên cứu chăm sóc động vật, Hội đồng quân y Mỹ và Viện nghiên cứu lực lượng Quân sự Khoa học Y học Mỹ [79]. 2 vec tơ là poxvirus: NYVAC-JEV và ALVAC-JEV được thử nghiệm để đánh giá tính an toàn, miễn dịch và hiệu giá bảo vệ trên mô hình khỉ Rhesus. Mỗi loại văcxin được tiêm cho 4 khỉ vào ngày 0 và 28 với nhóm chứng tiêm văcxin VNNB của Biken vào ngày thứ 0-7-28. Quan sát thấy không có phản ứng tại chỗ. Tất cả các văcxin đều có thể đánh giá có đáp ứng kháng thể trung hòa đặc hiệu với VNNB. Nhưng đáp ứng tăng cao, nhanh và nổi bật là nhóm tiêm văcxin viêm não của Biken so với 2 nhóm kia. Kháng thể tăng cao ở nhóm tiêm văcxin NYVAC-JEV cao hơn ALVAC-JEV. Nhóm tiêm văcxin BIKEN được theo dõi trong 273 ngày. Ngược lại 2 nhóm tiêm văcxin kia chỉ đến ngày 120. Vào ngày 273 tiêm liều bổ sung thì hiệu giá kháng thể trung hòa tăng nhanh sau ngày thứ 7 ở tất cả số khỉ tiêm văcxin. 2 tháng sau liều tiêm bổ sung tất cả khỉ được thử thách bằng đường nhỏ mũi virut viêm não. 4 khỉ tiêm PBS, 3 con tiêm ALVAC-JEV, 1 con tiêm NYVAC-JEV và 1 con tiêm văcxin BIKEN. Kết quả nghiên cứu cho thấy văcxin NYVAC-JEV và ALVAC-JEV an toàn và có miễn dịch trên khỉ. Còn văcxin NYVAC-JEV và BIKEN hiệu quả bảo vệ trên khỉ. (NYVAC-JEV (canarypox) vector là chủng giảm độc lực, ALVAC-JEV (attennated vaccinia) vector là chủng Poxvirus từ gia cầm). Sau khi thử thách NyVac- JEV và Biken được bảo vệ trên khỉ còn ALVAC-JEV thì thất bại. Có lẽ ALVAC-JEV đáp ứng miễn dịch kém trên loài linh trưởng. 46
  48. CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1 Vật liệu 1.1 Giống virut và sinh phẩm chủ yếu - Chủng virut VNNB Nakayama NIH, Nhật Bản. - Chủng virut VNNB Beijing-1 NIH, Nhật Bản. - Văcxin mẫu chuẩn : R194 Việt Nam, EJP034A Nhật Bản. - Tế bào BHK21 - Bộ sinh phẩm ELISA định lượng kháng nguyên VNNB chủng Nakayama - Bộ sinh phẩm ELISA định lượng kháng nguyên VNNB chủng Beijing-1. - Bộ sinh phẩm QIAamp® Viral RNA mini (Qiagen). - Bộ sinh phẩm Super ScripTM one-step with Platium Taq ( Invitrogen). - Bộ sinh phẩm TA cloning : vectơ PCR 2.1, enzim T4 ligaza ( Invitrogen) - Bộ sinh phẩm QIAamp® Plasmit mini (Qiagen). - Bộ sinh phẩm BigDye ® Terminator v 3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems- ABI). 1.2 Động vật thí nghiệm - Chuột ổ 2-4 ngày tuổi - Chuột swiss trắng 3-4 tuần tuổi - Chuột lang 150-300gr - Thỏ 1,5-2,5kg 1.3 Hóa chất và môi trường sử dụng cho sản xuất Tên hóa chất Hãng sản xuất - TCM 199 dạng bột không có đỏ trung tính Difco, Mỹ - TCM 199 dạng bột có đỏ trung tính Difco, Mỹ - Gelatin Sigma, Mỹ - Thimerosal Sigma, Mỹ - Formalin 37% Difco, Mỹ - Tween 80 Wako, Mỹ 47
  49. - Tween 20 Wako, Mỹ - Protamin sulfate Difco, Mỹ - Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) Sigma, Mỹ - Ethylenediaminetetracetic acid-4 sodium (EDTA-4Na) Sigma, Mỹ - Ethylenediaminetetracetic acid-3 sodium (EDTA-3Na) Sigma, Mỹ - Di-sodium hydrogen orthophosphate 12-hydrate (Na2HPO4.12H2O) BDH, Anh - Sodium di-hydrogen orthophosphate 2-hydrate (NaH2PO4.2H2O) BDH, Anh - Sodium chloride (NaCl) BDH, Anh - Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) BDH, Anh - Sodium bicarbonate (NaHCO3) BDH, Anh - Sodium bicarbonate (Na2HCO3) BDH, Anh - Calcium chloride (CaCl2) BDH, Anh - Sodium hydroxide (NaOH) BDH, Anh - Axit clohydric (HCl) BDH, Anh - Cồn 90o HALICO, Việt Nam - Cồn 70o HALICO, Việt Nam - Văcxin VNNB chủng Beijing-1 BIKEN, Nhật Bản - Tá chất Freund adjuvant incomplex Sigma, Mỹ - Tá chất Freund adjuvant complex Sigma, Mỹ - Gel DEAE sephacel AP Biotech - HRPO Sigma, Mỹ - Ortho-Phenylene-Diamine OPD Sigma, Mỹ - Sodium periodate (NaIO4) Sigma, Mỹ - Sodium tetrahydridoborate (NaBH4) Sigma, Mỹ - Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma, Mỹ - Sodium acetate (CH3COONa) BDH, Anh - Potassium chloride (KCl) BDH, Anh - Di-sodium hydrogen orthophosphate (Na2HPO4) BDH, Anh - Sodium di-hydrogen orthophosphate (NaH2PO4) Osi, Pháp - Sulfuric Acid (H2SO4) Sigma, Mỹ - Hydrogen Peroxide (H2O2) Merck, Đức 48
  50. - Acetic Acid (CH3COOH) Osi, Pháp - Axit citric (H3C6H5O7) Osi, Pháp 1.4 Hóa chất dùng cho kiểm định chất lượng và chế tạo bộ sinh phẩm định lượng kháng nguyên ELISA Tên hóa chất Hãng sản xuất Tên hóa chất Hãng sản xuất - Môi trường MEM Difco - Natri sulfat khan Gibco - Lactalbumin hydrolysat (LH) Difco - Axit tricloracetic Gibco - Trypsin Difco - Folin Gibco - Cao nấm men (Yeast extract) Difco - Đồng sulfat Gibco - Hexamethylen tetramin Difco - Gelatin Sigma - Albumin bò (BA) Sigma - Acetylaceton Sigma - Huyết thanh Bê (CS) Sigma - Amoni acetat Sigma - Huyết thanh bê bào thai Sigma - Axit acetic Sigma - Đỏ trung tính Sigma - Dithizon Sigma - Glucose Sigma - Carbon tetraclorit Sigma - Na-Glutamat Sigma - Erythromicin Sigma - EDTA-2Na Gibco - Vicillin Sigma - Agar Noble Gibco - Fungizon Sigma - Đỏ phenol Gibco 1.5 Các loại màng lọc - Màng Nylon mesh Thái Lan - Màng lọc vô trùng Millipore các cỡ 0,22, 0,45, 1,2 và 5,0µm Mỹ - Màng siêu lọc pellicon cassette 10.000Mw; 100.000Mw Mỹ 1.6 Dụng cụ plastic sử dụng một lần - Bơm tiêm 1, 2, 5, 10 và 20ml Terumo - Pipet 1, 2, 5, 10 và 20ml Nunc - Chai nuôi tế bào 25, 50 và 100ml Nunc - Hộp lồng đường kính 6cm Nunc 49